Hemolitik anemilerde tanı yöntemleri. Dr. Şule Ünal

Transkript

1 Hemolitik anemilerde tanı yöntemleri Dr. Şule Ünal

2 Hemolitik anemi Eritrosit yaşam süresi <120 gün

3 Hemolitik anemi Artmış retikülosit (Normali % ) Polikromazi, anizositoz, normoblastlar Hemolitik anemi tipine spesifik diğer periferik yayma bulguları Kemik iliğinde artmış eritroid prekürsörler

4 Retikülositler- New methylene blue EDTA lı kan 4 damla kan:4 damla NMB 10 dk oda sıcaklığında bekle Yayma yap havada kurut X100 büyütmede İmmersiyon yağı ile 1000 hücre sayıp (10 alanda) % olarak ifade edilir.

5 Retikülositler- Parlak krezil mavisi?

6 Polikromazi-PY // Giemsa - Wright

7 Retikülosit (%) (Normali % ) Düzeltilmiş retikülosit (%)= ret % x Hasta Hct Normal Hct (Normali % ) Reticulocyte production Index (%)= Düzeltilmiş retikülosit Maturation correction (Normali %2-3) Hematocrit (%) Retic survival (days) = maturation correction and below 2.5

8 Anizositoz-PY

9 PY de normoblastlar

10 Kemik iliğinde eritroid hiperplazi

11 Hemolitik anemi nedenleri (Etiolojiye göre) 1. INTRINSIK DEFEKTLER 2. EKSTRINSIK DEFEKTLER

12 Ekstravaskuler Hb katabolizması

13 Ekstravaskuler Hemoliz Anemi Serum indirek bil. Uriner urobilinojen Hemoliz ağırsa haptoglobin düşer

14 Intravaskuler Hb katabolizması Düşük serum haptoglobulin Hemoglobinuri Hb degraded in tubules Hemosiderinuri Methemoglobin

15 Anemi Plasma Hb Hemoglobinuri Hemosiderinuri Plazma haptoglobin Plazma methemalbumin Plasma methemoglobin Intravaskuler Hemoliz

16 Haptoglobin Kc* Deri, Bb, Ac AFR Kc hastalıklarında düşük Hayatın ilk 6 ayında düşük

17 Talasemi ve Anormal Hemoglobinler Hb Elektroforezi / HPLC / Periferik Yayma/Retikülosit Boyası

18 HEMOGLOBIN A

19 1 Hb molekülünde 4 globin bulunur (2 çeşit duplicate olarak) Embyonik : Hemoglobin Gower I ( z 2 e 2 ) Hemoglobin Portland ( z 2 g 2 ) Hemoglobin Gower II (a 2 e2) Fetal : HbF (a 2 g 2 ), HbA (a 2 b 2 ) Erişkin : HbA, HbA2 ( a 2 d 2 ), HbF.

20 Hb elektroforezi-normal erişkin Hb A Hb A 2 Hb F YAPI a 2 b 2 a 2 d 2 a 2 g 2 Normal % % % (1.5) %

21 Hemoglobinopatiler Hemoglobinopatiler genetik hastalıklardır. İki şekilde olabilirler: 1- Yetersiz normal Hb sentezi (Niceliksel hemoglobinopatiler) >>TALASEMİLER 2-Anormal Hb sentezi (Niteliksek hemoglobinopatiler) >>ORAK HÜCRELİ ANEMİ 3- Herediter persistan Hb F (γ globin switch gerçekleşemiyor)

22 Talasemiler (ERİŞKİNDE MAJOR Hb, HbA (2α2β) α β

23 1- Hiç globin üretilemiyorsa (a o - ya da b o -talasemi) YA DA 2- Biraz globin sentezi varsa (a + - or b + - talasemi)

24 Hemoglobinopatilerin tanısında Tam kan sayımı Periferik yayma HPLC (High pressure liquid chromatography)

25 Periferik yayma Hb S: Orak hücreli anemi Hb C: Hedef hücreler, Hb C kristalleri Talasemiler: Mikrositoz, hedef hücreler, bazofilik noktalanma

26 ORAK HÜCRELİ ANEMİ

27

28

29 Elektroforez HPLC GÜNÜMÜZDE HALA HPLC İÇİN ELEKTROFOREZ TABİRİNİ KULLANIYORUZ

30 Elektroforez: Yüklü moleküllerin elektriksel alanda hareketi esasına dayanır Hb, amfoteriktir. İçinde bulunduğu çözeltinin ph sına bağlı olarak pozitif ya da negatif yüklenebilir. Genellikle negatif yüklenir. JEL ELEKTROFOREZLERİ: Selüloz asetat agar: ph 8.6 Sitrat agar jel elektroforezi: ph 6.3

31

32 Seluloz asetat elektroforez (ph 8.4)

33 Sitrat Asit elektroforez

34

35 İzoelektrik odaklama Çok daha fazla anormal Hb nin ayırd edilmesine yarar. Amfolit tamponda elektrik verildiğinde Knossos

36 HPLC High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Zayıf katyon değişim kolonu. Elute eden solusyonun ion gücü dereceli olarak artırılır ve farklı Hb ler farklı retansiyon zamanlarıyla ayrışırlar.

37 HPLC HbA2 ve HbF kantite etmede en iyi metod. Hb S, C ve D kendi adları ile elüe olur. HbA2 ve Hb E beraber elüe olur.

38

39 Normal HPLC

40 Normal HPLC, 4 aylık bebek

41 Hb A2 Hemoglobin A 2 ARTMIŞ (>%3.5) β-talasemi taşıyıcılık, Sβ Hb AS, AC, SC, SS, CC Hb Lepore Hb E taşıyıcı AZALMIŞ (<%2) Ağır demir eksikliği anemisi α zincir varyantları

42 BETA TALASEMİ

43 Sessiz Taşıyıcılık %1 lerde Genelde promotor bölge mutasyonları )örneğin: -101C>T) HB MCV MCH HBA2 normal Evlilik taramasında sıkıntı!

44 Beta talasemi taşıyıcı + alfa talasemi taşıyıcı Daha hafif beta taşıyıcılık bulguları Alfa/beta zincir dengesizliği azaldığından HbA2 daha düşük (ANCAK HALA A2>3.5%) Fakat HbH ve beta taşıyıcılık varsa A2 normal olabilir. Evlilik taramasında risk! Anne: Beta tal taşıyıcı ve alfa --/SEA Baba: --/SEA Alfa Hb BARTS riski var

45 HPLC de A2 ile yürüyen Hb ler HbE Hb G-Accra Hb Spanish Town Hb Lepore Hb Kenya

46 ALFA TALASEMİ

47 Retikülosit boyasında Hb H

48

49

50

51 Türkiye de Anormal Hemoglobinlerin Görülme Sıklığı 1-HbS b6 Glu->Val (GAG->GTG) 2-Hb Los Angeles(D-Punjab) b121 Glu->Gln(GAA->CAA) 3-HbE b26 Glu->Lys(GAG->AAG) 4-Hb O-Arab b121 Glu->Lys(GAA->AAA)

52 AS, Orak hücreli anemi taşıyıcı Hb A > Hb S (%40) MCV N SS, Orak hücreli anemi hastası Hb A YOK Hb F %0.5-8 (KLİNİK ŞİDDETİ BELİRLER)

53 Hb A2 Hemoglobin A 2 ARTMIŞ (>%3.5) β-talasemi taşıyıcılık, Sβ Hb AS, AC, SC, SS, CC Hb Lepore Hb E AZALMIŞ (<%2) Demir eksikliği α zincir varyantları

54 Sβ + talasemi Hb S > Hb A Mikrositoz Splenomegali Ebeveynlerin biri S taşıyıcı, diğeri β taşıyıcı

55 Sβ 0 talasemi HbS: % HbF: %0-20 HbA2: %4-6 A YOK MCV düşük Anne baba çalışılması önemli

56 S taşıyıcı + α talasemi AS Hb S < %35 Mikrositoz

57 HbS ile kombine Anormal Hemoglobinler Bölge Klinik HbS/HbD Yaygın Hafif-ağır HbS/E Antalya hafif HbS/HbO Arab+a thal hafif HbS/HbO Arab Nadir hafif

58 HbD (Hb D-Los Angeles, D-Punjab) b121 Glu->Gln(GAA->CAA) Prof. Muzaffer Aksoy Prof Aksoy ülkemizde (Mersin) Hb D nin bulunduğunu göstermiştir Aksoy M, Lehmann H.:A further example of hemoglobin D-in a Turkish Family.Trans Roy Soc Trop Med and Hyg 50:178,1956 % 0.2 genel Türkiye % 0.3 K.Maraş Elbistan

59 Homozigot HbD Genelde asemptomatik ya da Hafif hemolitik anemi Hafif splenomegali Ağrılı kriz yok MCV düşük HB D Los Angeles in a Brazilian family Rev. Bras. Hematol. Hemoter. vol.23 no.3 São José do Rio Preto Sept./Dec Hemoglobin D/Beta (β)-thalassemia: Beta + mutasyon ise hafif anemi, genelde smg yok Beta 0 mutasyon ise sıklıkla ağır anemi, ciddi splenomegali Hemoglobin D/S Ağır ağrılı krizlerle gidebilir

60 Tanı yaşı 1-10 yaş

61 HbE (b26 Glu->Lys(GAG->AAG) Prof. Muzaffer Aksoy Prof Aksoy ülkemizde (Mersin) Hb E nin bulunduğunu ilk kez göstermiştir Aksoy M, Bird GWG, Lehmann H., Mourant AE, Thein H and Wickremasinghe RLJ.:Hb A and E in a subject from Southern Turkey J Physiol 180:55,1955. Uzak Doğu, Tayland Çukurova %1.3

62 Heterozigot HbE(trait) HbE %25-30 (HPLC de A2) Normal RBC morfolojisi Homozigot HbE HbE %98, F %2, A yok Asemptomatik Hafif anemi Hipokrom, mikrositer, target hc.

63 E + Beta HbE HbF HbA Beta 0 mutasyon %30-70 Kalanı - Beta + mutasyon + (%50-60) + (%30-35) + (%5) Klinik çok heterojen Talasemi major gibi seyir vs hiç transfuzyon almayanlar Hsmg %80-90 Büyüme geriliği %75

64 HbO-Arab b121 Glu->Lys(GAA->AAA) Hb Egypt de denir Heterozigotlarda hematoloji normal (%30-40 Hb O Arab) Homozigotlarda hafif anemi, mikrositoz Gypsy, Balkan Ülkeleri, Arabistan, Mısır O Arab tanısı için elektroforez gerekli Homozigot Bulgaristan, Yugoslavya, Türkiye

65 Olgu 25 yaşında kadın rutin incelemede PY de target hücreler görülmesi üzerine hematolojiye danışılıyor. Hgb: 15.0 Hct: 42.5 MCV: 87.8 MCH: 31.0 RDW: 12.6

66 HPLC HbF: %0.6; HbA 2 : %2.9; HbA: %56.3, HbC: %40

67 SS CC C trait S trait

68 Homozigot CC Mikrositoz Splenomegali Hafif genelde MCHC yüksek Hemolitik anemi Target hc Kristal formasyonu

69 Homozigot CC

70 HOMOZIGOT Delta-beta Hgb 8-10 Hb A2 yok Hb F %100 HETEROZIGOT MCV düşük Hb A2 N/düşük Hb F %5-15 HPHF Hgb N HbA2 yok Hb F %100 MCV N Hb A2 <%1.5 Hb F %10-30

71 Herediter sferositoz Ozmotik frajilite Otohemoliz SDS Page Electrophoresis

72 MCHC ARTAR

73

74 Ozmotik frajilite Tam kan En az 5 ml Sodyum heparin ya da Lityum Heparin tercihen EDTA da olabilir Gözle ayırdetme ya da Spektrofotometri Artan dilüsyonda salin solusyonları içinde Eritrositlerin hemolize rezistansını ölçer. Hemoliz ne kadar erken başlarsa Ozmotik frajilite o kadar artmıştır.

75 Taze kandan Ya da 24 s 37 o de inkube edilmiş kandan Normal 0.01 ml kan Parafın ile kapat Nazikçe çevir 30 dk oda sıcaklığında bekle Hereditary spherocytosis

76 Ozmotik frajilite 5 dk 1200 devirde santrifuj Supernatanı al Spektrofotemetride 540 nm de oku

77 Ozmotik frajilite Herediter sferositoz AIHA Ciddi yanık Yılan, akrep zehirlenmeleri DEA Talasemiler Orak hücreli anemi

78 OTOHEMOLİZ TESTİ Kontrol GLUKOZ + HERED. SFEROSITOZ HASTASI GLUKOZ + Hasta ve kontrol kanı 48 saat inkübe edilir. Test glukoz eklenmiş / eklememiş olarak yapılır

79 SDS PAGE Electrophoresis SDS amfipatik bir deterjan. Proteinler birbirinden ayrılır. Moleküler ağırlıklarına göre yol alırlar.

80 SDS PAGE Electrophoresis Hangi proteinde defekt var Ne şiddette hastalık

81 Immün Hemolitik Anemiler Direkt Coombs Indirekt Coombs

82

83

84

85 Direct Antibody Test (DAT) (Direct Coombs testi) Hasta kanıyla 5% hücre salin suspansiyonu hazırlanır. Üç tüpe T, PK ve NK yazılır. T (Test), 2 damla 5% saline hücre suspansiyonundan alınır. PC (Positive control), 1 damla anti D serum ve 1 damla Rh + havuz kanı NC (Negative control), 1 damla salin ve 1 damla Rh + havuz kanı Her tüpe 2 damla Anti human globulin eklenir (Coombs reagentı),polispesifik ya da monospesifik Karıştırılır, 1500 devirde 1 dk santrufuj edilir. TEST 22 derecede ve 37 derecede tekrarlanır. Makroskopik ve mikroskopik olarak agglutinasyona bakılır.

86

87 G6PD Eksikliği Periferik yayma Heinz cisimcikleri Kalitatif metod Kantitatif metod Sitoloji Genetik Akım sitometri

88 Bite cells G6PDH eksiklği

89 Heinz cisimleri-metilen mavisi-denature Hb

90 Kalitatif testler Sonuç normal ya da eksik olarak gelir Heterozigotlarla overlap olabilir 1. Floresan spot test (NADP azalması), Trinity R 2. Dye reduction test, Biorapid R, Trinity R ve Dojindo R (indofenol, parlak krezil mavisi, metilen mavisi) (NAPDP >NADPH) (Boya >) 3. Binax now G6PD test, Alere Inc R

91 Florosan spot test 10 microl tam kan (EDTA/heparin) 100 microl G6P, NADP, saponin karışımı Filtre kagıdına damlat UV ışıkta floresanda bak Florosan yoksa G6PD eksiktir.

92 Biorapid, 2, 6-dichlophenol indophenol NADP Soğuk zincirde gelmeli Örnekler hızlı, taze çalışılmalı

93 Kantitatif spektrofotometrik ölçüm Doğrudan NADPH üretim miktarı ölçülür 340 nm dalga boyunda

94 Am J Hematol Feb 3. doi: /ajh [Epub ahead of print] Multi-gene panel testing improves diagnosis and management of patients with hereditary anemias. Russo R 1,2, Andolfo I 1,2, Manna F 1,2, Gambale A 1,2, Marra R 1,2, Rosato BE 1,2, Caforio P 1,2, Pinto V 3, Pignataro P 2, Radhakrishnan K 4,5, Unal S 6, Tomaiuolo G 7, Forni GL 3, Iolascon A 1,2. Mutations in more than 70 genes cause hereditary anemias (HA), a highly heterogeneous group of rare/low frequency disorders in which we included: hyporegenerative anemias, as congenital dyserythropoietic anemia (CDA) and Diamond-Blackfan anemia; hemolytic anemias due to erythrocyte membrane defects, as hereditary spherocytosis and stomatocytosis; hemolytic anemias due to enzymatic defects. The study describes the diagnostic workflow for HA, based on the development of two consecutive versions of a targeted-ngs panel, including 34 and 71 genes, respectively. Seventy-four probands from 62 unrelated families were investigated. Our study includes the most comprehensive gene set for these anemias and the largest cohort of patients described so far. We obtained an overall diagnostic yield of 64.9%. Despite 54.2% of cases showed conclusive diagnosis fitting well to the clinical suspicion, the multi-gene analysis modified the original clinical diagnosis in 45.8% of patients (nonmatched phenotype-genotype). Of note, 81.8% of nonmatched patients were clinically suspected to suffer from CDA. Particularly, 45.5% of the probands originally classified as CDA exhibited a conclusive diagnosis of chronic anemia due to enzymatic defects, mainly due to mutations in PKLR gene. Interestingly, we also identified a syndromic CDA patient with mild anemia and epilepsy, showing a homozygous mutation in CAD gene, recently associated to early infantile epileptic encephalopathy-50 and CDA-like anemia. Finally, we described a patient showing marked iron overload due to the coinheritance of PIEZO1 and SEC23B mutations, demonstrating that the multigene approach is valuable not only for achieving a correct and definitive diagnosis, but also for guiding treatment.

95 Teşekkürler