Kathleen Danna ve Daniel Nathans tarafından 1971 de yayınlanan bir makale, rekombinant DNA çağının başlangıcını işaret etmiştir. Makale, bir bakteri

Transkript

1

2 Kathleen Danna ve Daniel Nathans tarafından 1971 de yayınlanan bir makale, rekombinant DNA çağının başlangıcını işaret etmiştir. Makale, bir bakteri suşundan bir enzimin ayrıştırılmasını ve enzimin viral DNA yı, özgül nükleotit dizilerinden kesmek için kullanılışını tanımlar. Bu proteinler restriksiyon enzimleri olarak adlandırılır.

3 Rekombinant DNA teknolojisinin ilk adımları bu çalışmayla başlamış ve 1970 lerin ortalarından sonra da geliştirilmiştir. Bu gelişmeler, bilim insanlarına, özgül bir DNA dizisini izole etme ve çalışma olanağı vermiştir.

4 Nathans, Hamilton Smith ve Werner Arber, bu teknolojinin gelişmesine yaptıkları katkılarından dolayı Fizyoloji ve Tıp alanında 1978 Nobel Ödülünü almışlardır. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978 was awarded jointly to Werner Arber, Daniel Nathans and Hamilton O. Smith "for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics". D. Nathans H.O. Smith W. Arber

5 Rekombinant DNA terimi, doğal olarak bir arada bulunması mümkün olmayan DNA moleküllerinin kombinasyonunu ifade eder. Rekombinant DNA teknolojisi, bir genomdaki binlerce gen arasından tek bir genin ayrıştırılmasını, tanımlanmasını ve bu genin klonlanmış DNA molekülü olarak büyük miktarlarda üretilmesini mümkün kılmaktadır. Bu teknoloji, bir genin potansiyel olarak sınırsız miktarda üretilmesi için güçlü bir araçtır.

6 Bilim adamları, genleri doğrudan çalışabilmek için, gen boyutundaki DNA parçalarının çok sayıda kopyasının elde edildiği yöntemlerin geliştirilmesine gereksinim duymuştur. Diğer bir deyişle, bilim adamları gen klonlaması ile ilgili tekniklere ihtiyaç duymuştur.

7

8 Gen klonlama: Bir genin birçok kopyasının oluşturulmasını ve izolasyonunu ifade eder. Bir genin klonlanması için gerekli laboratuar yöntemleri 1970 lerde bulunmuştur. Bu tekniklerin geliştirilmesiyle bulunan yöntemler hücre biyologları, biyokimyacılar, bitki biyologları ve mikrobiyologlar tarafından kullanılmıştır.

9 İlk geliştirilen klonlama yöntemi hücre-tabanlı klonlama olarak bilinir ve klonlanmış DNA yaratmak için çok yaygın olarak kullanılır. En yaygın kullanılan prokaryotik konak, K12 olarak bilinen E.coli nin bir laboratuar suşudur.

10 Klonlamanın temel basamakları şu şekildedir; Klonlanacak DNA, doku ya da hücrelerden izole edilir. Restriksiyon enzimleri kullanılarak özgül DNA parçaları elde edilir. Bu enzimler, DNA yı özgül dizilerinden tanır ve keser. Oluşturulan bu DNA parçaları vektör adı verilen DNA molekülleriyle birleştirilir. Rekombinant DNA molekülü, bir konak hücreye aktarılır. Konakta molekül kendini eşler ve düzinelerce kopyası oluşur.

11

12 Klonlanmış DNA konak hücrelerden izole edilip incelenebilir, transkripsiyona uğratılabilir, mrna sı translasyona sokulabilir ve kodlanan gen ürünü izole edilerek araştırma için ya da ticari amaçlarla satılmak için kullanılabilir.

13 Klonlanan genlerin potansiyel kullanımı 2 genel kategoride toplanır : Protein ürünü elde etmek Genin çok sayıda kopyasını hazırlamak

14 Kopyalanacak olan DNA parçaları konak hücresine doğrudan giremezler. Ancak, restriksiyon enzimiyle kesilmiş bir DNA parçası vektör adı verilen başka bir DNA molekülü ile birleşirse konak hücreye girebilir.

15 Vektörler, kendilerine takılan DNA parçasını nakleden ve replike eden taşıyıcı DNA molekülleridir.

16 Bir DNA molekülünün vektör olarak kullanılabilmesi için birtakım özelliklere sahip olması gerekir; Kendini ve taşıdığı herhangi bir DNA parçasını bağımsız olarak replike edebilmelidir. Klonlanacak DNA parçasının insersiyonuna olanak tanıyan birçok tanıma dizisi içermelidir. Vektörde seçicilik sağlayan marker genler bulunmalıdır. Bunlar, vektör taşıyan ve taşımayan konak hücreleri ayırmak için gereklidir. Vektör ve vektörün taşıdığı DNA parçası konaktan kolaylıkla ayrıştırılabilmelidir.

17 Konak özgüllüğü, Taşıdıkları parçanın büyüklüğü, Kopya sayıları, Tanıma dizilerinin sayıları, Marker genlerinin tipi ve sayıları gibi birtakım özellikleri açısından birçok farklı klonlama vektörü vardır.

18 Plasmidler Bakteriyofajlar Cosmidler Bakteri Yapay Kromozomları (BAC) Maya Yapay Kromozomları (YAC) Memeli Yapay Kromozomları (MAC) İnsan Yapay Kromozomları (HAC) İfade Vektörleri

19 Plasmid, çoğu bakteri türünde doğal olarak bulunan, bağımsız olarak replike olabilen, bakterinin kendi kromozomu dışındaki çift zincirli halkasal veya süper sarmallı DNA molekülleridir.

20

21 Plasmidler, küçük moleküllerdir; bu açıdan bir karşılaştırma yapılırsa, bakteriyel kromozomun %20'si ile %4'ü arasında büyüklüklerde olduğu görülür. Plasmidlerin büyüklüğü 1-400kb s kadar değişebilir.

22 Fertilite Plasmidleri (F) Direnç Plasmidleri (R): konakçıyı antibiyotiklere karşı dirençli kılar. Bu tip plasmidler, transfer edilerek başka hücrelerin de direnç kazanmasına yol açabilirler. Ampsilin (amp), Kloramfenikol (Cam), Streptomisin (Str), Kanamisin (Kan) ve Sulfonamid (sul) gibi direnç genleri vardır. Kolisinojenik Plasmidler (Col): Col plasmidleri, "kolisin" denilen bir grup proteinin sentezinden sorumlu genleri içerirler. Kolisinler, aynı tip Col plasmidini taşımayan bakterileri öldürme özelliğindedirler.

23 Ent Plasmidler (E. Coli) ; zararsız bakterilere girerek onları patojen hale getirirler ve diareye sebep olan enterotoksinlerin sentezini sağlarlar. Hly Plasmidi (hemoliz yapan plasmit) ; domuzdan izole edilen E.coli ler de bulunmuştur. Herhangi bir patojeniteye sebep olduğu görülmemiştir. Degredasyon Plasmidleri; Pseudomonas türü, yüzlerce çeşit organik bileşiği karbon kaynağı olarak kullanabilmektedir. Özellikle, toluen, oktan gibi zehirli karbonları kullanabilirler. Bu metabolik yetenek, degredasyon plasmidleri tarafından sağlanır. Toksik metal iyonlarına karşı direnç sağlayan plasmidler; direnç sağladıkları iyonun var olduğu ortamda bulunurlar.

24 Plasmidler, vektör olarak kullanılabilmeleri için genetik mühendisliği ile çok fazla değişikliğe uğratılmıştır. Plasmid vektörler genellikle 10kb a kadar insert DNA taşırlar. Plasmidler, ilk geliştirilen vektörlerdir ve hala klonlama için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kullanan ilk plasmid vektör, pbr322 olarak adlandırılmıştır. Bu vektörün büyüklüğü 4361 bp dir.

25

26 Plasmid vektörlerde; Replikasyon orjini (ori) Antibiyotik direnç genleri (marker gen) Restriksiyon enzimlerinin tanıma dizilerini içeren bir polylinker bölge bulunmalıdır.

27 Bir plasmid üzerinde bulunan kesim bölgelerinin hepsi bir yerde toplanmış olabilir. Polylinker bölge, yanyana farklı restriksiyon enzimlerinin kesim yerlerinin bir arada bulunduğu bölgedir.

28 Plasmid vektörler, mutlaka klonlanacak DNA parçasıyla aynı restriksiyon enzimiyle kesilmesi gerekir.

29 Bazı plasmidler, bakteri konak hücresine bir kere girince, kopya sayılarını binlerce kopya olacak şekilde arttırırlar. Bu tür plasmidlerden biri, vektör olarak birçok yararlı özelliği bulunan puc18 dir. Bu plasmid küçüktür (2686bp) ve bu nedenle daha büyük insert DNA parçalarını taşıyabilir. İnsert DNA nın hücre başına 500 kadar kopyasını oluşturabilir.

30

31 Vektör ve gen-kaynağı DNA nın izolasyonu DNA nın vektöre takılması Klonlama vektörünün hücrelere aktarılması Hücrelerin klonlanması İstenen geni taşıyan hücre klonlarının ayrımı

32 Gen-kaynağı DNA, laboratuar kültüründe gelişmekte olan insan doku hücrelerinden elde edilir. Plasmid ise, E.coli bakterisinden elde edilir. Plasmid DNA sın da ampisilin direnç geni ve lacz geni bulunur. Ayrıca, restriksiyon enzimi için tek bir tanıma dizisi bulundurur ve bu dizi lacz geni içerisinde yer alır.

33 Hem plasmid hem de insan DNA sı aynı restriksiyon enzimi ile kesilir. Enzim, plasmid DNA yı tek bir restriksiyon bölgesinden lacz genini bozarak keser. Enzim aynı şekilde insan DNA sını binlerce DNA parçası oluşturacak şekilde keser. Plasmid ve insan DNA sı birbirine uyan yapışkan uçlar oluştururlar. İnsan DNA fragmentleri kesilmiş plasmidlerle karıştırılır.

34 Plasmid yapışkan uçları, insan DNA fragmentlerinin komplementer yapışkan uçları ile baz çiftleri oluşturur. Bunun yanı sıra, iki plasmidin bir araya gelmesi, plasmidin kendi kendine kapanması ya da plasmidin çeşitli DNA parçalarıyla birleşmesi gibi kombinasyonlar da ortaya çıkabilir. DNA moleküllerini kovalent bağlarla birleştirmek üzere DNA ligaz enzimi uygulanır. Sonuç olarak, rekombinant DNA lardan oluşan bir karışım oluşur.

35 Bakteriler, rekombinant plasmidleri transformasyonla içeri alır. Kullanılan bakteriler lacz(-) dir. Yani laktozu parçalayamazlar. Bakterilerden bazıları istenilen rekombinant plasmidi bünyesine alır, bazıları ise alamayarak non-rekombinant durumda kalır.

36 Transforme edilen bakteriler, ampisilin ve X- gal bulunan katı besiyerine ekilir. Çoğalan bakteriler bir hücre klonu oluştururlar. Bu şekilde, plasmidler tarafından taşınan insan genleri aynı zamanda klonlanmış olur. Rekombinant plasmidleri taşıyan hücre kolonilerini seçmede plasmidin kendi genlerinden yararlanılır.

37 Besiyerinde amp bulunuşu sadece plasmid bulunduran hücrelerin gelişmesine izin verir. Çünkü sadece bunlarda amp direnç geni vardır. X-gal, yabancı DNA taşıyan plasmidleri bulunduran bakterilerin tanınmasını sağlar. X- gal in β-galaktozidaz ile hidrolizi sonucu mavi ürün meydana gelir. Bozulmamış β- galaktozidaz genlerini içeren plasmidleri taşıyan bakteriler mavi olur. Eğer plasmid yabancı DNA yı lacz geni içerisine yerleştirmişse, β-galaktozidaz üretemeyeceklerinden beyaz görülür. Kısaca, yabancı DNA yı taşıyanlar besiyerinde beyaz koloniler olarak gözlenir.

38 Genin kendisi veya ürünü olan protein aranabilir. Genin doğrudan aranmasına dönük tüm metotlar, nükleik asit hibridizasyonu adı verilen, gen ve diğer nükleik asit deki komplementer dizi arasındaki baz eşleşmesine dayanır. İstenilen genin bu diziye komplementer bir probu sentezlenir. Prob, radyoaktif bir izotopla veya floresan bir etiketle işaretlenerek izlenir.

39 İstenen geni taşıyan bir hücre klonu teşhis edildiğinde, hücreler büyük bir tankta sıvı besiyerinde üretilebilir ve izole edilebilir. Eğer istenen geni taşıyan hücreler bu geni protein şeklinde ifade ederse, tüm kolonileri protein yönünden tarayarak ayırmak mümkündür. Proteinin tespiti, aktivitesine ya da özgül olarak bağlanan antikorların kullanılmasıyla incelenen yapısına dayanır.

40 Virüsler canlı hücrelere girebilirler ve çoğalabilirler. Bir kromozomal gen, viral genom içerisine sokulursa, gen virüs DNA sı ile birlikte replikasyona uğrar ve çoğalır.

41 Lambda fajının genlerinin hepsi tanımlanmış, tüm genomunun haritası çıkarılmış ve nükleotit dizisi belirlenmiştir. ʎ fajının genetik olarak değiştirilmiş suşları vektör olarak kullanılır.

42 Vektör olarak kullanılması için, lambda kromozomunun ortasında yer alan genomun üçte birlik kısmı, yabancı bir DNA ile değiştirilir. Faj vektörler yaklaşık 20kb büyüklüğündeki DNA parçalarını taşıyabilirler.

43 Bu vektörü kullanarak DNA klonlaması yapmak için önce faj DNA sı ayrıştırılır. EcoR1 ile kesilerek, sol kol, sağ kol ve vazgeçilebilir orta bölüm olmak üzere 3 kromozomal parça oluşturulur. Sol ve sağ kollar izole edilir ve EcoR1 ile kesilmiş DNA ile karıştırılır. Parçaların DNA ligaz ile birleştirilmesiyle rekombinant vektörler oluşur.

44

45 Rekombinant ʎ vektörleri in vitro olarak fajın protein kafası içine paketlenir ve konak bakteri hücresine sokulur. Bakterinin içinde vektörler çoğalır ve her biri insert DNA taşıyan birçok faj kopyası oluşur. Fajlar oluştukça konak bakteri hücresini parçalar ve petri kabında plaklar oluşur. Bu plaklardan klon DNA lar ayrıştırılır.

46

47 Cosmid vektörler, lambda kromozomunun bir kısmı ile plasmidin bir kısmının birleştirilmesiyle oluşturulmuş hibrit vektörlerdir.

48 Cosmid vektörlerde; Cos dizileri: Yabancı DNA parçası taşıyan cosmid in lambda viral protein kılıfına sanki kendi viral kromozomu gibi paketlenmesini sağlar. Restriksiyon enzimi kesim bölgesi Replikasyon orjini (ori): cosmid in hücrede plasmid gibi kendisini çoğaltmasını sağlar. Antibiyotik direnç genleri: Cosmidleri taşıyan konak hücrelerin belirlenmesine yarayan marker genler.

49

50 DNA parçalarının takılmasından sonra rekombinant cosmidler, lambda protein kılıfı içine paketlenerek enfekte edici faj parçacıkları oluşturur. Cosmid, bir bakteri konak hücresinin içine girdikten sonra plasmid gibi replike olur.

51 Bakteriyofaj vektörler kb, plasmid vektörler 5-10 kb büyüklüğünde DNA parçaları taşırken, ikisinin birleşmesiyle oluşan hibrit Cosmidler, 50 kb büyüklüğünde DNA parçası taşırlar.

52

53 Değişik kaynaklardan türetilen ve kendi replikasyon orjinlerini içeren diğer hibrit vektörler birden fazla konak hücrede replike olabilirler ve mekik (shuttle) vektörler olarak adlandırılırlar. SV40 hayvan virüsü Taşıdıkları DNA yı, E.coli ile maya gibi konak hücreler arasında ileri geri taşımak için kullanılır. Bu vektörler genellikle gen ifadesi çalışmalarında kullanılırlar.

54 İnsan DNA sı gibi büyük genlerin klonlanması için çok büyük klonlama kapasitesi olan vektörlere gereksinim vardır. Büyük klonlama kapasitesine sahip vektörlerden biri bakteri yapay kromozomları (Bacterial Artificial Chromosomes-BAC) dır.

55 BAC lar, bakterinin üreme plasmidi olan F faktörü ile oluşturulur. F faktörleri, bakteri konjugasyonu sırasında genetik bilgiyi transfer eden, bağımsız olarak kendini eşleyebilen plasmidlerdir.

56

57 F faktörleri 1Mb uzunluğuna kadar olan bakteri kromozomlarını taşıyabildiklerinden, ökaryotik DNA parçaları için vektör olarak düzenlenmişlerdir ve yaklaşık 300 kb uzunluğundaki bir parçayı taşıyabilirler.

58 BAC vektörler; Replikasyon genleri F faktör genleri Antibiyotik direnç marker geni Promotor bölgesi Klonlanacak DNA nın gireceği polylinker bölgesi içermelidir.

59

60 Çok büyük miktarlarda DNA fragmentlerini klonlayabilirler. Maya kromozomlarının büyüklüğü 230kb ile 1900kb arasında değişebilir. Böylece, 100 ile 1000kb arasındaki büyüklükte olan DNA parçalarının YAC içine klonlanması mümkün olur. YAC vektörlerinin bu özelliği, onları İnsan Genom Projesinde çok önemli araçlar haline getirmiştir.

61 Floresan boyalarla etiketlenmiş maya yapay kromozomları

62 Saccharomyces cerevisiae, 5 nedenden ötürü ökaryotik genlerin ifadesi ve klonlanması için yaygın olarak kullanılan bir konak hücredir; 1- Maya ökaryotik bir organizma olmasına rağmen, bakteri hücreleri gibi manipüle edilebilir ve üretilebilir. 2- Maya genetiği ayrıntılı olarak çalışılmıştır. Geliştirilmiş bir genetik haritası ile mutasyonlarını gösteren geniş bir kataloğu vardır. 3- Maya nın tüm genom analizi yapılmış ve organizmadaki genlerin çoğu belirlenmiştir. 4- Bazı ökaryotik proteinlerin işlevlerini çalışmak için, translasyon sonrası değişiklikleri yapabilen bir konak hücreye gereksinim vardır. 5- Maya, yüzyıllar boyunca değişik alanlarda kullanılmıştır ve hala kullanılmaktadır. Güvenli bir organizma olarak kabul edilmiştir.

63 Saccharomyces cerevisiae

64 Bir YAC molekülü; Replikasyon orjini (ORI) Telomer bölgeleri (TEL): Linear hale getirilmiş olan yapının stabilitesini sağlar ve nükleazlar tarafından kesilmesini engeller. Sentromer bölgesi (CEN): Sentromer dizilerini içerir. Hücre bölünmesi sırasında vektörün kardeş hücrelere ayrılmasını sağlar. Marker bölgeler: 3 tip marker vardır. (SUP4- URA3 -TRP1) ARS dizileri: Otonom olarak çoğalmayı sağlayan gen dizileridir. Polylinker bölge: Restriksiyon enzimi kesim bölgeleri

65 Maya yapay kromozomu; pyac3 Kromozomun sol ve sağ kolları için seçici markerlar olan TRP1 ve URA3 maya genleridir. SUP4 geni içinde de SnaB1 enzimine ait restriksiyon tanıma dizisi bulunur. SnaB1 ve BamH1 ile yapılan kesim ile yapay kromozom iki kola ayrılır. Klonlanacak DNA, SnaB1 ile muamele edilerek birçok parçalar oluşturulur. Parçalar ve kollar birbirleri ile birleştirilir ve yapay kromozom maya konak hücresine sokulur.

66 SnBaI ile kesilir

67 Memeli yapay kromozomları, kromozomların fonksiyonel bölgelerini taşıyan ve hücreden bağımsız olarak çoğalabilen moleküllerdir. MAC yüzlerce kb büyüklüğünde genomik DNA taşıyabilir.

68 İnsan hücresindeki tek kopyalı bir memeli yapay kromozomu

69 Sentromer, telomer ve replikasyon orjini bir araya getirilerek oluşturulan MAC, kromozomların fonksiyonu, mitoz ve mayoz daki stabilitelerinin araştırılmasında ve memeli hücrelerine büyük genlerin aktarılmasında kullanılır. MAC temelli gen aktarım sistemi, BAC kökenlidir. MAC teknolojisinin gelişmesi; insan aneuploidi modellerinin kurulmasında, hücresel sistemde daha bol protein üretilmesinde ve gen terapisi için alternatif yöntem geliştirilmesinde yarar sağlayabilir.

70 MAC oluşumu, YAC a göre çok daha zordur.çünkü memeli telomeri maya telomerinden kat; memeli sentromeri ise maya sentromerinden yaklaşık 1000 kat daha büyüktür. Memeli sentromer ve telomer dizilerinin çok fazla sayıda tekrarlanması da memeli yapay kromozomu oluşturulmasını zorlaştırır. Bunlar hem E. coli, hem de ökaryot konakta çoğalan vektörlerdir.

71 İnsan yapay kromozomları; YAC sisteminin bir başarısı olarak geliştirilmiştir. HAC'lar, insan DNA dizileri, sentromer, telomer ve replikasyon noktasının olması ile gen tedavisi için avantajları olan bir vektördür.

72 Human Artificial Chromosomes

73 HAC ın avantajları; Daha büyük insan DNA'sı taşıması Stabiliteyi sağlayacak sentromer dizisinin olması Kromozom yapısının degradasyonunu önleyen telomer dizilerinin olması DNA replikasyon noktası ile bir hücre siklusundan diğerine replikasyonu düzenleyebilmesi

74 6-10 Mb uzunluğundadır. Transfer; liposomlar, reseptörler ile veya in vivo olarak da oluşturulabilir. Gen ekspresyonu çalışmalarında çok yararlı bir vektör olarak kullanılır. Keşfi, 1997 yılında olmuştur.

75 İfade vektörleri, seçilen bir proteinin birçok kopyasını konak hücrede üretmek için düzenlenmiş olan vektörlerdir. İfade vektörleri hem prokaryotik hem de ökaryotik konak hücrelerinde kullanılabilir.

76 pet, E.coli konak hücresinde kullanılan bir ifade vektörüdür. Bu vektörü kullanmak için; ifade edilecek olan gen, vektörün polylinker bölgesi içine klonlanır, T7 viral promotorunun ve bakteri lac operatörünün yanına yerleştirilir. Konak hücre genomu T7 viral polimerazı, lac operatörü taşıyacak şekilde değiştirilmiştir.

77 Polylinker bölge; İfade edilecek gen buraya yerleştirilir. Lac operonu T7 viral promotoru

78 Rekombinant plasmid konak hücreye sokulduktan sonra, laktoz analoğu IPTG nin ortama ilave edilmesiyle genlerin ifadesi indüklenir. IPTG, baskılayıcı proteini lac operatöründen uzaklaştırarak, bakteri kromozomundaki T7 polimeraz geninin ve polylinker bölgesindeki genin aktivasyonunu sağlar. T7 polimeraz, T7 promotoruna bağlanır ve polylinker bölgeye sokulmuş olan geni transkribe ederek söz konusu proteinin büyük miktarlarda sentezini sağlar.

79 Genler ökaryotik hücrelere aktarılabilir. Mayanın yanı sıra, hem bitki hem de hayvan hücreleri, çevrelerinden DNA moleküllerini içlerine alabilirler. YAC gibi çok farklı tipteki vektörler, ökaryotik hücrelere DNA aktarımında kullanılabilir. Eğer vektör bir plasmid ise, DNA aktarımı transformasyon; eğer vektör bir virüs ise transfeksiyon terimleri bir konağa DNA aktarımını tanımlar.

80 Prokaryotlar - Bakteriler Ökaryotlar - Bitki hücreleri - Memeli hücreleri

81 Yüksek yapılı bitkilere gen aktarmak için plasmid vektörler kullanılır. Toprak bakterisi Agrobacterium tumifaciens, bitki hücrelerini enfekte eder ve birçok farklı bitki türlerinde gal adı verilen tümörler oluşturur. Tümör oluşumu, bakterinin taşıdığı tümörindükleyici (Ti) plasmidi sayesinde olur.

82 T-DNA bölgesi, antibiyotik direnç genleri, restriksiyon enzimleri kesim bölgesi, replikasyon orjini ve klonlanmış parçanın konak bitki hücresinden alınmasını sağlayan lambda cos dizisi de içerir.

83 Ti plasmidi taşıyan bakteriler bitki hücrelerini enfekte ettiğinde, Ti plasmidinin T-DNA kısmı, konak bitki hücresinin genomuna aktarılır. T-DNA sındaki genler, tümör oluşumunu ve bakterinin büyümesi için gerekli olan bileşenlerinin sentezini kontrol eder. Yabancı genler, T-DNA parçasının içine sokulur ve A. tumifaciens in bitkiyi enfekte etmesiyle, rekombinant plasmid bitki hücrelerine aktarılır. T-DNA konak hücre kromozomuna katıldığında, yabancı DNA da bitki genomuna girmiş olur.

84

85 Rekombinant Ti plasmidini taşıyan bitki hücreleri, kültür ortamında callus olarak bilinen hücre kitlesi oluşturarak büyüyebilir. Kültür ortamını değiştirerek, callus ların kök ve sürgün oluşturması ve giderek yabancı geni taşıyan olgun bitkinin oluşumu sağlanabilir. Yabancı DNA taşıyan bitkiler ya da hayvanlar gen aktarımlı (transgenik) organizmalar olarak adlandırılır.

86 Transgenik bitki oluşumu

87 DNA, memeli hücrelerine çeşitli yollarla aktarılabilir. Yapay zar yapıları (lipozomlar) içine hapsedilen DNA nın, hücre zarından füzyonu ile memeli konak hücresi içine aktarımı gerçekleştirilebilir. YAC ya da retrovirüsler ile oluşturulan vektörler kullanılarak da DNA aktarımı yapılabilir.

88 YAC vektörü, farelerin eşey hücrelerine gen aktarımının verimliliğini arttırmaktadır. Transgenik fare oluşturmak için, döllenmiş yumurta ya da embriyonik kök hücre çekirdeğine YAC vektörü aktarılır. Vektörü çeşitli yollarla farelere aktarmak mümkündür. YAC DNA sı, fare yumurta hücresine mikroenjeksiyon yoluyla sokulabilir. Transgenik zigot daha sonra gelişmesi için üvey anneye implante edilir.

89 Fare yumurta hücresine mikroenjeksiyon

90 Memeli hücreleri için kullanılan bir diğer vektör retrovirüslerdir. Genomları tek zincirli DNA veya RNA dan oluşur. Konak hücreyi enfekte ettikten sonra RNA, revers transkriptaz enzimiyle çift zincirli DNA molekülüne çevrilir. Bu DNA, konak genomuna katılır ve hücre bölünmesi sırasında yavru hücrelere aktarılır.

91