RAPOR FORMATI Bilgisayarda 12 punto büyüklüğünde karakterler ile, tercihan "Times New Roman" stili kullanılarak yazılacak ve aşağıdaki kesimlerden (al

Transkript

1 EK-11 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Proje Başlığı Talasemi Majör Tanılı Hastalarda Trombin Jenerasyonu ile Protrombotik Fenotip Tayini Proje Yürütücüsünün İsmi Uzm. Dr. Elif Ünal İnce Yardımcı Araştırmacıların İsmi Prof. Dr. Nejat Akar Prof. Dr. Zümrüt Uysal Prof. Dr. Mehmet Ertem Yrd. Doç. Dr Talia İleri Biyolog Yonca Eğin Biyolog Hafize Gökçe Proje Numarası 09B Başlama Tarihi Bitiş Tarihi Rapor Tarihi Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2009 "

2 RAPOR FORMATI Bilgisayarda 12 punto büyüklüğünde karakterler ile, tercihan "Times New Roman" stili kullanılarak yazılacak ve aşağıdaki kesimlerden (alt kesimler de dahildir) oluşacaktır. I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri II. Amaç ve Kapsam III. Materyal ve Yöntem IV. Analiz ve Bulgular V. Sonuç ve Öneriler VI. Kaynaklar VII. Ekler a) Mali Bilanço ve Açıklamaları b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları) d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) NOT: Verilen kesin rapor bir (1) nüsha olarak ciltsiz şekilde verilecek, kesin rapor Komisyon onayından sonra ciltlenerek bir kopyasının yer aldığı CD ile birlikte sunulacaktır. Kesin raporda proje sonuçlarını içeren, ISI nın SCI veya SSCI veya AHCI dizinleri kapsamında ve diğer uluslar arası dizinlerce taranan hakemli dergilerde yayınlanmış makaleler, III. Materyal ve Yöntem ve IV. Analiz ve Bulgular bölümleri yerine kabul edilir.

3 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Talasemi majör otozomal resesif geçiş gösteren konjenital bir hemolitik anemidir. Son yıllarda talasemi majör hastalarının yaşam beklentisi, düzenli kan transfüzyonları ve demir şelasyonu sayesinde ilerlemiş olmasına rağmen artmış tromboz gibi komplikasyonlar bu hastalığın önemli problemlerinden olmaya devam etmektedir. Trombin, koagulasyon kaskadında merkezi bir enzimdir. Bir hastanın trombin jenerasyon potansiyeli o hastanın hipo veya hiperkoagulobilite fenotipini anlama konusunda yol gösterici olabilir. Talasemi majör hastalarındaki tromboza eğilimi araştırmak amacıyla, talasemi majör hastaları ile sağlıklı bireylerde trombin jenerasyonu ile protrombotik potasiyelin karşılaştırılması için prospektif bir çalışma planladık. Hasta grubunu 39, kontrol grubunu ise 23 kişi oluşturdu. Hasta ve kontrol grupları arasında trombin jenerasyonu için Lag Time, ttpeak, starttail açısından anlamlı derecede kısalma varken, ETP ve Peak değerlerinde azalma dikkati çekmiştir. Hasta grubunda splenektomi olanlar ve olmayanlar karşılaştırıldığında ise hiçbir trombin jenerasyon göstergesinde gruplar arasında farklılık gözlenmemiştir. Sonuç olarak talasemi majör hastalarında trombin jenerasyon ölçümü ile lag time ve ttpeak değerleri kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak kısalma görülmüştür. Bu bulgu trombin jenerasyonu ile tromboz eğiliminin bir göstergesi olarak değerlendirilebilir. Fakat, lag time ve ttpeak kısalması ile birlikteliği beklenen ETP ve Peak değerlerinde yükselme olmaması beklenmeyen ve bu çalışma verileriyle açıklanamayan bir durumdur. Bu beklenmeyen bulgu talasemi majör hastalarının kısa aralıklarla eritrosit transfüzyonu alması nedeniyle, tromboza eğilimden sorumlu tutulan mşkropartikül salımında azalma ve bu nedenle de ETP ve Peak değerlerinde beklenen yükselmenin ortaya çıkışını engellemesinin bir sonucu olabilir. Bu hipotezi açıklığa kavuşturmak amacıyla transfüzyon almayan talasemi intermedia tanılı hastaların trombin jenerasyonlarını, talasemi majör hastaları ve kontrol grubu ile karşılaştıran bir çalışma planlanabilir. Thalassemia major is a hereditary hemolytic disorder. Although the life expectancy has been improved with transfusion and chelation therapy, risk of thrombosis still remains a significant health problem for this group of patients. The conventional coagulation tests has failed to show the overall tendency for thrombosis or bleeding and with the recent use of techniques measuring the thrombin generation, it has been a potential measure fort he evaluation of the thrombotic phenotype. We have conducted a prospective study in order to measure the thrombotic potential of thalassemia major patients by using thrombin generation assay. Thirty nine thalassemia major patients and 23 healthy controls were included in the study. The lag time, ttpeak and starttail in the patient group was significantly decreased when compared with the control group. The ETP and Peak values were significantly decreased in the patient group when compared with the control group. The decreased lag time and ttpeak can be the sign of hypercoagulable state in thalassemia major patients but the unexpected decrease in ETP and Peak values cannot be explained with the findings in this study. One hypothesis may be the frequent red cell transfusions in this group of patients did not allow the expected the increase in the ETP and Peak values while the thrombotic potential was enough to decrease the lag time and the ttpeak. Measuring thrombin generation in untransfused thalassemia intermediate patients, thalassemia major patients and comparing with the control could be a study to test this hypothesis.

4 II. Amaç ve Kapsam Talasemi majör otozomal resesif geçiş gösteren konjenital bir hemolitik anemidir. Son yıllarda talasemi majör hastalarının yaşam beklentisi, düzenli kan transfüzyonları ve demir şelasyonu sayesinde ilerlemiş olmasına rağmen artmış tromboz gibi komplikasyonlar bu hastalığın önemli problemlerinden olmaya devam etmektedir. Talasemi majörlü hastalar ve özellikle de klinik olarak daha iyi seyirli talasemi intermedia tanılı hastalarda görülen trombotik olaylar talasemi hastalarının hiperkoagulobilitesi konusunda birçok araştırmaya konu olmuştur. Talasemi majör ve talasemi intermedialı hastalarda venöz ve arteyel tromboz, akciğer embolisi hem klinik olarak hem de otopsilerde gösterilmiştir (1-4). Farklı çalışmalarda talasemi majörde inme oranı %2 ila %20 arasında rapor edilmiştir (6). Hiperkoagulobilite talasemi intermedialı hastalarda talasemi majör tanılılara oranla daha da fazla artmıştır. Taher ve ark talasemi hastasında yaptıkları araştırmada tromboz riskini talasemi intermedialı hastalarda talasemi majöre göre 4,38 kez daha fazla bulmuştur (5). Splenektomi ise bu riski daha da artırmaktadır (7). Bu artmış tromboz riskinin protrombotik genetik risk faktörlerini varlığı, demir yükü, endoteliyal hasar, hiperviskozite, anormal eritroid hücreler gibi değişik faktörlerin bir araya gelmesiyle oluştuğu düşünülmektedir. Trombin, koagulasyon kaskadında merkezi bir enzimdir. Bir hastanın trombin jenerasyon potansiyeli o hastanın hipo veya hiperkoagulobilite fenotipini anlama konusunda yol gösterici olabilir. Geleneksel koagulasyon testleri olan PT ve PTT koagulasyon sistemini tam olarak değerlendiremez ve özellikle de protrombotik durumlar için hassas değildir. Koagulasyon faktörlerinin düzeyleri ise her ne kadar faktör eksikliklerini gösterse de her zaman klinikle korelasyon göstermez. Bir hastanın trombin jenerasyon kapasitesini ölçmek proteazlar ve inhibitörlerinin etkileşimlerinin son ürününü ölçmesi nedeniyle, o hastanın trombotik veya hemorajik fenotipini daha iyi yansıtmaktadır. Protrombotik olaylarda venöz trombozlarda, floroskopik trombin jenerasyon ölçümlerinde herediter protein C, S, ATIII eksikliklerinde ve FV R506Q ve protrombin G20210A mutasyonlarında artmış trombin jenerasyonu gösterilmiştir (9-17). Talasemi majör hastalarındaki tromboza eğilimi araştırmak amacıyla, talasemi majör hastaları ile sağlıklı bireylerde trombin jenerasyonu ile protrombotik potasiyelin karşılaştırılması planlandı. Materyal ve Yöntem: Hastalar: Hasta grubunu kliniğimizde aktif olarak takip edilen 39 talasemi majör hastası oluşturdu. Her hastadan 1 adet sitratlı tüpe 4 ml periferik kan alınacak ve Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Hematoloji Laboratuarında plazma ayrımını takiben - 20 C de saklandı. Örneklerin tamamlanmasından sonra Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Genetik Bilim Dalında örnekler aşağıda açıklandığı şekilde çalışıldı. Kontrol grubu olarak Pediatrik Hematoloji Polikliniğine anemi nedeniyle başvurmuş olan fakat altta yatan başka hastalığı ve kendisinde ve ailesinde kanama veya tromboz hikayesi olmayan hastalardan anemilerinin düzelmesini takiben bilgilendirilmiş onam alınarak sitratlı tüpe 4 ml kan alınarak çalışıldı.

5 Materyal: Çalışma grubunu oluşturan hastalardan 0,064 ml 0.109M Trisodyum Sitrat içeren tüplere, 2ml periferik kan örneği alındı. Alınan periferik kan örnekleri, 15dk. 2500g de santrifüj edilerek elde edilen plazma örnekleri -20 C de saklandı. Metod: Elde edilen plazma örnekleri; Thrombin Jenerasyon Kitleri kullanılarak çalışıldı. Çalışmada; Trombin Kalibratörü, PPP-Reagent 5pM, PPP-Reagent Low, PPP- Reagent High, FluCa-Kit Kimyasalları kullanıldı. Thrombin Kalibratör: 1ml distile su ile sulandırıldı. 20µl trombin kalibtatörü, 80µl plazma örneği ile muamele edildi. PPP-Reagent Low: 1ml distile su ile sulandırıldı. 20µl PPP-reagent low, 80µl plazma ile karıştırdı ve örneklerin bulunduğu kuyucuğa 20µl FluCA ilave edildi. PPP-Reagent High: 1ml distile su ile sulandırıldı. 20µl PPP-reagent high, 80µl plazma ile karıştırıldı ve örneklerin bulunduğu kuyucuğa 20µl FluCA ilave edildi. FluCa Kit: (Fluo-Buffer + Fluo_Substrate solüsyonları) Fluo-Buffer çalışma öncesinde 37 C su banyosunda bekletildi: Fluo-Buffer, Fluo_Substrate solüsyonları her çalışmada bir arada kullanıldı. Her kuyucuğa 20µl FluCA Kit ilave edildi. Yukarıda belirtilen şekillerde hazırlanan kitler, kuyucuklarda 80µl hasta örnekleri ile muamele edildikten sonra Thrombinoscope (Netherlend) cihazında değerlendirildi. Trombin Jenerasyonu ölçümünde: 1. Lag Time: Trombin jenerasyonunda pikin başladığı zaman 2. ETP:Endojen Trombin Potansiyeli 3. Peak: Pikin yüksekliği 4. Tt-Peak(Time to Peak): Pikin tepe noktasına yükseldiği ana kadar olan zaman (pike varış zamanı) değerlendirildi. 5. Start Tail: Kuyruğun başladığı zaman. Lag Time da kısalma, ETP değerinde artış, Peak değerinde artış, Tt-peak değerinde azalma trombotik potansiyelde artış olarak değerlendirildi. Hasta grubun trombotik potansiyelde artış olup olmadığının test edilmesi amacıyla hasta grubu ve kontrol grubu arasında Lag Time, ETP, Peak ve Tt Peak değerleri karşılaştırıldı. Ayrıca hasta grubu kendi içerisinde splenektomi uygulanmış olanlar ve splenektomi uygulanmamış olanlar olmak üzere gene Lag Time, ETP, Peak ve Tt Peak değerleri ile trombotik potansiyel açısından karşılaştırıldı.

6 İstatistiksel Değerlendirme: Hasta ve kontrol grubu arasında yaş ve cinsiyet farkının değerlendirilmesi amacıyla Mann Whitney U testi kullanıldı. Hasta ve kontrol grupları arasındaki veri karşılaştırmalarında normal dağılım göstermeyen değerler için Mann Whitney U testi ile değerlendirilip sonuçlar ortanca, minimum ve maksimum olarak özetlendi, normal dağılım gösteren değerler için ise bağımsız gruplarda student t testi uygulandı, tanımlayıcı istatistikler ise ortalama ve standart sapma olarak değerlendirildi. Anlamlılık düzeyi olarak p<0,05 seçildi. IV. Analiz ve Bulgular; Hasta grubunu 39, kontrol grubunu ise 23 kişi oluşturdu. Hasta grubu için yaş ortanca 18y (3y - 32y), kontrol grubu için ise yaş ortanca 22y (1y 24y) idi ve arada istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu. Hasta ve kontrol grupları arasında Lag Time, ttpeak, starttail açısından anlamlı derecede kısalma varken, ETP, Peak ve değerlerinde azalma dikkati çekmiştir. Sonuçlar Tablo I de gösterilmiştir. Tablo I: Kontrol Ve Hasta Grupları Trombin Jenerasyon Parametrelerinin Karşılaştırılması Parametre Kontrol Hasta p Lag Time (min) Ortanca(min-mak) 5,33 (3,00-7,00) 3,28 (2,28-6,95) <0,05 ETP (nmol/l) Ortanca(min-mak) 2170 (0-3094) 1526 ( ) <0,05 Peak (nmol/l) Ortalama ±SD 367,12 ± 71,46 320,87 ± 64,60 <0,05 ttpeak (min) Ortanca(min-mak) 8,00(5,00-10,33) 5,62 (3,95-9,96) <0,05 Starttail (min) Ortanca(min-mak) 25,00(18,00-29,00) 19,00(14,00-32,00) <0,05 Hasta grubu kendi içerisinde splenektomili olanlar ve olmayanlar da trombin jenerasyonu açısından değerlendirildi. Splenektomi olan 15, splenektomi olmayan 24 hasta vardı. Splenektomi olmayan hastaların yaş ortancası 14y (3y-29y), splenektomi olanların ise yaş ortancası 23y (9y-32y) idi ve splenektomili hastaların yaş ortancası olmayanalara göre daha yüksek bulundu ve aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı idi. Her iki grup arasında Lag Time, ETP, Peak, ttpeak, starttail açısından ise anlamlı fark bulunmadı (Tablo II). Tablo II: Splenektomi Olan Talasemi Majör Hastaları ile Splenektomi Olmayan Talasemi Majör Hastalarının Trombin Jenerasyon Parametrelerinin Karşılaştırılması Parametre Splenektomili (n=15) Splenektomisiz (n=24) p Lag Time (min) Ortanca(min-mak) 3,28(2,28-5,95) 3,28(2,94-6,95) >0,05 ETP (nmol/l) Ortanca(min-mak) 1582( ) 1522( ) >0,05 ttpeak (min) Ortanca(min-mak) 5,95 (3,95-9,96) 5,62(4,95-9,90) >0,05 Starttail (min) Ortanca(min-mak) 19(17-24) 20(14-32) >0,05 V. Sonuç ve Öneriler Talasemi majör hastalarında tromboz riskinin artmış olduğu gösterilmiştir ve son zamanlardaki çalışmalar, bu artmış tromboz riskinden eritrosit membranında fosfotidil serin açığa çıkışının sorumlu olabileceği üzerinde durulmaktadır (24). Bu tromboz riskinin geleneksel koagulasyon testleri olan PT ve PTT koagulasyon sistemini tam olarak değerlendilememektedir.

7 Trombin jenerasyonu lag time da kısalma, ETP değerinde ve Peak değerinde artma, ve ttpeak da kısalma ile trombotik potansiyelde artışı gösterebildiği çalışmalarla gösterilmiştir (21). Trombotik eğilimi artmış olduğu bilinen talasemi majör hastalarında protrombotik potansiyelinin trombin jenerasyonuyla gösterilebilip gösterilemeyeceği konusunda literatürde bilgi yer almamaktadır. Bu amaçla talasemi majör hastalarında trombin jenerasyonu ile protrombotik fenotipi araştırmak amaçlı prospektif bir çalışma yaptık. Çalışmaya 39 talasemi majör hastası ve 23 sağlıklı kontrol alındı. İki grup arasında trombin jenerasyonu lag time, ETP, Peak, ttpeak değerleri ölçüldü ve karşılaştırıldı. Talasemi majörlü hastalarla kontrol grubu karşılaştırıldığında lag time ve tttime zamanlarında anlamlı olarak kısalma görüldü [lag time: kontrol grubu vs hasta grubu ortanca 5,33 dk (3,00 dk-7,00dk) vs 3,28 dk (2,28 dk- 6,95 dk), ttpeak: kontrol grubu ortanca 8,00 dk (5,00 dk -10,33 dk); hasta grubu ortanca 5,62 dk (3,95 dk -9,96 dk) (p<0,05)]. Literatür incelendiğinde lag time da kısalma ve ttpeak de kısalma trombotik fenotip ile uyumlu olarak bulunmuştur. Ancak lag time ve ttpeak de kısalmaya genellikle ETP de ve Peak değerlerinde artışın eşlik etmesi kuvvetli bir trombotik potansiyel göstergesi olarak kabul edilmektedir (25). Bizim hasta grubumuzla kontrol grubunun karşılaştırılmasında ise her ne kadar lag time ve ttpeak zamanı kısalmış olsa bile buna ETP ve Peak değerlerinde yükselme eşlik etmemiş tam tersine ETP ve Peak değerleri hasta grubunda kontrol grubuna göre düşük bulunmuştur. [ETP: kontrol grubu vs hasta grubu ortanca 2170 nmol/l (0-3094) vs 1526 nmol/l ( ), Peak: kontrol grubu ortalama 367,12 ± 71,46; hasta grubu ortalama 320,87 ± 64,60 (p<0,05)]. Literatürde lag time kısalmamış olmasına rağmen Peak değerlerinde artış esansiyel trombositozlu hastalarda gösterilmiş olmasına karşın (26), lag time da kısalma olmasına rağmen ETP ve Peak de anlamlı olarak azalma görülmesi bildirilmemiştir. Bizim çalışmamızda hasta ve kontrol gruplarında ETP ve Peak değerlerinde azalma lag time da kısalmayı takip etmemiştir. Bunu literatür bilgileri ışığında açıklamak bu konuda kısıtlı bilgi olması nedeniyle mümkün olmamakla beraber yeni bir bulgudur. Bu yeni bulgunun olası nedenleri düşünüldüğünde çalışmamız teknik olarak incelendiğinde plazmalar hasta ve kontrol grubunda önceden alınarak -20 C de dondurulmuş ve bütün örnekler aynı anda çalışılmıştır. Bu durumda plazma proteinlerinin fonksiyon kaybına uğramadan saklanabileceği koşullar sağlanmış olup saklama koşullarıyla ilişkili olumsuzluk olduğunu düşündürecek bir sorun olmamıştır. Bu farklı bulgu talasemi majör hastalarıyla ilişkili olabilir. Talasemi majör hastaları 3-4 haftada 1 düzenli eritrosit transfüzyonu almakta ve böylelikle inefektif eritropoez baskılanmakta ve hastanın kendi eritrositlerini üretmelerine izin verilmemektedir. Bu çalışmada hastalardan kan örnekleri, hastalar eritrosit transfüzyonu almaya geldiklerinde hemen eritrosit transfüzyonu öncesi alınmıştır. Talasemi majör ve talasemi intermedia hastalarında trombotik yatkınlığın giderek daha çok eritrosit membranın fosfotidilserin açığa çıkışı ve mikropartiküllerle ilişkili olduğu düşünülmektedir. Olasıdır ki 3-4 haftada 1 eritrosit transfüzyonu alan talasemi majör hastalarında bu yeni ve sorunlu hemoglobin içermeyen eritrositlerin dolaşımda varlığı mikropartikül oluşma oranını ve dolayısı ile de trombotik riskini transfüzyon almayan talasemi intermedia hastalarına göre azaltmaktadır. Lag time ve ttpeak de kısalma olması fakat ETP ve Peak değerlerinde artma beklenirken azalma olması trombotik riskin artmış olmasına karşın, ETP ve Peak değerlerini de yükseltecek derece de artmadığını gösteriyor olabilir ve bu da sık transfüzyon almaları ile hipotetik olarak açıklanabilir. Transfüzyon almayan talasemi intermedia tanılı hastaların trombin jenerasyonlarını, talasemi majör hastaları ve kontrol grubu ile karşılaştıran bir çalışma planlanması bu soruyu cevaplamakta yardımcı olabilir. Talasemi majör hastalarında splenektomi sonrası da tromboz riski artmıştır. Biz

8 kendi çalışma grubumuzda bulunan splenektomi olmuş talasemi majör hastalarımızla, splenektomi olmamış hasta grubumuzu trombin jenerasyonu açısından karşılaştırmayı planladık. Trombin jenerasyonunun hiçbir parametresi (lag time, ETP, Peak, tttime) için splenektomi olan ve olmayan grup arasında anlamlı fark gözlenmedi. Sonuç olarak talasemi majör hastalarında trombin jenerasyon ölçümü ile lag time ve ttpeak de kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak kısalma gözlenmiştir. Bu bulgu trombin jenerasyonu ile tromboz eğiliminin bir göstergesi olarak değerlendirilebilir. Fakat, lag time ve ttpeak kısalması ile birlikteliği beklenen ETP ve Peak değerlerinde yükselme olmaması, beklenmeyen ve bu çalışma verileriyle açıklanamayan bir durumdur. Bu beklenmeyen bulgu talasemi majör hastalarının kısa aralıklarla eritrosit transfüzyonu alması nedeniyle, yeni eritrositlerden mikropartikül salımının azalması ile ETP ve Peak değerlerindeki yükselmenin ortaya çıkışını engellemiş olmasıyla açıklanabilir. Bu hipotezi açıklığa kavuşturmak amacıyla transfüzyon almayan talasemi intermedia tanılı hastaların trombin jenerasyonlarını, talasemi majör hastaları ve kontrol grubu ile karşılaştıran bir çalışma planlanabilir. VI. Kaynaklar 1. Michaeli J, Mittelman M, Grisaru D, Rachmilewitz EA.Thromboembolic complications in beta thalassemia major.acta Haematol 1992;87: Cappellini MD, Robbiolo L, Bottasso BM, Coppola R, Fiorelli AP, Mannucci AP. Venous thromboembolism and hypercoagulabilityin splenectomized patients with thalassaemia intermedia. Br J Haematol 2000;111: Gillis S, Cappellini MD, Goldfarb A, Ciceri L, Fiorelli G, Rachmilewitz EA. Pulmonary thromboembolism in thalassemia intermedia patients. Haematologica 1999;84: van Teunenbroek A, Wijburg FA, ten Cate JW, van den Berg RS, Weening RS. thromboembolic complications in an asplenic HbE-beta-thalassaemia patient. Neth J Med 1989;35: Taher A, Isma eel H, Mehio G, Bignamini D, Kattamis A, Rachmilewitz EA et al. Prevalence of thromboembolic events among 8,860 patients with thalassaemia major and intermedia in the Mediterranean area and Iran. Thromb Haemost 2006;96: Borgna Pignatti C, Carnelli V, Caruso V, Dore F, De Mattia D, Di Palma A et al. hromboembolic events in beta thalassemia major: an Italian multicenter study. Acta Haematol 1998;99: Cappellini MD, Grespi E, Cassinerio E, Bignamini D, Fiorelli G. Coagulation and splenectomy: an overview. Ann N Y Acad Sci 2005;1054: Aessopos A, Farmakis D, Karagiorga M, Rombos I, Loucopoulos D. Pseudoxanthoma lasticum lesions and cardiac complications as contributing factors for strokes in betathalassemia patients. Stroke 1997;28: Andresen MS, Abildgaard U, Liestøl S, Sandset PM, Mowinckel MC, Ødegaard OR, Larsen ML, Diep LM. The ability of three global plasma assays to recognize thrombophilia Thromb Res. 2004;113(6): Regnault V, Hemker HC, Wahl D, Lecompte T. Phenotyping the haemostatic system by thrombography--potential for the estimation of thrombotic risk. Thromb Res. 2004;114(5-6): Dargaud Y, Luddington R, Baglin TP.Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J Thromb Haemost May;4(5): Hézard N, Bouaziz-Borgi L, Remy MG, Nguyen P.Utility of thrombin-generation assay in

9 the screening of factor V G1691A (Leiden) and prothrombin G20210A mutations and protein S deficiency. Clin Chem Apr;52(4): Hézard N, Bouaziz-Borgi L, Remy MG, Florent B, Nguyen P.Protein C deficiency screening using a thrombin-generation assay. Thromb Haemost Jan;97(1): Hron G, Kollars M, Binder BR, Eichinger S, Kyrle PA. JAMA. Identification of patients at low risk for recurrent venous thromboembolism by measuring thrombin generation Jul 26;296(4): Castoldi E, Simioni P, Tormene D, Thomassen MC, Spiezia L, Gavasso S, Rosing Differential effects of high prothrombin levels on thrombin generation depending on the cause of the hyperprothrombinemia. J. J Thromb Haemost May;5(5): Gatt A, van Veen JJ, Cooper P, Kitchen S, Makris M.Protein C deficiency screening using a thrombin generation assay - an upgrade. Thromb Haemost Sep;98(3): van Hylckama Vlieg A, Christiansen SC, Luddington R, Cannegieter SC, Rosendaal FR, Baglin TP.Elevated endogenous thrombin potential is associated with an increased risk of a first deep venous thrombosis but not with the risk of recurrence. Br J Haematol Sep;138(6): Beltrán-Miranda CP, Khan A, Jaloma-Cruz AR, Laffan MA.Thrombin generation and phenotypic correlation in haemophilia A. Haemophilia Jul;11(4): Regnault V, Béguin S, Lecompte T. Calibrated automated thrombin generation in frozenthawed platelet-rich plasma to detect hypercoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb. 2003;33(1): Siegemund A, Petros S, Siegemund T, Scholz U, Seyfarth HJ, Engelmann L.The endogenous thrombin potential and high levels of coagulation factor VIII, factor IX and factor XI. Blood Coagul Fibrinolysis Apr;15(3): Chantarangkul V, Clerici M, Bressi C, Giesen PL, Tripodi A.Thrombin generation assessed as endogenous thrombin potential in patients with hyper- or hypo-coagulability. Haematologica May;88(5): Regnault V, Béguin S, Wahl D, de Maistre E, Coenraad Hemker H, Lecompte T. Thrombinography shows acquired resistance to activated protein C in patients with lupus anticoagulants. Thromb Haemost Feb;89(2): Regnault V, Boehlen F, Ozsahin H, Wahl D, de Groot PG, Lecompte T, de Moerloose P. Anti-protein S antibodies following a varicella infection: detection, characterization and influence on thrombin generation. J Thromb Haemost Jun;3(6): Ataga KI, Cappellini MD, Rachmilewitz EA. Beta-thalassaemia and sickle cell anaemia as paradigms of hypercoagulability. Br J Haematol Oct;139(1): Senzolo M, Sartori MT, Rodriguez-Castro K, Simioni P, Rossetto V. Increased thrombin generation in liver transplant recipients: does immunosuppressive therapy play a role? Liver Transpl Mar;17(3): doi: /lt Panova-Noeva M, Marchetti M, Spronk HM, Russo L, Diani E, Finazzi G, Salmoiraghi S, Rambaldi A, Barbui T, Ten Cate H, Falanga A. Platelet-induced thrombin generation by the calibrated automated thrombogram assay is increased in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera. Am J Hematol Apr;86(4): doi: /ajh