KROMONİL TİYAZOLİDİNDİON TÜREVLERİNİN ALDOZ REDÜKTAZ VE SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMLERİNİN AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİLERİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ KROMONİL TİYAZOLİDİNDİON TÜREVLERİNİN ALDOZ REDÜKTAZ VE SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMLERİNİN AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİLERİ Neda AMİRZADEH KHİABANİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2010 Her hakkı saklıdır

2 TEZ ONAYI Prof. Dr. Özlem YILDIRIM danışmanlığında, Neda AMİRZADEH KHİABANİ tarafından hazırlanan KROMONİL TİYAZOLİDİNDİON TÜREVLERİNİN ALDOZ REDÜKTAZ VE SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMLERİNİN AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİLERİ adlı tez çalışması 15/06/2010 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği / oy çokluğu ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman : Prof. Dr. Özlem YILDIRIM (Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü) Eş Danışman : Doç. Dr. Net DAŞ EVCİMEN (Ankara Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Biyokimya Bölümü) Jüri Üyeleri: Başkan: Doç. Dr. Emel EMREGÜL (Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya Bölümü) Üye : Doç Dr. Nesrin ÖZSOY (Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü) Üye : Doç. Dr. Nursel GÜL (Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü) Üye : Doç. Dr. Emel EMREGÜL (Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya Bölümü) Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof.Dr.Orhan ATAKOL Enstitü Müdürü

3 ÖZET Yüksek lisans tezi KROMONİL TİYAZOLİDİNDİON TÜREVLERİNİN ALDOZ REDÜKTAZ VE SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMLERİNİN AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİLERİ Neda AMİRZADEH KHİABANİ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman : Prof. Dr. Özlem YILDIRIM Eş Danışman : Doç. Dr. Net DAŞ EVCİMEN Çalışmamızda kromonil tiyazolidindion türevlerinin aldoz redüktaz ve süperoksit dismutaz enzimlerinin aktivitesi üzerine etkisi araştırılmıştır. Aldoz redüktaz enziminin aktivitesi hiperglisemi ile karakterize edilen diabetes mellitusda böbrek medullası, siyatik sinirler ve lensde artmaktadır. Bu durum dokularda diyabetik nefropati, nöropati, retinopati ve katarakt oluşumuna yol açmaktadır. Bu komplikasyonların oluşumunu engellemek veya geciktirmek amacıyla çok sayıda farklı aldoz redüktaz inhibitörleri bulunmuştur. Ancak, bunlar gösterdikleri bazı yan etkiler nedeni ile henüz kullanılmamaktadır. Bu nedenle, günümüzde halen yan etkilere neden olmayan aldoz redüktaz inhibitörlerinin tasarımına devam edilmektedir. Çalışmamızda, aldoz redüktaz enzimi sığır lenslerinden saflaştırılmıştır. Daha sonra 17 adet kromonil tiyazolidindion türevinin aldoz redüktaz ve süperoksit dismutaz enzimleri üzerine olası etkileri incelenmiştir. Buna göre, aldoz redüktaz enzimi üzerine, en fazla inhibisyon % oranında 5-(4-Okso-4H-kromen-2-il metilen)-tiyazolidin-2,4-dion isimli inhibitör maddede görülmüştür. Süperoksit dismutaz enzimi üzerine en yüksek aktivatör etki ise, % oranı ile 3-Etil-5-(4-okso-4H-kromen-3-il metilen)- imidazolidin-2,4-dion isimli inhibitör maddede gözlenmiştir. Haziran 2010, 129 sayfa Anahtar Kelimeler: Aldoz redüktaz, kromonil tiyazolidindion türevleri, diyabetik komplikasyonlar i

4 ABSTRACT Master of Thesis THE EFFECTS OF CHROMONIL THIAZOLIDINEDIONE DERIVATIVES ON ALDOSE REDUCTASE AND SUPEROXIDE DISMUTASE ENZYMES ACTIVITY Neda AMIRZADEH KHIABANI Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor : Prof. Dr. Özlem YILDIRIM Co Supervisor : Doç. Dr. Net DAŞ EVCİMEN In our study, the effects of chromonil thiazolidinedione derivatives on aldose reductase and superoxide dismutase enzymes activity were investigated. In diabetes mellitus, aldose reductase activities were increased in lens, kidney and nerve tissues. Hyperglycemia causes diabetic retinopathy, nephropathy, neuropahty and cataract formation in these tissues. For prevention or delay the formation of these pathological events a great of number aldose reductase inhibitors were found. However, these inhibitors could not be used as drugs because of their side effects. For these reason, nowadays the design of the aldose reductase inhibitors which do not cause side effects is still carried on. In our study, aldose reductase enzyme was purified from bovine lens tissues. Then, the probable inhibitory effects of 17 different chromonil thiazolidinedione derivatives on aldose reductase and superoxide dismutase enzymes were investigated. Depending upon the results the most aldose reductase inhibitory activity was found at the ratio % in 5-(4-Oxo-4H-chromen- 2-il metilen)-thiazolidine-2,4-dione. The most acivatory effect on superoxide dismutase was found at the ratio % in 3-Etil-5-(4-okso-4H-kromen-3-il metilen)-imidazolidin-2,4-dion. June 2010, 129 pages Key Words: Aldose reductase, chromonil thiazolidinedione derivatives, diabetic complications ii

5 ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR Bu çalışmada diabetes mellitusa bağlı olarak gelişen ikincil hastalıklardan başta katarakt olmak üzere diğer hastalıklarında oluşumunu engellemek veya geciktirmek amacıyla Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya Anabilim dalı tarafından sentez edilen kromonil tiyazolidindion türevleri olan aldoz redüktaz inhibitörlerinin sığır lensinden izole edilen aldoz redüktaz ve süperoksit dismutaz enzimleri üzerine etkileri in vitro ortamda araştırılmıştır. Yüksek lisansa kabul edildiğim ilk günden bugüne kadar her zaman yanımda olan, bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan ayrıca sabır ve hoşgörüsünü benden esirgemeyen değerli danışman hocalarım Prof. Dr. Özlem YILDIRIM ve Doç. Dr. Net DAŞ EVCİMEN e çok teşekkür ederim. Bununla birlikte hem tez çalışmamda hem de laboratuvar çalışmalarımda benden desteklerini esirgemeyen başta değerli danışman hocalarım Prof. Dr. Özlem YILDIRIM (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji A.B.D) ve Doç. Dr. Net DAŞ EVCİMEN e (Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya A.B.D), Prof. Dr. Rahmiye ERTAN (Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya A.B.D), Prof Dr. Oya BOZDAĞ DÜNDAR (Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya A.B.D), Dr. Ecz. Meltem CEYLAN ÜNLÜSOY (Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya A.B.D), ayrıca Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya A.B.D da görevini sürdürmekte olan değerli arkadaşım Uzm. Biyolog Mutlu SARIKAYA ya teşekkür ederim. Yaşamım boyunca gerek maddi ve gerekse manevi yönden desteklerini benden esirgenmeyen sevgili aileme ve tüm arkadaşlarıma da teşekkürü bir borç bilirim. Neda AMİRZADEH KHİABANİ Ankara, Haziran 2010 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ...vi ŞEKİLLER DİZİNİ...x ÇİZELGELER DİZİNİ...xiv 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Aldo-Keto Redüktaz Süper Ailesi Aldoz Redüktaz Enzimi Aldoz Redüktaz Enziminin Dokulardaki Konsantrasyonları Poliyol Yolağı Diabetes Mellitus Diabetes mellitusun sınıflandırılması Tip 1 diyabet Tip 2 diyabet Gestasyonel diabetes mellitus Diyabet Komplikasyonları Mikrovasküler komplikasyonlar Diyabetik retinopati Diyabetik nöropati Diyabetik nefropati Makrovasküler komplikasyonlar Hiperglisemiye Bağlı Hasarların Mekanizmaları Artan poliyol yolağı akışı İleri glikasyon son ürünlerinin oluşumu Protein kinaz C yolağı Heksozamin yolağı...37 iv

7 2.8 Aldoz Redüktaz Enziminin Diğer Hastalıklarla Olan İlişkisi Aldoz Redüktaz İnhibitörleri Süperoksit Dismutaz Enziminin Yapısı ve fonksiyonu Diyabet ve Oksidatif Stres MATERYAL VE YÖNTEM Kullanılan Cihazlar Kullanılan kimyasal maddeler Denekler Yöntem Aldoz redüktaz enziminin izolasyonu Aldoz redüktaz aktivite tayini Aldoz redüktaz protein miktar tayini Süperoksit dismutaz enziminin izolasyonu Süperoksit dismutaz aktivite tayini BULGULAR TARTIŞMA VE SONUÇ...88 KAYNAKLAR...94 ÖZGEÇMİŞ v

8 SİMGELER DİZİNİ ADA Amerikan Diyabet Birliği (American Diabetes Association) AGEs İleri Glikasyon Son ürünleri (Advanced Glycation End-products ) AKRs Aldo-Keto Redüktazlar ALR2 Aldoz redüktaz Anti-GAD Glutamikasit Dekarboksilaz-Antikoru ARE Antioxidant Response Elements Arg Arjinin (Arginine) ARL-1 Aldoz Redüktaz Benzeri protein-1 Asn Asparjin (Aspargine) Asp Aspartik asit (Aspartic acid) BAEC Sığır Aort Endotel Hücreleri (Bovine Aortic Endothelial Cells) BH 4 Tetrahidrobiyopterin BSA Sığır Serum Albumin (Bovine Serum Albumine) COX Siklooksigenaz (Cyclooxygenase) Cys Sistein (Cysteine) DAG Diaçilgliserol DCL Diklorosalisilik asit (Dichlorosalicylic acid) DDC Dietelditiyokarbamat (Dietheldithiocarbamate) DM Diabetes Mellitus DMF Dimetil Formamid DN Diyabetik Nöropati (Diabetic Neuropathy) DR Diyabetik Retinopati (Diabetic Retinopathy) E.C. Enzim Komisyonu ECM Ekstraselüler Matriks EC-SOD Ekstraselüler Süperoksit Dismutaz enos Endotelyal Nitrik Oksit Sentaz ET-1 Endotelin-1 FGF Fibroblast Büyüme Faktörü vi

9 GDM GFAT GFH Gln GSH HDL His IAAs ICAM ICAs IDDM IFG IGF IGT ILs IRMA Leu Lys MA MAPK MODY NAD NADH NADP NADPH NF-κB NIDDM Gestasyonel Diabetes Mellitus Glutamin:Fruktoz-6-fosfat Amidotransferaz (Glutamine:Fructose-6- phosphate Amidotransferase) Glomerüler Filtrasyon Hızı Glisin (Glycine) İndirgenmiş Glutatyon High Density Lipoprotein Histidin (Histidine) İnsülin Otoantikorları (Insulin Auto Antibodies) Hücre içi Adezyon Molekülü (Intracelular Adhesion Molecule) Adacık Hücre Antikorları (Islet Cell Antibodies) İnsüline Bağımlı Diyabet (Insulin Dependent Diabetes Mellitus) Bozulmuş Açlık Glukozu (Impaired Fasting Glucose) İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü Bozulmuş Glukoz Tolerans (Impaired Glucose Tolerans) İnterlökinler İntra Retinal Mikrovasküler Anormalik Lösin (Leucine) Lizin (Lysine) Mikroanevrizma Mitojenle Aktive edilen Protein Kinaz (Mitogen Activated Protein Kinase) Gençlerde Erişkin Başlangıçlı Diyabet (Maturity Onset Diabetes of Young) Okside Nikotinamit Adenin Dinükleotit İndirgenmiş Nikotinamit Adenin Dinükleotit Okside Nikotinamit Adenin Dinükleotit Fosfat İndirgenmiş Nikotinamit Adenin Dinükleotit Fosfat Nükleer Faktör Kappa B İnsüline Bağımlı Olmayan Diyabet (Non-Insulin Dependent vii

10 NO NPDR OGTT ONOO oxldl PAI-1 PARP PDR PGE2 Phe PKC PLA2 Pro RAGE ROT Ser STAT-JAK TGF-β TNF-α Trp Tyr T2DM UDP-GlcNAc VCAM-1 Diabetes Mellitus) Nitrik Oksit Non-Proliferative Diyabetik Retinopati Oral Glukoz Tolerans Testi Peroksinitrit Oksitlenmiş Düşük Yoğunluklu Lipoprotein Plazminojen Aktivatör İnhibitör-1 (Plasminogen Activator Inhibitor) Poli (ADP-riboz) Polimeraz (poly(adp-ribose) polymerase) Proliferative Diyabetik Retinopati Prostaglandin E2 Fenilalanin (Phenylalanine) Protein Kinaz C Fosfolipaz-A2 Prolin (Proline) İleri Glikasyon Son ürün Reseptörü (Receptor for Advanced Glycation Endproducts) Reaktif Oksijen Türleri (Reactive Oxygen Species) Serin (Serine) The Janus Kinase (JAK)-Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT) Dönüştürücü Büyüme Faktörü-Beta (Transforming Growth Factorβ) Tümor Nekroz Faktör-Alfa Triptofan (Tryptophan) Tirozin (Tyrosine) Tip 2 Diyabet (Type 2 Diabetes Mellitus) Uridin-5'-difosfat-N-asetilglukozamine Vasküler Hücre Adezyon Molekülü-1( Vascular Cell Adhesion Molecule-1) viii

11 VEGF VSMC WESDR WHO Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (Vascular Endothelial Growth Factor) Vasküler Düz Kas Hücreleri (Vascular Smooth Muscle Cells) Wiskonsin Epidemiyolojik Diyabetik Retinopati Çalışma Grubu (The Wisconsin Epidemiological Study of Diabetic Retinopathy) Dünya Sağlık Örğütü (World Health Organization) ix

12 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 AKR enzimlerinin izoformları ve lipit aldehitlerin metabolizması...3 Şekil 2.2 İnsanda bulunan aldo-keto redüktaz enzimlerinin fitogenetik ağacı...4 Şekil 2.3 İnsandaki aldoz redüktaz enzimine ait genin kromozom üzerindeki lokalizasyonu...5 Şekil 2.4 Normal glisemik ve hiperglisemi şartlarındaki lipit-aldehitlerin oluşumu ve metabolizması : Aldoz redüktaz enziminin rolü...6 Şekil 2.5 Aldoz redüktaz enziminin kristal yapısı...7 Şekil 2.6 NADPH kofaktörünün aldoz redüktaz enziminin aktif merkezine yerleşmesi...9 Şekil 2.7 Aldoz redüktaz enziminin katalitik mekanizması...9 Şekil 2.8 Poliyol (sorbitol) yolağı...11 Şekil 2.9 Poliyol yolağının katarakta olan etkisi...12 Şekil 2.10 ALR2 enziminin hücre sinyal ileti yolakları ile olan ilgisi...13 Şekil 2.11 Diyabetik vasküler komplikasyonların oluşumu...19 Şekil 2.12 Diyabetik retinopati oluşumunun mekanizması...21 Şekil 2.13 Diyabetik retinopatinin patogenezi...23 Şekil 2.14 Reaktif oksijen türlerinin oluşumunu içeren hipergliseminin nöronal dejenerasyona yol açtığı mekanizma...26 Şekil 2.15 Hiperglisemi ile aktive olan yolaklar...29 Şekil 2.16 Aldoz redüktaz enzimi ve poliyol yolağı...31 Şekil 2.17 İleri glikasyon son ürüleri oluşumu...32 Şekil 2.18 Hücre içi ileri glikasyon son ürün öncüllerinin oluşumu ile vasküler hücrelerin hasara uğrama mekanizması...34 Şekil 2.19 Hiperglisemi ile uyarılan PKC aktivasyonu sonucu gelişen hasarlar...36 Şekil 2.20 AKR1B10 nun akciğer hücrelerindeki retinoik asit sinyali üzerine etkisi...40 Şekil 2.21 Aldoz redüktaz enziminin moleküler yüzeyinde inhibitöre uygun şekilde bağlanabilmesi için oluşan değişiklikler...43 Şekil 2.22 Bazı aldoz redüktaz inhibitörlerinin kimyasal yapısı...44 Şekil 2.23 ALR2 enzimi ile inhibitörün (minalrestat) bağlanma bölgeleri...45 x

13 Şekil 2.24 ALR2 enzimi ile inhibitörün (tolrestat) bağlanma bölgeleri...45 Şekil 2.25 ALR2 enzimi ile inhibitörün (kersetin) bağlanma bölgeleri...46 Şekil 2.26 ALR2 enzimi ile inhibitörün (DCL) bağlanma bölgeleri...47 Şekil 2.27 Cu,Zn-SOD enzimin 3 boyutlu yapısı...48 Şekil 2.28 İnsanda bulunan EC-SOD enziminin gen yapısı...50 Şekil 2.29 İnsanda ve farede EC-SOD enzim yapısı...51 Şekil 2.30 LDL modifikasyonu ve köpük hücre oluşumu...53 Şekil 2.31 Oksidatif stres ile indüklenen insülin direnci...54 Şekil 2.32 Peroksinitritin kardiyovasküler hastalıklarına yol açtığı mekanizma...56 Şekil 4.1 Protein miktar tayini standart grafiği...63 Şekil 4.2 Aldoz redüktaz enzimi bazal aktivite grafiği...64 Şekil 4.3 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 5-(4-Okso-4H-kromen-3-il metilen)- tiyazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...69 Şekil 4.4 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 5-(4-Okso-4H-kromen-3-il metilen)- imidazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...70 Şekil 4.5 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 5-(4-Okso-4H-kromen-3-il metilen)-2-tiyoksoimidazolidin-4-onun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...71 Şekil 4.6 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 3-Metil-5-(4-okso-4H-kromen-3-il metilen)- tiyazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...72 Şekil 4.7 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 3-Etil-5-(4-okso-4H-kromen-3-il metilen)- tiyazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...73 Şekil 4.8 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 1,3-Dimetil-5-(4-okso-4H-kromen-3-il metilen)-imidazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...74 Şekil 4.9 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 3-Etil-5-(4-okso-4H-kromen-3-il metilen)- xi

14 imidazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...75 Şekil 4.10 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 3-Metil-2-(metiltiyo)-5-(4-okso-4Hkromen-3-il metilen)-imidazolidin-4-onun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...76 Şekil 4.11 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 3-Etil-2-(etiltiyo)-5-(4-okso-4Hkromen-3-il metilen)-imidazolidin-4-onun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...77 Şekil 4.12 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 5-(4-Okso-4H-kromen-2-il metilen)- tiyazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...78 Şekil 4.13 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 5-(4-Okso-4H-kromen-2-il metilen)- imidazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...79 Şekil 4.14 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 5-(4-Okso-4H-kromen-2-il metilen)-2- tiyokso-imidazolidin-4-onun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...80 Şekil 4.15 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 3-Metil-5-(4-okso-4H-kromen-2-il metilen)-tiyazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...81 Şekil 4.16 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 3-Etil-5-(4-okso-4H-kromen-2-il metilen)-tiyazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...82 Şekil 4.17 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 1,3-Dimetil-5-(4-okso-4H-kromen-2-il metilen)-imidazolidin-2,4-dionun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...83 Şekil 4.18 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 3-Metil-2-(metiltiyo)-5-(4-okso-4Hkromen-2-il metilen)-imidazolidin-4-onun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...84 Şekil 4.19 Aldoz redüktaz inhibitörü olan 3-Etil-2-(etiltiyo)-5-(4-okso-4H- xii

15 kromen-2-il metilen)-imidazolidin-4-onun formülü, molekül ağırlığı, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafiği...85 xiii

16 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Dokularda bulunan aldoz redüktaz konsantrasyonları...10 Çizelge 2.2 Diabetes mellitusun etiyolojik sınıflandırılması...15 Çizelge 2.3 Diyabetik komplikasyonların sınıflandırılması...20 Çizelge 2.4 NPDR sınıflandırılması...22 Çizelge 2.5 Diyabetik nöropati sınıflandırılması...25 Çizelge 2.6 Aldoz redüktaz inhibitörlerinin sınıflandırılması...42 Çizelge 4.1 Kromonil tiyazolidindion türevlerinin aldoz redüktaz enzim aktivitesi üzerine etkileri...65 Çizelge 4.1 Kromonil tiyazolidindion türevlerinin aldoz redüktaz enzim aktivitesi üzerine etkileri (devam)...66 Çizelge 4.1 Kromonil tiyazolidindion türevlerinin aldoz redüktaz enzim aktivitesi üzerine etkileri (devam)...67 Çizelge 4.2 Kromonil tiyazolidindion türevlerinin süperoksit dismutaz enzim aktivitesi üzerine etkileri...86 xiv

17 1. GİRİŞ Hiperglisemi ile karakterize edilen diabetes mellitus hastalığında glukozun, insülinden bağımsız olan dokulara (böbrek, sinir, lens, endotelyal hücre) girişinin artması, poliyol yolağının ilk enzimi olan aldoz redüktaz enziminin aktivitesinin artışına neden olmaktadır. Normal koşullar altında bu yolak, hücrelerin osmolitik dengesini sağlamakta, enerji ihtiyacını karşılamakta ve toksik yapıdaki aldehitleri detoksifiye etmektedir. Ancak, yolağın aktivitesindeki artış hücrelerde sorbitol ve fruktoz gibi metabolitlerin birikimine neden olduğu gibi, protein kinaz C, ileri glikasyon yolağı, heksozamin yolağı gibi yolakların da aktivasyonuna neden olmaktadır. Hücrelerde meydana gelen bu değişimler diabetes mellitusa bağlı olarak gelişen ikincil hastalıklara yani, mikrovasküler (katarak, diyabetik retinopati, nöropati ve nefropati) ve makrovasküler komplikasyonlara (kardiyovasküler, periferal arteriyal ve serebrovasküler hastalıklar) neden olmaktadır. Enzim komisyonu tarafından kodu verilen aldoz redüktaz enzimi, α/β fıçı modelinde ve aktif bölgesi substrat veya inhibitör madde ile etkileşime girebilen hidrofobik ve hidrofilik kısımlar taşımaktadır. İnhibitör maddeler bu bölgeyle ne kadar uyumlu olursa, enzimin aktivitesinin de o oranda azaldığı bilinmektedir. Bu nedenle enzimin inhibisyonu için çeşitli aldoz redüktaz inhibitörleri (karboksilik asit grubu, siklik imid grubu taşıyanlar ve sülfonil nitrometan türevleri) geliştirilerek, diabetes mellitusa bağlı olarak gelişen ikincil hastalıklardan başta katarakt olmak üzere diğerlerinin de oluşumu engellenmek ya da geciktirilmek istenmektedir. Bu amaç doğrultusunda planladığımız tez çalışmamızda, aldoz redüktaz inhibitörü olacak şekilde dizayn edilerek sentezlenmiş, saflaştırılmış ve kimyasal yapıları NMR, Kütle, FT-IR Spektrometreleri ve Elementel Analiz ile aydınlatılmış orjinal tiyazolidindion türevi ilaç etken maddelerinin (A.Ü. Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya ABD öğretim üyeleri Prof. Dr. Rahmiye ERTAN ve Dr. Ecz. Meltem CEYLAN ÜNLÜSOY tarafından sentezlenen) aldoz redüktaz enzimi ve antioksidan savunma sisteminin önemli enzimlerinden olan süperoksit dismutaz enziminin aktivitesi üzerine etkileri in vitro ortamda çalışılmıştır. 1

18 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Aldo-Keto Redüktaz Süper Ailesi Canlı organizmalar, sürekli olarak birçok bileşikte bulunan aldehitler ve ketonlarla etkileşime girmektedirler. Bu bileşikler ilaç metabolizmasında, besin sindiriminde ve kirletici faktörler gibi birçok yapının metabolizmasından ortaya çıkan ara ürünlerdirler (Fornachon ve Fornachon 1965, Bachur 1976, Kasai vd. 1982, Witz 1989, Maser 1995, Eder ve Schuler 2000, Kehrer ve Biswal 2000). Ayrıca, hücre içi lipid peroksidasyonu sonucu da oluşmakta olan aldehitler, ketonlarla birlikte sitotoksik etki göstererek canlı hücrelerin ölümüne yol açmaktadırlar (Bassi vd. 1997, Esterbauer vd. 1982). Bazı aldehitler ise, DNA ile reaksiyona girerek mutajenik etkiler gösterebilmektedirler. Bu teoriyi desteklemek amaçlı yapılan bakteri ve hücre kültürü çalışmalarında DNA-aldehit bileşenlerin ve buna bağlı ortaya çıkan mutasyonların izine rastlanmıştır (Bachur 1976, Esterbauer vd. 1982, Marnett vd. 1985, Chang vd. 1994, Sood ve O Brien 1994, Haynes vd. 2000, Gardner vd. 2003). Organizmalarda, aldehitlerin ve ketonların ölümcül etkilerini önleyebilmek için enzime dayalı çeşitli detoksifikasyon sistemleri geliştirilmiştir (Oppermann ve Maser 2000). Bu sistemler üç sınıfa ayrılmaktadır: 1- Aldehit dehidrogenaz enzimleri aracılığı ile aldehitler ve ketonların aside dönüştürülmesi (Townsend vd. 2001, Sladek 2003), 2- Glutatyon S-transferaz ile glutatyon konjugasyon ürünlerinin oluşturulması (Hayes ve Pulford 1995, Kazi ve Ellis 2002), 3- Aldehitler ve ketonların, alkol dehidrogenaz enzimleri ve aldo-keto redüktaz süper aile enzimleri tarafından alkole indirgenmesi (Wermuth 1985, Jez vd. 1997, Hyndman vd. 2003, Jornvall vd. 2003, Penning 2003). Aldo-keto redüktaz süper ailesi üyeleri (AKRs), (α/β) 8 katlanması ile ortalama amino asitten oluşan, kda ağırlığında olan ve genellikle monomerik yapıda bulunan, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) kofaktörüne bağlı 2

19 oksidoredüktaz enzimleridir (Bohren vd. 1989, Rondeau vd. 1992, Wilson vd. 1992, Bruce vd. 1994, Hoog vd. 1994, El-Kabbani vd. 1995, Wilson vd. 1995). AKR süper ailesi, 15 aile ve toplam olarak 151 protein yapılı enzim içermektedir. Bu enzimler, substratları olan alkanlar ve ketonları, alkol ürünlerine indirgemektedirler (Jez vd. 1997, Jez vd. 1997, Jez ve Penning 2001). Memelilerde, kurbağalarda, bitkilerde, mayalarda, protozoa ve bakterilerde bulunmakta olan AKR lar substrat olarak alifatik aldehitler, lipit aldehitler, monosakkaridler, polisiklik aromatik hidrokarbonlar, prostaglandinler, steroidler, ve izoflavinoid fitoaleksinleri metabolize etmektedirler (Tomlinson vd. 1994), (Şekil 2.1, Penning ve Drury 2007). Şekil 2.1 AKR enzimlerinin izoformları ve lipit aldehitlerin metabolizması (Penning ve Drury 2007) Aldo-keto redüktaz süper ailesi enzimleri genellikle monomerik yapıda bulunurken, son zamanlarda yapılan çalışmalar, AKR2, AKR6 ve AKR7 ailelerinin multimerik yapıda olduğunu ortaya koymuştur (Kelly vd. 2000, Kavanagh vd. 2002, Kozma vd.2002). İnsanda bulunan AKR lar ise, 3 aile olmak üzere AKR1, AKR6 ve AKR7 den ibarettir (Penning ve Drury 2007), (Şekil 2.2). 3

20 Şekil 2.2 İnsanda bulunan aldo-keto redüktaz enzimlerinin fitogenetik ağacı (Barski vd. 2008) 2.2 Aldoz Redüktaz Enzimi Aldoz redüktaz (EC ), NADPH kofaktörüne bağlı olarak birçok karbonil bileşiğin alkole çevirilmesinden sorumlu bir oksidoredüktazdır (Bohren vd. 1989). Bu enzim ilk defa Hers tarafından koyun plasentası ve seminal veziküllerde tayin edilmiştir (Hers 1956, 1957). Ardından da birçok türün doku ve organlarında bulunup test edilmiştir (Bhatnagar ve Srivastava 1992). İnsanda bulunan aldoz redüktaz enzimi, AKR1B1 geni tarafından kodlanan, 7q35 kromozomu üzerinde yer alan, 315 amino asitten oluşan ve 36 kda ağırlığında olan monomerik bir proteindir (Şekil 2.3). Aldoz redüktaz (ALR2) bir sitozolik enzim olarak lens, retina, böbrek, böbrek üstü bezi ve çeşitli üreme organlarında geniş miktarda dağılmış durumdadır (Srivastava vd. 2005). 4

21 Şekil 2.3 İnsandaki aldoz redüktaz enzimine ait genin kromozom üzerindeki lokalizasyonu (Barski vd. 2008) ALR2 nin fiziyolojik fonksiyonu tam olarak bilinmemekle beraber, detoksifikasyon sistemlerinde etkili olduğu düşünülmektedir (Grimshaw 1992, Vander Jagt vd. 1995). ALR2 enzimi, lipid peroksidasyon sürecinde yüksek konsantrasyonda oluşan orta ve uzun zincirli aldehitlerin (C6- C18) yanısıra, glutatyon konjugasyonlarının da indirgenmesinden sorumludur. Bu durum ise, glutatyonlanmış aldehitlerin reaktivitesini azaltarak, savunma mekanizmasına katkı sağlamaktadır (Srivastava vd. 2005) (Şekil 2.4). Ayrıca, gen dizilim bilgilerine göre, ALR2 enzimi steroid metabolizmasında da görev yapmaktadır (Warren vd. 1993). Yapılan araştırmalar, aldoz redüktaz enziminin poliyol yolağında D-glukozun D-sorbitole indirgenmesinden sorumlu olduğunu (Kador 1988) ve bu reaksiyonun hiperglisemide, diabetes mellitusun uzun dönem komplikasyonları ile ilişikili olduğunu savunmaktadırlar (Sarges ve Oates 1993). 5

22 Şekil 2.4 Normal glisemik ve hiperglisemi şartlarındaki lipit-aldehitlerin oluşumu ve metabolizması : Aldoz redüktaz enziminin rolü (Ramana vd. 2001) Tüm diğer aldo-keto redüktaz süper ailesi enzimleri gibi aldoz redüktaz enzimi de (α/β) 8 katlanması ile oluşurken, H1-α-heliks, H2-α-heliks, ilmek A, B ve C yapıları da bu modele eşlik etmektedir (Wilson vd. 1992, Jez vd. 1997), (Şekil 2.5). Aldoz redüktaz enziminin aktif bölgesi, α, β katlanması ile oluşan fıçı yapının karboksil terminalinde yer almaktadır. Bu bölge çok yüksek derecede hidrofobik olmakla beraber, aromatik kalıntılar (Trp20, Tyr48, Trp79, Trp111, Phe121, Phe122 ve Trp219), apolar kalıntılar (Val47, Pro218, Leu300 ve Leu301) ve polar kalıntılardan (Gln49, Cys298 ve His110) oluşmaktadır (El-kabbani vd. 2004). 6

23 Şekil 2.5 Aldoz redüktaz enziminin kristal yapısı (Barski vd. 2008) Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat kofaktörü enzimin aktif bölgesine menteşe gibi bağlanırken (Walsh 1979), kofaktör yapısındaki nikotinamid halkası fıçının iç kısmında ve pirofosfat bölümü ise fıçının kenarında yer almaktadır (Rondeau vd. 1992). Enzimin aktif bölümünde bulunan Tyr 48, His 110 ve Cys 298 aminoasitleri proton verici aminoasit kalıntıları olarak görev yapmaktadırlar. Bu bölgede yapılan mutajenik calışmalar; Cys 298 amino asitinin, nikotinamid halkasının aktif bölümünden uzakta yer aldığını ve aldo-keto redüktaz süper aile enzimleri tarafından kesinlikle korunan bir parça olmadığını gösterdikleri gibi, enzim reaksiyonu için de önemli bir unsur olmadığını ileri sürmektedirler (Petrash vd. 1992). Histidin ise, pk a değerinin 6-7 arasında olduğu (Liu vd. 1993) ve ALR2 dahil olmak üzere aldo-keto redüktaz süper ailesinin bazı enzimlerinde de proton donürü olarak görev yaptığı bilinmektedir (Fersht 1999). Yapılan mutajenik çalışmalarda, His 110 un mutasyon sonucu asparajin (Tarle vd. 1993), glutamin veya alanin (Bohren vd. 1994) ile yer değiştirmesi, enzimin gliseraldehit üzerinde gösterdiği katalitik aktivitede azalmaya neden olduğu 7

24 saptanmıştır. Aldoz redüktazın total enzimatik aktivite kaybı ise, Tyr 48 in fenilalanin ile yer değiştirmesi sonucu gözlenmiştir. Ancak, Tyr 48 in serin ve histidin ile yer değiştirdiği mutasyonlarda ise, enzim az da olsa katalitik aktivite göstermektedir (Bohren vd. 1994). NADPH kofaktörü enzimin aktif bölgesine bağlanırken nikotinamid halkasındaki amid grubu Gln184, Asn163, ve Ser162 kalıntıları ile hidrojen bağı yapar. Ayrıca, kofaktör yapısındaki adenozin halkasının 2'-fosfatı ile enzimin aktif bölgesinde bulunan Lys263 ve Arg269 kalıntıları arasında kurulan tuz köprüleri, kofaktörün enzim üzerindeki kararlılığını arttırmaktadır. Fosfat gurubunun kurmuş olduğu bu tuz köprüleri, enzimin NADH yerine NADPH ı tercih etme sebebini de açıklamaktadır (El-kabbani vd. 1998) (Şekil 2.6). Aldoz redüktaz enziminin aktif bölgesinde bulunan His113 aracılığıyla substratın enzimin aktif bölgesine yerleşmesi ardından başlayan katalitik reaksiyon, iki aşamada gerçekleşmektedir. 1. aşama NADPH ın nikotinamid halkasında yer alan arjinindeki hidrojenin substrattaki karbonil grubun karbonuna transferi ile başlarken nikotinamitin dördüncü karbonu ile van der Waals etkileşimi kuran Tyr50 nin hidroksil grubundan substratın karbonil oksijenine ikinci aşama olan proton transferi ile son bulmaktadır (Şekil 2.7). Katalitik reaksiyonun ikinci aşamasında gerçekleşen proton transferi, Asp45 ile tuz köprüsü kuran Lys80 nin amonyum yan zinciri ile Tyr50 nin hidroksil gurubu arasında kurulan hidrojen bağı tarafından kolaylaştırılmıştır (Lui vd. 1993). Bu şekilde aldehit yapıda bulunan substrat alkole indirgenirken, NADPH kofaktörü de okside forma geçmektedir. Kısaca, ALR2 tarafından gerçekleştirilen bu mekanizma NADPH kofaktörünün bağlanmasıyla başlarken, NADP + ın ayrılması ile de son bulmaktadır (Davidson ve Flynn 1979, Kubiseski vd. 1992). 8

25 Şekil 2.6 NADPH kofaktörünün aldoz redüktaz enziminin aktif merkezine yerleşmesi (El-Kabbani vd. 1998) Şekil 2.7 Aldoz redüktaz enziminin katalitik mekanizması (Barski vd. 2008) 9

26 2.3 Aldoz Redüktaz Enziminin Dokulardaki Konsantrasyonları Antijen-antikor etkileşmesine dayanan bir analiz yöntemi kullanılarak, çeşitli insan dokularından izole edilen sitozolik aldoz redüktaz enzim konsantrasyonları, aşağıdaki çizelgede yer almaktadır (Çizelge 2.1). Bu analize göre, enzim konsantrasyonunun en yüksek olduğu dokular, böbrek medullası, siyatik sinirler ve lens olarak gösterilmiştir. Enzim düzeylerinin diyabetik komplikasyonların hedef dokularında daha yüksek olması, bu komplikasyonların oluşumundan aldoz redüktazın sorumlu olduğunu göstermektedir (Tanimoto vd. 1998). Çizelge 2.1 Dokularda bulunan aldoz redüktaz konsantrasyonları (Tanimoto vd. 1998) 2.4 Poliyol Yolağı Birçok dokuda bulunan aldoz redüktaz enzimi, hücre içi glukozu kullanabilmek için heksokinazlarla doğrudan rekabet etmektedir. Heksokinazların glukoza olan afinitesi aldoz redüktaz enzimine göre çok daha yüksek olduğundan, normal fiziyolojik şartlarda hücre içi glukozun büyük bir kısmı heksokinazlar aracılığıyla glukoz 6-fosfata fosforillenirken, fosforile olmayan glukozun küçük bir bölümü de glukoz 10

27 metabolizmasının alternatif rotası olan poliyol yolağına girmektedir (Kinoshita 1974, Kinoshita vd. 1983, Gonzales vd. 1984). Poliyol yolağının birinci enzimi olan aldoz redüktaz, NADPH varlığında glukozu sorbitole dönüştürmektedir. Sorbitol ise poliyol yolağının diğer bir enzimi olan sorbitol dehidrogenaz aracılığıyla fruktoza dönüşmektedir. Hiperglisemi şartlarında heksokinaz enzimlerinde oluşan doygunluk sonucu hücre içindeki total glukozun 1/3 i (% 33) poliyol yolağı ile metabolize olmaktadır (Kinoshita 1974, Kinoshita vd. 1983, Gonzales vd. 1984) (Şekil 2.8) Şekil 2.8 Poliyol (sorbitol) yolağı (Yabe-Nishimura 1998) Artan poliyol yolağı, hücre içi sorbitolun birikimi sonucu oluşan ozmotik değişikliğin yanısıra (Kinoshita 1986, Dvornik 1987a, b), NADPH ve NAD + miktarlarının azalmasına da neden olmaktadır. Bu durum ise, çeşitli metabolik düzensizliklere (çeşitli kinazların aktivasyonu ve apoptoz regülasyonu gibi) sebep olarak (Evans vd. 2002), diyabetik komplikasyonların hedef organları olan oküler lens, retina, periferik sinir ve böbrek glomerülerinde erken doku hasarın oluşumuna yol açmaktadır (Kinoshita ve Nishimura 1988, Pugliese vd. 1991) (Şekil 2.9). Ayrıca son zamanlarda yapılan deneysel çalışmalar da, poliyol yolağı ile artan glukoz metabolizması sonucu aktifleşen 11

28 p38-mapk (mitojenle aktive edilen protein kinaz) yolağının, sinir iletim hızında hasar oluşturarak diyabetik nöropati gelişimine yol açtığını desteklemektedir (Price vd. 2004) (Şekil 2.10). Şekil 2.9 Poliyol yolağının katarakta olan etkisi (Chethan vd. 2008) Hızlanan poliyol yolağına bağlı olarak artan protein kinaz C aktivasyonu, kan damarlardaki düz kas hücrelerinin göçüne ve aterosklerozun oluşumuna neden olmaktadır. Bu durum ise, yetişkin diyabetik hastaların % nin ateroskleroz komplikasyonları nedeniyle hayatını kaybetme sebebini açıklamaktadır (Nakamura vd. 2001, Suzuki vd. 2001). Ayrıca, artan poliyol yolağı aktivitesi, yükselmiş olan oksidatif stres aracılığıyla endotel hücrelerin hasarına sebep olarak aterosklerotik komplikasyonların gelişiminde de rol oynamaktadır (Oyama vd. 2006). Diğer taraftan 12

29 poliyol yolağı sonucu artan fruktoz miktarları da, ileri glikasyon son ürünlerinin (AGEs) oluşumuna sebep olmaktadır. Oluşan AGE ürünleri ise kovalent modifikasyonlar oluşturarak proteinlerin fonksiyonlarındaki patolojik değişikliklere yol açmaktadırlar (Jerums vd. 2003, Dan vd. 2004). Şekil 2.10 ALR2 enziminin hücre sinyal ileti yolakları ile olan ilgisi (Srivastava vd. 2005) Kalp, kan damarları, isklet kası ya da beyin gibi dokularda aldoz redüktazın aşırı ekspresyonunun, glukoz metabolizması ve ozmotik regülasyondan başka; aşırı demir yükselmesi (Barisani vd. 2000), kalp yetmezliği (Yang vd. 2000), miyokardial iskemi (Shinmura vd. 2000), vasküler inflamasyon (Rittner vd. 1999), restenoz (damar genişletilmesi) (Ruef vd. 2000) gibi proselerle de ilişkili olabileceği düşünülmektedir (Ramana vd. 2002). 2.5 Diabetes Mellitus Diabetes Mellitus (DM), pankreas β-hücrelerindeki insülin sekresyonunda ve / veya insülin etkisinde meydana gelen bozukluklar sonucu ortaya çıkan, yüksek mortalite ve 13

30 morbidite riski taşıyan, kronik hiperglisemi ile karakterize bir metabolik hastalıktır. Diyabetteki kronik hiperglisemi göz, böbrek, sinir, kalp ve kan damarları dahil olmak üzere pekçok organda hasar oluşturmaktadır (Anonymous 2005, Fain 2009, Anonymous 2010). Diyabetin gelişiminde çeşitli faktörler rol oynamaktadır. Bunların en önemlisi pankreatik β-hücrelerdeki otoimmun hasar sonucu oluşan insülin yetmezliği ve bazı anormaliler sonucu periferik hücrelerde oluşan insülin direncidir. Diyabetik kişilerde karbohidrat, yağ ve protein metabolizmasındaki bozuklukların temeli insülin hormonunun hedef dokular üzerindeki yetersiz etkisine dayanmaktadır (Anonymous 2005, 2010). Hipergliseminin belirtileri; aşırı susama (polidipsi), sık idrara çıkma (poliüri), aşırı yeme (polifaji), bulanık görme, ketonüri, glukozüri ve kilo kaybından ibarettir. Bu belirtilerle birlikte, 1) günün herhangi bir saatinde aç veya tok olunmasına bakılmaksızın ölçülen plazma glukoz düzeyinin 200 mg/dl ye eşit veya üzerinde olması, 2) en az 8 saatlik tam açlık sonrası, açlık plazma glukoz düzeyinin 126 mg/dl nin üzerinde olması ve 3) 75g lık oral glukoz tolerans testinde (OGTT) 2.saat sonunda plazma glukoz düzeyinin 200 mg/dl nin üzerinde olması, Amerikan Diyabet Birliği (ADA) tarafından diyabet olarak tanımlanmaktadır (Anonymous 1997). Hastaların büyük bir grubunda, kan glukoz düzeyinin diyabet tanı konulması için yeterince yüksek olmasa da, açlık kan glukoz düzeyinin mg/dl arasında ve 2.saat plazma glukoz düzeyinin mg/dl arasında tespit edilmesi, ADA tarafından sırasıyla Bozulmuş Açlık Glukozu (IFG) ve Bozulmuş Glukoz Toleransı (IGT) olarak tanımlanmaktadır (Anonymous 1997, Anonymous 2004) Diabetes mellitusun sınıflandırılması Amerikan Diyabet Birliği (ADA) raporuna göre, diyabetin etiyolojik sınıflandırılması aşağıdaki çizelgede yer almaktadır (Çizelge 2.2) (Anonymous 2005). 14

31 Çizelge 2.2 Diabetes mellitusun etiyolojik sınıflandırılması (Anonymous 2005) SINIFLANDIRMA I. Tip-1 diabetes mellitus 1. İmmun nedenli 2. İdiyopatik II. Tip-2 diabetes mellitus 1. Periferik insülin direnci ön planda 2. İnsülin sekresyon yetmezliği ön planda III. Gestasyonel diabetes mellitus IV. Diğer spesifik tipler A. β-hücre fonksiyonunun genetik defektleri 1. Kromozom 20, HNF- 4α ( MODY1) 2. Kromozom 7, glukokinaz ( MODY2) 3. Kromozom 12, HNF- 1α ( MODY3) ve diğerleri B. İnsülin fonksiyonunda genetik defektler 1. Tip A insülin direnci 2. Leprechaunism 3. Rabson- Mendenhall sendromu ve diğerleri C. Ekzokrin pankreas hastalıkları 1. Pankreatitler 2. Travmal pankreatektomi 3. Neoplazitler ve diğerleri D. Endokrinopatiler 1. Akromegali 2. Cushing sendromu 3. Glukogonoma ve diğerleri E. İlaç ve kimyasal sebepler 1. Vakor 2. Pentamidin 3. Nikotinik asit ve diğerleri F. Enfeksiyonlar 1. Konjenital rubella 2. Sitomegalovirus enfeksiyonu ve diğerleri G. Otoimmun diyabetin nadir formları 1. Anti- insülin reseptör antikorları 2. Stiff- man sendromu ve diğerleri H. Diğer genetik hastalıklar 1. Down sendromu 2. Klinifelter sendromu ve diğerleri 15

32 2.5.2 Tip 1 diyabet Diyabet populasyonunun % 5-10 unu kapsamakta olan tip-1 diyabette, pankreatik beta hücrelerin otoimmun kaynaklı harabiyeti ile ortaya çıkan mutlak insülin yetmezliği söz konusudur. Tip-1 diyabet, bu grupta yer alan hastaların yaşamlarını sürdürebilmek için insülin enjeksiyonuna bağımlı oldukları, ayrıca küçük yaş grupları ve gençlerde daha sık ortaya çıkması nedeniyle insüline bağımlı diyabet (IDDM) veya gençlik diyabet (Juvenile Onset Diabetes) olarak da adlandırılmaktadır (Atkinson ve Maclaren 1994). Tip-1 diyabet, otoimmun (Tip-1A) ve idiyopatik (Tip-1B) olmak üzere iki alt gruba ayrılmaktadır. Otoimmun hastaların % nın serumunda β-hücre harabiyetine sebep olan adacık hücre antikorları (ICAs), insülin otoantikorları (IAAs), glutamik asit dekarboksilaza karşı gelişen antikorlar (anti GAD 65 ) ve trioz fosfata karşı gelişen antikorlar (IA-2 ve IA-2β) bulunmaktadır (Baekkeskov vd. 1982, Atkinson vd. 1986, Christie vd. 1992, Kaufman vd. 1992, Schmidli vd. 1994, Schott vd. 1994, Cantor vd. 1995, Myers vd. 1995, Lan vd. 1996, Lu vd. 1996). Tip-1 diyabetin, DRB genin etkisinde olan, aynı zamanda da DQA ve DQB genlerine bağlı bulunan insan lökosit antijenleri (HLA) ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (Cantor vd. 1995, Huang vd. 1996). Diğer taraftan da, tip-1 diyabetli hastalarda insülin sekresyonunun az olması veya sentezinin gerçekleşmemesi, plazma C-peptid düzeyinin belirlenmeyecek seviyede olmasına neden olmaktadır. Yani HLA varlığının yanısıra, adacık hücre antikorları pozitif olan ve intravenöz glukagon verildiğinde C-peptid düzeyi yükselmeyen diyabetik hastalar, büyük olasılıkla tip-1 diyabet hastalığına sahiptirler. Tip-1 diyabetteki β-hücre harabiyeti, bebeklerde ve çocukların birçoğunda çok hızlı ilerlerken, çoğu yetişkinlerde daha yavaş ortaya çıkmaktadır (Zimmet vd. 1994). Tip-1 diyabet özellikle çocuklar ve yetişkinlerde ketoasidoz ile tanımlanmaktadır. Uzun süre orta düzeyde seyreden hiperglisemi, enfeksiyon ve stres gibi faktörlerin etkisi ile hızlı bir şekilde akut hiperglisemiye dönüşmekte veya ketoasidozun ortaya çıkmasına yol açmaktadır. Tip-1A lı diyabetik bireyler, Hashimoto tiroiditisi, Graves hastalığı, Addison hastalığı ve Vitiligo gibi otoimmun bozukluklara daha yatkındırlar (Anonymous 2002). 16

33 Otoimmun tipte, genetik eğilim ve çevresel faktörler rol oynarken, idiyopatik tipin etiyolojisinden sorumlu faktörler tam olarak bilinmemektedir. Kalıtsal olarak gelişen tip-1b diyabete sahip hastaların birçoğu kalıcı insülin eksikliğine sahip ve ketoasidoza yatkın kişilerdirler. Ancak, bu kişilerde otoimmun beta hücre harabiyeti ve insan lökosit antijenleri gibi immunolojik bulgular görülmez. Bu hastalar da, tip-1a hastalar gibi yaşamlarını sürdürebilmek için insülin tedavisi görmek zorundadırlar (Banerji ve Lebovitz 1989) Tip 2 diyabet Diyabet popülasyonunun % ini kapsayan tip-2 diyabet; insülinin periferik hücreler üzerindeki etki bozukluğu (insülin direnci) ve insülin sekresyon bozukluğu (insülin yetmezliği) ile karakterize bir hastalıktır. Tip-2 diyabet (T2DM), insüline bağımlı olmayan diyabet (NIDDM) ve yetişkin başlangıçlı diyabet (adult onset diabetes) olarak da adlandırılmaktadır (Reaven vd. 1976, DeFronzo vd. 1979, Turner vd. 1979, Olefsky vd. 1982). Genellikle 40 yaş ve üzeri yaş grublarda ortaya çıkan ve genetik yatkınlığı olan tip-2 diyabet, Afrika lı, Meksika lı ve yerli Amerika lıların yanısıra pasifik adalarında yaşayan insanlarda daha sık görülmektedir. Çoğu hastalarda, kan glukoz düzeyi diyabet tanısı konulması için çok yüksek olmadığından T2DM senelerce gizli kalabilmektedir (Skelly 2006). Hiperglisemi başlangıcı ile T2DM tanısının konulması arasındaki sürecin 9-12 sene arasında değişebileceği bildirilmiştir (Harris vd. 1992). Bu hastalarda, mikrovasküler ve makrovasküler komplikasyonların gelişim riski daha yüksektir (Moss vd. 1984, Fujimoto vd. 1987, Uusitupaa vd. 1993, Kuusisto vd. 1994, Andersson ve Svaardsudd 1995). Tüm tip-2 diyabetik hastalarda, yağ ve kas gibi periferik dokuların insüline yanıt verme yeteneğinin azalmasının yanısıra pankreatik β-hücrelerin insülin yapma ve salgılama gücünün kaybolması sonucu normal kan glukoz hemostazının sağlanamaması, ayrıca karaciğerde artan glikojenoliz sonucu yükselen glukoz metabolizması söz konusudur (Harmel ve Mathur 2004, Skelly 2006). Tip-2 diyabetin gelişimindeki en önemli risk faktörleri obezite, yaşlanma, stres, genetik eğilim ve fiziksel aktivite eksikliği olarak bilinmektedir (Zimmet 1992, Harris vd. 1995). Ayrıca, 17

34 tip-2 diyabet, sık sık gestasyonel diyabetik hastalarda, dislipidemiye veya hipertansiyona sahip kişilerde de ortaya çıkmaktadır (Fujimoto vd. 1987, Zimmet 1992, Harris vd. 1995). Obezite ile insülin direnci arasında doğrudan ilişki olduğu ve tip-2 diyabetik hastaların % nin diyabet öncesi obez olduğu bilinmektedir (Kolterman vd. 1981, Bogardus vd. 1985, Guthrie ve Guthrie 2004, Skelly 2006). Obezitenin en karakteristik özelliği ise yağ dokusunun artmasıdır. Yağ dokusu adiposit olarak adlandırılan lipid dolu hücrelerin gevşek bağlanmasıyla oluşur (Gimble 2003). Yapılan çalışmalar, adipositlerden ve adipositler arasında bulunan bağ dokusu hücrelerinden salgılanan adipokin isimli proteinlerin otokrin, parakrin ve endokrin etkileri olduğunu saptamışlardır (Gimble 2003, Tilg ve Hotamisligil 2006). Obez kişilerde, kandaki trigliseridler gibi zararlı yağların artışı ve yararlı yüksek yoğunluklu lipoproteinlerin (HDL) azalması olarak bilinen dislipidemi görülmektedir (Guthrie ve Guthrie 2004, Skelly 2006). Tip-2 diyabette, kilo kontrolü, diyet, egzersiz ve ilaç kullanımı seçeneklerindeki uygun kombinasyonlar ile kan şekeri kontrol altında tutulabilmektedir (Scarlett vd. 1982, Simonson vd. 1984, Firth vd. 1986, Henry vd. 1986, Wing vd. 1994) Gestasyonel diabetes mellitus Gestasyonel diabetes mellitus (GDM), hamilelik sırasında başlayan veya ilk kez hamilelik sırasında saptanan glukoz intoleransı olarak tanımlanmaktadır (Anonymous 2005, 2009). Gestasyonel diyabet, genellikle hamilelik sırasında salgılanan hormonlara bağlı olarak artan insülin direnci sonucu gelişmektedir. Genellikle hamileliğin ikinci yarısında (üçüncü trimester) ortaya çıkan GDM un, Amerika Birleşik Devletlerindeki hamile bayanlarda görülme sıklığı % 4 olarak bildirilmiştir (Anonymous 2009). Gestasyonel diabetes mellitus, tip-2 diyabet gelişimi için çok güçlü bir prediktör olmakla beraber, doğumdan sonra 10 yıl içindeki tip-2 diyabetin gelişim oranı ise % 70 olarak bilinmektedir (Kim vd. 2002). ADA tarafından GDM için bildirilen risk 18

35 faktörleri ise, glukozüri, obezite, birinci derece aile bireylerinde diyabet öyküsünün bulunması şeklindedir (Anonymous 2009, 2010) 2.6 Diyabet Komplikasyonları Diyabet hastalığının yüksek morbidite ve mortalite oranı, hastalığın ileri döneminde gelişmekte olan mikrovasküler ve makrovasküler komplikasyonlardan kaynaklanmaktadır (Brownlee 2001). Diyabetik komplikasyonların gelişiminde, hipergliseminin yanısıra diyabet süresi, yaş, hasta soygeçmişindeki komplikasyon öyküsünün varlığı, dislipidemi, hipertansiyon ve sigara gibi faktörler de rol oynamaktadırlar (Rossing vd. 2002). Hiperglisemi sonucu pekçok biyokimyasal yolakta meydana gelen değişikliklere bağlı olarak diyabetik komplikasyonlar oluşmaktadır (Şekil 2.11). Diyabetik komplikasyonların sınıflandırılması çizelge 2.3 de gösterilmektedir. Şekil 2.11 Diyabetik vasküler komplikasyonların oluşumu (Johansen vd. 2005) 19

36 Çizelge 2.3 Diyabetik komplikasyonların sınıflandırılması (Braunvvald vd. 2004) DİYABETİK KOMPLİKASYONLARIN SINIFLANDIRILMASI I. Akut (metabolik) komplikasyonlar - Hipoglisemi - Hiperozmolar non-ketotik koma - Diyabetik ketoasidoz - Laktik asidoz II. Kronik (dejeneratif) komplikasyonlar A. Mikrovasküler komplikasyonlar - Diybetik retinopati - Diyabetik nöropati - Diyabetik nefropati B. Makrovasküler komplikasyonlar - Hipertansiyon - Kroner arter hastalığı - Serebrovasküler hastalığı C. Diğer kronik komplikasyonlar - Gastrointestinal - Genitoüriner (seksüel disfonksiyon, üropati) - Dermatolojik - Kemik ve mineral metabolizma bozukluklar - Diyabetik ayak - Piskolojik problemler ve psikiyatrik bozukluklar Mikrovasküler komplikasyonlar Hiperglisemiye bağlı olarak diyabet süresi uzadıkça, kapiler membran kalınlaşması, kapiler permeabilite, kan akımı ve viskozitesinde artış ve trombosit fonksiyonlarında bozulmalar gözlenir. Bunun sonucunda mikroalbuminüri, mikrotrombus ve iskemik hasarlar meydana gelmektedir. Bu hasarlar mikrovasküler komplikasyonların oluşumuna yol açmaktadır. Mikrovasküler komplikasyonlar diyabetik retinopati, nöropati ve nefropati olarak sınıflandırılmaktadır (Sato 1992, Lee vd. 1995, Oates 2002, Reddy vd. 2008). 20

37 Diyabetik retinopati Diyabetik retinopati (DR), gözün ışığı algılamasını sağlayan retina tabakasının kan damarlarındaki değişikliklerle karakterize bir hastalıktır (Şekil 2.12). Tüm görme kaybı nedenleri arasında ilk sırada görülen diyabetik retinopati, batılı ülkelerinde özellikle çalışan kişilerde daha sık görülmektedir (Klein vd. 1984). Ancak tüm dünyada, en yüksek diyabetik vakaya, ayrıca DR nedeniyle görme yeteneğini yitiren hasta sayısına sahip ülke Hindistan dır (Kumar 1998). Dünya Sağlık Örgütü (WHO) raporuna göre Hindistan da 31.7 milyon diyabetik vaka saptanmıştır ve bu sayının, 2030 yılı itibariyle 79.4 milyon kişiye yükselmesi beklenmektedir (King vd. 1998). Şekil 2.12 Diyabetik retinopati oluşumunun mekanizması (Kowluru ve Chan 2007) Amerikan Diyabet Birliği araştırmalarına göre, diyabetik retinopati nedeniyle her yıl 12,000 ile 24,000 arasında değişen sayıda ve özellikle yaş aralığındaki kişilerde görme kaybı görülmektedir (Anonymous 2006). Tip-2 diyabetik hastaların % 60 tan 21

38 fazlasında (20 seneye aşkın diyabetik hastalığı olan kişilerde) ve nerdeyse tip-1 diyabetik hastaların tümünde, diyabetik retinopati bildirilmiştir (Klein vd. 1984a, b, Fong vd. 2004). Tip-1 diyabet tanısı konulduğunda, hastalardaki diyabetik retinopati yaygınlığı % 0-3 oranında iken, T2DM larda bu oran % a yükselmektedir (Williams vd. 2004, Anonymous 2005). Wiskonsin Epidemiyolojik Diyabetik Retinopati Çalışma Grubunun (WESDR) raporuna göre, tip-1 diyabetik hastalarda 9-10 sene arasındaki süreçte diyabetik retinopatinin yaygınlık oranı % 74 e yükselirken, sene içindeki yaygınlık oranı ise % 95 i bulmaktadır (Klein vd. 1984a). Amerikan Oftalmoloji Akademisinin sınıflandırmasına göre, diyabetik retinopati proliferatif olmayan DR (NPDR) ve proliferatif olan DR (PDR) olmak üzere iki alt gruba ayrılmaktadır (Anonymous 2003, Goldman ve Ausiello 2004). DR nin erken döneminde gelişmekte olan NPDR, başlangıç DR olarak da bilinmektedir. NPDR, mikroanevrizma, retina içi kanamalar, sert ve yumuşak eksüdalar oluşumu ile karakterize edilen bir aşamadır (Davis 1992, Hudson 1996, Alder vd. 1997, Neely vd. 1998, Fong vd. 2003). NPDR, kendi içinde 3 alt gruba ayrılmaktadır (Anonymous 2003, Goldman ve Ausiello 2004) (Çizelge 2.4). Çizelge 2.4 NPDR sınıflandırılması (Olk ve Lee 1993, Anonymous 2003) Non Proliferatif Diyabetik Retinopati Sınıflandırılması 1. Hafif NPDR: Mikroanevrizma (MA), sert eksüdalar ve retina içi kanamalar göz küresinin 4 kadrandan az bir oranını kapsamaktadır. 2. Orta NPDR: Birden çok MA/hemoraji, sert ve yumuşak eksüdalar, makula ödemi ve venöz değişiklikler görülmektedir. 3. Ağır NPDR: Aşağıda belirtilen durumların herhangi birisinin bulunması (4-2-1 kuralı); - 4 kadranda MA/hemoraji - 2 kadranda venöz lup - 1 kadranda IRMA (intra retinal mikrovasküler anormalik) bulunması ağır NPDR e işaret etmektedir (Olk ve Lee 1993, Anonymous 2003). 22

39 NPDR aşamasındaki mikroanevrizmaların gelişmesi, kapiler duvarı etrafındaki perisit adlı destekleyici hücrelerin azalmasından kaynaklanmaktadır (Kohner ve Dollery 1970). NPDR de meydana gelen damar duvarındaki bozukluklar, kan ve sıvı sızıntısına yol açmaktadırlar. Retina ve retina merkezinde yer alan ve keskin görme bölgesi olan makula damarlarındaki sıvı sızıntısı sonucu makula ödemi ve kan damarlarının tıkanıklığı sonucu da makula iskemisi oluşmaktadır. Damarların tıkanıklığı ile retina yeterince beslenememekte ve oksijensiz kalmaktadır. Daha sonra bu durumu telafi etmek amacıyla birçok yeni damar oluşmaya başlamaktadır (neovaskülarizasyon). Yeni damar oluşumunu içeren aşama, proliferatif retinopati ile karakterize edilmektedir. Ancak, PDR de oluşan yeni damarlar zayıf oldukları için hem retina, hem de vitreousda kanamalara yol açmaktadır. Bu da, görme kaybına neden olmaktadır (Anonymous 2003), (Şekil 2.13). Şekil 2.13 Diyabetik retinopatinin patogenezi (Olmos vd. 2009) 23

40 PDR nin risk faktörleri arasında retinopatinin ilerlemesi, yüksek glikozillenmiş hemoglobin, düşük hematokrit, yüksek trigliserid ve düşük serum albumin miktarlarının yanısıra, diyabetik nöropati özgeçmişi olan bireyler, genç bireyler (tip-1 diyabetik hastalar) ve hafif yada orta nonproliferatif retinopatili kişiler de yer almaktadırlar (Davis vd. 1998) Diyabetik nöropati Diyabetik nöropati (DN), diyabete bağlı periferik duyusal, motor ve otonom sinir liflerinde diffüz veya lokal hasar oluşturan kronik bir komplikasyondur (Boulton vd. 2005). Diyabetin en yaygın komplikasyonlarından biri olan diyabetik nöropati, tip-1 ve tip-2 diyabetik hastaların % sını etkilemektedir (Greene vd. 1997, Boulton 2005, Boulton vd. 2005, Argoff vd. 2006, Hall vd. 2006). Diyabetik komplikasyonların sebep olabileceği en yüksek morbidite ve mortalite oranına sahip olan diytabetik nöropati, hastalarda 1-7 kat daha fazla amputasyon riskini arttırmakta ve 5-10 sene içinde % oranında daha fazla mortaliteye sebep olmaktadır (Vinik vd. 2003). Diyabetik hastaların fiziksel, duygusal ve sosyal hayatlarını olumsuz yönde etkileyen diyabetik nöropati (Jensen vd. 2007), ayak ülserasyonu (Kiziltan vd. 2007) ve amputasyonun yanısıra (Hamalainen vd. 1999, Argoff vd. 2006) retinopati ve nefropati gibi diğer diyabetik komplikasyonlarla da ilişkilidir (Dyck ve Dyck 1993). Ayrıca yapılan çalışmalar, nöropati ve depresif belirtiler arasında doğrudan bağlantı olduğunu ve tip-1 diyabetik hastalar ile kardiyovasküler hastaların, diyabetik nöropati için 2 kat daha fazla risk taşıdığını belirtmektedirler (Tesfaye vd. 2005, Vileikyte vd. 2005). Diyabetik nöropati için birçok sınıflandırma şeması önerilmiştir (Thomas ve Tomlinson 1993). Birçok sınıflandırma klinik semptomlar veya patojenik faktörlere göre yapıldığından çok karmaşık ve kafa karıştırıcı olmaktadır (Thomas 1997). Ancak, Thomas tarafından yapılan anatomik sınıflandırma çok daha basit ve popülerdir (Thomas 1973, Thomas ve Tomlinson 1993, Thomas 1997). Bu sınıflandırmaya göre DN diffüz ve fokal olarak iki ana gruba ayrılmaktadır (Çizelge 2.5). 24

41 Çizelge 2.5 Diyabetik nöropati sınıflandırılması (Thomas 1973, Thomas ve Tomlinson 1993, Thomas 1997) I- Diffüz SINIFLANDIRMA 1- Distal simetrik sensorimotor polinöropati 2- Otonomik nöropati a) Sudomotor b) Kardiyovasküler c) Gastrointestinal d) Genitoüriner 3- Simetrik proksimal alt ekstremite motor nöropati (amiyotrofi) II- Fokal 1- Kranial nöropati 2- Radikülopati/ pleksopati 3- Tuzak (entrapment) nöropati 4- Asimetrik alt ekstremite motor nöropati (amiyotrofi) Diyabetik periferal nöropati, ilk fonksiyonel ve daha sonra yapısal değişiklikler yaparak sinir sistemini bozabilmektedir. Diyabetik periferal nöropatinin ana morfolojik özelliği: a) Miyelinli liflerde, demiyelinizasyon ve akzonal dejenerasyon kombinasyonunu yapmak, b) Miyelinsiz liflerde, dejenerasyon ve rejenerasyonun yanısıra endonöronal mikroanjiyopatiyi oluşturmak ve son aşamada ise c) sinir lif kaybına sebep olmaktır (Malik vd. 2005). Diyabetik ratlarla yapılan çalışmalar, diyabetik nöropati oluşumunda birçok mekanizmanın rol aldığını ileri sürmektedir. Hiperglisemi sonucu hücre içinde artan glukoz, glikozillenmiş karbohidratlar ve ileri glikasyon son ürünlerini oluşturarak oksidatif hasara ve protein kinaz C (PKC) aktivasyonuna sebep olmaktadır (Stevens vd. 1998). Ayrıca hiperglisemi sonucu poliyol yolağında oluşan değişiklikler de, diyabetik nöropati gelişiminde önemli rol oynamaktadır (Şekil 2.14). Poliyol yolağının aktivasyonu sonucu sinir hücrelerinde birikmekte olan sorbitol, hücre içi normal metabolizmalar için gerekli olan miyoinozitol ve tuarin miktarının azalmasına ve yetersiz kalmasına sebep olmaktadır (Greene ve Lattimer 1983). Diyabetik ratlardaki 25

42 yapılan diğer araştırmalarda, miyoinozitol ve tuarinin tükenmesi ile (Na + /K + ) adenozin trifosfataz aktivitesinin azalması ve sinir liflerdeki iletim hızının düşmesinin bağlantılı olduğu tespit edilmiştir (Greene ve Lattimer 1983, Greene vd. 1992, Pop-Busui vd. 1998). Şekil 2.14 Reaktif oksijen türlerinin (ROT) oluşumunu içeren hipergliseminin nöronal dejenerasyona yol açtığı mekanizma (Feldman 2003) 26

43 Diyabetik nefropati Diyabetik nefropati, artan üriner albumin atılımı ve yükselen kan basıncının birleşmesi ile oluşan azalmış glomerüler filtrasyon hızı sonucu gelişen böbrek yetmezliği olarak tanımlanmaktadır. Diyabetik nefropatili hastalarda genellikle retinopati de görülmektedir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, diyabetik nefropati ve kardiyovasküler hastalıklar arasında doğrudan ilişki olduğunu ve kardiyovasküler riskinin albuminüri ile paralel şekilde arttığını ileri sürmektedir. Kardiyovasküler hastalıklar için bağımsız bir risk faktörü olan diyabetik nefropati tüm dünyada böbrek yetmezliği vakalarının en sık nedeni olarak gösterilmektedir (Marshall 2004). İdrar ile ençok atılan protein albumin olarak bilinmektedir. Mikroalbuminüri olarak adlandırılan bu durum, diyabetin başlangıcından itibaren 5-15 yıl içinde ortaya çıkmaktadır. Mikroalbuminüri aşamasından yaklaşık 10 sene sonra ortaya çıkan proteinüri, glomerüler filtrasyon hızında azalmalara neden olarak böbrek yetmezliğine yol açmaktadır. Yapılan çalışmalara göre, normal albumin atılımı olan diyabetik hastalarına karşın diyabetik nefropatili hastalarda, yüksek kan basıncı, retinopati, nöropati, dislipidemi (özellikle düşük yoğunluklu lipoprotein-klosterol miktarlarının azlığı ve trigliseritlerin çokluğu), insülin direnci, sol ventriküler hipertrofisi ve disfonksiyonu daha sık görülmektedir. Kan glukozu ve kan basıncı diyabetik nefropatinin oluşumunda ve ilerlemesinde iki önemli faktör olarak yer almaktadır (Marshall 2004). Diyabetik nefropatide artan üriner albumin atılımının çoğunlukla glomerüler kaynaklı olduğu bilinmektedir. Albuminin idrarda görülmesi için, glomerüler endotel hücreleri, glomerüler bazal membranı ve glomerüler epitel hücrelerinden oluşan glomerüler filtrasyon bariyerinden geçiş yapması gerekmektedir. Yapılan araştırmalara göre artan intraglomerüler basıncının, bazal membrandaki negatif yüklü glikozaminoglikan kaybının, hastalık sürecinin ve bazal membranda artan gözeneklerin boyutunun, albuminürinin oluşumunda etkili olduğu bilinmektedir. Bu çalışmalar tarafından bildirilen mikroskobik anormalikler ise glomerüler bazal membran kalınlaşması, mezanşiyal matriks birikimi ve artan mezanşiyal hücre sayısı şeklindedir (Osterby vd. 27

44 1990). Bu değişiklikler glomerüler filtrasyon hızında (GFH) azalmaya ve proteinüri de artışa neden olmaktadır (Wiwanitkit 2007, Doi vd. 2008). Diyabetik nefropatinin gelişmesi ve ilerlemesinde, hiperglisemi aracılığıyla aktive edilen poliyol yolağı, PKC yolağı, enzimatik olmayan glikasyon ve oksidatif stres yolakları etkili olmaktadır (Kikkawa vd. 2003) Hiperglisemi, ileri glikasyon yolağını aktive ederek AGE ürünlerinin oluşumuna, böbreklerde birikmesine ve renal fonksiyonların bozulmasına sebep olmaktadır (Cooper 1998). Bu ürünler vasküler geçirgenliği artmasını, büyüme faktörlerin ve sitokinlerin sentezlenmesini sağlamaktadır (Lehmann ve Schleicher 2000). Bununla beraber, AGE oluşumu, kollajen IV ve laminin gibi önemli matriks bileşenlerinin fonksiyonel özelliklerini de değiştirmektedir (Agardh vd. 2002). Bir aldoz redüktaz inhibitörü olan epalrestatın, sorbitol birikimini engellediği gibi AGE ürünlerinin oluşumuna da azalttığı bildirilmiştir. Ayrıca, PKC-β2 nin izoformlarını inhibe eden LY isimli bileşiğin hiperfiltrasyon ve albuminüri gibi renal fonksiyonların gelişimini engellediği gösterilmiştir (Cooper vd. 1998) Makrovasküler komplikasyonlar Koroner arter, serebrovasküler ve periferal vasküler hastalıklarını içeren diyabetik makrovasküler komplikasyonlar, diyabetik hastaların mortalitesinden sorumlu olan en önemli faktör olarak bilinmektedirler (Anonymous 1993, Anonymous 2002). Makrovasküler komplikasyonlar, diyabet hastalarının kan damarlarındaki multifaktöriyel nedenlerle oluşan hasarlar sonucu gelişen aterogenez insidansın artışıyla ilişkili olmaktadırlar. Diyabetik hastalarda aterojenik hasara neden olan en önemli tetikleyici faktörler ise, insülin direnci ve dislipidemi olarak bilinmektedir (Assmann vd. 1999). 28

45 2.7 Hiperglisemiye Bağlı Hasarların Mekanizmaları Diyabetik hastalarda, hipergliseminin kronik komplikasyonlara nasıl yol açtığını açıklamaya çalışan dört teori bulunmaktadır; 1) Artan poliyol yolağı akışı, 2) İleri glikasyon son ürünlerinin oluşumu, 3) Protein kinaz C izoformlarının aktivasyonu ve 4) Artan heksozamin yolağı akışı (Brownlee 2001) (Şekil 2.15). Şekil 2.15 Hiperglisemi ile aktive olan yolaklar (Gleissner vd. 2007) 29

46 2.7.1 Artan poliyol yolağı akışı Hiperglisemi sonucu poliyol yolağına kayan glukoz metabolizmasının zararlı etkilerini açıklayan birkaç mekanizma ileri sürülmektedir. Bu mekanizmalar; 1) Sorbitol nedeni ile oluşan oksidatif stres, 2) Azalan (Na +, K + ) ATPaz aktivitesi ve 3) Yükselen NADH/NAD + oranı ile azalan sitozolik NADPH miktarlarıdır. Hücre içinde artan sorbitol, çok güçlü bir hidrofobik ajan olduğundan kolaylıkla hücre membranından geçiş yapamadığı, dolaysıyla da hücre içi redoks potansiyelini değiştirdiği ve hücresel osmolaliteyi arttırdığı düşünülmektedir. Ancak, yapılan çalışmalar diyabetik damar ve sinirlerde ölçülen sorbitol konsantrasyonunun, oksidatif strese sebep olabilmek için çok az ve yetersiz olduğunu ileri sürmektedirler (Brownlee 2001). Yapılan çalışmalarda, poliyol yolağı sonucu azalan (Na + /K + ) ATPaz aktivitesinin fosfotidilinozitol sentezindeki azalmadan ziyade, protein kinaz C aktivasyonundan kaynaklandığı bildirilmiştir. Hiperglisemi ile uyarılan PKC aktivasyonu sonucu artan sitozolik fosfolipaz A 2 (PLA 2 ) aktivitesi, (Na + /K + ) ATPaz inhibitörlerinden olan araşidonat ve prostaglandin E 2 nin (PGE 2 ) yüksek miktarda üretilmesine neden olmaktadır (Xia vd. 1995). Hücre içi NAD + ile gerçekleşen sorbitol oksidasyonu, sitozolik NADH/NAD + oranının yükselmesine ve böylece gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz enzim aktivititesinin inhibisyonuna ve trioz fosfat konsantrasyonun artmasına sebep olmaktadır (Williamson vd. 1993). Artan trioz fosfat konsantrasyonu, hem metilglioksal hem de diaçilgliserol (α-gliserol 3-fosfat aracılığıyla) oluşumunu arttırarak, ileri glikasyon son ürünlerinin oluşumuna ve PKC aktivasyonuna yol açmaktadır. Bunun sonucu reaktif oksijen türleri (ROT) oluşmakta ve proteinlerde modifikasyonlar meydana gelmektedir (Şekil 2.15). Endotel hücrelerinde, hiperglisemi sonucu NAD in mutlak konsantrasyonundaki saptanan belirgin azalma, NAD in NADH e indirgenmesinden daha çok, aktifleşen poli (ADP-riboz) polimeraz enzimi PARP aracılığıyla tüketilmesinden kaynaklanmaktadır (Garcia-Soriano vd. 2001). Hiperglisemi ile gerçekleşen PARP aktivasyonu, reaktif oksijen türlerin üretimindeki artışa aracılık etmektedir. Diğer taraftan, poliyol yolağındaki glukozun NADPH kullanarak sorbitole dönüşmesi, antioksidan savunma sistemi enzimi olan glutatyon redüktazın fonksiyonu için gerekli olan NADPH 30

47 kaynakların tüketilmesine ve hücre içi oksidatif stresin oluşumundaki artışa sebep olmaktadır (Lee ve Chung 1999) (Şekil 2.16). Aldoz redüktaz ekspresyonunun artışı sonucu transgenik fare lenslerindeki indirgenmiş glutatyon miktarının azalması, artan poliyol yolağı sonucu olasılığını düşündürmektedir (Lee ve Chung 1999). Bu teoriyi desteklemek amacı ile yapılan bir çalışmada ise, aldoz redüktaz eksikliği olan diyabetik farelerin sinir hücrelerinde redükte glutatyon düzeylerinde bir değişiklik saptanmamıştır. Köpeklerle yapılan 5 yıllık bir çalışmada, aldoz redüktaz enzim inhibisyonunun diyabetik nöropatiyi önlediği, ancak retina, böbrek ve kastaki kapiler bazal membran kalınlaşmasını önlemekte yetersiz olduğu gösterilmiştir (Engerman vd. 1994). Bunun yanısıra, aldoz redüktazın etkili inhibitörü olan zenarestat ile yapılan plasebo kontrollü denemede, aldoz redüktaz inhibisyonunun diyabetik nöropati üzerinde pozitif etki yaptığı bulunmuştur (Greene vd. 1999). Şekil 2.16 Aldoz redüktaz enzimi ve poliyol yolağı (Brownlee 2001) 31

48 2.7.2 İleri glikasyon son ürünlerinin oluşumu İntraselüler hiperglisemi, diyabetik retina damarlarında (Stitt vd. 1997) ve böbrek glomerülerinde (Horie vd. 1997) yüksek miktarda bulunmakta olan intraselüler ve ekstraselüler ileri glikasyon son ürünlerinin oluşumundan sorumlu tutulmaktadır (Degenhardt vd. 1998). İleri glikasyon son ürünleri, 1) hücre içi glukozun glioksalata oksidasyonu, 2) 1-amino-1-deoksifrüktoz lizinin, amadori ürünü olan 3- deoksiglukozona dönüşmesi veya 3) gliseraldehit 3-fosfat ve dihidroksiaseton fosfatın, metilglioksala fragmentasyonu sonucu ortaya çıkmaktadırlar (Thornalley 1990). Reaktif olan bu intraselüler dikarboniller (glioksal, metilglioksal ve 3-deoksiglukozon) intraselüler ve ekstraselüler proteinlerin amino grupları ile reaksiyona girerek ileri glikasyon son ürünlerini oluştururlar (Brownlee 2001) (Şekil 2.17). İleri glikasyon son ürünlerinin öncülü olan bu 3 bileşik, aldehit redüktaz gibi diğer redüktaz enzimlerinin de substratıdırlar. Ayrıca, metilglioksal ve glioksal öncülleri glioksalaz sistemi tarafından da detoksifiye edilmektedirler (Thornalley 1990, Suzuki vd. 1998). Şekil 2.17 İleri glikasyon son ürüleri oluşumu (Daroux vd. 2010) 32

49 İntraselüler ileri glikasyon son ürünlerinin hedef hürelerdeki oluşturduğu hasar, 3 genel mekanizma ile gerçekleşmektedir; 1) İleri glikasyon son ürünleri ile modifiye olan intraselüler proteinlerin değiştirilmiş işlevi, 2) İleri glikasyon son ürünleri ile modifiye olan ekstraselüler matriks (ECM) bileşiklerin, hücrelerdeki matriks proteini olan integraller ve diğer matriks bileşikleri ile anormal etkileşimleri ve 3) İleri glikasyon son ürünleri ile modifiye olan plazma proteinlerinin, aterogenez ile ilgili olan çeşitli hücre tipleri (endotel, makrofajlar ve vasküler düz kas hücreleri) üzerinde bulunan ileri glikasyon son ürün reseptörlerine (RAGE) bağlanarak reaktif oksijen türlerin üretimine sebep olmaktadırlar (Schmidt vd. 1999, Brownlee 2001, Goldin vd. 2006) (Şekil 2.18). RAGE ligasyonu, transkripsiyon faktörü olan nükleer Faktör kappa B nın (NF-κB) çekirdek içine translokasyonuna ve adezyon molekülleri (Hücre içi adezyon molekülü (ICAM), E-selektin ve vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1)) ile pro inflamasyon faktörlerin (vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), interlökin (IL- )1α, IL-6 ve tümor nekroz faktör-alfa (TNF-α)) transkripsiyonunun artmasına (Goldin vd. 2006), ayrıca NO ve prostasiklin gibi damar gevşetici bileşiklerin azalmasına neden olmaktadır. RAGE uyarımı, NADPH oksidaz enzimini aktive ederek oksidatif stresi arttırmaktadır (Rojas ve Morales 2004, Meerwaldt vd. 2009). İn vitro ve in vivo çalışmalar, AGE ürünlerinin, tip-iv kollajen, laminin, fibronektin gibi yapısal matriks proteinleriyle geri dönüşümsüz çapraz bağlar yaptığını göstermektedir (Wautier ve Guillausseau 2001). Proteinler üzerindeki bu yapısal değişimler bazal membran kalınlaşmasına neden olmaktadır. Bununla birlikte, proteoglikanların ileri glikasyonu, elektronegatif yüklerde değişiklikler oluşturarak bazal membranın seçici filtrasyon özelliklerini değiştirmektedir (Wautier ve Guillausseau 2001). Ayrıca, tip-i ve IV kollajen, matriks proteinleri, düşük yoğunluklu lipoproteinler, fibrin ve kristalin gibi proteinler ile AGE ürünlerinin etkileşimi, diyabetik nöropati, retinopati, nefropati, katarakt ve Alzheimer gibi hastalıklara neden olabilmektedir (Molnar 2006). Diyabetik komplikasyonların patogenezindeki ileri glikasyon son ürünlerinin potansiyel önemi, hayvan modellerinde yapılan gözlemler ile desteklenmektedir. İleri glikasyon son ürünlerinin farklı inhibitörleri ile yapılan bir çalışmada, diyabetik mikrovasküler 33

50 komplikasyonlar sonucu retina, böbrek ve sinirde oluşan çeşitli yapısal ve fonksiyonel düzensizliklerin kısmen önlendiği saptanmıştır (Hammes vd. 1991, Soulis-Liparota vd. 1991, Nakamura vd. 1997). Gelişmiş nefropatiye sahip tip-1 diyabetik hastalardaki incelemeler sırasında kullanılan ileri glikasyon son ürünleri inhibitörü olan aminoguanidinin, üriner protein miktarındaki azalmaların yanısıra, nefropati gelişimini de yavaşlattığı bulunmuştur. Ayrıca, aminoguanidinin diyabetik retinopati gelişimini geciktirdiği yönünde de bulgular elde edilmiştir. Şekil 2.18 Hücre içi ileri glikasyon son ürün öncüllerinin oluşumu ile vasküler hücrelerin hasara uğrama mekanizması (Brownlee 2001) 34

51 2.7.3 Protein kinaz C yolağı Protein kinaz C ailesinin üyeleri, proteinlerin fosforilasyonunu serin ve treonin amino asitleri üzerinden gerçekleştirirler. 11 izoformdan oluşan bu ailenin 8 üyesi diaçilgliserol tarafından aktive edilmektedir (Brownlee 2001, Daş Evcimen ve King 2007). Mikrovasküler hücre kültürlerinde ve diyabetik hayvanların retina ve böbrek glomerülerinde yapılan çalışmalarda, intraselüler hipergliseminin, glikolitik ara ürün olan dihidroksiaseton fosfatın gliserol 3-fosfata redüksiyonu ve kademeli açilasyonu ile de novo DAG sentezin miktarını arttırdığı saptanmıştır (Koya ve King 1998). Ayrıca hiperglisemi, RAGE ligasyonu (Portilla vd. 2000) ve artan poliyol yolağı aktivasyonu ile reaktif oksijen türlerin oluşumunu arttırarak, dolaylı şekilde protein kinaz C izoformlarının aktivasyonuna da sebep olmaktadır (Keogh vd. 1997, Portilla vd. 2000). Kronik diyabetik hayvan modellerinde belirgin aktivasyon gösteren PKC izoformları, PKCα, βi, βii, γ ve δ dan ibarettir (Inoguchi vd. 1992, Idris vd. 2001). Deneysel diyabetik çalışmalarda PKC-β izoformlarının aktivasyonu, nitrik oksit (. NO) üretimini azaltarak ve/veya endotelin-1 aktivitesini arttırarak retina ve böbrekdeki kan akışında anormaliklere neden olduğu bulunmuştur (Ishii ve Jirousek 1996). Hiperglisemi sonucu oluşan PKC nin anormal aktivasyonu, glomerüler nitrik oksidin yanısıra, düz kas hücrelerindeki nitrik oksit üretiminde de azalmaya sebep olmaktadır (Craven vd. 1994, Ganz ve Seftel 2000). Ayrıca, endotel hücre kültürlerindeki PKC aktivasyonu, insülin ile uyarılmış endotel nitrik oksit sentaz (enos) mrna nin ekspresyonunu inhibe etmektedir (Kuboki vd. 2000). Yüksek glukoza maruz kalan endotel hücre kültürlerinin geçirgenliğindeki artışın, PKC-α aktivasyonu aracılığıyla gerçekleştiği düşünülmektedir (Hempel vd. 1997). Bununla birlikte, hiperglisemi ile aktive edilen PKC, düz kas hücrelerinde VEGF ün ekspresyonunu da uyarmaktadır (Aiello vd. 1997, Williams vd. 1997). Hiperglisemi ile indüklenen protein kinaz C aktivasyonu, oluşturduğu kan akımı ve geçirgenlikdeki düzensizliklerin yanısıra, mezanşiyal hücre kültürlerinde ve diyabetik ratların glomerülerinde dönüştürücü büyüme faktörü-β1 (TGF-β1), fibronektin ve tip IV kolajen ekspresyonunu uyararak, mikrovasküler matriks 35

52 proteinlerinin birikimine yol açmaktadır (Studer vd. 1993, Koya vd. 1997). Bu etki büyük olasılıkla PKC tarafından gerçekleşen nitrik oksit üretimindeki inhibisyon ile ortaya çıkmaktadır (Craven vd. 1997). Ancak, mezanşiyal hücre kültürlerindeki hiperglisemi ile uyarılan laminin C 1 ekspresyonu, PKC aktivasyonundan bağımsızdır (Phillips vd. 1999). Hiperglisemi ile uyarılan protein kinaz C aktivasyonu, plazminojen aktivatör inhibitör-1 (PAI-1) ifadelenmesinde artışa (Feener vd. 1996), ayrıca endotel hücre kültürleri ile düz kas hücrelerinde NF-κB aktivasyonuna (Pieper ve Riaz-ul-Haq 1997, Yerneni vd. 1999) ve membranla ilişkili olan çeşitli NADPH a-bağımlı oksidazların regülasyonuna ve aktivasyonuna sebep olmaktadır (Şekil 2.19). PKC-β nın spesifik bir inhibitörü ile yapılan tedavide, diyabetik hayvanların retina ve böbrek glomerülerinde PKC aktivasyonununda belirgin bir azalma ile birlikte, glomerülerdeki filtrasyon hızının normal seviyeye indiği ve idrardaki albümin atılımının kısmen düzeldiği gösterilmiştir (Koya vd. 2000). Şekil 2.19 Hiperglisemi ile uyarılan PKC aktivasyonu sonucu gelişen hasarlar (Brownlee 2001) 36

53 2.7.4 Heksozamin yolağı Hiperglisemi şartlarında, aşırı intraselüler glukozun heksozamin yolağına kayması ile çeşitli diyabetik komplikasyonların görülmesi arasında doğrudan ilişki vardır (Kolm- Litty vd. 1998). Heksozamin yolağı, glikolitik ara ürün olan fruktoz 6-fosfatı glutaminfruktoz-6-fosfat amidotransferaz enzimi (GFAT) aracılığıyla, glukozamin 6-fosfata dönüştürerek, proteoglikan sentezi ve O-linked glikoproteinlerin oluşumu için gerekli olan substratı (uridin-5'-difosfat-n-asetilglukozamin (UDP-GlcNAc)) sağlamaktadır (Brownlee 2001). Sığır aort endotel hücrelerinde (BAEC) yapılan incelemelerde, hiperglisemi ile uyarılan GFAT enzim aktivasyonunun, TGF-β1 ve PAI-1 transkripsiyonu ile ilişkili olduğu bulunmuştur (Du vd. 2000). Bu etki, GFAT inhibitörü olan azaserin tarafından inhibe edilmiştir (Du vd. 2000). Heksozamin yolağının, hiperglisemi ve obezite ile uyarılan insülin direncinin oluşumunda önemli rolü olduğu bilinmektedir (Marshall vd. 1991, Hawkins vd. 1997). Heksozamin yolağının gen transkripsiyonundaki artışa nasıl sebep olduğu tam olarak bilinmemektedir. Bununla birlikte, hiperglisemi ile uyarılan vasküler düz kas hücrelerindeki PAI-1 promotor aktivasyonunun, transkripsiyon faktörü olan Sp1 in bağlanma bölgeleri ile düzenlendiği bilinmektedir (Chen vd. 1998). Heksozamin yolağı aktivasyonu ile PAI-1 genin transkripsiyonundaki değişiklikler arasındaki ilişkinin, Sp1 in N-asetilglukozamin ile kovalent modifikasyonundan kaynaklandığı düşünülmektedir. Glomerüler mezanşiyal hücrelerinde, glukozaminin Sp1 bölgeleri aracılığıyla PAI-1 promotorunun aktivasyonuna sebep olduğu saptanmıştır (Goldberg vd. 2000). Sp1 in glikozile formunun, glikozile olmamış formuna oranla transkripsiyonu daha fazla arttırdığı bildirilmiştir (Kadonaga vd. 1988). O-GlcNAc-β- N-asetilglukozaminidaz enziminin inhibisyonu sonucu oluşan Sp1 in O- asetilglukozaminilasyonundaki 4 kat artış, Sp1 deki serin ve treonin aminoasitlerindeki fosforilasyon düzeyinin % 30 azalmasına neden olmaktadır. Bu bulgu aynı zamanda, Sp1 proteini üzerinde gerçekleşen O-asetilglukozaminilasyon ve fosforilasyonun aynı bölgeler için yarıştığını düşündürmektedir (Haltiwanger vd. 1998). Yapılan 37

54 çalışmalarda, hipergliseminin aortik endotel hücrelerindeki heksozamin yolağı aktivasyonunda 2.4 kat artışa ve sonuç olarak da Sp1 O-linkedGlcNAc düzeyinde 1.7 kat çoğalmaya ve Sp1 O-bağlı fosfoserin ve fosfotreonin miktarında % oranında azalmaya sebep olduğu saptanmıştır (Du vd. 2000). Transkripsiyon faktörlerinin yanısıra, birçok nükleer ve sitoplazmik proteinler de O- linkedglcnac aracılığıyla modifiye olmaktadır. Diyabetik komplikasyonlarda, hiperglisemi nedeniyle enos proteinlerinin Akt bölgelerinde gerçekleşen O- asetilglukozaminilasyon, enos enziminin inhibisyonuna neden olmaktadır (Du vd. 2001). Ayrıca, çeşitli PKC izoformları da membran translokasyonuna gerek kalmadan glukozamin tarafından aktive olmaktadırlar. Hiperglisemi ile uyarılan heksozamin yolağı aktivasyonu, gen transkripsiyonu ve protein fonksiyonundaki değişikliklere yol açarak, diyabetik komplikasyonların gelişimine katkıda bulunmaktadır. Ancak yapılan çalışmalarda, glukozaminin in vivo şartlarda sığır aortik endotel hücrelerinin bariyer fonksiyonunu geliştirdiği ve bu hücrelere THP-1 monosit hücrelerin bağlanmasını % 50 oranında azalttığı bulunmuştur (Duan vd. 2005). Ayrıca, Apoe - / - faresine intraperitonal glukozamin uygulanması yapılan 12 haftalık bir çalışmada da, ateroskleroz lezyonların miktarında orta seviyede bir azalma saptanmıştır (Duan vd. 2005). Sonuç olarak, heksozamin yolağının diyabetik mikrovasküler komplikasyonlarla bağlantılı olduğu, ancak makrovasküler komplikasyonlar ve ateroskleroz ile yeterince ilişkili olmadığı bulunmuştur (Gleissner vd. 2007). 2.8 Aldoz Redüktaz Enziminin Diğer Hastalıklarla Olan İlişkisi Galaktoz ve galaktoz metabolitlerinin birikimi memeli overlerinde hasara neden olmaktadır (Liu vd. 2000). Galaktitol, overlerde ozmotik dengesizlik ve GSH depolarının tükenmesine yol açarak hasar oluşturur. Poliyol yolağı aktivasyonu ise galaktitol üretimi nedeni ile bu hasarın oluşumuna katkıda bulunur. Yapılan 38

55 çalışmalarda, aldoz redüktaz inhibitörlerinin galaktoz bağımlı toksiteyi de önlediği gösterilmiştir (Meyer vd. 1992, Bery 1995). Aldoz redüktaz enziminin fazla miktarda ifadelenmesi, pekçok kanser hücresinde görülmektedir (Kang vd. 2005). Kolon kanserinin temel özelliklerinden biri, icox-2 (siklooksigenaz-2) enziminin aşırı ekspresyonudur. Bu enzim, araşidonik asitten kolon epitel hücrelerinin kontrolsüz bir şekilde çoğalmasını sağlayan prostaglandinlerin sentezini gerçekleştirmektedir. Bu hücrelerde, COX-2 nin transkripsiyonel düzenlenmesi çeşitli büyüme faktörleri (TGF, IGF, VEGF, FGF) ve sitokinler (TNF-α) tarafından sağlanmaktadır. Bununla beraber, büyüme faktörleri ve sitokinler ALR2 enziminde transkripsiyonunu aktive etmektedir (Tammali vd. 2006). TNF-α gibi sitokinler de kolon kanserine yakalanma riskini arttırmaktadır. ALR2 inhibisyonu, TNF-α uyarımlı PKC ve NF-κB nin aktivasyonunu engellemektedir ve böylece COX-2 enzimi ifade edilememektedir. Bu durum ALR2 enziminin, NF-κB nin aktivasyonu için gerekli olduğunu göstermektedir (Tammali vd. 2006, Tammali vd. 2007). Ayrıca, HepG2 ve HeLa hücreleri gibi bazı kanser hücrelerinde ve insan karaciğer kanser hücrelerinde ALR2 ve aldoz redüktaz benzeri protein-1 (ARL-1) in aşırı miktarda sentezlendiği bilinmektedir. ARL-1, ALR2 ile benzer enzimatik aktivasyon göstermektedir. Bununla beraber, göğüs, servikal, ovaryum ve rektal tümörlerde de aldoz redüktaz yüksek düzeyde ifadelenmektedir (Saraswat vd. 2006). ALR2 enzimiyle yaklaşık %71 benzerlik gösteren ve aldoz redüktaz ailesinin bir üyesi olan AKR1B10, çoğu dokuda ifade olmazken, ilk defa ince barsak ve kolon hücrelerinde saptanmış ve karaciğer hücrelerinde de çok az miktarda ifadelendiği bildirilmiştir (Penning 2005). AKR1B10, sigara kullanımına bağlı olarak çoğu adenokarsinomada olduğu gibi, insan karaciğer kanser hücrelerinde ve uterus kanserinde aşırı sentezlenmektedir (Fukumoto vd. 2005, Balendiran vd. 2009). Ayrıca, bu enzim all-trans-retinal molekülünü, all-trans-retinole çevirirken, retinoik asit sinyal oluşumunu engellemektedir (Şekil 2.20). Squamous (yassı hücre) metaplasisinde (doku 39

56 değişimi) bu enzimin aşırı miktarda ifadelendiği bilinmektedir. Bu durum, yassı hücre karsinomanın gelişimine yol açmaktadır (Penning 2005). Şekil 2.20 AKR1B10 nun akciğer hücrelerindeki retinoik asit sinyali üzerine etkisi, RALDH: Retinaldehit dehidrogenaz, ADH: Alkol dehidrogenaz (Penning 2005) 2.9 Aldoz Redüktaz İnhibitörleri Hiperglisemi şartlarında, rat lenslerindeki aldoz redüktaz enziminin sorbitol ve galaktitol gibi poliyolların birikimine ve buna bağlı olarak da ozmotik dengenin değişimine sebep olduğu ilk defa bilim adamı Van Heyningen tarafından ileri sürülmüştür (Van Heyningen 1959). Bu gözlemlere dayanarak yapılan çalışmalarda, ALR2 nin farmakolojik inhibitörlerinin, diyabetik ratlarda ve galaktoza maruz bırakılan tavşanlardaki katarakt oluşumunu iyileştirdiği saptanmıştır (Kinoshita vd. 1968, Varma ve Kinoshita 1976). 40

57 Son 30 yılda, aldoz redüktaz inhibitör etkinliği olan birçok ilaç (sorbinil, statil, tolrestat, zopolrestat vb.) sentezlenip, test edilmiştir (Kador vd. 1985, Dvornik 1992, Tsai ve Burnakis 1993, Pfeifer vd. 1997). Hayvan modellerinde yapılan ilk denemeler, diyabetik komplikasyonların oluşumunun engellenmesi üzerine önemli ve belirgin düzeyde koruma göstermiştir (Pitts vd. 1986, Hotta vd. 1990, Stribling 1990). ALR2 inhibitörlerinin, diyabetik ve galaktozomik kataraktın yanısıra (Kinoshita vd. 1968, Varma ve Kinoshita 1976), diyabetik nefropati (Passariello vd. 1993, Ranganathan vd. 1993) ve nöropatiyi de (Handelsman ve Turtle 1981, Jaspan vd. 1983) iyileştirdiği bulunmuştur. Ancak, Srivastava ve ark lı yılların ortasında, ilaç firmaları tarafından sentezlenmekte olan birçok aldoz redüktaz inhibitörünün spesifik etki yapmadığını ve ALR2 nin yanısıra aldehit redüktaz gibi diğer aldo-keto redüktaz süper ailesi enzimlerini de inhibe ettiğini ileri sürmüşlerdir (Srivastava vd. 1982). Bu bilim adamları ayrıca, galaktozomik ve diyabetik katarakt oluşumundaki poliyolların birikimi sonucu artan ozmotik basıncın, katarakt gelişimindeki en önemli sebep olmadığını belirtmelerinin yanısıra (Srivastava ve Ansari 1988, 1990, Ansari vd. 1994), ALR2 aracılığıyla glukozun indirgenmesinde kullanılan NADPH kaynaklarının tükenmesinden ve reaktif oksijen türleri ile hidroperoksitlerin detoksifikasyonu gibi birçok metabolik yolaklar için gerekli olan NADPH ın yetersiz kalmasından kaynaklandığını ileri sürmektedirler. Bu hipotez, diyabetik ratlardaki antioksidan uygulanması ile yapılan çalışmalar sonucu bulunan önlenmiş diyabetik katarakt oluşumu ile desteklenmektedir. Aldoz redüktaz inhibitörleri ile yapılan klinik denemeler sonucu ortaya çıkan tutarsız veriler, bu ilaçların sadece aldoz redüktaz üzerine değil diğer redüktazlar üzerine de inhibitör etki göstermesi nedeni ile ortaya çıkmaktadır. Bununla birlikte, enzimin posttranslasyonal modifikasyonundan kaynaklanan etkiler de, spesifik inhibisyonun oluşumunu engellenmektedir. Enzimin aktif bölgesinde yer alan tek bir sistein kalıntısının oksidasyonu, hem substrat hem de inhibitör bağlanmalarını regüle etmektedir. Böylece, diyabet hastalığı sırasında oluşan oksidatif modifikasyonlara bağlı olarak aldoz redüktazın inhibitör maddelere olan ilgisi ve duyarlılığı azalmaktadır (Gonzalez vd. 1984, Liu vd. 1993, Bhatnagar vd. 1994). Bugüne kadar ALR2 inhibitör etkinliği gösteren 9 adet ilaç sentezlenmiştir. Ancak, bunların hiç birisi Amerika Birleşik Devletlerinde kullanılmamaktadır. Buna karşın, epalrestat (kinedak) 1992 den 41

58 beri Japonya da diyabetik nöropati ve retinopati tedavisinde kullanılmaktadır (Hotta vd. 2006, Anonymous 2008). Epalrestatın yan etkileri ise, genellikle mide bulantısı, kusma ve ishal olarak bildirilmektedir. Aldoz redüktaz inhibitörleri yapı olarak başlıca üç sınıfa ayrılmaktadır (Oka vd. 2000, Da Settimo vd. 2001, Kurono vd. 2001, Oka ve Kato 2001) (Çizelge 2.6). Çizelge 2.6 Aldoz redüktaz inhibitörlerinin sınıflandırılması (Oka ve Kato 2001) Sınıflandırma İnhibitör madde Kullanım durumu 1) Asetik asit bileşikleri Epalrestat Japonya da kullanılmaktadır. Alrestatin Tolrestat Zenarestat Zopolrestat NZ-314 2) Spirohidantiyonlar Sorbinal Fidarestat 3) Suksinamid AS-3201 (ranirestat) Altda belirtilen diğer tüm bileşikler ise zararlı yan etkilerinden dolayı kullanılmamaktadırlar. Japonya daki satışları durdurulmuştur. Amerika Birleşik Devletlerinde üçüncü faz denemelerinde olmaktadır. Aldoz redüktaz enziminin inhibitöre bağlanması enzimin aktif bölgesinde bulunmakta olan iki domain aracılığıyla gerçekleşmektedir; 1) Hidrofilik domain: Bu bölge hidrojen bağı kurabilmek için kofaktörün yakınında yer almakta ve belli bir dizi içermektedir. 2) Hidrofobik domain: Özgül cebi taşımaktadır (Urzhumtsev vd. 1997). ALR2 enzimin anyonik bölgesi Tyr48, His110 ve NADP dan oluşmaktadır (Harrison vd. 1994). Özgül cep ise, anyonik bağlanma bölgesi ile yan yana olup Trp111, Phe122, 42

59 Leu300 ve Ser302 den meydana gelmektedir (Zandt vd. 2009). Aldoz redüktaz inhibitörlerinin tamamı, fiziyolojik ph larda negatif yüke sahiptirler ve bu negatif yüklü kısımları ile enzimin anyonik bağlanma bölgesine bağlanmaktadırlar. Bu durum ise NADPH kofaktörün okside formu olan NADP + ın inhibitörler tarafından tercih edilme nedenini açıklamaktadır (Podjarny vd. 2004). ALR2 inhibitörleri, enzim yapısının aktif bölgesinde bulunan hidrofobik bölge kalıntıları ile birçok van der Waals bağı kurmaktadırlar (Wilson vd. 1993, Wilson vd. 1995, Steuber vd. 2008). ALR2 enziminin aktif bölgesi, inhibitöre uyum sağlayabilmek için birçok konformasyonel değişiklik yapabilmektedir (Şekil 2.21). Bazı ALR2 inhibitörlerinin kimyasal yapısı aşağıda verilmektedir (Şekil 2.22). Şekil 2.21 Aldoz redüktaz enziminin moleküler yüzeyinde inhibitöre uygun şekilde bağlanabilmesi için oluşan değişiklikler (Urzhumtsev vd. 1997) 43

60 Şekil 2.22 Bazı aldoz redüktaz inhibitörlerinin kimyasal yapısı (Carbone vd. 2009) Minalrestat ile ALR2 kompleksinin kristal yapısı araştırılmıştır (El-Kabbani vd. 2004). Bu araştırmalarda, minalrestatdaki siklik imid halkasının, enzimin aktif bölgesinde yer alan His110 (NE2; 2.8A ), Tyr48 (OH; 2.6A ) ve Trp111 (NE2; 2.8A ) ile hidojen bağı kurduğu, ayrıca bu aminoasit kalıntılarının florobenzil grubuyla da π bağları oluşturduğu bulunmuştur. Enzimin, diğer hidrojen bağı etkileşimleri de Thr113 (OG1; 2.9A ) ve Leu300 (N; 3.1A ) kalıntıları ile gerçekleşmektedir. İnhibitörün yapısındaki izokuinolin halkası ise, Trp20, Val47, Trp111, Phe115, Phe122, Trp219 ve Leu300 kalıntıları ile hidrofobik bağı kurmaktadır (Şekil 2.23). 44

61 Şekil 2.23 ALR2 enzimi ile inhibitörün (minalrestat) bağlanma bölgeleri (Carbone vd. 2009) Tolrestat ile ALR2 kompleksinin kristal yapı incelemelerinde ise (Steuber vd. 2006), tolrestatın karboksilat grubu ile His110 (NE2; 2.6A ), His113 (NE2; 3.1A ), Tyr48 (OH; 2.6A ) ve Trp111 in (NE1; 2.8A ) arasında etkileşim olduğu saptanmıştır. Tolrestatın Trp20, Val47, Trp79, Trp111, Phe115, Val130, Phe122, Trp219 ve Leu300 kalıntıları ile gerçekleştirdiği hidrofobik etkileşimler, inhibitörün ALR2 enzimi üzerindeki kararlılığını arttırmaktadır (Şekil 2.24). Şekil 2.24 ALR2 enzimi ile inhibitörün (tolrestat) bağlanma bölgeleri (Carbone vd. 2009) 45

62 Kersetin ile ALR2 enziminin aktif bölgesinde yapılan araştırmalar (Costantino vd. 1999), kersetinin 7-OH grubu ile enzimdeki His110 (NE2; 3.2A ) ve Tyr48 (OH; 2.6A ) kalıntıları arasında gerçekleşen hidrojen bağlarının yanısıra, fenil halkasının 3- ve 4-OH grubları ile Thr113 ün yan zinciri (OG1) ve benzopiran oksijeni ile Trp111 in nitrojeni (NE2) arasında hidrojen bağlarının kurulduğunu saptanmıştır. 3,4-hidroksifenil ile Trp ın yan zinciri arasında gerçekleşen π bağlarının, kersetin ile ALR2 enzimi arasındaki etkileşim enerjisine çok büyük bir katkı sağladığı bilinmektedir (Şekil 2.25). Şekil 2.25 ALR2 enzimi ile inhibitörün (kersetin) bağlanma bölgeleri (Carbone vd. 2009) Diklorosalisilik asit (DCL) ile ALR2 kompleksinin Kristal yapı incelemelerinde (Carbone vd. 2008), DCL in karboksilat grubu ile Trp111 (NE1;3.7A), His110 (NE2;3.5A ) ve Tyr48 (OH;3.5A ) arasında gerçekleşen etkileşimlerin yanısıra, DCL in 5-Cl atomu ile Val47 nin karbonil grubu arasında van der Waals etkileşiminin olduğu ayrıca DCl in 5-Cl atomu ile Trp20 arasında da π yığınları etkileşimi kurulduğu saptanmıştır (Şekil 2.26). 46

63 Şekil 2.26 ALR2 enzimi ile inhibitörün (DCL) bağlanma bölgeleri (Carbone vd. 2009) AKR1A1 (aldehit redüktaz) ve ALR2 enzimlerini birbirinden ayırabilecek inhibitörlerin geliştirilmesi üzerine yapılan birçok çalışmanın aksine, AKR2 inhibitörlerinin AKR1B10 enzimi ile çapraz reaktivitesini incelemeyi hedefleyen çok daha az çalışma bulunmaktadır. Yapılan bazı çalışmalarda, tolrestatın ALR2 ve AKR1B10 enzimleri için benzer IC 50 değerleri gösterdiği saptanmıştır (Crosas vd. 2003, Gallego vd. 2007). Zopolrestat ve sorbinil inhibitörleri ile AKR1B10 enzimi için bildirilen K i değerleri ise, ALR2 enzimine göre önemli ölçüde yüksek olduğu bulunmuştur (Verma vd. 2008). Kısaca, klinik çalışmalarda gözlenen ters-hedef etkileri gibi ALR2 inhibitörlerinin in vivo şartlarındaki etkileri de, AKR1B10 enziminin inhibisyonundan kaynaklandığı bilinmektedir. Bu durum ise, AKR1B10 enziminin glukoz indirgenmesi için zayıf bir katalizör olduğu, dolaysıyla da diyabetteki sorbitol üretiminde belirgin bir rol oynamadığı şeklinde açıklanmaktadır (Barski vd. 2008). AKR1B nin iki izoformunu birbirinden ayrıt edebilecek inhibitörlerin geliştirilmesi, daha az yan etki yaparak diyabetik komplikasyonlarla mücadele eden çok daha spesifik ilaçların üretilmesini sağlayacaktır. 47

64 2.10 Süperoksit Dismutaz Enziminin Yapısı ve Fonksiyonu Reaktif oksijen türleri ile reaktif nitrojen türlerinin oluşumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta bazı savunma mekanizmaları geliştirilmiştir. Bunlar antioksidan savunma sistemleri olarak adlandırılmaktadırlar. Antioksidan moleküller endojen ve eksojen kaynaklı yapılar olup, oluşan oksidan moleküllerin neden olduğu hasarı hem hücre içi, hem de hücre dışı savunma ile etkisiz hale getirmektedirler. Antioksidan savunma sisteminin en önemli enzimlerinden biri de süperoksit dismutaz enzimidir. Süperoksit dismutaz enzimi, süperoksit anyonunun dismutasyonunu katalizleyerek, hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) oluşumunu sağlamaktadır (McCord ve Fridovich 1969). Ökaryotik hücrelerde, 1- Cu,Zn-SOD ve 2- Mn-SOD olmak üzere iki çeşit intraselüler süperoksit dismutaz enzimi bulunmaktadır (McCord ve Fridovich 1969, Weisiger ve Fridovich 1973) (Şekil 2.27). Hücre içerisinde görev alan, Cu,Zn-SOD enzimidir. Cu,Zn-SOD, 32 kda luk bir homodimer yapıdadır ve tüm hücrelerin sitozolunda ve çekirdeğinde yer almaktadır (Crapo vd. 1992). Mn-SOD ise, 96 kda luk bir homotetramerdir ve ilk olarak da mitokondri matriksinde saptanmıştır (Slot vd. 1986, Oury vd. 1995). Cu +2, Zn +2 - SOD1 + O 2 Cu +1, Zn +2 - SOD1 + O 2 Cu +1, Zn +2 - SOD1 + O 2 + 2H + Cu +2, Zn +2 - SOD1 + H 2 O 2 Şekil 2.27 Cu,Zn-SOD enziminin 3 boyutlu yapısı (Furukawa ve O Halloran 2006) 48

65 Cu,Zn-SOD enzimi, iki aktif merkezli ve iki benzer alt birimden oluşmakta ve 151 amino asit kalıntısı içermektedir. Enzimin katalitik bölgesinde bulunen bakır, süperoksiti indirgeyerek oksijene dönüştürürken, çinko iyonu redoks potansiyelini arttırarak reaksiyonun ilerlemesini sağlamaktadır (Crapo vd. 1992) da, Marklund ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada üçüncü bir SOD izozimi saptanmıştır. Bu enzim ekstraselüler süperoksit dismutaz (EC-SOD) olarak adlandırılmaktadır. EC-SOD hücre dışındaki sıvılarda (lenf, sinovial sıvısı ve plazma) yer almaktadır (Marklund vd. 1982, Marklund vd. 1986). EC-SOD 135,000 kda ağırlığında olan bir hidrofobik glikoproteindir (Marklund 1982). EC-SOD çoğu organizmalarda tetramer yapıda bulunurken (Oury vd. 1996), nadir olarak da dimer şeklinde bulunabilmektedir (Gerlach vd. 1998). Her tetramer iki dimer altüniteden oluşmaktadır. Bu dimerler, her altünitenin karboksil-terminalinde yer alan sistein amino asitlerinin, disülfit köprüler yapması sonucu birbirine bağlanmaktadırlar (Oury vd. 1996, Fattman vd. 2000). EC-SOD her altünitesinde bir bakır ve bir çinko atomu bulundurmaktadır. Bu elementler SOD aktivitesi için gereklidirler (Tibell vd. 1987). EC-SOD aktivitesi asit ve siyanid gibi bileşikler tarafından inhibe olurken dietelditiyokarbamat (DDC) ve H 2 O 2 tarafından da inaktif hale getirilmektedir (Marklund 1984). EC-SOD proteini kararlı bir yapı göstermekte ve yüksek ısı, ph ve yüksek üre konsantrasyonuna karşı çok dayanaklı olmaktadır (Tibell vd. 1993). İnsanda EC-SOD geni 4q21 kromozomunda yer almaktadır (Hendrickson vd. 1990). Bu gen, intraselüler Cu,Zn-SOD ile %60 lık oranda homoloji göstermektedir (Zelko vd. 2002). Ancak Mn-SOD ile çok az oranda homoloji gösterir (Ho vd. 1991). EC-SOD geni, 5900 bp uzunluğunda ve 3 ekzon ile 2 introndan oluşmaktadır (Folz ve Crapo 1994). Genin, promotor bölgesinde çeşitli regülatör elementler bulunmaktadır. Örn: antioksidan yanıt elemanları (ARE), AP-1 bağlanma bölgeleri, ksenobiyotik yanıt elemanları ve NF-κB motifleri (Folz ve Crapo 1994, Bowler vd. 2001) (Şekil 2.28). İnsan vücudundaki 4.2 kb lık mrna kalp, pankreas ve akciğerde yüksek oranda 49

66 bulunurken, böbrek, karaciğer ve kaslarda orta seviyede ve beyinde ise çok az miktarda bulunmaktadır (Folz ve Crapo 1994). Şekil 2.28 İnsanda bulunan EC-SOD enziminin gen yapısı (Fattman vd. 2003) EC-SOD 3 fonksiyonel domainden oluşmaktadır; I) 1-95 amino asitlerini içeren amino terminal bölgesi. Bu bölgedeki 89. amino asit (Asn) glikozile olmuş durumdadır (Hjalmarsson vd. 1987, Stromqvist vd. 1991). Glikozilasyon, enzimin çözünülür olmasını sağlamaktadır (Edlund vd. 1992). II) amino asit bölgesi. Bu bölge Cu,Zn-SOD ile yüksek oranda homoloji göstermektedir. EC-SOD ın aktif bölgesi bu domainde yer almaktadır. III) amino asit bölgesi. Bu bölge 9 adet pozitif yüklü amino asiti (3 lizin ve 6 arjinin) içermektedir (Hjalmarsson vd. 1987). EC- SOD ın en önemli karakteristik özelliği ise, heparine olan ilgisidir (Lookene vd. 2000). Yapılan araştırmalar, C-terminal domainin ( amino asit bölgesi) varlığının, EC-SOD ın heparin ve heparan-sülfat ile etkileşimi için gerekli olduğunu vurgulamaktadır (Adachi vd. 1992, Sandstrom vd. 1992). EC-SOD ın heparan-sülfat proteoglikanları ile etkileşiminin, enzimin hücre yüzeyinde ve ekstraselüler matriksteki lokalizasyonuna destek olabileceğini düşündürmektedir. Plazma EC-SOD heparine bağlı kromatografide 3 ayrı fraksiyona ayrılmaktadır (Marklund 1990, Ohta vd. 1993). 50

67 1 ) A fraksiyonu (heparine karşı ilgisi olmayan bölge). 2 ) B fraksiyonu (heparine çok az ilgi gösteren bölge). 3 ) C fraksiyonu (heparine çok büyük ilgi gösteren bölge) (Şekil 2.29). Çoğu organizmalarda EC-SOD, C formunda bulunurken (Sandstrom vd. 1993), ratlarda EC-SOD yalnızca A ve B formunda bulunmaktadır (Karlsson ve Marklund 1988). C fraksiyonu, homotetramer EC-SOD dan oluşmakta ve bu tetramerin altüniteleri C terminal domainlerinde, heparine bağlanan bölgeler bulundurmaktadırlar (CCCC). B fraksiyonu, heterogenez SOD-tetramerden oluşmakta ve bu tetramerin bazı domainleri heparine bağımlı ve bazıları ise heparinden bağımsız olarak görülmektedir (CCCA ve CCAA). A fraksiyonu ise, bir homotetramerden oluşmaktadır ve bu yapının altünitelerinde heparine ilgisiz domainler bulunmaktadır (AAAA) (Sandstrom vd. 1992). Şekil 2.29 İnsanda ve farede bulunan EC-SOD enziminin yapısı (Fattman vd. 2003) 51

68 2.11 Diyabet ve Oksidatif Stres Kronik hiperglisemiye bağlı oluşan oksidatif stres, diyabetik komplikasyonların etiyolojisinde önemli rol oynamaktadır (Baynes 1991). Oksidatif stres belirteci olan plazma ve üriner F 2 -izoprostanın ölçülmesi, ayrıca plazma ve dokulardaki nitrotirozin ve. O - 2 seviyelerinin belirlenmesi üzerine yapılan çalışmalar, diyabetteki oksidatif stres oluşumunu göstermektedir (Guzik vd. 2000, Ceriello vd. 2001, Guzik vd. 2002, Oberg vd. 2004, Vega-Lopez vd. 2004). Diyabetteki oksidatif strese neden olan kaynaklar, mitokondriyel, enzimatik ve enzimatik olmayan yolaklar olmak üzere üç ana gruba ayrılmaktadır (Turko vd. 2001). Reaktif oksijen türleri, enzimatik olmayan glukoz oksidasyonunun yanısıra, amadori bileşenlerin oluşumu sırasında ve poliyol yolağı aktivasyonu sonucu da ortaya çıkmaktadırlar (Johansen vd. 2005). Diyabetteki reaktif moleküllerin enzimatik kaynakları ise NOS, NADPH oksidaz ve ksantin oksidazdan oluşmaktadır (Guzik vd. 2000, Guzik vd. 2002, Alıcıgüzel vd. 2003). Reaktif oksijen tüleri, düşük yoğunluklu lipoproteinlerin oksidasyonuna (ox-ldl) ve bu moleküllerin LDL reseptörleri tarafından tanımlanamamasına yol açtığı gibi ox- LDL lerin makrofaj reseptörleri tarafından alınarak köpük hücre ve aterosklerotik plakların oluşumuna da neden olmaktadır (Boullier vd. 2001) (Şekil 2.30). Süperoksit anyonu, poliyol yolağı, protein kinaz C, heksozamin ve ileri glikasyon son ürünlerin oluşum yolaklarının aktivasyonuna yol açarak diyabetik mikrovasküler ve makrovasküler komplikasyonların gelişimine katkıda bulunmaktadır (Brownlee 2001, Guzik vd. 2002, Ceriello 2003). Hidrojen peroksit ve süperoksit anyonu, NF-κB, p38- MAPK ve STAT-JAK (Janus kinaz (JAK)-sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü (STAT)) gibi strese bağlı sinyal ileti yolaklarının uyarılmasına ve sonuçta vasküler düz kas hücrelerin (VSMC) göçüne ve çoğalmasına sebep olmaktadırlar. Ayrıca H 2 O 2, endotel hücrelerinde apoptoza ve patolojik anjiyogeneze de yol açmaktadır (Taniyama ve Griendling 2003) (Şekil 2.31). 52

69 Şekil 2.30 LDL modifikasyonu ve köpük hücre oluşumu (Negre-Salvayre vd. 2008) 53

70 Şekil 2.31 Oksidatif stres ile indüklenen insülin direnci (Newsholme vd. 2007) Süperoksit anyonu,. NO radikali ile hızlı bir şekilde reaksiyona girerek çok güçlü bir oksidan olan peroksinitriti (. ONOO) oluşturur. Peroksinitrit ise çeşitli biyomoleküllere saldırarak birden fazla mekanizma ile kardiyovasküler fonksiyon kaybına neden olmaktadır (Beckman ve Koppenol 1996, Pacher vd. 2005). Bu mekanizmalar üç sınıfa ayrılmaktadır; 1) Peroksinitrit radikali, lipit peroksidasyonun yanısıra protein nitrasyonu ile biyomoleküllerin fonksiyonunu değiştirebilmektedir. Örneğin: potasyum kanallarının 54

71 peroksinitrit aracılığıyla nitrasyonu, damarların gevşemesini tamamen inhibe etmektedir (Turko vd. 2001, Liu ve Gutterman 2002, Liu vd. 2002). Diyabet ile çeşitli dokularda artan nitrozatif stres ve peroksinitrit oluşumu arasındaki ilişki çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda, diyabetik bireylerin trombositlerinde inos a bağlı peroksinitrit oluşumunda ve tip-2 diyabetiklerde plazma nitrotirozin miktarında artış saptanmıştır (Tannous vd. 1999, Ceriello vd. 2001). Maymunlarla yapılan bir araştırmada, hayvanların arter duvarlarında, hiperglisemiye bağlı olarak artan nitrotirozin oluşumu saptanmıştır (Pennathur vd. 2001). Diyabetik hastalarda yapılan kalp biyopsilerinde, endotel hücreleri, miyosit ve fibroblastlardaki nitrotirozin miktarı ile dokudaki fonksiyon kaybı arasında doğrudan bağlantı olduğu saptanmıştır. Bu da, peroksinitrit ile nitrotirozinin kardiyovasküler sistem üzerinde toksik etki yaptığını bir kez daha vurgulamaktadır (Frustaci vd. 2000). Hiperglisemiye bağlı olarak oluşan endotel hasarın patogenezinde çeşitli evrelerin var olduğu ileri sürülmektedir. Kısa süreli etkiler, peroksinitrit oluşumu ile ortaya çıkan nitrozatif stresin ve oksidatif stresin kombinasyonu sonucu ortaya çıkmaktadır. Uzun süreli etkiler ise, reaktif oksijen türlerinin oluşumu ile bağlantılıdır. Her iki durumda da, protein kinaz C yolağının vasküler geçirgenlikteki değişikliklere aracılık ettiği bilinmektedir (Pricci vd. 2003). 2) Peroksinitrit, tek iplikli DNA da kırılmalar meydana getirerek, nükleer enzim olan poli(adp-riboz) polimerazın aktivasyonuna neden olmaktadır (Soriano vd. 2001, Virag ve Szabo 2002, Pacher vd. 2005). Diyabetik hayvanlar ve diyabetik insanlarda görülmekte olan diyabetik kardiyovasküler fonksiyon kaybının gelişiminde, PARP-1 aktivasyonunun önemli rolü olduğu bilinmektedir (Garcia Soriano vd. 2001, Pacher vd. 2002, Szabo vd. 2002). Ayrıca artan PARP etkinliğinin, NF-κB sinyal ileti yolağı aracılığıyla da retinopati, nöropati ve nefropati gibi diğer diyabetik komplikasyonların gelişimine katkı sağladığı düşünülmektedir (Pacher ve Szabo 2005). 3) Peroksinitrit,. NO radikalinin miktarını azaltarak, bozulan gevşemenin yanısıra, vasküler endotel hücrelerindeki lökosit adezyonlarını ve trombositleri temizleyen 55

72 . NO in antiproliferatif etkisini de inhibe etmektedir (Maritim vd. 2003). Ayrıca peroksinitrit, NOS enziminin önemli kofaktörü olan tetrahidrobiyopterini (BH 4 ) oksitleyerek,. NO radikali yerine süperoksit anyonu üreten eşleşmemiş (uncoupled) NOS ın oluşumuna sebep olmaktadır (Maritim vd. 2003). Gerçekleşen tüm bu patolojik modifikasyonlar, vasküler fonksiyon kaybının gelişimine yol açmaktadır (Şekil 2.32). Şekil 2.32 Peroksinitritin kardiyovasküler hastalıklarına yol açtığı mekanizma (Pacher ve Szabo 2005) 56

73 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Kullanılan Cihazlar Hassas Terazi (AND Electronic Balance FY-300) Hassas Terazi (Sartorius-CP 224S) Magnetik Karıştırıcı (Torrey Pines Scientific) Otomatik Pipetler (Gilson) Yüksek Devirli Soğutmalı Santrifüj (Sorvall RCM 120 EX) Yüksek Devirli Soğutmalı Santrifüj (Sigma 3K30) Soğutmalı Santrifüj (Sigma) Vorteks (Heidolph) ph-metre (Inolab WTW Series ph 720) Spektrofotometre (SHIMADZU UV-1700) Derin Dondurucu (-80 C) (Bosch) Buzdolabı (Arçelik) Kullanılan kimyasal maddeler (NH 4 ) 2 SO 4 (Merck), NaCl (Merck), NADPH (Sigma), DL-gliseralaldehit (Sigma), KH 2 PO 4 (Sigma), K 2 HPO 4 (Sigma), DMF (Merck), Bio-Rad Reagent (BIO-RAD), metanol (Reidel-de Haen), sığır serum albumini (BSA) (Sigma), Kersetin (Sigma), TMEDA (Merck) ve EDTA (Merck) firmalarından temin edilmiştir. Aldoz redüktaz enzimi üzerine inhibitör etkisi olabileceği düşünülen bazı kromonil-tzd türevleri, Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya Anabilim Dalı tarafından sentezlenmiştir. Ayrıca, bu bileşiklerin süperoksit dismutaz enzimi üzerine olası etkileri de incelenmiştir Denekler Deney için normal diyetle beslenmiş 50 adet kg ağırlığındaki sığırlardan elde edilen lensler kullanılmıştır. Haymana mezbahasında kesilen sığırlardan alınan gözler 57

74 bekletilmeden buz kutularına alındıktan sonra -80 C de saklanmıştır. Daha sonra, lensler donmuş göz dokusundan çıkarılarak homojenize edilmiştir. Elde edilen sığır lens homojenatlarından aldoz redüktaz enzimi izole edilmiştir. 17 adet TZD türevinin ALR2 ve SOD enzimleri üzerine olası inhibitör etkileri incelenmiştir. Yapılan tüm deneyler üçer defa tekrarlanmıştır. Hayvanların bakımları, ilgili ulusal ve uluslararası kanun ve yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 3.2 Yöntem Aldoz redüktaz enziminin izolasyonu Deneylerde 100 adet sığır lensi kullanılmıştır. Lens dokularından ALR2 enzimi izole edilmiş (Das ve Srivastava 1985) ve aktivite tayinleri yapılmıştır. İzolasyon işlemi için, -80 C de saklanmış sığır gözlerinden alınan lensler, tartılıp, ağırlıklarının 3 katı kadar distile su eklendikten sonra, homojenize edilmiştir. Elde edilen homojenat +4 C de, 10000g de 20 dakika santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatan üzerine, % 40 doygunluk oluşturabilmek için doymuş amonyum sülfat çözeltisi eklenmiştir. Daha sonra, süspansiyon magnetik karıştırıcı ile 15 dakika karıştırılıp, +4 C, 10000g de 20 dakika santrifüj edilmiştir. Bu şekilde inert proteinler ayrıldıktan sonra elde edilen ikinci süpernatana, % 50 satürasyon için tekrar doymuş amonyum sülfat ilave edilip, 15 dakika karıştırılmış ve tekrar +4 C, 10000g de 20 dakika santrifüj edilmiştir. % 50 doygunluktaki bu üçüncü süpernatana toz amonyum sülfat eklenerek % 75 doygunluk sağlandıktan sonra hiç bekletmeden +4 C, 10000g de 20 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda elde edilen pellet, 5 ml 0.05 M NaCl içersinde çözülerek aktivite tayinlerinde kullanılmıştır Aldoz redüktaz aktivite tayini Kullanılan çözeltiler: 1. Doymuş amonyum sülfat çözeltisi 58

75 2. İnhibitör madde stok çözeltisi (10-4 M) 3. İnhibitör madde çözücüsü: % 50 dimetil formamid (DMF)- % 50 metanol M stok NADPH çözeltisi M stok gliseraldehit çözeltisi M fosfat tamponu, ph= M NaCl çözeltisi Sığır lenslerinden elde ettiğimiz ALR2 enziminin aktivitesi, 340 nm dalga boyunda UV spektrofotometre kullanılarak tayin edilmiştir. Enzim aktivitesi bu dalga boyunda, NADPH konsantrasyonundaki azalmaya bağlı olarak ölçülmektedir (Cerelli vd. 1986). Reaksiyon ortamı, 0.2 ml fosfat tamponu, 0.1 ml NADPH (2x10-5 M final konsantrasyon), 0.1 ml inhibitör madde çözeltisi ve 2.3 ml distile su içeren inkübasyon ortamına mg protein (Aldoz redüktaz izolatı) eklenerek hacim 2.9 ml ye tamamlanarak hazırlanmıştır. Reaksiyon, yukarıda hazırlanan küvete 0.1 ml DLgliseraldehit (5x10-4 M final konsantrasyon) ilavesi ile başlatılmıştır. 340 nm de ve 37 C de NADPH konsantrasyonundaki azalma 5 dakika sürecince takip edilmiştir. Daha sonra absorbans değerleri lineer olan aralıklar tespit edilip, eğim hesapları yapılmıştır. Eğim değerleri, aşağıdaki formüle uygulanarak inhibitör madde olmadan enzimin aktivitesi U/L cinsinden hesaplanmıştır. Bu değer %100 enzim aktivitesi olarak kabul edilmiştir. Daha sonra, inkübasyon ortamına inhibitör maddenin eklenmesiyle elde edilen lineer grafikten hesaplanan enzim aktiviteleri, inhibisyon olmadan elde edilen aktivitelere oranlanarak % aktivite oranları hesaplanmıştır. U/L = ΔA V(L) 1000 (µ mol/min -1 /L -1 ) Δt v(l) ε d ΔA = Test tüpündeki absorbans farkı Δt = Zaman (Dakika) ΔA/Δt = Eğim ε = Ekstinsiyon Katsayısı (6.22 mmol -1 mm -1 ) d = Işık Yolu (10 mm) 59

76 V(L) = Total Hacim v(l) = Enzim Hacmi Aldoz redüktaz protein miktar tayini Kullanılan çözeltiler: 1. Sığır serum albumin çözeltisi (BSA): 2mg/ml 2. BIO-RAd Reagent Çalışmamızda protein miktarı tayini için Bradford metodu (Bradford 1976) kullanılmıştır. Protein miktar tayininde standart olarak sığır serum albumini (BSA) kullanılmıştır. Stok BSA çözeltisinden konsantrasyonu 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4 mg/ml olan standartlar hazırlanmıştır. Organik boya olarak kullandığımız BIO-RAD Reagent, 1/5 oranında seyreltildikten sonra Whatman no.1 filtre kağıdı aracılığıyla süzülmüştür. Deney tüplerine; stok BSA çözeltisinden hazırlanan standart çözeltilerden 0.1 ml alınarak üzerlerine hazırlanmış olan organik boyadan 5 er ml eklenmiştir. 1ml lik küvetlere hazırlanan bu çözeltilerden 1 ml çekilerek spektrofotometrede 595 nm de ölçümler yapılmıştır. Protein miktar tayininde daha hassas sonuç elde etmek için enzim, 1/40 oranında seyretilmiştir. Standartlarda olduğu gibi 0.1 ml enzime 5 ml organik boya eklendikten sonra spektrofotometrik ölçümü yapılmış ve standart grafikten protein miktarı mg/ml cinsinden hesaplanmıştır Süperoksit dismutaz enziminin izolasyonu Deneylerde, aldoz redüktaz enziminde olduğu gibi, sığır lensi kullanılmıştır. Lens dokularından SOD enzimi izole edilmiş ve aktivite tayinleri yapılmıştır. İzolasyon işlemi için, -80 C de saklanmış sığır gözlerinden alınan lensler, tartılıp, ağırlıklarının 3 katı kadar fosfat tamponu (ph 7.4) eklenerek, homojenize edilmiştir. 60

77 Homojenize edilen doku +4 C de, g de 20 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonucu elde edilen süpernatandan süperoksit dismutaz aktivite tayini yapılmıştır Süperoksit dismutaz aktivite tayini Süperoksit dismutaz aktivite tayini Kostyuk ve Potapovich in önerdiği yönteme göre gerçekleştirilmiştir (Kostyuk ve Potapovich 1989). Bu yöntem kersetinin otooksidasyonuna dayanmaktadır. Buna göre. O 2 molekülleri kersetini oksitlemekte ve kersetinin başlangıçtaki derişimi ile bir t anındaki derişimi farklılık göstermektedir. Bu farklılık otooksidasyonunun 406 nm deki absorbanslarının, zamana karşı izlenmesiyle saptanmıştır. Lens dokularında bulunan süperoksit dismutaz enziminin aktivite tayini amacıyla; 9 ml ph 9,2 olan ve 0,890 mm TMEDA ve mm EDTA içeren fosfat tamponu üzerine 0,5 ml saf su ve 0,5 ml kersetin çözeltisi ilave edilip vortekslendikten sonra spektrofotometrede 406 nm de 1, 3, 5, 8, 12 ve 20 nci dakikalarda absorbansları ölçülmüştür. Başlangıçtaki absorbans (Ao) ile 20. dakikadaki absorbans (A 20 ) arasındaki farktan % 100 otooksidasyonu elde edilmiştir (% 100 inhibisyon). SOD aktivitesi ölçülecek olan süpernatana ve SOD çözeltilerine de aynı işlemler uygulanıp, 20. Dakikada absorbansları okunmuştur. Standart çözeltilerin 20. Dakikadaki absorbanslarının kersetin absorbansına oranı ile SOD hesaplamaları yapılmıştır. 17 adet kromonil tiyazolidindion bileşiğinin SOD enzimi üzerine etkisi ise, standart SOD grafiğinin yardımı ile hesaplanmıştır. 61

78 4. BULGULAR Sığır lenslerinden elde edilen aldoz redüktazın protein miktarını ölçmek için Bradford yöntemi kullanılmıştır (Bradford 1976). Bu yönteme göre, stok BSA çözeltisinden hazırlanan 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4 mg/dl olan standartların 595 nm de spektrofotometrik ölçümleri yapılmıştır. Bu çalışmanın ardından 1/40 oranında seyreltilen 0.1 ml lik enzime 5 ml BIO-RAD çözeltisi eklenerek seyreltilen enzimin protein miktarı 595 nm de ölçülmüştür ve standart grafiğe göre protein miktarı mg/ml olarak hesaplanmıştır. Protein miktar tayini standart grafiği şekil 4.1 de gösterilmektedir. Sığır lenslerinden elde ettiğimiz aldoz redüktaz enziminin enzim aktivitesi 340 nm de NADPH kontrasyonundaki azalmaya bağlı olarak ölçülmüştür. Standart grubunda yani inhibitör maddeler olmadan sadece aldoz redüktaz enziminin oluşturduğu aktivite değeri U/L olarak hesaplanmıştır (Şekil 4.2). Bu değer % 100 enzim aktivitesi olarak kabul edilmiş ve inhibitör maddelerin enzim aktivitesi üzerine etkileri bu değere oranlanarak hesaplanmıştır. Aldoz redüktaz enziminin aktivitesi hesaplandıktan sonra, Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya A.B.D nda Prof. Dr. Rahmiye ERTAN ve Dr. Ecz. Meltem CEYLAN ÜNLÜSOY tarafından sentezlenen ve her biri 10-4 M konsantrasyonda 17 adet kromonil TZD türevlerinden 0,1 er ml kullanılmıştır. Sentezlenen bu inhibitörlerin enzim aktivitesi üzerine etkileri çalışılmıştır. Her inhibitör maddeye karşın enzimin aktivitesi yeniden ölçülmüş ve aktivite değerleri U/L cinsinden hesaplanmıştır. Ölçülen bu değer %100 enzim aktivisi olarak kabul edilen U/L değeri ile oranlanarak enzimin inhibisyon veya aktivasyon % leri hesaplanmıştır. İnhibitör maddelerin formülleri, moleküler ağırlıkları, absorbans ve zamana (sn) bağlı olarak çizilen eğim grafikleri şekil arasında gösterilmiştir. Çizelge 4.1; Kromonil tiyazolidindion türevlerinin aldoz redüktaz enzim aktivitesi üzerine etkilerini göstermektedir. Kromonil tiyazolidindion türevlerinin süperoksit dismutaz enzim aktivitesi üzerine etkileri de cizelge 4.2 de gösterilmektedir. 62

79 Şekil 4.1 Protein miktar tayini standart grafiği 63

80 Şekil 4.2 Aldoz redüktaz enzimi bazal aktivite grafiği 64