SEMEN LEKELERİNDE Y KROMOZOMU SHORT TANDEM REPEAT LERİN FARKLI ORTAM KOŞULLARINDA ZAMANA BAĞLI OLARAK SAPTANABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ADLİ TIP ANABİLİM DALI SEMEN LEKELERİNDE Y KROMOZOMU SHORT TANDEM REPEAT LERİN FARKLI ORTAM KOŞULLARINDA ZAMANA BAĞLI OLARAK SAPTANABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI Dr. ALİ EREN UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. BEHNAN ALPER ADANA 2010

2 T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ADLİ TIP ANABİLİM DALI SEMEN LEKELERİNDE Y KROMOZOMU SHORT TANDEM REPEAT LERİN FARKLI ORTAM KOŞULLARINDA ZAMANA BAĞLI OLARAK SAPTANABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI Dr. ALİ EREN UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. BEHNAN ALPER Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. TF2008LTP4 ADANA 2010

3 TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimi süresince gereksinim duyduğum destek, bilgi ve tecrübeleri ile bana yol gösteren, Anabilim Dalı Hocalarım Prof. Dr. Mete Korkut GÜLMEN e, Prof. Dr. Behnan ALPER e Prof. Dr. Necmi ÇEKİN e, ve Doç. Dr. Ahmet HİLAL e, Tez çalışmalarım sırasında yardım ve desteğini esirgemeyen tez danışmanım Prof. Dr. Behnan ALPER ile Anabilim Dalı Hemogenetik Laboratuvar çalışanı Dr. Bio. Ayşe SERİN, Dr. Bio. Hüsniye CANAN ve Anabilim Dalımız çalışanlarına, Uzmanlık eğitimi süresince sabrını ve manevi desteğini esirgemeyen sevgili eşim Elif EREN e, TF2008LTP4 no lu Tıpta Uzmanlık Tez Araştırma Fonu ile tezin gerçekleştirilmesine katkıda bulunan Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu na teşekkür ederim. Saygılarımla Dr. Ali EREN i

4 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR i İÇİNDEKİLER ii TABLO LİSTESİ iv ŞEKİL LİSTESİ v KISALTMA LİSTESİ vi ÖZET ve ANAHTAR SÖZCÜKLER vii ABSTRACT-KEYWORDS viii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER Genetik Biliminin Gelişimi Genetiğin Adli Tıpta Kullanımı Adli Amaçlı Kimliklendirme Semen Sıvısı Semen Lekelerinin İncelenmesi Semen Lekelerinden Suçlunun Kimliklendirilmesi İnsan Y Kromozomu Yapısı Short Tandem Repeat Lokusları Parçalanmış DNA Örneklerinde Short Tandem Repeat Kullanımının Avantajı Adli Amaçlı Kullanılan Y Kromozomu-Short Tandem Repeat Lokusları Y Kromozomu Short Tandem Repeat lerin Adlandırılması Y Kromozomu Short Tandem Repeat Kullanımının Avantajları Eski ve Parçalanmış Örneklerden DNA Eldesi Polimer Zincir Reaksiyonu Polimer Zincir Reaksiyonu İnhibisyonu Polimer Zincir Reaksiyonu İnhibisyonunun Engellenmesi Kantitatif (Real-Time) Polimer Zincir Reaksiyonu Kapiller Elektroforez Kapiller Elektroforez ve Jel Elektroforez Yöntemlerinin Karşılaştırılması Elektroforegramın Değerlendirilmesi GEREÇ VE YÖNTEM Semen Örneğinin alınması Semen Örneklerinin Makroskobik ve mikroskobik İncelenmesi (Spermiyogram) Semen Lekelerinin hazırlanması ve saklanması Semen Lekelerinden DNA ekstraksiyonu Deneyde Kullanılan Cihazlar Deneyde Kullanılan Kimyasal Maddeler 22 ii

5 QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN) ile DNA Ekstraksiyonu DNA Miktarının Ölçülmesi Örneklerin Polimer Zincir Reaksiyonu ile Amplifikasyonu Örneklerin Otomatik Kapiller Elektroforezde Yürütülmesi BULGULAR Spermiyogram Sonuçları Kantitatif Polimer Zincir Reaksiyonu Sonuçları Elektroforez Sonuçları TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER 37 KAYNAKLAR 39 EK 45 ÖZGEÇMİŞ 61 iii

6 USayfa TABLO LİSTESİ Tablo no: U no: Tablo 1: Polimer Zincir Reaksiyonu amplifikasyonunda kullanılan kimyasallar 14 Tablo 2: Örneklerin spermiyogram sonuçları 25 Tablo 3: Örneklerin kantitasyon sonuçları 26 Tablo 4: Örneklerin Y Kromozomu Short Tandem Repeat tiplendirme sonuçları 28 iv

7 ŞEKİL LİSTESİ Şekil no: Sayfa no: Şekil 1: İnsan Y kromozomu yapısı 8 Şekil 2: Kapiller Elektroforezin çalışma prensibi 17 Şekil 3. Çalışmanın 6. ayında 5 no lu kişiye ait örnek elektroforegram 29 v

8 KISALTMA LİSTESİ AL AP DNA dntp HLA KE kv M Mb ml mm ng nm PCR PSA RFLP STR VNTR V/cm Y-STR ma mg ml mm : Allelic Ladder : Asit Fosfataz : Base pairing : Deoksiribo nükleik asit : Deoksi nükleotid trifosfat : Human leukocyte antigen : Kapiller Elektroforez : Kilovolt : Nanometre : Molar : Mililitre : Milimolar : Nanogram : Nanometre : Polymerase chain reaction (Polimeraz zincir reaksiyonu) : Prostat spesifik antijen : Restriction fragment length polimorphism : Short tandem repeat (Ardışık kısa tekrarlar) : Variable number of tandem repeat : Volt/santimetre : Y kromozomu short tandem repeat : Mikroamper : Mikrogram : Mikrolitre : Mikromolar vi

9 ÖZET Semen Lekelerinde Y Kromozomu Short Tandem Repeat lerin Farklı Ortam Koşullarında Zamana Bağlı Olarak Saptanabilirliğinin Araştırılması Amaç: Cinsel saldırı olgularında mağdurun elbiselerinde veya ortamda saptanan delil niteliğindeki semen lekelerinin kimliklendirilmesiyle suçluya ulaşmak mümkündür. Y kromozomuna özgü short tandem repeat ler (ardışık kısa tekrarlar) günümüzde cinsel saldırı olgularında, olay yerinde bulunan kadın-erkek karışımı biyolojik materyalden yola çıkarak erkek saldırganın ayrımında, babanın bulunamadığı soy davalarında başarıyla kullanılmaktadır. Olay yerinde saptanan semen lekeleri sıklıkla kötü ortam koşullarında beklemiştir ve olaydan uzun zaman geçmiştir. Bu lekelerin parçalanmış DNA örnekleri içermesi ve az miktarda olması nedeniyle bir defada DNA profili yapılabilmesi gereklidir. Bu çalışmada farklı ortam koşullarında beklemiş semen lekelerinde Y kromozomu short tandem repeat lerin saptanabilirliği araştırılacaktır. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada 5 gönüllüden alınan semen sıvısından hazırlanan lekeler kullanıldı. Gazlı beze oluşturulan lekeler oda ısısında kurutuldu. Kurutulan bu lekeler etüv (37 C), buzdolabı (4 C) ve oda ısısı(25 C) nda 6 aya kadar bekletilerek zamanı gelen örneklerden DNA ekstraksiyonu yapıldı. Elde edilen DNA, Polimeraz zincir Reaksiyonu ile çoğaltılarak kapiller elektroforezde yürütüldü. Çalışmanın 3. ve 6. ayına ait lekelerde DNA kantitasyonu çalışıldı. Bulgular: Altı aya kadar bekletilen tüm lekelerden Y kromozomuna özgü short tandem repeat profili elde edildi. DNA kantitasyon çalışmasında 6 aylık örneklerdeki DNA yıkımının 3 aylık örneklerden daha fazla olduğu görüldü. Buzdolabında tutulan örneklerde DNA yıkımının en az olduğu, bunu oda ısısı ve etüvün izlediği görüldü. Sonuç: Farklı ortam koşullarında 6 aya kadar beklemiş eski semen lekelerinde adli Y kromozomuna özgü short tandem repeat tiplendirmesinin yapılabileceği görülmektedir. Literatür bulgularıyla uyumlu olarak DNA yıkımının zamana bağlı olarak arttığı ve sıcaklığın yıkımı olumsuz etkilediği görüldü. Anahtar sözcükler: Degrade DNA, mikrosatellit, semen lekesi, Y Kromozomu. vii

10 ABSTRACT Y Chromosome Short Tandem Repeat Analysis of Semen Stains Exposed Different Environment Conditions Depending Time Interval. Purpose: In cases of sexual assault, it is possible to achieve the identity of perpetrators by examining semen stains detected on the victim s garments or environment. In daily routine, Y chromosome short tandem repeat analysis is successfully used in sexual assault cases, to identify male perpetrator from biological materials of female-male mixture in crime scene and in cases of paternity. Semen stains detected at crime scenes are generally expose to poor environmental conditions with a long time interval. Since these stains contain degraded DNA samples in a small amount of material, DNA profiling should be performed at one analysis. In this study, the determination of Y chromosome short tandem repeats of semen stains exposed different environment conditions will be investigated. Materials and Methods: In this study, samples prepared from semen of five volunteer individuals were used. Semen samples spotted on gauze were dried at room temperature. Following this step, three different environments, incubator (37 C) refrigerator (4 C) room temperature (25 C), were prepared for dried samples for six months. DNA extraction was performed from each sample. Obtained DNA underwent polymerase chain reaction amplification and capillary electrophoresis. As the last step, DNA quantitation performed for samples at the third and sixth month of storage. Results: Y chromosome short tandem repeat profile was obtained from all of the stains kept for six months. DNA quantitation revealed that the level of DNA degradation were higher in the samples of sixth month compared to third month. DNA degradation level was the lowest in the samples kept in the refrigerator, which followed by room environment and oven. Conclusion: It is concluded that, Y chromosome short tandem repeat profiling can be carried out in semen stains stored in different environment conditions for six months. In concordance with literature findings, it was found that DNA degradation increases depending on the time and temperature has negative effects on degradation. Key words: Degraded DNA, Microsatellite, semen stain, Y Chromosome. viii

11 1. GİRİŞ Adli olguların genetik kimliklendirilmesinde, insanların parmak izi yerine geçen DNA farklılıklarından yararlanılmaktadır. Moleküler tekniklerin ve teknolojinin hızlı ilerleyişi ile olay ortamında bırakılan tek bir hücreden yola çıkılarak suçluya çabucak ulaşmak sorun olmaktan çıkmıştır. Her yıl giderek artan sayıda görülen cinsel suçların tamama yakını, erkekler tarafından işlenmektedir. Bu da sadece paternal (babadan oğula) kalıtım gösteren Y kromozomunu adli genetik yönden daha ilgi çekici ve önemli hale getirmiştir. Sadece sperm ile aktarılan Y kromozomu küçük bir kısmı haricinde rekombinasyona uğramaz. Buna rağmen Y kromozomunda bulunan STR (ardışık kısa tekrarlar) lerin sahip olduğu polimorfizm ve bu kromozomun haploid olması yüksek derecede dışlama sağlayabilmektedir. Neredeyse hiç değişmeden babadan oğula aktarılan Y kromozomu mutasyonları sonucu oluşan varyasyonların erkeğe özgü kalması insan evriminin ve filogenetik çalışmaların yapılmasına olanak sağlamaktadır. Adli bilimlerde olay yerinden alınan semen lekeleri de diğer örnekler gibi olguların aydınlatılmasında çok önemlidir. Cinsel saldırı vakalarında çoğunlukla olaydan 72 saat geçtikten sonra spermatozoolar saptanamamakta suçluya ulaşılması güçleşmektedir. Örneklerin eskidiği ya da çok az olduğu bu gibi durumlarda semen lekesinden Y kromozomu STR analizi ile suçluyu saptamak mümkündür. Yine babanın bulunamayıp birinci derece erkek akrabanın bulunduğu babalık testlerinde de sonuca ulaşılabilmektedir. Yapılan çalışmalarda semen lekelerinde zamana ve çeşitli çevre koşullarına bağlı olarak otozomal STR sistemlerinin araştırıldığı literatür bilgilerine ulaşılmış, ancak Y kromozomuna özgü STR lerin bu tip koşullarda tanımlanabilirliği ile ilgili literatür bilgilerine ulaşılamamıştır. Bu çalışmada ırza geçme olaylarında kadın ve erkek DNA sının karışık olduğu örneklerin incelenmesi ve babalığın belirlenmesi amacıyla kullanılan Y-STR 1

12 sistemlerinin çeşitli çevre koşullarına maruz kalmış semen lekelerinde tanımlanabilirliği araştırılacaktır. 2

13 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Genetik Biliminin Gelişimi Genetik bilim dalının uğraşı alanı genetik materyalin işlevi, bunun yeni nesillere nasıl aktarıldığı ve çeşitliliğin (varyasyon) nedenleri gibi konulardır. Tarihsel gelişimi diğer bilim dallarıyla paralellik göstermektedir. 1-4 Genetiğin temelini oluşturan kavramlar ilk olarak Mendel tarafından ortaya konmuştur. Mendel 1866 yılında bezelyeler üzerinde yaptığı gözlemlerle sonuçlarını bitki melezleri ile çalışmalar adlı yayınında sunmuştur. De Vries, Correns ve Tschermak adlı araştırıcılar yaptıkları çalışmalarıyla Mendel i doğrulamışlardır. Bu araştırmacılar görüşlerini 1900 yılında Mendel yasaları olarak yayınladılar. Böylece 1900 yılı genetik biliminin doğum yılı olarak kabul edilmiştir yüzyılın ilk yarısında canlılarda kalıtımdan sorumlu bir maddenin olduğu açıklanmaya çalışılmış, Sutton ve Boveri tarafından genlerin kromozomlar üzerinde taşındığı bulunmuş, 1911 yılında Wilson tarafından bir genin yeri saptanmıştır. 1-4 Watson ve Crick, 1953 yılında DNA nın üç boyutlu modelini oluşturmuş, Wilkins de çift sarmallı yapıyı kanıtlamıştır. Bu tarihten sonra genetik olaylar moleküler düzeyde ele alınmıştır. Böylece moleküler genetik bilim dalı doğmuş, bu bilim dalında çalışmalar çok yoğun ve baş döndürücü bir hızla ilerlemiştir. 1-4 Jeffreys tarafından 1985 yılında tanımlanan minisatellit DNA (DNA parmakizi) düzeyindeki analizler ve aynı yıl Saiki tarafından geliştirilen PCR yöntemi adli bilimler alanında yeni bir dönem açmıştır yılında nükleer transplantasyon başarılarak kopya koyun dolly yapılmıştır yılında insan genomu haritalanması tamamlanmıştır. 1-4 Günümüzde yeni araştırmalarla yeni genetik markerler tanımlanmaya devam etmekte, gen tedavisi araştırmaları, gen frekans çalışmaları büyük bir hızla sürmektedir. 3

14 2.2 Genetiğin Adli Tıpta Kullanımı Genetik bilimindeki ilerlemeler Adli bilimlerdeki uygulama alanlarını da genişletmiştir. Teknolojik gelişmelerle birlikte çağdaş hukuk sistemi adli bilimlerden daha kesin sonuçlar istemektedir. Adli olgularda DNA analiz yöntemleri kullanılarak kimliği meçhul cesetlerin kimliklendirilmesinde, babalık annelik davalarında, toplu felaketlerde kurbanların kimliklendirilmesinde, akrabalık ilişkilerinin gösterilmesi (soy davaları) ve suçlunun bıraktığı biyolojik materyalden suçlunun kimliğinin saptanmasında yararlanılmaktadır. 5,6, Adli Amaçlı Kimliklendirme Kimliklendirme bir kişinin ayırdedilmesinde farklı özelliklerin ortaya konması olarak tanımlanabilir. Tek yumurta ikizleri haricinde her bireyde eşsiz, kendine özgü genetik imza mevcuttur; bu genetik imza rekombinant DNA teknolojileri ile gösterilebilir. Adli bilimlerde kişilerarası farklılıklar yani polimorfizm çok önemlidir. Adli olgulardan elde edilen her türlü biyolojik materyalin kimliklendirilmesinde ya da birbiriyle akrabalık ilişkilerinin gösterilmesinde polimorfik özelliklerden yararlanılmaktadır. Adli seroloji ve adli hemogenetik bu konularla uğraşan adli bilim dallarıdır yy başlarında kan grubunun tanımlanmasından sonra eritrosit antijen sistemleri, izoenzim markerlar, insan lökosit antijenleri (HLA) bulunmuş ve bireysel ayrım amacıyla kullanılmıştır. Kan grubu antijenlerinin kullanılmasıyla % 80 lere varan ayrım gücü sağlanmıştır li yıllarda bunlara ek olarak kullanılan insan lökosit antijenleri (HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ) kimliklendirme ve nesep tayininde % 99 un üzerinde ayrım gücü sağlamıştır. Konvansiyonel yöntemler olarak bilinen bu yöntemler son 20 yıl öncesine kadar kullanılmaktaydı. 6,9 İlerleyen yıllarda DNA yapısının ve fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması ve gelişen teknolojiyle kimliklendirmede daha güçlü ayrım sağlayan sistemler keşfedilmiştir. Bu sistemler DNA üzerinde bulunan polimorfik alanlara dayanmaktadır. İki tür polimorfizm saptanmıştır. 4

15 1- Sekans Polimorfizmi: Tek nükleotid farklılığına dayanan diamorfik polimorfizm, bunlarda ayrım gücü düşüktür. 2- Uzunluk Polimorfizmi: Belirli sayıda baz diziliminin baş-kuyruk olacak şekilde ardarda tekrarından oluşan dizilim. Bu dizilim tekrar sayıları da kişiden kişiye değişmektedir. Bu tip polimorfizmler değişen sayıda ardarda tekrar (variable number of tandem repeat, VNTR) lar olarak isimlendirilir. Ayrım gücü yüksekliği nedeniyle adli amaçlı incelemelerde tercih edilirler. 8,10,11 Bu tip polimorfizmler otozomal kromozomlar üzerinde olabildiği gibi insan Y kromozomu üzerinde de bulunmaktadır. 10, Semen Sıvısı Erkeğin cinsel aktivitesi sonucu oluşan ejakulat sıvısı semen olarak isimlendirilir. Semen içeriğinin % 60 ı seminal keseden, % 20 si prostat bezinden, % i bulboüretral, üretral, duktus epididimis ve duktus deferensten salgılanan sıvılardan ve % 5 i spermatozoadan oluştuğu bildirilmektedir. 13,14 Semen sıvısının biyokimyasal içeriğinde fruktoz, asit fosfataz, spermin, PSA, çinko, v.s. çok sayıda bileşik bulunmaktadır. 15 Semen kendine özgü kestane çiçeği kokusundadır. Üç günlük cinsel perhiz sonrası alınan ejakulat hacmi ortalama 2-5 ml ve taze ejakulat gri-beyaz opelesan görünümdedir. Seminal plazmanın ph si turnusol kağıdı ile ölçüldüğünde hafif baziktir (ph: ). Ejakulasyondan 5-40 dakika sonra önce koagülasyon, ardından likefaksiyon görülür. 16 Dünya Sağlık Örgütünün sperm konsantrasyonuna göre normal spermiyogram parametrelerine bakıldığında normalde sperm sayısı 20 milyon/ml üzerinde değerlerdir. Oligozoospermi sperm sayısının azalması, azoospermi ise ejakulatın santrifüj edilmesine rağmen hiç sperm görülmemesidir. Mikroskobik incelemede çok sayıda eritrosit kanamayı, lökosit ise (normalde 1 milyon/ml den az) enfeksiyonu düşündürür. Ayrıca mikroskobide makrofajlar, dev hücreler, sertoli hücreleri ve bakteriler görülebilir. Günümüzde otomatize edilmiş sistemlerle semen analizi yapılmaktadır. 14,17 5

16 2.4.1 Semen Lekelerinin İncelenmesi Suç sayılan cinsel amaçlı davranışa maruz kalan mağdurda fizik muayene ile birlikte semen lekelerinin varlığı araştırılmalıdır. Önceki uygulamalarda cinsel saldırı olgusunda tanı kriteri içerisinde en anlamlısının mağdurun vücudunda, elbiselerinde veya eşyalarında ejakulat sıvısı veya bulaşığının saptanması olduğu belirtilmektedir. 18,19 Spermatozoitlerin mikroskop yardımı ile gösterilmesinin bu yöntemlerin en güvenilir olduğu vurgulanmakta, ancak şüpheli materyalde spermatozoit görülmemesi incelenen örneğin semen olmadığını ekarte ettirmemektedir. 9,19 Bu nedenle semen lekelerininin ayrımında kullanılan kimyasal yöntemler sperm görülmesine dayanan mikroskopik yöntemlere tercih edilmiştir. 9 Bundan önce semen sıvısı içerisindeki farklı komponentler ve bunların fonksiyonları konusunda ayrıntılı çalışmalar yapılmıştır. Elbise, çarşaf gibi geniş alanlar üzerindeki semen lekelerinin nm dalga boyunda mor ötesi (wood ışığı) ışık altında mavi-beyaz floresan verdiği bilinmektedir. Ancak günümüzde tekstilde kullanılan çok sayıda kimyasal maddenin yanlış sonuç verdiği bildirilmektedir. 9,19 Semen içeriğindeki asit fosfataz (AP) düzeylerinin diğer dokulara göre kat daha fazla olması, deneylerin çok duyarlı olması, 64 kata kadar sulandırılan leke ve örneklerde sonuç vermesi, 20 yıl kadar eski semen lekelerinde saptanabilmesi onu bir süre önemli bir marker yapmıştır. Ancak AP ın da enzim aktivitesinin kaybına bağlı olarak negatif sonuçlar alınabileceği bildirilmektedir. 9, yılında tanımlanan lösin aminopepdidaz enziminin prostat kaynaklı ve ejakulat içinde çok yüksek aktivitede olduğu bulunmuştur. Semen lekelerinin tespitinde kullanılan renk reaksiyonuna dayanan yöntem geliştirilmiştir. Vazektomi uygulanan kişilerde de sonuç alınmıştır. 9,19 Semen içeriğinde çok yüksek düzeyde bulunan kolinin temel kaynağı olan fosforilkolinin seminal veziküllerden sentezlendiği, vazektomize kişilerin bıraktığı semen sıvısı ve lekelerden tespitinin uygun olduğu, 5 yıl bekletilen semen lekelerinin tümünde olumlu sonuç alındığı, bu sürenin 24 yıla kadar çıkabileceği bildirilmektedir. 9,19 6

17 1985 yılında bir proteolitik enzim olan proteinaz K ile ortamda bulunan vajinal epitel hücrelerin yıkıma uğratılarak spermatozoitlerin rahatça görülebildiği, spermde ABO kan gruplaması yapılabileceği bildirilmiştir. 20 Prostat spesifik antijen (PSA, p30 antijeni) bazı özellikleri nedeniyle asit fosfatazın yerini almıştır. Yapılan çalışmalarda p30 antijeninin prostat küboid asini hücrelerinde üretildiği gösterilmiştir. Adli belirteç olarak kullanılma nedeni; biyolojik özgüllüğü, vazektomili şahıslarda problem olmaması, çok az miktarlarda bile saptanabilmesi ve kurutulmuş lekelerde uzun süre (12-16 yıl) sonra bile saptanabilmesi olduğu belirtilmektedir. 13,21, Semen Lekelerinden Suçlunun Kimliklendirilmesi Semen sıvısına özgü markerlerin kullanılması ve lekenin semen lekesi olduğunun belirlenmesi olayın gerçekleşip gerçekleşmediğinin ortaya konmasında önemlidir. Sadece cinsel aktivitenin varlığını kabul ettiren bu değerler suçlunun kimliklendirmesinde yetersiz kalmaktadır. 9 Bu nedenle DNA bazlı genetik çalışmalar yapılmadan önce kan grupları, eritrosit enzimleri, serum proteinleri, hemoglobin ve lökosit antijenleri düzeyinde ifade edilen genetik varyasyonlardan yararlanılmıştır. 23 Geçmişte semen lekelerinden absorbsiyon-elüsyon ve absorbsiyon-inhibisyon teknikleri ile sekretör kişilerde ABO grup tayini yapılmaktaydı. Fakat semen lekelerinin bazı deterjanlarla yıkanması yanlış sonuçlara neden olabildiğinden günümüzde kullanılmamaktadır. 24 Özellikle adli kanıt niteliği olan lekelerin kimliklendirilmesinde polimorfik antijen, enzim ve protein sistemlerinin tanımlanması zordur. Bu sistemlerin kötü çevre koşullarında kontaminasyon, ısı, ışık, nem- aktivitelerini koruyamadıkları saptanmıştır. 25 Yukarıda bahsedilen polimorfik belirteçler adli bilimciye değerli kanıtlar sunabilmesine karşın bazı dezavantajları vardır. Bu belirteçler daha çok taze kan ve kan lekelerinde etkin olarak kullanılmaktadır. Kişilerarası polimorfik düzeyleri sınırlı olduğundan tek başlarına biyolojik tanımlayıcı olarak kullanılması uygun değildir. Kişiye ait olduğu veya olmadığını söyleyebilmek için tüm protein ve antijenik belirteçlerin çalışılması gereklidir. Bunları saptayacak yöntemler büyük miktardaki biyolojik kanıta gereksinim duymaktadır. 23 7

18 Günümüzde semen lekelerinin ve diğer her türlü biyolojik materyalin adli amaçlı kimliklendirmesinde STR lokusu sistemler kullanılmaktadır. 13, İnsan Y Kromozomu Yapısı Her erkekte tek Y kromozomu bulunmaktadır. İnsan genomunda Y kromozomu homoloğu yoktur. Bu durum hemizigozite olarak bilinir. Y kromozomu insan genomunun % 2 sini oluşturur ki bu da 60 milyon baz (60 Mb) çiftine denk gelir. Cinsiyet kromozomları olan X ve Y kromozomlarının sonlarındaki rekombinasyonun mikroskopik olarak gözlenmesi bu iki kromozomun bir çift olarak tanımlanmasının kanıtı sayılmıştır. Yakın zamanda yapılan çalışmalarda Y kromozomunun % 95 ini oluşturan X-Y kros-over inin olmadığı bölgeler nonrekombinasyon bölgeleri olarak adlandırılmıştır. Rekombinasyon sadece kromozomun uzun ve kısa kollarının distal bölgelerinde olur. Bu iki bölge, psödootozamal bölgelerdir (PAR1 ve PAR2). 12,26 Nonrekombinasyon bölgesi haploid şekilde bulunur ve babadan oğula (paternal) değişmeden aktarılır. Bu özelliği Y kromozomu polimorfizmi açısından önemlidir. Şekil 1 de insan Y kromozomu yapısı görülmektedir. Şekil 1. İnsan Y kromozomu yapısı 12 8

19 Y kromozomu sınırlı sayıda işlevsel gen içermektedir. Kromozom üzerinde tek kopya ve çok kopya genler bulunur. Bunlardan biri kromozomun kısa kolunda bulunan SRY (sex reversal Y) genidir ve testis gelişimini başlatmaktadır. 26,27 Bu genin mutasyona uğraması kısır bir erkeğe neden olur. Son çalışmalarda Yq kolunda bulunan AZFa, AZFb, ve AZFc (azoospermi faktörleri) bölgelerinin mikrodelesyonlarının erkek infertilitesinden sorumlu olduğu bildirilmiştir. Y kromozomu üzerindeki bir çok genin tam fonksiyonu bilinmemektedir. 12,26 Y kromozomunun % 60 dan fazlası kromozomun q kolunda bulunan tekrar motiflerinden oluşur. 28 Yapısal olmayan DNA bölgelerinde bulunan ardışık kısa tekrar bölgeleri (satellitler) tüm kromozomlarda bulunmakta ve yüksek düzeyde polimorfizm göstermektedir. 29 Satellitler ardarda tekrar birimin uzunluğuna göre isimlendirilirler. Uzun tekrarlar makrosatellit, kısa tekrarlar minisatellit, çok kısa tekrarlar ise mikrosatellit (short tandem repeat-str) olarak isimlendirilir. STR ler bunların en polimorfik olanlarıdır, çünkü ardarda tekrar uzunlukları 2-5 baz çiftidir, tekrar sayıları değişir ve replikasyon kayması daha fazla görülür. STR ler yapısal gen bölgeleri değildir, ancak kalıtıma uğradığından gen olarak kabul edilirler Short Tandem Repeat Lokusları STR (Short Tandem Repeat, mikrosatellit) ler 2-5 baz çifti uzunluğunda belli bir ünitenin ardarda tekrarıyla oluşmuş baz dizilimi bölgeleridir. Bu bölgeler tekrar ünite sayısının varyasyonuna bağlı olarak çok fazla miktarda uzunluk polimorfizmi gösterirler. İnsan genomunda binlerce polimorfik mikrosatellit (STR) saptanmıştır. Yaklaşık her 10 bin nükleotidde bir görülürler. 6,7,10,30 STR lokusları kimliklendirmede, antropolojik araştırmalarda, genetik haritalamada ve babalık-annelik tayininde ve akrabalık ilişkilerinin gösterilmesinde kullanılmaktadır. Bir lokusun adli belirteç olarak kullanılabilmesi için bazı şartlar gereklidir. 1- Lokusun mendel kalıtımına uyması, 2- Lokusun kromozomdaki yeri ve allellerin genetik dengede olması, 3- Mutasyon sıklığının bilinmesi, 4- Populasyona ait allel frekansların bilinmesi gereklidir. STR lokusları tekrar ünite sayısı farklılığı yanısıra tekrarlanan ünitelerin yapısı veya tek baz dizilim farklılığı da gösterebilir. Buna göre STR ler üçe ayrılır; 9

20 1- Basit tekrarlar: tekrar ünitesinin farklı sayıda tekrarından oluşur. 2- Bileşik tekrarlar: birden fazla tekrar ünitesi içerir. 3- Kompleks tekrarlar: baz sayısı ve baz dizilimi farklı olan birkaç tekrar ünitesi. 29, Parçalanmış DNA Örneklerinde Short Tandem Repeat Kullanımının Avantajı STR lokuslarının küçük ürün boyutlarında bile amplifiye edilebilmesi özelliği sayesinde STR primerlerinde intakt DNA zinciri bulma şansı yüksektir. Parçalanmış örneklerdeki 190 lık DNA moleküllerinin iç yapısının daha uzun parçalara göre daha stabil olduğu bulunmuştur. 31 Bu nedenle dar boyut aralığındaki STR allellerinin analizi özellikle parçalanmış örneklerde daha avantajlıdır. 10 Yapılan çalışmalarda parçalanmış DNA da PCR amplifikasyonun başarısı lokus büyüklüğü ile ters orantılı bulunmuştur. Lokusun başarılı tiplendirmesi o lokusun allel uzunluğuna bağlıdır. 10 Parçalanmış DNA örnekleri analiz etmedeki başarı düşünüldüğünde ilk defa 1999 yılında kullanılmaya başlanan Multiplex STR markerları eski sistemlere göre daha üstün olduğu görülmektedir. STR ler tek lokus probu kullanan RFLP metoduna nazaran daha hassastır. VNTR sistemlerine göre de (örneğin D1S80 gibi) allelik ayrışmaya daha az meyili olduğu saptanmıştır Adli Amaçlı Kullanılan Y Kromozomu Short Tandem Repeat Lokusları STR ler insan Y kromozomunda da bulunur. Otozomal STR markerleri gibi Y- STR ler de küçük veya parçalanmış örneklerin tiplendirilmesinde kullanılır ve aynı cihaz platformunda analiz edilebilirler 8. Adli uygulamalarda tetranükleotid tekrar üniteleri içeren lokuslar daha çok tercih edilirler. Tetranükleotid tekrar içeren lokusların tanımlanması sırasında hata payının az olması, jelde ayrımının daha kolay olması ve amplifikasyonu tamamlanan örneklerin elektroforezinde artık ürün oluşumunun daha az olması bazı avantajlarıdır 6. Adli amaçlı kimliklendirme ve paternite çalışmalarında kullanım için genel bazı kriterler göz önünde bulundurulmalıdır. Bunlar içerisinde, 1- Hassasiyeti yüksek lokus kullanımı, 10

21 2- Lokusun allel uzunluklarının baz çifti arası olması, 3- Lokusun ayrım gücünün %90 ın üzerinde olması, 4- Kötü ve bozulmuş örneklerde sağlıklı ve güvenilir sonuç vermesi, 5- Farklı örneklerde sağlıklı sonuç verebilmesi sayılabilir. 6 Adli amaçlı kullanılan Y-STR lokusları Ek te sunulmuştur Y Kromozomu Short Tandem Repeat lerin Adlandırılması Gün geçtikçe yeni lokusların ve bunlara ait allellerin bulunduğu göz önüne alındığında karışıklığa yol açmamak için isimlendirmenin standardize edilmesi şarttır. STR lokus ve allellerinin isimlendirmesinde olduğu gibi Y kromozomu STR lerinin isimlendirmesi de aynı prensipler çerçevesinde yapılmaktadır. İsimlendirme hususunda ISFG (International Society of Forensic Genetics) komisyonlarının tavsiyeleri doğrultusunda D#-S # sistemine göre yapılmaktadır. Örneğin DYS19 lokusu Y kromozomunda bulunduğu ve toplam tekrar ünite sayısı dikkate alınarak isimlendirilmiştir. 5, Y Kromozomu Short Tandem Repeat Kullanımının Avantajları Kadın-erkek karışık örneklerde kadın DNA sının baskın olduğu durumlarda otozomal STR tiplendirmesi yapılamamaktadır. Tipleme yapılsa dahi kadına ait allellerin ve bunların stutter (hedeflenen ana pikten 4 baz kısa fazladan pik) piklerinin varlığından dolayı sonuca gitmek zorlaşmaktadır. Y-STR bazlı tiplendirmede sadece erkeğe özgü primerler kullanıldığından bu durumlarda oldukça etkili oldukları ve birden fazla kişiye ait karışık semen örneklerinde de otozomal STR sistemine göre üstün oldukları kabul edilmektedir Eski ve Parçalanmış Örneklerden DNA Eldesi İç ve dış faktörlere bağlı olarak hücreler 2 değişik ölüm şeklinden birini yaşarlar. Bunlar apoptozis veya nekrozdur. 24,33 Apoptozis enerji bağımlı bir olaydır ve endojen endonükleazların aktivasyonu ile DNA 180 lik parçalara ayrılır. 24,33 Nekroz enerjiden bağımsız dejeneratif bir olaydır, rastgele bir DNA parçalanma paterni görülür

22 Postmortem süreçte DNA parçalanma sürecini başlatmada ilk ajanlar arasında endojen nükleazlar başroldedirler. Lizozomal enzimlerce histon proteinlerin yıkımı endonükleaz enzimlerin DNA yı parçalamasını kolaylaştırmaktadır. Postmortem DNA parçaları çevrede bulunan mikroorganizmalarca salınan eksojen nükleazlarca parçalanmaya devam eder. Sonrasında hidroliz ve oksidasyonla görülen parçalanma çok yavaş bir hızla DNA yapısını modifiye edecektir. 35,36 Hücre ölümünün daha geç evrelerinde hücre zarlarının kaybı ile besinden zengin sıvıların serbestleşmesi çevresel mikroorganizmaların büyümesine ve makromoleküllerin parçalanmasına zemin hazırlar. 37,38 Kuru çevre DNA yıkım oranını azaltmaktadır. 39 Örneğin 20 derece sıcaklık düşüşü ile nükleotid baz dekompozisyon oranı kat azalmaktadır. 40 Suyun varlığı hidrolitik enzimlere substrat sağlar ve bakterilerin büyümesini destekler. 39 Ortamdaki enzimlerin ekspresyon derecesi, iyonların varlığı, sıcaklık ve ph gibi durumlar parçalanmanın oranını etkilemektedir. 41 Enzimatik yıkımı, çok daha yavaş ama devam eden nonenzimatik ya da spontan DNA yıkımı takip eder. 42 DNA fosfodiester bağı nonenzimatik hidrolize yüksek derecede dirençli iken, glikozidik bazlı şeker bağı en duyarlı bağdır. 43,44 Nonenzimatik yıkım oldukça yavaştır. İntrasellüler içeriğe benzer iyonik konsantrasyonlu ortamda (37 C de ve 7,21 ph de) pürinsiz bölgenin saat arası yarı ömre sahip olduğu belirtilmektedir. 44 Teorik olarak 15 C de 800 lik DNA parçalanmasının gerçekleşmesinin 5-10 bin yıl alacağı bildirilmektedir. 45,46 Ortamdaki aerobik mikroorganizmalarca oluşturulan serbest oksijen radikalleri oksidatif hasara neden olabilir. Primidinlerin (özellikle timin) oksidatif hasara pürinlerden daha hassas olduğu belirtilmektedir. 47 Bir adli DNA laboratuvarına gelen örnekler genellikle idealden az ve bozuktur. Kayıp bir insanın kimliğinin araştırılması örneğinde olduğu gibi olaya kanıt olabilecek materyaller günler aylar ve hatta yıllar boyu kötü çevresel şartlara maruz kalmıştır. Örneğin cinayet kurbanları kimsenin bulamayacağı yerlere bırakılır. Suç alanındaki DNA molekülleri çoğu zaman bozuk, kirli ve saf olmayacak hale gelmiştir. Bir başka sorun olay yerinden elde edilen biyolojik materyal miktarının bazen çok az olmasıdır. Dolayısı ile bu tip limitli bir örnek adli bilimciyi tek bir analizde güvenilir sonuç elde etmeye zorlamaktadır. Çeşitli çevresel maruziyetler sonrasında DNA nın rastgele kırılması sonucu DNA molekülleri küçük parçalara ayrılmaktadır. 12

23 Ortamda bulunan su ve DNA yı sindiren nükleaz enzimleri DNA nın intakt olarak kalmasına engel olur. 24,33 RFLP gibi eski teknolojilerde çok parçalanmış DNA örneklerinin analizi oldukça zordu. Günümüzde kullanılan PCR metodlarında Multiplex STR kullanımı sayesinde çok az DNA olsa dahi saptanabilir düzeylere yükseltilebilir. RFLP metodunda DNA eldesi için 100 ng DNA gerekirken, Multiplex kalıp kullanılarak 1 ng dan daha az DNA başarılı bir şekilde amplifiye edilebilir. 10 Amplifikasyonun başarılı olabilmesi için iki primerin bağlanabileceği hedef bölgenin sağlam olması gerekir. Bu şekilde tam uzama olur. STR bölgesini çeviren ve sağlam bir kalıp çizgisi olmayan DNA nın PCR ı başarısız olur. Dolayısı ile uzama kırık bölgede durur Polimeraz Zincir Reaksiyonu İlk kez 1985 yılında geliştirilen bu metodla hedef DNA bölgesinin milyonlarca kopyası elde edilebilir. PCR tekniği kalıtsal hastalıklar, genom çalışmaları, kimliklendirme, ziraat ve zootekni gibi birçok bilim dalında yaygın kullanılmaya başlanmıştır. Bu yöntemin hassas, spesifik olması yanında rutin uygulamalarda kolaylığı ve hızlı sonuç alınabilmesi gibi avantajları vardır. 6,7,30 PCR bazlı sistemler RFLP metoduna göre daha küçük ve sağlam dizilere ihtiyaç duyar. Birkaç yüz bazlık parçalar başarılı bir amplifikasyon için yeterlidir. Hassastırlar ve 0,3-0,5 ng DNA (RFLP metodundan 100 kat daha az) içeren örneklerde bile başarılı sonuç verir. 8 PCR üç basamaktan oluşur. Denaturasyonda C sıcaklıkta çift iplikçiğin birbirinden ayrılması sağlanır. Böylece komplementer DNA zincirleri solüsyonda serbest kalır. İkinci aşamada sıcaklık C ye düşürülerek DNA polimeraz enzimi varlığında primerlerin kalıp DNA ya yapışması sağlanır. Son aşamada sıcaklık C ye çıkarılarak primer ekstansiyon ile DNA ya komplementer bir zincir sentezlenir. Bu üç basamak bir döngü olarak kabul edilir. Normal bir PCR da döngü kullanılır. Bu sayı araştırılan hedef DNA dizisine ve kullanım amacına bağlı olarak değişir. 6,7,30 PCR uygulaması Thermal Cycler adı verilen cihazla yapılmaktadır. 30 Uygulamada µl lik hacimlerde çalışılır. 8 Günümüzde bazı firmalar tarafından üretilen hazır 13

24 kitler mevcuttur. Optimal konsantrasyonda hazırlanan bu kitler sayesinde amplifikasyona hazırlık süresi kısalmakta ve olası hatalar en aza inmektedir. 30 Son yıllarda hem PCR metodunda kullanılan cihazlar hem de sonraki basamaklar için geliştirilen cihazların otomasyonu sayesinde zaman ve malzeme tasarrufu sağlanmaktadır. Tablo 1 de PCR amplifikasyonunda kullanılan kimyasallar görülmektedir. 10 Tablo 1. Polimeraz zincir reaksiyonu amplifikasyonunda kullanılan kimyasallar 8 Ayıraç Optimal konsantrasyon Tris-HCL, PH 8.3 (25 C) mm Magnezyum klorid 1,2-2,5 mm Potasyum klorid 50 mm dntp ler Herbirinden 200 µl DNA polimeraz 0,5-5 U Bovin Serum Albumin 100 µg/ml Primerler 0,1-1µM Templat DNA 1-10 ng genomik DNA Polimeraz Zincir Reaksiyonu İnhibisyonu Adli kanıt niteliğindeki örneklerin analizinde karşılaşılan başka bir sorun, örneğin kendi içinde bulunan inhibitör maddelerin PCR amplifikasyonunu engellemesidir. 8,10,31 Tekstil boyaları veya hemoglobin gibi maddelerin DNA ile aynı ortamda bulunması PCR sırasında DNA polimerazla etkileşerek başarılı bir PCR yapılmasını engelleyebilir. Örneğin Hematin gibi bir inhibitör varlığında amplifikasyon yapılması durumunda bazı STR lokusu allelleri amplifiye olmayabilir. Bir örnekteki STR lokusunu amplifiye etmede başarısız olunduğunda iki ihtimal düşünülür; birincisi; yeterince sağlam DNA kalıbının olmadığı parçalanmış DNA nın olması, ikincisi; inhibisyona yetecek düzeyde ortamda bulunan PCR inhibitörünün polimeraz aktivitesini azaltmasıdır. 10,31 14

25 Polimeraz Zincir Reaksiyonu İnhibisyonunun Engellenmesi İnhibisyonun engellenmesi için genomik DNA kalıbının dilüe edilmesiyle ortamda bulunan inhibitör madde de dilüe edilmiş olur. Böylece amplifikasyon gerçekleşebilir. 10 İnhibitör maddenin üstesinden gelebilmek için bir başka yol ortamda bulunan DNA Polimeraz enzimi miktarının artırılmasıdır. Bu sayede Taq Polimerazın bir kısmı inhibitör moleküle bağlanarak devre dışı kalır. 10 Yakın geçmişte ve halen PCR inhibisyonunu önlemek için bovin serum albumini veya DNA yı sodyum hidroksit ile muamele etme yöntemleri kullanılmıştır. Yine ekstrakte edilen DNA yı ayrıştırmak için özel filtreler kullanılmaktadır Kantitatif (Real-Time) Polimeraz Zincir Raksiyonu Kinetik PCR, homojen PCR, kantitatif real-time PCR gibi isimlerde kullanılır. Floresan işaretli prob ve boyaların kullanıldığı, floresanın oluşan DNA ile doğru orantılı olarak arttığı bir yöntemdir. Biyolojik örneklerdeki DNA miktarını belirleme yanında, nokta mutasyonları, patojen belirleme, SNP (Single nucleotide polymorphism) analizi gibi çeşitli işlemleri gerçekleştirebilir. 48,49 Özgül olmayan belirleme sisteminde SYBR Green I yöntemi kullanılır. Kullanılan floresan boya sadece çift zincirli DNA ya bağlandığından çoğalan DNA miktarı arttıkça cihazda okunan floresan miktarı görülür. Uzama başladığında bu floresan boya molekülü çift zincirli DNA arasına girerek sinyalin artmasına neden olacağından bu monitorden takip edilebilir. Bu yöntemin avantajı maliyetin ucuz olmasıdır. 48,49 Dezavantajı ise hedef DNA dışındaki DNA nın da çoğaltılması ve ölçülmesidir. Ya da ortamda DNA olmadığında primerlerin birbiriyle bağlanmaları sonucu primer dimer oluşumu ve yanlış ölçümdür. Bunun üstesinden gelebilmek için DNA erime eğrisi analizi (melting curve, dissociation) yapılmalıdır. Her çift zincirli DNA molekülünün kendine özel erime sıcaklığı (Tm) vardır. Tm, DNA nın boyutu ve dizilimine göre değişmektedir. Cihaz PCR tüplerini ısıttığında DNA molekülü arasındaki boyanın serbest kalması ile bir erime eğrisi grafiği çıkarılır. Erime sıcaklığı bilinen ürünle karşılaştırmalarda bu yöntem güvenilirdir. 48,49 15

26 Çoğaltılmak istenen DNA parçası özel bir bölge ise bu bölgeye spesifik floresan işaretli problar kullanılır. Bu teknikler TagMan probu, moleküler boncuk yöntemi, hibridizasyon prob yöntemi gibi çeşitleri kullanılmaktadır. 48,49, Kapiller Elektroforez Kapiller elektroforez (KE) molekül boyutu farklılığı, elektriksel alandaki hareket kabiliyeti, faz ayrımı gibi özelliklere göre ayrım yapan bir tekniktir. 51 İlk elektroforez ile DNA ayrıştırması 1980 li yılların sonunda yapılmıştır. KE, elektroforez ailesine yeni katılmış, 1990 lı yılların ortalarında yeni enstürmanların kullanılması ile hızla popüler olmuştur. 10 Ana elemanları dar bir kapiller, kapillere polimer dolduran şırınga, her iki kutupta geçirgenliği sağlayan tampon hazneleri ve yüksek voltajlı güç kaynağıdır. 10,51 Bunların yanında bir lazer, bir floresan dedektör, tarayıcı ve bilgisayar da kullanılır. İdeal bir kapiller µm çaplı, uzunluğu cm arası değişebilen silika veya başka maddelerden yapılan bir borudur. Kapiller yüksek ısı iletkenliğine sahip ultraviyole radyasyona karşı şeffaf, adsorbe bileşenlere yanıtsız özellikte üretilir. 10,51,52 Ayrım yüksek voltaj (5-30 Kv, µa) altında V/cm doğru akımla sağlanır. 35 Bu akımla hem moleküller elektrikle yüklenir hem de tüm solüsyonun hareketi sağlanır (elektro-ozmoz). 51 Kapiller elektroforez sisteminin kullanıldığı adli genetik incelemelerde PCR ürünlerinin LIF (Lazer indüklenen floresan) dedektörler ile saptanması gerektiğinden PCR ürünleri floresan primerlerle etiketlenir ya da primer boyalarla işaretlenir. 52 STR analizlerinde DNA parçacıklarının deteksiyonu için kullanılan tarayıcıların avantajı yüksek düzeyde dijital veri stoğu oluşturabilmeleridir. 5 Negatif yüklü DNA molekülleri polimer içerisinde ve yüksek voltaj altında anoda doğru hareket eder. Hareket hızı, polimer yapısı, DNA molekülün büyüklüğü ve elektriksel kuvvete bağlıdır. 51 Günümüzde kullanılan cihazlarda tam otomatizasyon sağlanmıştır. Kapiller tüp her örnek için yeniden polimerle doldurulur. DNA içeren örnek kapiller içine alınarak sabit voltaj ve sabit sıcaklıkta anota doğru hareket eder. DNA molekülleri kapillerin silika ile kaplanmayan bölgesinden (yanık penceresi) geçerken buradaki lazer ışınına göre bağlandıkları primerin rengine göre değişik dalga boyunda ışın yayarlar. Primerler kullanılan ticari kite göre 5 ayrı boya (6-FAM, VIC, 16

27 NED, PET, LIZ) ile işaretlenmiştir. 53 Yayılan bu ışın bir CCD (charge-coupled device) kamera tarafından algılanır. Bu veriler bir bilgisayar tarafından algılanarak uygun bir yazılım ile değerlendirilerek ekranda büyüklük ve yoğunluğu ifade eden pikler şeklinde okunur. Bunun okunabilmesi için öncelikle floresan işaretli fragman büyüklüğü bilinen standartlar bu programa okutularak tanıtılmalıdır. 51,53 Standardizasyon işleminde allelik ladder (AL) lar kullanılır. AL bir lokusa ait yaygın allellerin çoğunu içermekle birlikte allel boyutunun standardize edilmesi için gereklidir. 54 KE in çalışma prensibi şekil 2 de görülmektedir. Şekil 2: Kapiller Elektroforezin çalışma prensibi 5, Kapiller Elektroforez ve Jel Elektroforez Yöntemlerinin Karşılaştırılması Her iki yöntem aslında aynı esasa göre çalışmaktadır ve moleküler ayrıştırma mekanizmaları aynıdır. 55,56,57 Jel elektroforezinde kullanılan tamponlar KE de de kullanılabilir. Geleneksel yöntemde DNA moleküllerini elek gibi süzen jel matriks kullanılır. KE de ise elek ortamı olarak vizköz bir polimer kullanılır. Elek ortamında 17

28 DNA molekülleri porlar (fleksibl polimer zincirler) arasında yol alırken büyük DNA molekülleri küçüklerine göre daha yavaş hareket eder. Böylece poliakrilamid jellerdeki porlardan geçen DNA nın boyut bazlı ayrışması sağlanır. Jel elektroforezinde de DNA içeren örnek iki plaka arasına dökülen poliakrilamid jel arasındaki porlardan elektrik kuvveti varlığında ilerler. DNA bantlarının görünür hale getirilmesi için gümüş iyonu kullanılır. Burada oluşabilecek sorun gümüş boyası az olduğunda veya DNA miktarı az olduğunda oluşan DNA bantlarının silik görülmeleridir. Bu nedenle KE küçük hacimli örneklerde veya degrade örneklerde az miktarda PCR ürünü bulunduğu durumlarda daha etkin sonuç verir. Yapılan çalışmalarda KE yönteminin geleneksel jel elektroforez yöntemine göre daha etkin ayrım yapabildiği bildirilmektedir. 51,58,59 Çalışılan örneğin çok küçük olması ve ihtiyaç halinde tekrar çalışılabilmesi yerine konamayan çok az miktardaki adli örnekler için önemli bir avantajdır. Diğer bir üstün yönü enjeksiyon, ayrıştırma ve saptama basamaklarının tamamen otomatik olması ve aynı anda bir çok örneğin çalışılabilmesidir. Kapiller ayrıştırmada kapillerden ısı artışına daha çok izin verdiğinden yüksek voltajlar kullanılarak saatler yerine dakikalar içinde ayrışma tamamlanır. Kantitatif bilgi işlem sonlanır sonlanmaz elektronik formatta elektroforegram olarak hazırdır Elektroforegramın Değerlendirilmesi Tiplendirme sonucu elektroforegramda pik yükseklikleri olarak görülür. Yani DNA molekülleri sayı ve boyut olarak derecelendirilir. Tek bir kişiye ait sonuçlarda birkaç istisna dışında o allele ait pikler tek olarak görülür. Ekstra pikler stutter ürünler (hedeflenen ana pikten 4 baz kısa fazladan pik), inkomplet 3 A nükleotid ekleme, boya artefaktları ve karışık DNA örneklerinde görülür. 10,51,53 Elektroforegramda pik yüksekliği/alan oranı % 70 üzerinde ise tek örnek olduğu düşünülür. Pik yüksekliği/alan oranı % 15 in altında ise bu stutter product olarak değerlendirilir. Oran % arasında ise bu örnekte iki veya daha fazla katılımcının olması muhtemeldir. Bu durumu anlamanın bazı ipuçları vardır. 1- Beklenen allel boyut aralığında 2 den fazla pik gösteren lokus, 2- Bir lokustaki heterozigot alleller arasında belirgin bir pik yükseklik dengesizliği, 3- Stutter product ürünlerin anormal şekilde yüksek görülmesi, 18

29 Otozomal STR lerin incelendiği bir elektroforegramda bunlardan birinin olması halinde karışım karışık bir örnektir. Otozomal STR lerin incelendiği iki farklı kişiye ait DNA içeren örnekte bir lokusta 1, 2, 3 ya da 4 pik görülebilir. 10 a) 4 pik: heterozigot-heterozigot, alleller arası örtüşme yok. b) 3 pik: 1. Heterozigot-heterozigot, bir allel örtüşüyor, 2. Heterozigot-homozigot, örtüşen allel yok. c) 2 pik: 1. Heterozigot-heterozigot, 2 allel örtüşüyor, 2. Heterozigot-homozigot, 1 allel örtüşüyor, 3. Homozigot-homozigot, örtüşme yok. d) Tek pik: Homozigot-homozigot, alleller örtüşüyor. 10 Bazı Y-STR lokuslarında duplikasyon nedeni ile iki allel kalıtılmaktadır. Buna DYS19 ve DYS385 lokusları örnek olarak verilebilir. Klinefelter sendromu gibi birden fazla X kromozomu bulunan durumlarda da Y-STR sisteminin güvenle kullanılabileceği bildirilmiştir. 32,60 19

30 3. GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışmada 5 gönüllü erkekten elde edilen ejakulattan hazırlanan semen lekeleri çalışılmıştır. Gönüllü olarak ejakulat sıvısı vermeyi kabul eden kişilerle karşılıklı görüşme sonrası rıza formu imzalatılarak örnekler alındı. Hazırlanan ve farklı ortamlarda bekletilen 90 adet lekeden Y-STR tiplendirmesinin saptanabilirliği araştırıldı. Bu çalışmanın gerçekleştirilmsi için TF2008LTP4 nolu proje önerisine Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Bütçesinden parasal destek alınmıştır. Form 1. Vericileri bilgilendirme ve rıza formu BİLGİLENDİRME FORMU Bu çalışmanın amacı cinsel saldırı olgularında çok önemli bir delil niteliği taşıyan semen lekelerinde erkek (Y) kromozomu STR profilinin farklı ortam koşullarında saptanabilirliğinin araştırılmasıdır. Gönüllü kişilerden usulüne uygun olarak alınacak ejakulattan gazlı bez üzerine lekeler elde edilerek oda ısısında kurutulacaktır. Kurutulan lekeler oda ısısı (25 C), buzdolabı (4-8 C) ve vücut sıcaklığında (etüvde 37 C de) 6 aya kadar bekletilecektir. Aşama aşama bu lekelerden YSTR profili çalışılacaktır. Elde edilen sonuçlar Adli Tıp Anabilim Dalınca yapılacak çalışmalarda kişilerin ad, soyad veya onları tanıtıcı herhangi bir işaret belirtilmeden veri olarak kullanılabilecektir. Sonuçlar çalışmaya katılan kişilere istedikleri takdirde yazılı olarak bildirilecektir. Ejakulat sıvısı verme işlemi öncesi bu çalışmaya gönüllü olarak katılmak istediğinize dair rıza formunu imzalamanız gerekmektedir. RIZA FORMU Aşağıda imzası bulunan ben Semen Lekelerinde Y Kromozomu STR lerin Farklı ortam Koşullarında Zamana Bağlı Olarak Saptanabilirliğinin araştırılması çalışması hakkında tam olarak bilgi aldım. Bu bilgileri aldıktan sonra bu çalışmaya gönüllü olarak katıldığımı beyan ederim. Gönüllünün Adı Soyadı: Yaşı: Geçirdiği önemli hastalıklar: Evli olup olmadığı: Semen sıvısının alındığı tarih ve saat: Tarih: İmza: 20

31 3.1. Semen Örneğinin Alınması Daha önceki hastalıkları sorgulanan ve 3-4 günlük cinsel perhizi bulunan gönüllü kişilerden masturbasyon yöntemi ile herhangi bir kayganlaştırıcı madde kullanmadan ejakulat vermeleri sağlandı. Bunun için steril, tek kullanımlık kaplar kullanıldı Semen Örneklerinin Makroskobik ve Mikroskobik İncelenmesi (Spermiyogram) Alınan 5 ayrı semen örneği renk, koku, hacim, vizkozite zamanı ve sperm konsantrasyonuna göre spermiyogram tetkiki ile değerlendirildi. Mikroskobik incelemede kullanılan cihazlar: -Makler Sayım kamarası -WLJY-9000 Color Sperm Analysis System cihazı -Motic B2 kameralı mikroskop 3.3. Semen Lekelerinin Hazırlanması ve Saklanması Uygun şekilde alınan ve vizkozite zamanı gelen örneklerin spermiyogram işlemi tamamlandıktan sonra steril 2x2 cm gazlı bezler üzerine steril bir pipetle semen sıvısı damlatılarak lekeler elde edildi. Her örnek için 18 leke hazırlandı. Lekeler oda ısısında iyice kurumaları için bekletildi. Kuruduktan sonra temiz kağıt zarflara konularak her bir örnek için hazırlanan 6 şar leke 1-oda ısısı, 2- buzdolabı, 3-etüv olarak gruplandı. Bu gruplardaki lekeler 1. gün, 1 hafta, 1 ay, 2. ay, 3 ay ve 6 ay olarak işaretlendi. Her grup kendi ortamına kaldırıldı. Zamanı gelen leke çıkarılarak çalışıldı Semen Lekelerinden DNA Ekstraksiyonu Deneyde Kullanılan Cihazlar Termocycler cihazı: GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems, Santrifüj cihazı; Universal 30F Hettich Mikrosantrifüj cihazı: EBA 12 (Hettich Zentrifugen) Su Banyosu: (elektro mag KB6), Vortex: (elektro mag M16) Buzdolabı: (AEG) Derin dondurucu: (Bosch GSD2616ID) Etüv:Memmert Eppenorf tüpleri: ısıya dayanıklı malzemeden yapılmış, 0,5 ml, 1 ml ve 1,5 ml hacim kapasiteli. Pipet ucu: 10 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl DNA, RNA free, steril filtreli pipet uçları Mikropipet: Costar, Pipetman PCR Kantitasyon cihazı (7500 Real Time PCR Systems, Applied Biosystems) Kapiller elektroforez cihazı (3130 Genetic Analyzer, ABI ) 21

32 Deneyde Kullanılan Kimyasal Maddeler Formamid DTT (Sputalyin, dithiotreitol) Proteinaz K POP7 QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN) İÇİNDEKİLER: (Katalog numarası: 56304) -QIAamp MinElute columns -Collection tubes -Buffer ATL -Buffer AL -Buffer AW1 -Buffer AW2 -Buffer AE -Carrier RNA -Proteinaz K AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kit (Katolog numarası: ) İçindekiler -AmpFlSTR Yfiler Primer Set -AmpFlSTR Yfiler PCR Reaction Mix -AmpFlSTR Yfiler Allelic Ladder -AmpFlSTR Control DNA 007 -AmpliTaq Gold DNA Polymerase -AmpFlSTR Control DNA 9947A Quantifiler Duo DNA Quantification Kiti: (Katolog numarası: ) Kitte Bulunan Solusyonların Hazırlanması Buffer AW1çözeltisi; 95 ml AW1 üzerine 125 ml etanol (%98) ilave edilerek oda ısısında saklandı. Buffer AW2 çözeltisi; 66 ml AW1 üzerine 160 ml etanol (%98) ilave edilerek oda ısısında saklandı. Deneyler Bu çalışmada gönüllü vericilerden hazırlanan toplam 90 semen lekesi kullanıldı. Lekeler hazırlandıktan sonra 1.gün, 1. hafta, 1. ay, 2. ay, 3.ay ve 6. ay sonunda her aşamada 15 er leke olmak üzere toplam 90 leke çalışıldı QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN) ile DNA Ekstraksiyonu 1- Semen lekesi bulunan gazlı bezden 0,5 cm 2 materyal alınıp küçük parçalara bölündü. Küçük parçalar 2 ml lik santrifüj tüpüne aktarıldı. Bu tüpün içine 300 µl ATL Buffer ve 20 µl proteinaz K ilave edildi. 20 µl 1 M DTT (dithiothreitol) eklendi, kapağı hafifçe kapatılarak 10 saniye vortekslendi. 2- Hazırlanan karışım 56 ºC su banyosuna yerleştirilerek her 10 dakikada bir 10 saniye vortekslendi. 3- Kısa santrifüj yapılarak kapaktaki damlaların tüpün içine düşmesi sağlandı µl Buffer AL eklendi, 10 saniye vortekslendi C de 10 dakika su banyosunda bekletilirken 3 dakikada bir 10 saniye çalkalandı. 6- Tüp xg de 1 dakika santrifüj edildi. 22

33 7- Dikkatlice üstteki kısım filtreli kolona aktarıldı. 8- Kapağı kapatılarak 6000 xg de 1 dakika santrifüj edildi. Filtreli kolon çıkartılıp yeni bir tüpe takıldı. Alttaki sıvı kısım atıldı. 9- Filtreli kolona 500 µl Buffer AW1 katıldı xg de 1 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası sıvı ve kalan alt tüp atıldı. Filtreli kolonyeni tüpe konuldu. 10- Yeni tüpe yerleştirilen filtreli kolona 500 µl Buffer AW2 katıldı xg de 1 dakika santrifüj edildi. Herhangi bir solüsyon eklemeden filtreli kolon yeni bir tüpe kondu. Alttaki sıvı kısım atıldı. 11- Filtreli kolon xg de 3 dakika santrifüj edildi. 12- Santrifüj sonrası filtreli tüp 1,5 ml ependorf kapaklı tüpe koyuldu. Dikkatlice membran tüpünün kapağı açılarak içerisine 50 µl distile su katıldı. 13- Kapağı kapatıldı, 5 dakika oda ısısında beklendi xg de 1 dakika santrifüj edildi. 50 µl distile su içine alınan DNA örneği PCR yapılana kadar buzdolabı veya 20 0 C ye kaldırıldı DNA Miktarının Ölçülmesi Ekstrakte edilen örneklerin DNA miktarı Quantifiler DNA Duo Quantification kiti ile Real-Time PCR cihazında ölçüldü. Bu ölçümde hem insan DNA sının hem de cinsiyetin belirlenmesi mümkündür. Real-Time PCR da kullanılan malzemeler ve PCR protokolü aşağıdaki şekildedir. Kullanılan malzemeler miktar Reaksiyon karışımı 12,5 µl Primer 10,5 µl Örnek 2,5 µl Çalışmada kit içinde bulunan ve konsantrasyonu bilinen DNA örneğinde 8 farklı DNA solüsyonu hazırlandı ve standart olarak kullanıldı. Standart olarak 200 ng/µl stok solüsyonundan 50, 16,7, 5,56, 1,85, 0,62, 0,21, 0,068 ve 0,023 ng/µl konsantrasyonlarda DNA solüsyonları hazırlandı. 96 kuyucuklu optik reaksiyon plate ine koyulan örneklerde PCR döngü parametresi uygun kuyucuklara 1ng kontrol olarak kullanılan dilüe DNA örnekleri ve bilinmeyen örnekler koyuldu. Aşağıda belirtilen PCR protokolü uygulanarak çalışıldı. PCR sonucunda hazırlanan standart DNA örnekleri içindeki DNA konsantrasyonları baz alınarak yapılan bilgisayar destekli değerlendirme sonucunda bilinmeyen örnekteki DNA miktarı belirlendi. PCR Protokolü Aşama: 90 C de 2 dakika Aşama : 95 C de 10 dakika Aşama : 95 C de 15 saniye Aşama : 60 C de 1 dakika 40 döngü 23