ARAŞTIRMA PROJESİ SELÜLOZ İÇEREN KAĞIT FABRİKASI ATIKLARININ VE BİTKİSEL ATIKLARIN BİYOETANOL ÜRETİMİ İÇİN DEĞERLENDİRİLMESİ

Transkript

1 ARAŞTIRMA PROJESİ SELÜLOZ İÇEREN KAĞIT FABRİKASI ATIKLARININ VE BİTKİSEL ATIKLARIN BİYOETANOL ÜRETİMİ İÇİN DEĞERLENDİRİLMESİ Proje Yüklenicisi: Yrd. Doç. Dr. Melek ÖZKAN GEBZE YÜKSEK TEKNOLOJİ ENSTİTÜSÜ MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ 29-İstanbul. Bu araştırma projesi Projem İstanbul kapsamında İstanbul Büyükşehir Belediyesi tarafından hazırlatılmıştır. İstanbul Büyükşehir Belediyesi ve araştırmacının yazılı izni olmadan çoğaltılamaz ve kopyalanamaz. i

2 İÇİNDEKİLER DİZİNİ İÇİNDEKİLER DİZİNİ...İ TABLOLAR DİZİNİ...İV ŞEKİLLER DİZİNİ... V ÖZET...İX ABSTRACT... Xİİ 1. GİRİŞ YÖNTEM DENEYDE KULLANILAN MİKROORGANİZMALAR KULLANILAN BESİYERİ HÜCRELERİN EKİLMESİ ÖLÇÜM METODLARI HÜCRE TUTUKLAMALI REAKTÖRÜN HAZIRLANIŞI LİGNOSELÜLOZİK KAYNAKLARIN ASİT HİDROLİZİ TOPLAM ŞEKER VE SELÜLOZ MİKTARININ TESPİTİ YAPILAN ÇALIŞMALAR VE BULGULAR DEĞİŞİK LİGNOSELÜLOZİK KAYNAKLARIN C. THERMOCELLUM TARAFINDAN KULLANIMI FARKLI KONSANTRASYONLARDA KAĞIT VE BITKI KALINTISI IÇEREN NUMUNELERDE GLUKOZ VE ETANOL ÜRETIMI S. CEREVİSİAE KULLANILARAK BİYOETANOL ÜRETİMİ S. cerevisiae nın üreme hızı ve etanol üretimini etkileyen parametrelerin belirlenmesi Saccharomyces cerevisiea 2662 ile hücre tutuklamalı reaktörde etanol üretimi C. thermocellum kültür sıvısında biriken glukozun S. cerevisiae tarafından kullanılması ve Etanol Üretimi (Kesikli sistem) C. thermocellum tarafından selülozun parçalanması sonucu üretilen glukozun kesikli sistemde ve hücre tutuklamalı dolgulu yataklı sürekli reaktörde maya hücreleri tarafından kullanılması ve etanol üretim veriminin hesaplanması ii

3 3.4. SELÜLAZ ENZİMİ KULLANILARAK ŞEKER ÜRETİMİNİN ARTTIRILMASI ÖN İŞLEM METODLARININ KIYASLANMASI KARBON KAYNAĞI OLARAK MEYVE ATIKLARI KULLANILDIĞINDA S. CEREVİSİAE'NIN ETANOL ÜRETİMİ KAĞIT FABRİKASI TORTU VE LİKİT ATIKLARININ C. THERMOCELLUM BAKTERİSİ TARAFINDAN PARÇALANMASI VE ARITMA GİRİŞİ LİKİT ATIĞIN TOKSİK SEVİYESİNİN BELİRLENMESİ FARKLI KAĞIT ATIKLARINDAN ETANOL ÜRETİMİ Farklı kağıt atıklarının C. thermocellum bakterisi tarafından parçalanması Atıkların parçalanmasından ortaya çıkan sıvıda maya tarafından etanol üretimi SELÜLOLİTİK ETANOL ÜRETİCİSİ MİKROORGANİZMALARIN İZOLASYONU VE TANIMLANMASI C.THERMOCELLUM 2745 KÜLTÜR SIVISINDAKİ EKSTRASELÜLAR SELÜLAZ ENZİM AKTİVİTESİNİN BELİRLENMESİ TARTIŞMA/SONUÇ EK (KULLANILAN BESİYERLERİ) KAYNAKLAR iii

4 TABLOLAR DİZİNİ Tablo. 1. Saman kağıtlarının kullanım sonrası ortamda kalan selüloz miktarı 15 Tablo 2. Farklı miktarlarda bitki kalıntısı içeren besiyerinde zamana bağlı glukoz birirkimi Tablo 3. Farklı miktarlarda bitki kalıntısı içeren besiyerlerinde zamana bağlı son ürün miktarları Tablo 4. Farklı konsantrasyonlarda bitki kalıntısı içeren kültürlerde elde edilen ürünler ve kullanım verimleri Tablo 5. S. cerevisiae nin etanol üretimi üzerinde etkisi incelenen besiyeri bileşenlerinin konsantrasyonları ve ph değerleri Tablo 6. Besiyeri optimizasyonunda incelenen mineral kombinasyonları 23 Tablo 7. Besiyeri optimizasyonunda etkisi incelenen fiziksel parametreler 27 Tablo 8. Farklı oranlarda taze besiyeri ile karıştırılmış C. thermocellum kültür sıvısında maya hücrelerinin glukoz kullanım verimi ve etanol üretim miktarı Tablo 9. Dolgu yataklı sürekli reaktörde selüloz ve lignoselüloz içeren C. thermocellum kültür sıvıları ile etanol üretim verimliliği Tablo 1. 5 g/l selüloz içeren besiyerinde C. thermocellum un glukoz üretiminin zamanla değişimi Tablo 11. Selülaz enziminin selülozdan glukoz birikimine etkisi 42 Tablo 12. Bütünleştirilmiş proses ile (C. thermocellum + S. cerevisiae) otoklavlama önişlemine tabi tutulmuş buğday saplarından etanol üretimi Tablo 13 Meyve Atıklarının Etanol Üretimine Etkisi 47 Tablo 14. Besiyerlerinin sıvı kompozisyonu 51 Tablo 15. C. thermocellum hücrelerince biriktirilen glukoz ve üretilen konsantrasyonlarının 2 gün sonundaki değerleri Tablo 16. C. thermocellum tarafından biriktirilen glukozun mayalar tarafından kullanımı ve etanol üretimi Tablo 17. Üretilen yan ürünler ve konsantrasyonları 58 Tablo 18. Kültürler, kaynakları ve selüloz kullanım kapasiteleri 59 Tablo 19. Selüloz parçalayabilen kültürlerde glukoz birikimi ve fermentasyon son ürünleri Tablo ve 37 C de aerobik koşullarda ekstrasellülar enzim aktivitesi iv

5 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 HPLC analizinde standart sellobiyoz, glukoz, laktik asit, asetik asit ve etanol e ait sinyal pikleri. Şekil 2.2. Polimere tutuklanmış S. cerevisiea hücreleri ile etanol üretmek için kullanılan Hücre Tutuklamalı Reaktör (Immobilized cell Reactor, ICR) 6 8 Şekil 3.1. Değişik kağıt atıklarının C. thermocellum tarafından kullanımı sonucu 1 biriken glukoz miktarı (A) ve etanol üretimi (B) Şekil 3.2. Kaynatma ve alkali hidroliz işlemlerinden geçirilmiş tarımsal atıkların 12 C. thermocellum tarafından kullanımı; glukoz birikimi ve etanol üretimi Arpa sapı (A), Buğday sapı (B), Sazlık otu (C), Mısır kabuğu (D), Palmiye ağacı lifleri (E), Barbunya kabuğu (F) Şekil 3.3. Farklı konsantrasyonlarda kağıt içeren C. thermocellum kültüründe 14 glukoz birikimi (A), etanol üretimi (B). Şekil 3.4. Değişik oranlarda kağıt fabrikası atığı + ticari selüloz içeren C. 16 thermocellum kültüründe glukoz birikimi (A) ve etanol üretimi (B). Şekil g/l glukoz içeren besiyerlerinde S. cerevisiae nin üremesi (A) ve 19 etanol üretimi (B) Şekil g/l glukoz içeren besiyerlerinde S. cerevisiae nin üremesi (A) ve 19 etanol üretimi (B) Şekil 3.7 Besiyerindeki fosfat konsantrasyonunun S. cerevisiae nın üreme hızına 21 (A) ve etanol üretimine (B) etkisi Şekil 3.8. Besiyerindeki ticari ve laboratuarda hazırlanmış maya özütü 22 konsantrasyonunun S. cerevisiae nın üreme hızına (A) ve etanol üretimine (B) etkisi Şekil 3.9. Besiyerindeki mineral konsantrasyonunun S. cerevisiae nın üreme 23 hızına (A) ve etanol üretimine (B) etkisi Şekil 3.1 Besiyeri ph sının S. cerevisiae nın üreme hızına (A) ve etanol 24 üretimine (B) etkisi Şekil 3.11 Farklı şekerler içeren besiyerlerinde S. cerevisiae nın üreme hızları 25 v

6 Şekil 3.12 Kesikli sistemde glukoz konsantrasyonunun S. cerevisiae nın etanol 26 üretimine (A) ve glukoz kullanım ve etanol üretim verimlerine (B) etkisi Şekil 3.13 Atmosfer koşullarının S. cerevisiae nın üreme hızına (A) ve etanol 27 üretimine (B) etkisi Şekil 3.14 Sıcaklığın S. cerevisiae nın üreme hızına (A) ve etanol üretimine (B) 27 etkisi Şekil 3.15 Çalkalama koşullarının S. cerevisiae nın üreme hızına (A) ve etanol 28 üretimine (B) etkisi Şekil ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı 29 Şekil ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı 29 Şekil ,5 ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı 3 Şekil ml/dk debide kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarı 3 Şekil 3.2. Debinin kullanılan glukoz ve üretilen etanol miktarına (g etanol/dk) 31 etkisi Şekil Debinin etanol üretim verimine (gr etanol/gr glukoz) etkisi 31 Şekil g/l glukoz konsantrasyonunda farklı sıcaklıklarda glukoz 32 kullanım ve etanol üretim verimleri Şekil g/l glukoz konsantrasyonunda farklı sıcaklıklarda glukoz 32 kullanım ve etanol üretim verimleri Şekil Dolgu yataklı reaktörde kullanılan polimer ve tutuklanmış maya 33 hücrelerinin SEM görüntüleri: Boş polyhipe polimer (büyütme gücü 4 X) (A), maya hücreleri ile kaplanmış polimer yüzeyi (büyütme gücü 2 X) (B) ve polimer gözeneklerinde tutuklanmış maya hücreleri (büyütme gücü 5 X) (C) Şekil Farklı ph Değerlerine Sahip C. thermocellum Kültür Sıvısında S. 35 cerevisiea nın Üreme hızı (A) ve etanol üretimi (B) Şekil Farklı Konsantrasyonlarda Fosfat İçeren C. thermocellum Kültür 35 Sıvısında S. cerevisiea nın Etanol Üretimi Şekil g/l glukoz birikimine sahip C. thermocellum kültür sıvısında S. 36 cerevisiea nın etanol üretimi Şekil C. thermocellum kültüründe zamana bağlı glukoz birikimi ve etanol 37 üretimi vi

7 Şekil Farklı konsantrasyonlarda glukoz içeren besiyerinde farklı akış hızlarında reaktör verimi: %E: substrat giderim verimi (% dönüşüm) =1*(Cso-Cs)/Cso; %Ep: etanol üretim verimi= 1*P/Cso: Cso=başlangıçtaki glukoz miktarı, Cs=kalan glukoz miktarı Şekil 3.3. Farklı karbon kaynaklarının kullanımı sonucu elde edilen sıvıların farklı akış hızlarında reaktörden geçirilmesi ve verime etkisi: %E: substrat giderim verimi (% dönüşüm) =1*(Cso-Cs)/Cso; %Ep: etanol üretim verimi= 1*P/Cso: Cso=başlangıçtaki glukoz miktarı, Cs=kalan glukoz miktarı. C : 1 g/l ticari selülozdan C. thermocellum un ürettiği şeker içerikli sıvı. L : 1 g/l alkali hidrolize tabi tutulmuş buğday atıklarınından (lignoselüloz) C. thermocellum un ürettiği şeker içerikli sıvı Şekil Farklı sıcaklıklarda selülaz enziminin glukoz birikimine etkisinin zamanla değişimi (. günde enzim içeren sıvılarda glukoz konsantrasyonu yüksek bulunmuştur. Enzim ilavesi yapıldıktan sonra numuneler alınmış ve ölçüm yapılana kadar +4 C de bekletilmişlerdir. Bu geçen sürede enzim aktivite gösterdiği için glukoz miktarında artış olmuştur.) Şekil 3.32 Lignoselülozik materyalin (buğday sapı) otoklav öncesi ve otoklavlama işleminden sonraki görüntüleri Şekil 3.33 Farklı konsantrasyonlarda kağıt fabrikası atığı (tortu kısmı) içeren C. thermocellum kültüründe glukoz birikimi (A), etanol üretimi (B). Şekil 3.34 Değişik oranlarda kağıt fabrikası atığı (tortu kısmı) + ticari selüloz içeren C. thermocellum kültüründe glukoz birikimi (A) ve etanol üretimi (B). Şekil Farklı konsantrasyonlarda arıtma giriş ve çıkış likit atıklarının C. thermocellum hücrelerinin glukoz birikimi üzerine etkisi. Şekil Farklı konsantrasyonlarda arıtma giriş ve çıkış likit atıklarının maya hücrelerinin glukoz tüketim ve etanol üretim verimleri üzerine etkisi Şekil Değişik kağıt içeren besiyerlerinde C. thermocellum un toplam şeker üretimi Şekil Değişik kağıtlar içeren besiyerlerinde C. thermocellum un etanol üretimi Şekil Farklı kağıt atıkları içeren besiyerlerinde biriken glukoz ve diğer son ürünlerin miktarları vii

8 Şekil 3.4 Maya hücrelerinin 24 saat sonunda ürettikleri etanol ve besiyerinde kalan glukoz konsantrasyonları Şekil C. thermocellum selülaz enzim sistemi Şekil C de C. thermocellum kültür sıvısındaki selülolitik aktivite 66 viii

9 ÖZET Günümüzde özellikle taşımacılık sektöründe en çok kullanılan yakıt olan petrolün çevre kirliğine sebep olması, reservlerinin sınırlı olması ve fiyatının hergeçen gün yükselmesi yeni yakıt ve enerji kaynaklarına duyulan ihtiyacı artırmaktadır. Yenilenebilir kaynaklardan üretilen yakıtlar bu alternatif enerji kaynaklarının en önemlileri arasındadır. Fermentasyonla üretilen etanol (biyoetanol) özellikle taşımacılık sektöründe benzin yerine kullanılabilecek yenilenebilir bir enerji kaynağıdır. Biyoetanolün petrol ile rekabetini güçlendirmek için üretim maliyetinin düşürülmesi gerekmektedir. Sellüloz içeren atık maddelerin değerlendirilmesi etanolün ekonomik üretimi için üzerinde durulan konulardan biridir. Bu projede kağıt fabrikası atıkları ve bitkisel atıkların biyoetanol üretiminde değerlendirilmesi ve etkin bir şekilde kullanılması hedeflenmiştir. Selüloz ve selüloz içerikli katı atıkların (kağıt ve bitki sapları), Clostridium thermocellum ATCC 2745 suşunun selülolitik aktivitesiyle glükoz dimer ve monomerlerine dönüştürülmesi ve bu işlem sonucunda oluşan şeker içeren besiyerinin Saccharomycess cerevisiae ATCC 2662 şusu tarafından gerçekleştirilecek olan biyoetanol fermentasyonunda karbon kaynağı ve besiyeri olarak kullanımı araştırılmıştır. Projenin ilk aşamasında farklı kağıt atıklarının ve bitki saplarının bakteri tarafından parçalanma kapasitesi ve glukoz üretimi incelenmiştir. C. thermocellum hücrelerinin kağıt fabrikası atıkları ve bitki saplarını parçalayabildiği ancak ticari selüloza kıyasla bu materyalleri parçalama veriminin daha düşük olduğu görülmüştür (4-5 g glukoz/1 g atık). Lignoselülozik bitki atıklardan elde edilen glukoz miktarı 4g glukoz/1 g atık civarında ölçülmüş, alkali hidroliz ön işlemi ile lignoselülozik atıklardan glukoz eldesi % 1-14 civarında artırılmıştır. Alkali hidrolizi yapılan bitki artıklarının birçoğunun C. thermocellum tarafından daha kolay kullanıldığını ve bu kültürlerde etanol üretiminin kontrole kıyasla daha yüksek olduğunu söyleyebiliriz. Alkali hidroliz yöntemi en çok arpa sapında etki göstermiş, alkali hidrolizinden geçirilen bitki saplarını içeren numunelerde glukoz birikiminin kontrole oranla %14 arttığı gözlenmiştir. Buğday sapı ve sazlık otu içeren besiyerinde de alkali hidrolizin etkili olduğu kontrole kıyasla glukoz birikimini %1 ve 15 oranında arttırdığı görülmüştür. ix

10 Sonraki çalışmalarda besiyeri bileşen konsantrasyonlarının ve fiziksel koşulların S. cerevisiae nın etanol üretim kapasitesi üzerindeki etkileri incelenmiştir. S. cerevisiae nın etanol üretimini etkileyen faktörler incelendiğinde besiyerindeki maya özütü konsantrasyonunun etanol üretimi için önemli olduğu ve en uygun konsantrasyonun 5 g/l olduğu tespit edilmiştir. Yüksek metal konsantrasyonlarının mayanın etanol üretimine olumsuz etki yaptığı görülmüştür. Sıcaklığın etanol üretimi üzerinde fazla etkili olmadığı, ancak 3 ve 37 o C de etanol üretiminin oda sıcaklığına kıyasla %7 oranında daha yüksek olduğu görülmüştür. Laboratuarda hazırladığımız maya özütünün miktarı ticari maya özütü miktarının iki katı olacak şekilde besiyerine eklendiğinde kontrol ile aynı seviyelerde etanol üretildiği gösterilmiştir. Bu sonuç yüksek ölçekli fermentasyonda ortamda biriken maya hücrelerinin kurutulup yıkandıktan sonra yeni hazırlanan besiyerine besin maddesi olarak eklenebileceğini göstermektedir. TOPRAK Kağıt fabrikasından alınan atık elyaf kalıntılarının C. thermocellum tarafından parçalanması ve etanol üretimi incelenmiş farklı miktarlarda kağıt atığı içeren kültürlerde en yüksek glukoz birikimi 2 g/l kağıt atığı içeren kültürde 5,9 g/l olarak ölçülmüştür. Maya hücrelerinin etanol üretimi için dolgu yataklı hücre tutuklamalı reaktör kurulmuş ve sürekli kültür deneyleri bu reaktör kullanılarak gereçekleştirlmiştir. S. cerevisiae hücreleri iç faz emülsiyonu yüksek bir polimer olan polyhipe polimer üzerine tutuklanmış ve sürekli sistemde etanol üretimi takip edilmiştir. Besiyerindeki farklı glukoz konsantrasyonlarının sistemin performansına olan etkileri incelenmiştir. 6,7-25 g/l aralığında glukoz konsantrasyonuna sahip besiyerleri 1 ml/dk akış hızıyla ve 5 g/l glukoz içeren besiyeri 1, 2, 3, 6, 9, 12 ml/dk akış hızlarıyla çalışılmıştır. Farklı konsantrasyonlarda glukoz içeren besiyerlerinin sabit akış hızı ile sisteme verildiği deneyler sonucunda 5 g/l glukoz içeren besiyeri 1 ml/dk hızla geçirildiğinde reaktörün en yüksek verimlilikte çalıştığı gözlenmiştir. Reaktör içerisindeki kuru hücre ağırlığı 2 gr hücre/ gr polimer olarak hesaplanmıştır. Tarayıcı Elektron Mikroskobu ile yapılan incelemeler polyhipe polimer matrisinin maya hücrelerinin immobilizasyonu için son derece kullanışlı olduğunu ve hücrelerin polimerin yalnızca yüzeyine tutunduğunu göstermiştir. x

11 C. thermocellum un selülozu kullanımı sonucu ortaya çıkan glukozun tutuklanmış maya hücreleri tarafından kullanımı ve etanol üretimi incelenmiş, yaklaşık 7 g/l glukoz içeren C. thermocellum kültürü ile reaktörün beslenmesi sonucunda glukozun % 19 oranında etanole dönüştüğü görülmüştür. Kültür sıvısında metabolik artıklar ve besin yetersizliği olabileceği düşünülerek %75 oranında taze besiyeri ilavesi yapılmış ve sürekli sistemde etanol üretiminin % 83 oranında artığı görülmüştür. Asit baz hidrolizi önişlem olarak kullanıldığında 15 g glukoz/7 g buğday sapı olacak şekilde şeker açığa çıkmış ancak bu solusyonda hücreler sağlıksız üreme göstermişlerdir. Hücre üremesi veya enzim aktivitesine negatif etki etmemesi nedeniyle buhar ile yapılan önişlem kimyasal maddeler kullanılarak gerçekleştirilen önişlem metodlarına kıyasla daha etkin bir yöntemdir. Proje çalışması kapsamında lignosellülozik materyalin buhar ile zayıflatılması için 13 C otoklavlama yapılmıştır. Otoklavdan sonra lignoselülozik materyalin bulunduğu kap içinde biriken sıvının besiyeri olarak kullanıldığı kültür ortamında gerçekleşen bütünleştirilmiş proses ve selülaz enzimi ilavesi sonucunda 7,3 g/l etanol üretilmiştir (7.3 g etanol/7 g buğday sapı). C. thermocellum hücrelerinin glukoz üretimi ile etanol üretim verimine katkısı % 24 olarak hesaplanmıştır. Mikrobiyel degredasyon özellikle tarımsal alanlarda kullanılmayan sap kalıntılarının, etanol üretim tesislerinde açığa çıkan mısır koçanı atıklarının ve kağıt fabrikası atıklarının etanole dönüştürülmesinde kullanılabilecek, selülaz enzimi miktarında yaklaşık %14 oranında kar sağlayabilecek ek bir önişlem metodu olarak kullanılabilir. Selülozu aktif bir şekilde parçalayabilen etanol üreticisi mikroorganizmaların izolasyonu amacıyla Türkiye nin çeşitli bölgelerinden 96 toprak veya gübre örneği toplanmış ve bu örneklerden elde edilen kültürlerden 24 ünde selüloz kullanımı gözlemlenmiştir. İzole edilen suşlar substrat kullanımı ve ürün üretimi yönleri ile karakterize edilmiş ve C. thermocellum bakterisi ile aynı substratları kullanarak aynı ürünleri ürettikleri gözlemlenmiştir. Yalova dan alınmış örnekten elde edilen 5 numaralı bakteri kültüründe ve Bursa dan alınmış olan örnekten elde edilen 6 numaralı bakteri kültüründe selüloz kullanımının ve etanol üretiminin endüstriyel bir suş olan C. thermocellum ATCC 2662 suşu ile kıyaslanabilecek seviyelerde olduğu görülmüştür. Anahtar Sözcükler: Biyoetanol, Clostridium thermocellum, Selülozik atıklar, Sacharomycess cerrevisia, Kesikli ve sürekli fermentasyon xi

12 ABSTRACT There is an increasing demand for alternative fuel and energy sources due to the problems associated with petrollium, widely used fuel source especially in transportation sector. It causes air pollution, its reserves are limited and its cost is increasing day by day. The new fuel sources obtained from renewable materials are the most important alternative energy sources today. Bioethanol produced by fermentation is a renewable fuel source which can be used especially in trasportation sector. For producing bioethanol more compatable with petrollium, cost of bioethanol production should be reduced. Researhers are now focused on use of cellulose containing waste materials for low-cost ethanol production. At start, degredation of paper waste and lignocellulosic plant waste by C. thermocellum was analysed. C. thermocellum cells was able to degrade paper waste however degredation yield was found to belower than that of commercial cellulose (4-5 g glucose/1 g waste). The glucose from lignocellulosic plant waste degredation was measured as 4 g/1g waste. Alcaline hydrolysis resulted in 1-14% increase in glucose accumulation. Most of the plant waste hydrolized by alcaline solution were degredad by C. thermocellum more easily as compared to un hydrolysed ones. It was shown that glucose accumulation increased 14% and 1 % when alcaline hydrolysis applied to barley and wheat, respectively The effect of medium component concentrations and environmental conditions on ethanol production by S. cerecvisiea was investigated. Yeast extract was found to be effective nutrient on ethanol production of S. cerevisiae. The most suitable yeast extract concentration was determined to be 5 g/l in the medium for increased ethanol production. High metal concentrations in the medium caused a decrease in the amount of ethanol. It was also shown that ethanol production at 3-37 C was higher as compared to those obtained at room temperature. Nonetheless, the effect of incubation temperature on production was not so remarkable. Yeast extract prepared in the laboratory was shown to be usable as a media component instead of commercial yeast extract. The concentration of yeast extract prepared in the laboratory should be twice the commercial yeast extrat for obtaining same level of ethanol production. xii

13 S. cerevisiae cells were immobilized on polyhipe polymer, which has high internal phase emulsion, and ethanol production in continuous packed-bed reactor was monitored at various glucose concentration in the feed medium. A large initial concentration range of glucose between 6,7-25 g/l was studied at 1 ml/min and 5 g/l glucose gave the maximum efficiency. The dried weight of the cells was found to be ca. two g for per gram of cell supporting material. Scanning electron microscope photographs showed that the polyhipe polymer can successfully be used for yeast cell immobilization. A very homogenous thick layer of yeast cells were seen from the scanning electron micrographs only on the surface of the polymer giving rise to less diffusion limitations. Glucose accumulated at the end of cellulose degradation was used as substrate for immobilized S. cerevisiae cells in batch and packed-bed reactor. Cellulose was degraded in Clostridium thermocellum culture and about 7 g/l glucose accumulated at the end of this degradation process. It was observed that the culture was found to be usable by S. cerevisiae. 19% of glucose in C. thermocellum culture was converted to ethanol by yeast cells. It was thought that presence of some metabolic by products and nutrient limitation in C. thermocellum culture might cause limited utilization of glucose. Ethanol production increased by 83% when the culture mixed with 75% fresh medium was fed into the reactor. C. thermocellum could degraded waste of paper pulp industry and lignocellulosic materials and 4-5 g glu/1 g waste was produced at the end of the process. This value is lower as compared to commercial cellulose degredation. Alcaline hydrolysis pretreatment method increased the amount of glucose produced from lignocellulosic wastes about %1- %14 with respect to the type of waste material. When acid base hydrolysis method was used as pretreatment method 15 g glu/7 g lignocellulosic waste was produced. However, bacteria and yeast cells did not grow well in the presence of acid hydrolized materials. Steam treatment is more efficient pretreatment method since there is no chemical factor affecting microbial growth and enzyme avtivity. We autoclaved the lignocellulosic waste material at 13 C (steam process). The liquid accumulated in the container of lignocellulosic waste materil was used as culture medium for C. thermocellum cells. At the and of this consolidated bioprocessing and enzyme addition 7.3 g/l ethanol was produced (7.3 g ethanol/7 g lignocellulose). It was calculated that 24% of total produced ethanol was produced by the help of C. thermocellum cells in this process. The result of study showed that microbial degredation of cellulose and lignocellulose containing materials can be used as supplementary process in ethanol production rafineries. The waste materials like xiii

14 corn fibers, other agricultural waste and waste from paper pulp industry can be converted to ethanol by microorganisms. Cost of cellulase enzyme used for cellulose breakdown can be decreased about %14 when microorganisms help degredation process. For isolation of microorganisms with high cellulolytic acvtivity and ethanol production capacity, 96 soil or dump samples were collected from various region of Turkey. 24 cellulolytic cultures were obtained from those samples. The cultures numbered as 5 and 6 from Yalova and Bursa, respectively, showed maximum cellulose degredation and ethanol production capacities. Key Words: Cellulosic waste, Biyoetanol, Clostridium thermocellum, Sacharomycess cerrevisia, Batch and continious fermentation. xiv

15 1. GİRİŞ Fosil yakıta dayalı enerji kullanımı; fosil yakıt dışalımının büyümesi, ithalat giderinin artması gibi olumsuzluklardan başka, çevre kirlenmesinin de artmasına neden olmaktadır. İhtiyaç duyduğumuz yiyecek, yakıt ve kimyasal sınıfına giren maddelerin tarım, yiyecek, mobilya veya kağıt sektöründen gelen ve çevre kirliliğine sebep olan atıkların yapısında bulunan selülozun kullanılmasıyla üretimi atık maddelerin ortadan kaldırılması problemine çözüm getirecek olması, çevre kirliliğinin azalmasına yardımcı olması, insanlığın yakıt sağlamak için fosil kaynaklarına bağımlılığının azaltılması ve hayat standartlarını geliştirecek olması sebebiyle önem taşımaktadır yıllarında uluslararası kuruluşlar ve büyük şirketlerin yaptırdıkları araştırmalara göre, 225 yılında dünya genelinde modern biyokütle ile sağlanacak enerji jeotermal enerjinin 6.4 katı, rüzgar enerjisinin katı, güneş enerjisinin katı olacaktır. Görüleceği gibi en büyük pay modern biyokütleye ayrılmıştır. Yeryüzündeki petrol kaynaklarının tükenmeye yüz tutmasıyla birlikte petrol dışında alternatif enerji kaynakları üretme çalışmalarında dünya çapında bir artış gözlenmektedir. Yaklaşık yirmi yıldır, taşıma sektöründe ihtiyaç duyulan, % 97 sini petrol kaynaklarının oluşturduğu enerjinin değişik yollardan sağlanması için yeni teknolojiler geliştirilmeye çalışılmaktadır (Mielenz, 21). Atık maddelerin enerjiye dönüştürülmesi için yapılan araştırmalar bu çalışmaların en güncel ve ümit verici örneğidir. Atığın enerjiye dönüştürüldüğü güvenli ve doğaya zararsız olan bu işlemde kullanılan atığın hacminin 9% oranında azaldığı saptanmıştır (VanWyk, 21). Karada ve okyanuslarda yıllık fotosentez yoluyla üretilen biokütle 3x1 21 joul değerinde bir enerjiye sahiptir. Bu da insanların tüm dünya çapında harcadıkları yıllık enerjinin on katıdır (Cowling, 1976). Yeryüzündeki bitki biyokütlesinin bol miktarda bulunması ve doğal olarak sürekli yenilenmesi selülozun kullanımıyla elde edilecek kimyasallar üzerindeki ilgiyi artırmıştır (Jeewon, 1997). Odunsu ve lifli bitkilerin yapısında bulunan lignoselülozun % 45 i selüloz, % 3 u hemiselüloz, % 25 i ise ligninden oluşur (Wiselogel ve ark, 1996) Hemiselüloz altı karbonlu (D-galaktoz, mannoz) ve beş karbonlu (D-xylose, L-arabinoz) çok dallı şeker heteropolimerlerinden oluşur. Lignin ise fenolik karakterde aromatik bir polimerdir. Enzimatik reaksiyonları engellediği için sellülolitik atıkların mikroorganizmalar tarafından kullanılmadan önce ligninden arındırılması gerekir (Zaldivar ve ark. 21). 1

16 Selüloz ekosistemdeki karbon döngüsüyle sürekli üretilen ve yeryüzünde miktarı en fazla olan polisakkarittir. Moleküler ağırlığı 2-2 kda arasındadır. Sayıları 4 ile 8 arasında değişen β-1-4 bağlı D-glükoz moleküllerinin oluşturdukları zincirlerin birbirine paralel plakalar halinde dizilmeleriyle oluşan bu yapının doğadan temizlenmesi uzun bir süreç gerektirir. Tarımsal atıklar (mısır, buğday gibi bitkilerin sapları, patates ve pancar gibi bitkilerin kullanılmayan kısımları) ya da belediye atıkları, kağıt atıkları ve şeker fabrikası atıkları selüloz içeren biyokütle kaynaklarına örnek verilebilir. Selüloz sellülolitik mikroorganizmalar tarafından karbon kaynağı olarak kullanılarak doğadan temizlenebilir. Sellülaz enzimi birçok mikroorganizma tarafından üretilir. Bu mikroorganizmalar arasında sellülolitik termofilik mikroorganizmalar sıcağa dayanıklı enzimler üretmeleri sebebiyle önem taşırlar. Selüloz enzimlerinin çeşitliliği bakteriye özel selüloz enzim aktivitelerinin kıyaslanmasını zorlaştırabilir ancak bakteriyel sellülaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri fungal sellülazlardan on kat daha yüksektir. (Himmel ve ark., 1996). Termofilik, anaerobik bir bakteri olan Clostridium thermocellum un sellülolitik enzim sistemi selülozu parçalayabilen anaerobik bakteriler ve funguslar için model teşkil etmektedir (Johnson ve ark., 1982). C. thermocellum'un sellülaz enzim sisteminin spesifik aktivitesi ticari değeri yüksek olduğu bilinen ve yaygın kullanıma sahip bir fungus olan Trichoderma reseei'nin sellülaz enziminin seksen katıdır (Johnson, 1983). Sellülaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri aktif bölgelerinin yeterliliğine, son ürünlerin inhibisyonuna ve selülozu dekristalize edebilmelerine bağlıdır. Bu özellikler belirli sıcaklıklarda çalışılmıştır. Genellikle enzimatik reaksiyonların birçoğu yüksek sıcaklıklarda difüzyon ve kataliz termodinamiğinden kaynaklanan avantajlardan yararlanır. Bu yüzden termofilik sellülaz enzimleri ve termofilik sellülolitik bakteriler bu tip uygulamalarda tercih edilirler (Sheehan ve Himmel, 1999). Üzerinde yapılan çalışmaların derinliği ve spesifik aktivitesinin yüksek olması sebebiyle C. thermocellum'un sellülaz enzim sistemi selülozun kimyasal maddelere dönüştürülmesi için fungal sellülazlar yerine kullanılabilecek uygun bir alternatiftir. C. thermocellum selülozu karbon kaynağı olarak kullanarak etanol, asetik asit, laktik asit ve hidrojen gazı (H 2 ) üretir yılında dünyadaki etanol üretiminin 31.2 milyar L civarında olduğu rapor edilmiştir. Bunun % 7 si sentetik olarak üretilen etanol geri kalanı ise fermentasyonla elde edilen etanoldür (Berg, 1999). Toplam üretimin 2/3 ünü yakıt olarak kullanılan etanol oluşturur. Bölgesel üretim karşılaştırılacak olursa Amerika kıtası 2.3, Asya 5.5, Avrupa 2

17 4.7, Afrika.5 Okyanusya.2 milyar L etanol üretir. En fazla etanol üreten ülke Birezilyadır (13.5 milyar litre). Amerika nın etanol üretimi 3.9 milyar L dir. Avrupa Birliği 2 milyar L etanol üretir ancak bunun yalnızca % 5 i yakıt olarak kullanılmaktadır. Bu üretimin % 3 unu Fransa, %18 ini İngiltere, % 17 sini Almanya ve %9 unu İtalya gerçekleştirmektedir. İsviçre ise %.22 lik bir paya sahiptir (Bothast ve ark., 1999). Son 2 yılda etanol üretim maliyeti 4 kat düşmüştür. Etanol şu anda benzin ile karışım olarak kullanılmak için çok uygundur ve birkaç şirket ilk fabrikalarını kurmak için çalışmalarına başlamışlardır. Ancak etanolün benzin ile yarışabilmesi için daha yeterli bir etanol üretim prosesine ve ucuz substratların kullanımı gerekmektedir (Zaldivar ve ark, 21). Daha yüksek seviyede etanol üretimi için lignoselüloz gibi ucuz substratlar değerlendirilebilir. Tarımsal kaynaklı selülozik atıkların kullanımıyla etanol üretimi daha ekonomik hale getirildiğinde yakıt kaynaklarının teminindeki sıkıntı hafifleyeceği gibi tarım sektörüne destek sağlayacak yeni bir pazar da sağlanabilir. Lignoselülozik materyallerin hidrolizinden açığa çıkan şekerlerin fermentasyonunu yapabilen yeterince mikroorganizma olmaması bu materyalin kullanımını engelleyen ana faktörlerden biridir. Bazı termofilik bakteriler ve genetik araştırmalar sonucunda elde edilen bazı suşlar selülozun etanole direk dönüşümünde önemli rol oynarlar (Jeewon, 1997). Optimum üreme sıcaklığı 6 C olan ılımlı termofilik bakteriler etanol fermentasyonu konusunda çok sık gündeme gelirler (Camganella ve Wiegel, 1993; Hogsett ve ark., 1992; Kurose ve Tonomura, 1994; Lamed ve Bayer, 1988). Çünkü termofilik fermentasyonun birtakım avantajları vardır. Örneğin yüksek sıcaklıklarda ortamda yoğunluk ve yüzey direnci az, substrat çözünürlüğü ve reaksiyon hızı yüksek, bioreaktör soğutması ekonomik, kontaminasyon riski düşük, oksijen çözünürlüğü az, ürünün elde edilmesi kolay, substrat ünitesine düşen ürün üretimi yüksek, ve ürün birimine düşen hücre miktarı düşüktür. Bakteriyel direk dönüştürme prosesi etanol üretim maliyetini düşürmenin ümit verici bir yoludur. Bu proseste sellülaz enziminin üretimi ve etanol üretimi aynı mikrobik bileşim tarafından gerçekleştirilir. Etkili bir direk dönüşüm prosesi için tek ya da iki organizmanın birleşimiyle oluşan mikrobiyel sistemin aşağıdaki özelliklere sahip olması gerekir: 1. Yüksek miktarda aktif selüloz ve hemiselüloz enzim sistemi sentezlemesi 2. selüloz ve hemiselülozdan şeker fermentasyonu yapabilmesi 3. istenen ürünü istenmeyen diğer yan ürünlerden daha fazla miktarda üretebilmesi ve bu ürünün saf olarak ayrıştırılabilmesi. Yukarıda belirtilen tüm özelliklere sahip bir mikroorganizma henüz mevcut değildir. 3

18 Termofilik anaerobik ve sellülolitik bakteriler lignoselüloz biyokütlede bulunan karbonhidratların parçalanması işleminde çok aktiftirler ancak glükozdan etanol üretimi konusunda S. cerevisiae veya Zymomonas mibilis ile yarışamazlar. S. cerevisiae altı karbonlu şekerlerin fermentasyonuyla etanol üretiminde yüzyıllardan beri kullanılmaktadır. Bu mikroorganzima etanole, diğer fermenytasyon yan ürünlerine ve lignoselüloz ve hidrolizatında bulunan engelleyici maddelere karşı son derece dirençlidir. Bu yüzden etanol üretim kapasitesi çok yüksektir (Hahn-Hagerdal ve ark, 21; Olsson ve Hahn- Hagerdal, 1993). Genellikle S. cerevisiae hücreleri lignosellülozik maddelerin degredasyonundan açığa çıkan xyloz un kullanımı konusunda yetersizdirler. Van Zyl ve arkadaşları (1989) S. cerevisiae ATCC 2662 suşunun D-riboz varlığında xylozu kullanabildiğini göstermişlerdir. Termofilik anaerobik sellülolitik bakteri C. thermocellum ve S. cerevisiae nın en etkili oldukları iki prosesin birleştirildiği bu projede selülozun parçalanmasıyla oluşan glükozun maya tarafından kullanılmasıyla daha ekonomik bir etanol üretiminin sağlanması amaçlanmıştır. 4

19 2. YÖNTEM 2.1. Deneyde Kullanılan Mikroorganizmalar Bu çalışmada Amerikan Kültür Kolleksiyonu ndan (American Type Culture Collection) temin edilmiş olan Clostridium thermocellum ATCC 2745 suşu ve Saccharomyces cerevisiea 2662 suşu kullanılmıştır. C. thermocellum RM sıvı besiyerine periyodik olarak ekilmiştir. Uzun süre muhafaza için logaritmik faza kadar üretilen hücreler % 2 gliserol içeren RM besiyerinde -2 C de saklanmışlardır Kullanılan Besiyeri Bakterilerin üretilmesi için RM (Russian Medium) besiyeri kullanılmıştır [Tsoi et al, 1987]. RM besiyeri 1 g/l karbon kaynağı (selüloz veya selüloz içeren atık maddeler), 2 g/l üre, 2 g/l KH 2 PO 4, 3 g/l K 2 HPO 4, 5 g/l maya özütü,,2 g/l MgCl 2.6H 2 O,,5 g/l CaCl 2.2H 2 O,,25 g/l FeSO 4.7H 2 O ve 1 g/l L-Sistin amino asiti içermektedir. Besiyeri 1 ml lik septum şişelerinde karbon kaynağı (C), üre (RM I), tampon (RM II), maya özütü (RM III) ve metaller ve sistin (RM IV) olmak üzere beş ayrı bileşen şeklinde hazırlanıp anaerobik kabinde 15 dakika bekletilerek oksijenden arındırılmışlardır. 121 C de 15 dakika otoklavlanarak steril edilen besiyerleri hücrelerin üretilmesi için kullanılmıştır. Besiyerinin oksijenden arındırıldığının anlaşılması için RM II bileşenine 2 ml resazurin (1 g/l) indikatörü eklenmiştir. Anaerobik ortam sağlanması için anaerobik kabin kullanılmıştır. Kabin atmosferi azot gazı içermektedir Hücrelerin Ekilmesi Deneye başlanmadan önce hücreler üç gün boyunca RM besiyerinde 55 o C de karışım gazı içeren anaerobik kabinde üretilmişlerdir. Tüm deneyler aynı şartlarda hazırlanıp üretilmiş taze kültürden ekim yapılarak başlatılmıştır. Ekim yapmak için steril enjektörler kullanılmış, 5 ml RM besiyeri içeren 1 ml lik lastik kapaklı septum şişelerine 5 ml kültür ekilmiştir. Tüm deneylerde başlangıç kültürü (aşı) miktarı toplam kültür hacminin 1/11 i olacak şekilde ayarlanmıştır. 5

20 2.4. Ölçüm Metodları Glukoz, Sellobiyoz, Etanol, Laktik Asit ve Asetik Asit Miktarının HPLC (High Pressure Liquid Cromotography) kullanılarak Tespit Edilmesi Kültür ortamında biriken glukoz ve üretilen etanol miktarları HPLC (Essence system, Lab Alliance) cihazı kullanılarak ölçülmüştür. HPLC cihazına numune verilmeden önce 1 ml numune.45 μm gözenek genişliğine sahip filtreden süzülmüştür. Süzülen numune 45 C de çalışan kolon fırını içine yerleştirilmiş polimer IEXH form 8 μm şeker kolonu ve 45 C de çalışan refraktif indeks dedektörü kullanılarak analiz edilmiştir. Mobil faz olarak 9 mm sülfürik asit çözeltisi kullanılmıştır. Akış hızı 1 ml/dk olarak ayarlanmıştır. Şekil 2.1 de HPLC analizlerine ait sellobiyoz, glukoz, laktik asit, asetik asit ve etanol standartlarına ait sinyal pikleri gösterilmiştir. Şekil 2.1 HPLC analizinde standart sellobiyoz, glukoz, laktik asit, asetik asit ve etanol e ait sinyal pikleri Hücre Tutuklamalı Reaktörün Hazırlanışı Polimerin hazırlanışı Bir biyofilm oluşturmak amacıyla kullanılan polimer 4 ml su,.5g potasyumperoxidisulfat, 5.6 ml styrene, 2.6 ml divynilbenzen ve 1.8 ml span 8 içermektedir. 5 ml lik falkon tüp içerisine 1.8 ml span 8, 5.6 ml styrene ve 2.6 ml divynil benzen eklenip iyice çalkalanmıştır. Bu karışım üzerine 5 dk boyunca manyetik karıştırıcıyla karıştırılmış 4 ml %1.25 potasyumperoxidisulfat eklenmiş ve 5 dk boyunca 6

21 hızlı bir şekilde çalkalanmıştır. Karışım 5 dk 6 C deki etüve dik bir şekilde inkübasyona bırakılmıştır. 5 dakikada bir etüvden çıkarılan falkon tüp içindeki karışım 2-3 dk hızla çalkalanmış ve bu işlem 2 defa tekrarlanmıştır. Falkon tüp içerisinde 1 gün bekletilen polimer daha sonra tüpten çıkarılıp 1 gün 6 C de etüvde kurumaya bırakılmıştır. Kuruyan polimer el ile küçük parçalara ayırılarak elekten geçirilmiştir. 8 mesh boyutundaki parçacıklar reaktör dolgu maddesi olmak üzere alınmıştır. Reaktör içerisine 8 gr polimer yerleştirildikten sonra reaktörün üst kısmına cam yünü konulmuş ve reaktör kapatılmıştır. Kapatılan reaktör 121 C de 15 dk boyunca otoklavlanarak steril hale getirilmiştir. Reaktörün çalıştırılması Paslanmaz çelikten yapılmış silindirik reaktör 18 ml iç hacim, 4.8 cm iç çap, 1 cm iç yükseklik, 7 cm dolgu maddesi yüksekliğine sahiptir (Şekil 2.2). S.cerevisiae hücreleri 1 g/l glukoz içeren 1 litre YM besiyerinde 3 gün üretildikten sonra 8 gr polimerin bulunduğu steril silindirik çelik reaktör içerisine peristaltik pompa (Masterflex, Cole-Parmer) yardımıyla verilerek polimerik maddeye tutuklanmaları sağlanmıştır. Daha sonra maya hücrelerinin üremesi için sisteme sırasıyla 2 g/l glukoz içeren YM ve 2 g/l glukoz içeren RM besiyerleri 1 ml/dk debi ile verilmiştir. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için besiyerlerine konsantrasyonu 5 μg /l olacak şekilde tetrasiklin ilave edilmiştir. 7

22 Şekil 2.2. Polimere tutuklanmış S. cerevisiea hücreleri ile etanol üretmek için kullanılan Hücre Tutuklamalı Reaktör (Immobilized cell Reactor, ICR) 2.6. Lignoselülozik Kaynakların Asit Hidrolizi Lignoselülozik kaynak olarak buğday sapları kullanılmıştır. Saplar ince parçalar halinde kesilmiş ve 55 C de 24 saat kurutulmuştur. Kurutulmuş atık üzerine 14,2 ml/gr lignoselülozik atık olacak şekilde H2SO4 ilave edilmiştir. Ağızları kapatılan şişeler otoklavlandıktan sonra NaOH ile ph değerleri 5 e yükseltilmiştir Toplam şeker ve selüloz miktarının tespiti Kültürlerde biriken şeker ve kalan selüloz miktarları fenol sülfürik asit metodu (Dubois ve ark., 1956) ile tespit edilmiştir. 1 ml hücre kültürü 65 rpm hızda 5 dakika çöktürüldükten sonra sıvı kısmı (supernatant) indirgen uçlu şeker miktarının belirlenmesi için, çökelti (pellet) kısmı ise selüloz miktarının tespiti için kullanılmıştır. 8

23 3. YAPILAN ÇALIŞMALAR VE BULGULAR 3.1. Değişik Lignoselülozik Kaynakların C. thermocellum Tarafından Kullanımı Projenin bu bölümünde, farklı kağıt atıkları ve tarımsal atıkların termofilik, selülolitik ve anaerobik bir bakteri olan C. thermocellum un selülolitik kapasitesinden yararlanılarak parçalanması sağlanmış ve bu parçalanma sonucunda ortamda biriken glukoz miktarı ve üretilen etanol miktarı ölçülmüştür. Öncelikle karbon kaynağı olarak 1 g/l olacak şekilde Whatman filtre kağıdı (no:1), A4 kağıdı, havlu kağıt, pamuk ve selüloz tartılıp hiçbir kimyasal ön işlem yapılmadan küçük parçalara bölünerek modifiye RM besiyerine eklenmiştir. Hazırlanan besiyerlerine C. thermocellum hücreleri ekilmiş ve yirmi günlük fermentasyon süresince glukoz konsantrasyonu ölçülmüştür. Proses sonunda kullanılamayan kağıt kalıntıları kurutulup tartılarak parçalanan miktarları tespit edilmiştir. Selülozun doğada en saf halde bulunduğu madde olan pamuk içeren besiyerinde en yüksek glukoz konsantrasyonuna ulaşılmıştır (9,13 g/l) fakat üretilen etanol miktarında fazla bir artış görülmemiştir (Şekil 3.1 B). Whatman filtre kağıdında en yüksek glukoz konsantrasyonu onuncu günde 7,9 g/l olarak ölçülmüştür, etanol miktarı ise,5 g/l olarak tespit edilmiştir. 1g/l selüloz içeren besiyerinde ve havlu kağıt içeren besiyerinde on beşinci günde sırasıyla 6,4 ve 8 g/l glukoz birikimi olduğu görülmüştür. A4 kağıdının ise C. thermocellum tarafından parçalanma hızının çok düşük olduğu tespit edilmiştir. Havlu kağıt içeren besiyerinde asetik asit üretiminde artış görülmüştür beşinci günden itibaren asetik asit miktarı 1,1 g/l ye çıkmıştır. Etanol konsantrasyonu ise on beşinci günde,6 g/l ye çıkabilmiştir. 9

24 glukoz konsantrasyonu (g/l) zaman (gün) selüloz whatman havlu kağıt A4 pamuk etanol konsantrasyonu (g/l) 1,8,6,4, zaman (gün) selüloz whatman havlu kağıt A4 pamuk (A) (B) Şekil 3.1. Değişik kağıt atıklarının C. thermocellum tarafından kullanımı sonucu biriken glukoz miktarı (A) ve etanol üretimi (B) Yirmi günlük proses sonunda ortamda,71 g/l havlu kağıt,,5 g/l whatman filtre kağıdı,,9 g/l pamuk,,36 g/l A4 ve,43 g/l selüloz kullanılmadan kalmıştır. Proses atık kağıtların ortadan kalıdırılması açısından bakıldığında oldukça başarılıdır. Çalışmanın ikinci kısmında bitki kalıntılarının C. thermocellum tararfından kullanımı incelenmiş, selülozik atıkların işlem öncesi kaynatılmasının ve alkali hidrolizine tabi tutulmalarının degredasyona olan etkisi araştırılmıştır. Tarımsal kaynaklı lignoselülozik atıklardan; arpa sapı, buğday sapı, sazlık otu, mısır kabuğu, palmiye ağacı lifi ve barbunya kabuğu C. thermocellum kültürleri için selüloz kaynağı olarak kullanılmış ve bu atıkların parçalanması sonucu biriken glukoz miktarları tespit edilmiştir. Arpa sapı içeren besiyerlerinde en fazla glukoz konsantrasyonu ön işlem (alkali hidroliz) görmüş olan numunelerde elde edilmiştir. Alkali hidroliz edilen numunelerdeki glukoz miktarı onuncu ve on beşinci günler için sırasıyla 4,6 ve 4,1 g/l olmuştur (Şekil 3.2. A). En yüksek glukoz değeri onuncu günde elde edilmiştir. Kontrole oranla glukoz konsantrasyonu alkali hidroliz yapılmış numunelerde onuncu günde alınan değerlere göre 1

25 % 14 artmıştır. Kaynatılmış numunelerde ilk beş gün içinde glukoz konsantrasyonu artmış daha sonra düşüş göstermiştir (Şekil 3.2. A). Etanol üretiminin alkali hidroliz yapılan arpa sapının karbon kaynağı olarak kullanıldığı kültürlerde daha yüksek olduğu gözlemlenmiş, fermentasyonun onuncu ve on beşinci günlerinde,5 g/l olarak ölçülmüştür (Şekil 3.2. A). Alkali hidrolizinin buğday sapının parçalanma hızını ve sonuç olarak glukoz miktarını arttırdığı görülmüştür. Kontrole kıyasla alkali hidrolizine tabi tutulan buğday saplarını içeren besiyerinde glukoz birikimi %1 oranında artış göstermiştir. Fermentasyonun beşinci gününde 4,2 g/l glukoz birikimi olmuştur (Şekil 3.2. B). Ayrıca alkali hidrolizine tabi tutulmuş buğday sapının bulunduğu kültürlerde diğerlerine kıyasla biraz daha fazla etanol üretimi olmuş ve on beşinci günde,5 g/l olarak ölçülmüştür (Şekil 3.2. B). Alkali hidroliz uygulamasının sazlık otunun hidrolizini kolaylaştırdığı ve glukoz birikimini arttırdığı gözlemlenmiştir. Bu kültürde onuncu günde 4 g/l glukoz biriktiği görülmüştür. Fermentasyonun onuncu gününde etanol konsantrasyonu yaklaşık,7 g/l ye ulaşmıştır (Şekil 3.2. C). Mısır kabuğu içeren besiyerlerinin tümünde fermentasyonun on beşinci gününde glukoz konsantrasyonu en yüksek değerine ulaşmıştır. En yüksek glukoz birikimi kontrol numunesinde gerçekleşmiştir on beşinci günde glukoz miktarı 4,7 g/l olarak ölçülmüştür (Şekil 3.2. D). Ancak kontrolde etanol üretimi kaynatılmış ve alkali hidroliz uygulanmış örneklerdekine kıyasla düşüktür. 11

26 glukoz konsantrasyonu (g/l) zaman (gün) kontrol (glukoz) alkali hidroliz (glukoz) kaynatılmış (etanol) 1,8,6,4,2 etanol konsantrasyonu (g/l) kaynatılmış (glukoz kontrol (etanol) alkali hidroliz (etan glukoz konsantrasyonu (g/l) ,8,6,4, zaman (gün) 1 etanol konsantrasyonu (g/l) kontrol (glukoz) kaynatılmış (glukoz) alkali hidroliz (glukoz) kontrol (etanol) kaynatılmış (etanol) alkali hidroliz (etanol) (A) (B) glukoz konsantrasyonu (g/l) ,8,6,4, zaman (gün) 1 etanol konsantrasyonu (g/l) kontrol (glukoz) kaynatılmış (glukoz) alkali hidroliz (glukoz) kontrol (etanol) kaynatılmış (etanol) alkali hidroliz (etanol) glukoz konsantrasyonu (g/l) zaman (gün) kontrol (glukoz) alkali hidroliz (glukoz) kaynatılmış (etanol) 1,8,6,4,2 etanol konsantrasyonu (g/l) kaynatılmış (glukoz) kontrol (etanol) alkali hidroliz (etanol) (C) (D) Şekil 3.2. Kaynatma ve alkali hidroliz işlemlerinden geçirilmiş tarımsal atıkların C. thermocellum tarafından kullanımı; glukoz birikimi ve etanol üretimi Arpa sapı (A), Buğday sapı (B), Sazlık otu (C), Mısır kabuğu (D), Palmiye ağacı lifleri (E), Barbunya kabuğu (F) (Şekil arka sayfada devam ediyor). 12

27 glukoz konsantrasyonu (g/l) zaman (gün) kontrol (glukoz) alkali hidroliz (glukoz) kaynatılmış (etanol) 1,8,6,4,2 etanol konsantrasyonu (g/l) kaynatılmış (glukoz) kontrol (etanol) alkali hidroliz (etanol) glukoz konsantrasyonu (g/l) zaman (gün) kontrol (glukoz) alkali hidroliz (glukoz) kaynatılmış (etanol) 1,8,6,4,2 etanol konsantrasyonu (g/l) kaynatılmış (glukoz) kontrol (etanol) alkali hidroliz (etanol) (E) (F) Şekil 3.2. Devamı. Palmiye ağacı lifi için uygulanan ön işlemlerin glukoz birikimi için etkili olmadığı görülmüştür. Ancak kontrolde hiç etanol üretimi görülmezken alkali hidrolize tabi tutulan örneklerde etanol konsantrasyonu onuncu günde,4 g/l ye ulaşmıştır (Şekil 3.2. E). En yüksek glukoz konsatrasyonu onuncu günde kontrol numunesinde 4,4 g/l olarak ölçülmüştür. Benzer şekilde barbunya kabuğu için uygulanan ön işlemlerinde glukoz birikimine faydalı olmadığı görülmüştür. En yüksek glukoz konsantrasyonuna beşinci günde kontrol numunesinde ulaşılmış ve 4,2 g/l olarak ölçülmüştür. Kaynatma işlemi uygulanan numunelerde onuncu günde 4 g/l glukoz elde edilmiştir. Uygulanan ön işlemler etanol konsantrasyonunda da bir artış sağlamamıştır (Şekil 3.2. F) Bitki kalıntılarının C. thermocellum tararfından parçalanması işlemini özetleyecek olursak alkali hidrolizi yapılan bitki artıklarının birçoğunun C. thermocellum tarafından daha kolay kullanıldığını ve bu kültürlerde etanol üretiminin kontrole kıyasla daha yüksek olduğunu söyleyebiliriz. Alkali hidroliz yöntemi en çok arpa sapında etki göstermiş, alkali hidrolizinden geçirilen bitki saplarını içeren numunelerde glukoz birikiminin kontrole oranla %14 arttığı gözlenmiştir. Buğday sapı ve sazlık otu içeren besiyerinde de alkali hidrolizin etkili olduğu kontrole kıyasla glukoz birikimini %1 ve 15 oranında arttırdığı görülmüştür. 13

28 3.2. Farklı Konsantrasyonlarda kağıt ve bitki kalıntısı içeren numunelerde glukoz ve etanol üretimi Farklı Konsantrasyonlarda kağıt atığı içeren numunelerde glukoz ve etanol üretimi Çalışmanın bu bölümünde farklı miktarlarda saman kağıdı içeren besiyerlerinde C. thermocellum hücreleri tarafından kağıt kullanımı incelenmiş, glukoz ve etanol miktarı on beş günlük fermentasyon sonucunda tespit edilmiştir. Şekil 3.3. A da görüldüğü gibi en yüksek glukoz birikimi (4,5 g/l) 3 g/l kağıt içeren kültürde gerçekleşmiştir. Kağıt miktarının yükseltilmesi glukoz birikiminde bir artışa neden olmuştur ancak bu artış ortamdaki kağıt miktarı ile doğru orantılı bir artış değildir. Etanol üretimi ise 2 ve 3 g/l kağıt içeren besiyerlerinde diğerlerine kıyasla daha yüksektir ve yaklaşık,45 g/l olarak ölçülmüştür (Şekil 3.3. B). Proses sonucunda ortamda kalan selüloz miktarı Tablo 2. de verilmiştir. glukoz konsantrasyonu (g/l) glukoz konsantrasyonu (g/l) kağıt miktarları (g/l) kağıt miktarları (g/l) (A) (B) Şekil 3.3. Farklı konsantrasyonlarda kağıt içeren C. thermocellum kültüründe glukoz birikimi (A), etanol üretimi (B). 14

29 Tablo. 1. Saman kağıtlarının kullanım sonrası ortamda kalan selüloz miktarı Kağıt miktarı (g/l) Kalan selüloz miktarı (g/l) Farklı miktarlarda bitki kalıntısının glukoz ve etanol üretimine olan etkisini incelemek amacıyla buğday sapı kullanılmıştır. Buğday sapı lignin içeriği yüksek ve zor parçalanan bir bitki kalıntısıdır. 5, 1, 2, 3, 5 ve 7 g/l alkali hidrolize tabi tutulmuş buğday parçalarını içeren RM besiyerine üzerine C. thermocellum hücreleri ekilmiş ve 55 C de anaerobik kabin içerisinde inkübe edilmiştir. Bu besiyerlerinde glukoz birikiminin zamana bağlı değişimi Tablo 2 de gösterilmiştir. Şekil 3. 4 te ise bu veriler grafik olarak gösterilmiştir. Grafiği incelediğimizde en yüksek glukoz miktarı 5 g/l buğday sapı içeren besiyerinde elde edilmiş ve 6 g/l olarak ölçülmüştür. Besiyerine eklenen bitki miktarındaki artış glukoz birikimini artırmıştır ancak bu artış çok yüksek seviyelere çıkmamıştır. 1 g/l bitki kalıntısı içeren besiyerinde 14. günde ölçülen glukoz miktarı 2,7 civarında iken 5 g/l bitki kalıntısı içeren besiyerinde bu miktar 6 g/l olarak ölçülmüştür. C. thermocellum bakterisi selulozu glukoza parçalarken oluşan glukozun bir kısmını Tablo 3 de görülen asetik asit, laktik asit ve etanol gibi ürünlere dönüştürmektedir. Oluşan glukoz kullanıldığı için 5 g/l nin altındaki konsantrasyonlarda bitki kalıntısı içeren besiyerlerinde glukoz miktarında kayda değer bir artış görülmemiştir. Tablo 2. Farklı miktarlarda bitki kalıntısı içeren besiyerinde zamana bağlı glukoz birirkimi zaman Farklı Lignoselüloz Konsantrasyonlarında Glukoz Birikimi 5g/l 1g/l 2g/l 3g/l 5g/l 7g/l.gün 2,3 2,4 2,9 2,3 2,6 3, 4.gün 2,4 1,9 2,3 2,1 2,6 2,7 8.gün 2,6 2,6 2,6 2,2 3,3 3,3 14.gün 1,9 2,7 2,7 2,9 6 4,8 15

30 7 glukoz konsantrasyonu (g/l) gün 4.gün 8.gün 14.gün zaman 5g/l 1g/l 2g/l 3g/l 5g/l 7g/l Şekil 3.4. Farklı miktarlarda bitki kalıntısı içeren besiyerinde zamana bağlı glukoz birirkimi Tablo 3. Farklı miktarlarda bitki kalıntısı içeren besiyerlerinde zamana bağlı son ürün miktarları 5g/l 1g/l 2g/l Laktik Asetik Etanol Laktik Asetik Etanol Laktik Asetik Etanol zaman asit asit asit asit asit asit.gün 4.gün,4 8.gün,3,2,1,5,3,2,5,3 14.gün,75,3,3,2,7,4,3,7,4 3g/l 5g/l 7g/l Laktik Asetik Etanol Laktik Asetik Etanol Laktik Asetik Etanol zaman asit asit asit asit asit asit.gün 4.gün,1,7,5,1,5,3 8.gün,2,5,1,7,3,1,4,3 14.gün,3,4,1,7,3,1,7,3 16

31 Şekil 3.4 te 1 g/l bitki kalıntısı içeren besiyerinde 14. günde elde edilen glukoz miktarı Şekil 3.1 de 1 g/l selüloz içeren besiyerinde biriken glukoz miktarı ile karşılaştırılacak olursa biriken glukoz miktarlarında yaklaşık 2.5 g/l lik bir fark olduğu görülür. Çünkü işlenmiş selüloz bakteri tarafından çok daha kolay parçalanabilmektedir. Buğday sapı ise ortama herhangi bir enzim ilavesi yapılmaksızın yalnızca bakteriyel aktivite ile parçalanması zor bir bitki kalıntısıdır. İçeriğinde fazla miktarda lignin olması parçalanmasını zorlaştırmakta ve içeriğinde bulunan selülozun bakteri tarafından kullanımını engellemektedir. Bu tip maddeler dışarıdan yapılacak olan lignin parçalayıcı enzimler ve selülaz enzimi ilavesi ile daha etkin bir şekilde parçalanabilir ve ortamda biriken glukoz miktarı artırılabilir. Bitki kalıntısı içeren besiyerlerinde kalan selüloz miktarının tespit edilmesi Farklı konsantrasyonlarda lignoselülozik madde içeren besiyerlerinin 14 gün boyunca C. thermocellum hücrelerince kullanımı sonucunda oluşan ürünler ve kullanılan selülozik madde miktarları Tablo 5 de gösterilmiştir. Deneylerimizde lignoselüloz içeren madde olarak buğday sapı kalıntıları kullanılmıştır. Literatürde yapılan çalışmalar buğday çöpündeki toplam selüloz miktarının % 3, hemiselüloz miktarının % 5, lignoselüloz miktarının ise % 15 olduğunu göstermektedir (Sun ve ark., 22). Deneyimizde kalan toplam selülozik madde miktarı proses sonucu ortamda kullanılmadan kalan selülozik maddelerin kurutulup tartılması ile bulunmuştur. Kalan bu selülozik maddeler kullanılmayan bitki kalıntıları olup içerik olarak selüloz, hemiselüloz ve lignoselülozdan oluşmaktadır. Selüloz ve hemiselüloz bakteriler tarafından kolay parçalanan selüloz kaynaklarıdır. Lignoselüloz ise lignin içermesi nedeniyle zor parçalanmakta ve kullanılmadan kalmaktadır. Dolayısı ile üretilen tüm ürünler (glukoz selobioz, laktik asit, asetik asit ve etanol) bitki kalıntısı içinde bulunan selüloz ve hemiselülozun kullanılması ile üretilmektedirler. Tablodaki değerler incelendiğinde kullanılan selülozik madde miktarı arttıkça kullanım veriminin düştüğü görülmektedir. 5 g/l lignoselüloz (buğday atığı) ile yapılan deneyde kullanım verimi selüloz ve hemiselüloz miktarları baz alındığında %94; toplam selülozik madde miktarı (lignoselüloz dahil) baz alındığında %75 olarak bulunmuştur. Bitki kalıntısı miktarı 7 g/l ye çıkartıldığında ise ortamdaki toplam selüloz ve hemiselülozun yeterince kullanılamadığı görülmektedir. Kullanım verimi toplam selülozik 17