MOLEKÜLER TESTLERDE YENİ TEKNOLOJİLERİN KULLANIMI. Doç. Dr. Alpaslan Alp Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "MOLEKÜLER TESTLERDE YENİ TEKNOLOJİLERİN KULLANIMI. Doç. Dr. Alpaslan Alp Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı"

Ahmet Bayrak
5 yıl önce
İzleme sayısı:

2 MOLEKÜLER TESTLERDE YENİ TEKNOLOJİLERİN KULLANIMI Doç. Dr. Alpaslan Alp Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

3 Sunum Akışı: den geleceğe bir bakış 2. Moleküler tanıda tam otomasyon 3. Yeni nesil dizileme 4. CRISPR-Cas teknolojisi 5. Üzerinde düşünelim...

6 PZT Uygulamaları: 2002 Özellikle viral etkenlerin tanısında giderek artan uygulamalar Ticari testler sınırlı sayıda etken için var Laboratuvar-yapımı (in-house) testlerde standardizasyon sorunu Niesters HGM: Clinical virology in real time. J Clin Virol 2002; 25:S3-S12.

7 Real-Time PCR Uygulamaları: 2002 Viral etkenlerin tanısında altın standart Güvenilir kantitasyon imkanı Geleneksel PZT den daha pahalı Yarının laboratuvarları için hedef: Multipleks uygulamalar! Mackay IM, et al: Real-time PCR in virology. Nucleic Acid Res 2002; 30:

11 Moleküler Teknolojinin Klinik Tanıya Etkisi Laboratuvar test sonuçları, hasta hakkında verilen kararların %80 ini şekillendiriyor. Sonuçlar daha güvenilir. Sonuçlanma süreleri kısaldı. Laboratuvara olan güven artıyor. Laboratuvar test sayıları giderek artıyor. O Connor C, Fitzgibbon M, Powell J, et al. A commentary on the role of molecular technology and automation in clinical diagnostics. Bioengineered 2014; 5, 3:

12 Moleküler Tanıda Tam Otomasyon

13 Moleküler Tanıda Tam Otomasyon Örneği: University Hospital of Lausanne Greub G, Sahli R, Brouillet R & Jaton K. Ten years of R&D and full automation in molecular diagnosis. Future Microbiol 2016; 11(3):

14 Moleküler Tanıda Tam Otomasyon Örneği: University Hospital of Lausanne Laboratuvar yapımı real-time PCR Tüm patojenler için ortak real-time PCR protokolü Greub G, Sahli R, Brouillet R & Jaton K. Ten years of R&D and full automation in molecular diagnosis. Future Microbiol 2016; 11(3):

16 Tam Otomatize Moleküler Tanı Sistemlerinde Yaşanan Sorunlar Greub G, Sahli R, Brouillet R & Jaton K. Ten years of R&D and full automation in molecular diagnosis. Future Microbiol 2016; 11(3):

18 Artan Laboratuvar Etkinliği: Kantitatif Moleküler Yöntemler Tanı Prognoz Tedavi izlemi

19 Artan Laboratuvar Etkinliği: Kantitatif Moleküler Yöntemler Son yirmi yıllık süreç: Competitive PCR (Yarışmalı PZT) Real-Time PCR (İzlenebilir PZT) Dijital PZT...

20 PCR keşfi Real-Time PCR Kartuş Testleri 1985 Geleneksel PCR Mikroçip Teknolojisi

22 Xpert MTB/RIF Testi Ortak bir çalışmanın ürünü: FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics) Cepheid (A.B.D.) University of Medicine and Dentistry of New Jersey İki saat içerisinde M. tuberculosis varlığının ve rifampin direncinin saptanması Üç primer ve beş prob kullanılarak uygulanan heminested real-time PCR

24 DSÖ nün Xpert MTB/RIF Testi Değerlendirmesi Xpert MTB/RIF testinin kullanımı, geleneksel mikroskobi, kültür ve ilaç duyarlılık testlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırmaz.

28 Yeni Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing: NGS) İlk yeni nesil dizileme cihazı: Mikrobiyal genomik dizi verisinde 100 kat artış. NGS henüz klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında rutin iş akışı algoritmalarına girememiş durumda. NGS nin enfeksiyon hastalıklarının tanısındaki olası rolü iyi değerlendirilmeli. İlk hedef: Geleneksel tanısal yöntemlerle tanımlanamayan bakterilerin tanımlanması.

29 Yeni Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing: NGS) Örnek-1: Mikrobiyom analizi: Tedaviyi şekillendirebilecek veya prognozu belirleyebilecek düzeyde faydalı olabilecek mi? Qin J, et al A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 464: Graessler J, et al Metagenomic sequencing of the human gut microbiome before and after bariatric surgery in obese patients with type 2 diabetes: correlation with inflammatory and metabolic parameters. Pharmacogenomics J 13: Wang Z, et al Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature 472: Price KE, et al Unique microbial communities persist in individual cystic fibrosis patients throughout a clinical exacerbation. Microbiome 1:27.

30 Yeni Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing: NGS) Örnek-2: Ensefalit olgularının %63 üne, geleneksel yöntemlerle tanı konamıyor. Son 3 yılda, NGS kullanılarak Leptospira, Astrovirus ve Bornavirus saptanmış ensefalit olguları mevcut: Brown JR, Morfopoulou S, Hubb J, et al Astrovirus VA1/HMO-C: an increasingly recognized neurotropic pathogen in immunocompromised patients. Clin Infect Dis 60: Wilson MR, Naccache SN, Samayoa E, et al Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by nextgeneration sequencing. N Engl J Med 370: Naccache SN, Peggs KS, Mattes Fmet, al Diagnosis of neuroinvasive astrovirus infection in an immunocompromised adult with encephalitis by unbiased next-generation sequencing. Clin Infect Dis 60: Hoffmann B, Tappe D, Höper D, et al A variegated squirrel bornavirus associated with fatal human encephalitis. N Engl J Med 373:

31 Yeni Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing: NGS) Örnek-3: NGS nin hastane enfeksiyon kontrol sürveyans programları ve salgın tespitlerinde kullanımı: MLST ve benzeri yöntemlerden çok daha doğru ve kesin veri sağlıyor. GenomeWeb. 7 August CDC earmarks $2.3 million for NGS, bioinformatic approaches to combat infectious disease. GenomeWeb, New York, NY. 23m-ngs-bioinformatic-approaches-combat-infectiousdisease. Turabelidze G, Lawrence SJ, Gao H, et al Precise dissection of an Escherichia coli O157:H7 outbreak by single nucleotide polymorphism analysis. J Clin Microbiol 51:

32 Yeni Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing: NGS) Örnek-4: NGS; SNP (single nucleotide polymorphism) veya varyant analizinde, tüm genom dizileme sayesinde gerekli detaylı veriyi sağlayabiliyor. Rasko DA, et al Origins of the E. coli strain causing an outbreak of hemolytic uremic syndrome in Germany. N Engl J Med 365: Chin C, et al The origin of the Haitian cholera outbreak strain. N Engl J Med 364: Azarian T, et al Whole-genome sequencing for outbreak investigations of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the neonatal intensive care unit: time for routine practice? Infect Control Hosp Epidemiol 36: Snitkin ES, et al Tracking a hospital outbreak of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with whole-genome sequencing. Sci Transl Med 4:148ra116.

33 Yeni Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing: NGS) Örnek-5: NGS ile antibiyotik duyarlılık testlerinin gerçekleştirilebilme potansiyeli var (direnç genlerinin saptanması ile): Henüz başlangıç aşamasında. Tüm bakterilere uygulanabileceği düşünülmüyor. Stoesser N, et al Predicting antimicrobial susceptibilities for Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates using whole genomic sequence data. J Antimicrob Chemother 68: Arias CA, et al Genetic basis for in vivo daptomycin resistance in enterococci. N Engl J Med 365: Tran TT, et al Whole-genome analysis of a daptomycin susceptible Enterococcus faecium strain and its daptomycin-resistant variant arising during therapy. Antimicrob Agents Chemother 57:

34 Yeni Nesil Dizileme: Rutin tanı laboratuvarlarında kullanılabilir mi? Bakteri: Altın standart kültür yöntemleri Virüs: Moleküler yöntemler Yeni teknolojinin rutin tanısal klinik mikrobiyoloji laboratuvarları algoritmalarına girebilmesi için belirli bir zamana ihtiyaç vardır.

35 Yeni Nesil Dizilemenin Potansiyel Klinik Uygulamalarında Soru İşaretleri Halen çok pahalı. Henüz bir standardizasyon yok. Kültür yöntemleri canlı bakteri varlığını gösterir. Biyoinformatik açığı.

36 Yeni Nesil Dizileme ile Genom Analizi Goldberg B, et al Making the leap from research laboratory to clinic: challenges and opportunities for nextgeneration sequencing ininfectious disease diagnostics. mbio 6(6):e doi: /mbio

Yeni Nesil Dizileme İş Akışı Goldberg B, et al. 2015.

37 Yeni Nesil Dizileme İş Akışı Goldberg B, et al Making the leap from research laboratory to clinic: challenges and opportunities for nextgeneration sequencing ininfectious disease diagnostics. mbio 6(6):e doi: /mbio

40 Tekrarlayan DNA Dizileri

42 CRISPR Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats Düzenli Aralıklarla Dizilmiş Kısa Palindromik Tekrarlar Kritik element: CRISPR ları ayıran diziler. Bu ayırıcı dizilerin bazı yabancı plazmid ve bakteriyofaj dizilerine homolog olduğu gösterilmiş (Barrangou et al., 2007).

Bakterilerde Adaptif İmmünite: CRISPR-Cas Sistemleri; -Aşılama Etkisi- CRISPR dizileri: 28-37

43 Bakterilerde Adaptif İmmünite: CRISPR-Cas Sistemleri; -Aşılama Etkisi- CRISPR dizileri: nükleotid Ayırıcı diziler: nükleotid CRISPR lokuslarındaki tekrar sayısı genellikle 50 den az.

44 Bakterilerde Adaptif İmmünite: CRISPR-Cas Sistemleri; -Aşılama Etkisi- Barrangou R, et al: Bacteria get vaccinated. Nature 2014; 513:

45 Bakterilerde Adaptif İmmünite: CRISPR-Cas Sistemleri; Barrangou R, et al:crispr-cas systems: prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Mol Cell 2014; 54: doi: /j.molcel

46 CRISPR İlişkili Biyomoleküler Teknolojiler Genom düzenlemeleri: Belirlenen hedef bölgede Cas9 un çift zincirli DNA da kırık oluşturması, Endojen mekanizmalarla onarım. Ancak bakterilerin onarım kapasitesi ökaryotlara göre daha düşük.

47 CRISPR İlişkili Biyomoleküler Teknolojiler Gen düzenlemeleri: Cas9 nükleaz, aktif bölgelerindeki mutasyonlarla bir DNAbağlayan proteine dönüştürülür. Katalitik olarak inaktif olan bu Cas9 un DNA parçalama özelliği kalmamıştır; ancak DNA ya bağlanabilir. Hedef genin promotor veya orf bölgesine bağlanan Cas9, transkripsiyonun başlamasını önler: Gen ekspresyonun inhibisyonu.

48 CRISPR Temelli Antimikrobiyaller Luo ML, et al: Current and future prospects of CRISPR-based tools in bacteria. Biotechnology and Bioengineering 2016; 113:

49 Hasta-Başı Moleküler Test olarak CRISPR Teknolojisinin Kullanımı

50 CRISPR-Temelli Tanı Yöntemi Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 2017; 356 (6336):

51 CRISPR-Temelli Tanı Yöntemi Caliendo AM, and Hodinka RL. A CRISPR way to diagnose infectious diseases. N Engl J Med 2017; 377;17:

52 CRISPR-Temelli Tanı Yöntemi Caliendo AM, and Hodinka RL. A CRISPR way to diagnose infectious diseases. N Engl J Med 2017; 377;17:

53 Üzerinde Düşünelim: Hasta-başı testler mi? Merkezileşmeye devam mı? Öncelikli yatırım hangisine yapılmalı? Fazla teknoloji, aslında kontrolü kaybetmek mi? (NGS örneği) Teknoloji bağımlılığı, düşünce tembelliğine neden olup yaratıcılığımızı yok etmemeli. Yeni nesile güven; eğit ve bilinçlendir. Kayıp nesil değil, yaratıcı nesil olsun.

Benzer belgeler

MİKROBİYOLOJİDE MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ: NEREDEN NEREYE?

MİKROBİYOLOJİDE MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ: NEREDEN NEREYE? Doç. Dr. Alpaslan Alp Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Sunum Akışı: 1. Son 20 yıllık sürece, örneklerle