T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TOXOPLASMA GONDII CANLI TAKİZOİT ÜRETİMİNDE FARE KULLANIMINA ALTERNATİF: SÜREKLİ HÜCRE KÜLTÜRÜ Doktora Tezi Doktor Aysu DEĞİRMENCİ DANIŞMAN Prof. Dr. Ahmet ÜNER İZMİR 2009 i

2 ii

3 DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ Adı Soyadı İmza Başkan (Danışman) : Prof. Dr. Ahmet Üner Üye : Prof. Dr. A. Yüksel Gürüz Üye : Prof. Dr. Mucide Ak Üye : Prof. Dr. Ziya Alkan Üye : Prof. Dr. Çiler Akısü Doktora Tezinin kabul edildiği tarih: iii

4 ÖNSÖZ Doktora tezimde Toxoplasma gondii canlı takizoit üretiminde fare kullanımına alternatif sürekli hücre kültürü denemeleri yapılmıştır. Elde edilen hücre kültürü kaynaklı antijenin BALB/c fare kaynaklı antijen ile uyumluluk ve/veya farklılığı toxoplasmosis tanı testleri ile araştırılmıştır. Bu projenin planlanmasında 2006 yılında Parasitology dergisinde yayınlanan ve yazarları içinde bulunduğumuz Behavior of Toxoplasma gondii RH Ankara Strain Tachyzoites During Continuous Production in Various Cell Lines adlı araştırmamıza ait veriler temel alınmıştır. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar ile bağlantılı olarak hazırladığımız tez projemiz Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK Proje no: SBAG 105S022) ve Ege Üniversitesi Bilim Teknoloji Uygulama ve Araştırma Merkezi (EBİLTEM Proje no: 2006 BİL 012) tarafından desteklenmiştir. Bu araştırmanın bilimsel olarak planlanmasında, gerçekleştirilmesinde ve aynı zamanda bilim insanı olarak yetişmemde büyük katkıları olan, başta Tez Danışmanım Prof. Dr. Ahmet Üner, fikirleriyle çalışmalarıma destek olan Bilim Dalı Başkanımız Prof. Dr. Yüksel Gürüz, Prof. Dr. Metin Korkmaz ve tüm değerli öğretim üyelerine çok teşekkür ederim. Ayrıca doktora tezimin her aşamasında yarattıkları bilimsel tartışma ortamıyla beni teşvik eden çalışma arkadaşlarım Uzm. Dr. Ayşe Caner ve Uzm. Dr. Mert Döşkaya ya, bu süreçte hoşgörüleriyle bana destek olan tüm Kan merkezi ekibine ve Parazitoloji çalışanlarına teşekkürü bir borç bilirim. Son olarak, tüm doktora eğitimim boyunca desteklerini ve sevgilerini her zaman yanımda hissettiğim canım kızım Ada ya, sevgili anne ve babama en içten teşekkürlerimi sunarım. İzmir, Dr. Aysu Değirmenci iii

5 İÇİNDEKİLER ÖNSÖZ... iii ŞEKİLLER DİZİNİ... viii TABLOLAR DİZİNİ... ix GRAFİKLER DİZİNİ... xi BİRİNCİ BÖLÜM GİRİŞ Tarihçe ve sınıflandırma Morfoloji ve Hayat Döngüsü Epidemiyoloji Patogenez ve Patoloji İmmunoloji Klinik İmmun sistemi sağlam hastalar Edinilmiş akut T. gondii enfeksiyonu olan hamileler ve erişkinler Konjenital olarak enfekte çocuklar İmmun sistem yetmezliği bulunan hastalar HIV ile enfekte hastalar Organ transplantasyonu olan hastalar Tanı Indirek tanı iv

6 Direk tanı Hücre kültürü ve Toxoplasma gondii Tedavi Korunma İKİNCİ BÖLÜM GEREÇ ve YÖNTEM Hücre kültürü Hücre kültürü ve kriyopreservasyon çalışmalarında kullanılan cihaz, solüsyon, besiyeri ve sarf malzemeleri Cihazlar Solüsyon ve besiyeri Sarf malzemesi HeLa hücre kültürü T. gondii takizoit ekimi için kültürde kullanılacak HeLa hücresi sayısının belirlenmesi HeLa hücre kültüründe sürekli üretim için ekilecek T. gondii takizoit sayısının belirlenmesi HeLa hücre kültüründe üretilen T. gondii takizoit kriyopreservasyonu Serolojik testler Serolojik testlerde kullanılan cihaz, solüsyon, antikor ve sarf malzemeleri Cihazlar v

7 Antikorlar Kimyasal sarf malzemeleri Plastik ve diğer sarf malzemeleri Serolojik testler için antijen hazırlama IFAT yöntemi için partikül antijen hazırlama ELISA ve Western blot yöntemleri için eriyik antijen hazırlama İndirek floresan antikor testi (IFAT) Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ve Western blot Eriyik antijenlerin örnek tampon ile karıştırılması Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Western blot İstatiksel analiz ÜÇÜNCÜ BÖLÜM BULGULAR T. gondii takizoit ekimi için kültürde kullanılacak HeLa hücresi sayısının belirlenmesi HeLa hücre kültüründe sürekli üretim için ekilecek T. gondii takizoit sayısının belirlenmesi vi

8 3.3. HeLa hücre kültüründe üretilen T. gondii takizoit kriyopreservasyonu Serolojik testler İndirek floresan antikor testi (IFAT) Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) Western blot DÖRDÜNCÜ BÖLÜM TARTIŞMA BEŞİNCİ BÖLÜM SONUÇ ve ÖNERİLER ÖZET ABSTRACT YARARLANILAN KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ vii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1. T. gondii hayat döngüsü... 6 Şekil 1.2. T. gondii takizoitinin konak hücreye invazyonu Şekil 1.3. T. gondii takizoiti Şekil 1.4. T. gondii enfeksiyonu sırasında oluşan hücresel immun yanıt Şekil 1.5. Yeni doğan (18) ve annesinden (17) alınan serum örneğine uygulanan IgG Western blot Şekil 1.6. T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin çeşitli hücre kültürü ortamlarında giemsa boyama ile gösterilmesi Şekil 2.1. Jel tutucu kasetin oluşturulma sırası ve yönü Şekil 3.1. T. gondii takizoitlerinin HeLa hücre kültüründe üretimi Şekil 3.2. BALB/c fare ve iki gün aralıkla 4 ardışık HeLa hücre kültürü pasajından elde edilen antijenlerin A) SDS-PAGE ve B) Western blot yöntemi ile karşılaştırılması Şekil 3.3. BALB/c fare (A) ve HeLa hücre kültürü 1. pasaj kaynaklı (B) eşit miktarda T. gondii RH Ankara suşu takizoiti içeren antijenler kullanılarak toxoplasmosis ön tanısı almış yedi grup anne ve bebeğine ait serum örneklerinde anti-toxoplasma IgG antikorları araştırılması ve oluşan bant paternlerinin karşılaştırılması viii

10 TABLOLAR DİZİNİ Tablo 1.1. İnsan konjenital toxoplasmosis olgularında genotip dağılımı Tablo 1.2. Klinik öneme göre konjenital toxoplasmosisli olguların genotip dağılımı Tablo 1.3. İmmun sistemi baskılanmış kişilerde toxoplasmosis olgularının genotip dağılımı Tablo 1.4. İmmun sistemi sağlam oküler toxoplasmosisli olgularda genotip dağılımı Tablo 1.5. Toxoplasma enfeksiyonları ve tedavi seçenekleri Tablo 2.1. Geliştirme besiyeri hazırlanması Tablo 2.2. İdame besiyeri hazırlanması Tablo 2.3. Stok 2x örnek tamponu hazırlanması Tablo 2.4. Mini Protean III elektroforez sistemi için % 12 lik alt jel içeriğinin hazırlanışı Tablo 2.5. Mini Protean III elektroforez sistemi için üst jel içeriğinin hazırlanışı Tablo 2.6. Pearson korelasyon katsayısının değerlendirilmesi Tablo 3.1. HeLa hücre ve T. gondii RH Ankara suşu takizoit etkileşimi sonucu elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu Tablo 3.2. HeLa hücre ve T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 3 günlük etkileşimi sonucu elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu ix

11 Tablo 3.3. HeLa hücre ve T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 2 günlük etkileşimi sonucu elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu Tablo 3.4. HeLa hücre/takizoit oranının 1/8 olduğu ortamda 2 gün aralıkla sürekli T. gondii üretimi sonucu elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu Tablo 3.5. HeLa hücre kültüründe iki gün aralıkla 4 ardışık pasajdan ve BALB/c fareden elde edilen antijenler ile gerçekleştirilen IFAT IgG ve ELISA IgG sonuçları Tablo 4.1. HeLa hücre kültüründe T. gondii RH suşu takizoitlerinin iki farklı sıcaklıkla, iki tur ve farklı zaman aralıklarında tutulmaları sonucu elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu Tablo 4.2. HeLa hücre kültüründe T. gondii RH suşu takizoitlerinin iki farklı sıcaklıkla ve farklı zaman aralıklarında tutulmaları sonucu elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu x

12 GRAFİKLER DİZİNİ Grafik 3.1. Farklı konsantrasyondaki HeLa hücrelerine belirli sayıdaki T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin etkisi sonunda 25-cm 2 flaskın 5 ml üst sıvısından elde edilen ortalama takizoit miktarı, canlılığı ve HeLa kontaminasyonu Grafik 3.2. HeLa Hücre kültüründe T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 3 günlük etkileşimi sonunda 25-cm 2 flaskın 5 ml üst sıvısından elde edilen ortalama takizoit miktarı, canlılığı ve HeLa kontaminasyonu Grafik 3.3. HeLa Hücre kültüründe T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 2 günlük etkileşimi sonunda 25-cm 2 flaskın 5 ml üst sıvısından elde edilen ortalama takizoit miktarı, canlılığı ve HeLa kontaminasyonu Grafik 3.4. HeLa hücre/takizoit oranının 1/8 olduğu ortamda 2 gün aralıkla sürekli T. gondii takizoit üretimi sırasında sekiz adet 25-cm 2 flaskın ortalama 40 ml üst sıvısından elde edilen takizoit miktarı, canlılığı ve HeLa kontaminasyonu Grafik 3.5. HeLa hücre kültüründe iki gün aralıkla 4 ardışık pasajdan ve BALB/c fareden elde edilen antijenler ile gerçekleştirilen ELISA IgG absorbans değerlerinin Pearson korelasyon ve regresyon analizi xi

13 BİRİNCİ BÖLÜM GİRİŞ Toxoplasma gondii medikal önemi yüksek bir protozoon parazittir. Dünyadaki insanların yaklaşık üçte birini enfekte ettiği tahmin edilmektedir. İnsanların yanı sıra sıcakkanlı hayvanların pek çoğunu enfekte eden önemli zoonotik bir patojendir. T. gondii nin Kuzey Afrika kemirgenlerinden olan Ctenodactylus gundi nin dokularında Charles Nicolle ve Manceaux tarafından keşfinden bu yana 100 yılı aşkın bir süre (1908) geçmiştir (2, 53, 106). T. gondii, günümüzde sebep olduğu su ve besin kaynaklı salgınlar sebebiyle National Institutes of Health (Amerikan Sağlık Enstitüsü) tarafından kategori B (biyoterörizm) ajanı ilan edilince dikkatleri daha da üzerine çekmiştir (12, 15, 18, 50, 106, 117, 128, 146, 151). Toxoplasmosis insanlarda genelde asemptomatik seyretmekte, semptomatik enfeksiyon daha nadir gözlenmektedir. Özellikle hamilelğinde akut enfeksiyon geçiren annelerin fetusların, HIV/AIDS nedeniyle immun sistem yetmezliği olanların, kanser kemoterapisi ve organ transplantasyonu sonrasında immun sistemi baskılananların ciddi enfeksiyon riski altında olduğu belirtilmiştir (123, 124, 161, 162). Retinokoroidit konjenital veya akkiz toxoplasmosis sonucu sık karşımıza çıkmakta ve posterior üveitin yurdumuzda ve dünyada en önemli sebepleri arasında gösterilmektedir (84, 144, 159). Günümüzde T. gondii hayvanlarda ve hücre kültürlerinde üretilmektedir. T. gondii nin hayvanlarda üretilebilmesinde hayvan evi, deneyimli personel varlığı gibi ciddi alt yapı gereksinimi ve yasal düzenlemeler (etik kurul onayı v.b.) mevcuttur. Toxoplasmosis tanısı ile uğraşan pek çok merkezde istenilen koşullar yerine 1

14 getirilemediğinden T. gondii üretiminde hücre kültürü tercih edilen yöntem olmuştur. Hücre kültüründen elde edilen takizoitlerin serolojik tanı testlerindeki kullanım kolaylığı ve düşük maliyetinin yanısıra in vivo inokülasyon tekniklerine göre etik sorunlar çıkarmaması nedeniyle tercih sebebi olduğu bildirilmektedir (7, 8, 23, 31, 60). Bu güne kadar hücre kültüründe üretilen T. gondii takizoitleri tanısal testlerin geliştirilmesi, aşı çalışmaları, ilaç araştırmaları, deneysel modellerin geliştirilmesi, genomik ve proteomik çalışmalar, immunolojik ve biyokimyasal yolakların ortaya çıkarılması ve patogenez gibi geniş bir çalışma yelpazesinde kullanılmaktadır (7, 8, 31, 51, 90, 136, 142, 157). Toxoplasmosisin serolojik tanısında in vivo kültür kaynaklı antijenin yerini alması amacı ile çok çeşitli hücre kültürü ortamlarında T. gondii takizoitleri üretilmiş ve hücre kültürü kaynaklı antijenin rutin serolojik tanı testlerinde kullanılabileceği bildirilmiştir (7, 8, 31, 60, 90). Bu çalışmalarda genellikle canlılık oranı yüksek, bol ve sürekli T. gondii takizoit üretilmesinin yanı sıra üst sıvıda konak hücre kontaminasyonunun düşük seviyede kalması amaçlanmıştır. Bu süreç içinde hücre kültüründe T. gondii takizoitlerinin kültür ortamına adapte olurken gen ekspresyonlarında değişiklikler oluştuğu belirtilmiş ve ortama adapte olma sürecindeki T. gondii suşlarında oluşan antijenik değişikliklerin, serolojik testlerin yorumlanmasını zorlaştırabileceği vurgulanmaya başlanmıştır (31, 52, 121). Adaptasyon sırasında kültür ortamındaki konak hücrelerin ölümüyle T. gondii takizoitleri sağlam hücreleri aynı hızla işgal edememekte, ölen konak hücreleri kültür ortamının dengesini olumsuz etkileyip takizoitlerin ölüm hızını artırmaktadır. Ölüm sürecine giren T. gondii takizoitlerinin protein ekspresyonu ve antijenik özelliklerinde farklılık oluşması ve ölen konak hücrelerine ait protein yapıların antijen kalitesine etki edeceği saptanmıştır (31, 52, 121). Bu sebeple hücre kültürü 2

15 ortamında T. gondii takizoit üretimi sonrasında elde edilen üst sıvıdan konak hücre eksiltilmesi çalışmalarının yerini üretim sırasında konak hücre eksiltilmesi çalışmaları almıştır (7, 8, 31, 51, 60, 90). Ayrıca T. gondii RH suşu takizoitlerinin adapte oldukları HeLa hücre kültürü ortamında üreme sürelerinin çok değişken olduğu ve bu durumun her test gününde yeterli ve canlılık oranı yüksek takizoit elde etmede sorunlar yarattığı izlenmiş, bu sebeple inkübasyon ısı ve süreleri üzerine de araştırmalar yapılmıştır (7, 8, 31, 60). Sonuç olarak günümüzde T. gondii takizoitlerinin serolojik testlerde antijen olarak kullanılması için öncelikle çok sayıda ve canlılık oranı yüksek takizoit elde edilmesi kadar, kültür üst sıvısında düşük konak hücre kontaminasyonu ve antijenin istenilen zamanda hazırlanabilmesi önem kazanmıştır. Bunun sağlanması için her T. gondii suşuna uygun hücre tipi, hücre kültürü ortamı, inkübasyon sıcaklık ve süre kriterlerinin belirlenmesi gerekliliği doğmuştur. Bu araştırmada HeLa hücre kültürü ortamında sürekli üretilen T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin serolojik testlerde antijen olarak kullanılabilmesi için üretim sırasında üst sıvıdaki konak hücre kontaminasyonunun en az, takizoit miktar ve canlılığının en yüksek seviyede tutulması ve takizoitlerin antijenik özlliklerinin in vivo modellerde elde edilen takizoitlere en yakın yapıda oluşturan hücre kültürü ortamının belirlenmesi amaçlanmıştır Tarihçe ve sınıflandırma Toxoplasma gondii ilk defa 1908 yılında Tunus Pastör Enstitüsünde leishmaniasis çalışmalarında kullanılan Ctenodactylus gundi adlı hamster benzeri kuzey Afrika rodentinin çeşitli dokularında saptanmıştır. Bulunan parazit ilk önce 3

16 Leishmania zannedilse de daha sonra yeni bir organizma olduğu anlaşılmış, Nicolle ve Manceaux tarafından morfolojik yapısı (Yunanca Toxon = yay, plasma= yaşam, yaratık, görüntü) ve ilk bulunduğu konağın adı sebebiyle Toxoplasma gondii adı verilmiştir (161, 162). İnsanda klinik tabloyu yansıtan vakalar Castellani (1914), Fedorovitch (1916), Chalmers ve Kamar (1920), Janku (1923), Torres (1927), Coulon (1929), Wolf ve Cowen (1937) tarafından tarif edilmiş fakat bu bildirilerde parazitin adı konamamış veya yanlış konulmuştur. Wolf, Cowen ve Paige 1939 da insandan ilk T. gondii suşunu izole etmiş, fare ve tavşanlarda pasajını gerçekleştirmiştir. Sabin tarafından 1939 da ensefaliti bulunan iki çocuktan (R.H. ve W.B.D.) T. gondii izole edilmiştir. R.H isimli hastaya ait doku örnekleri farelere inoküle edildikten 13 gün sonra karın bölgesi şişen farenin periton sıvısında oluşan eksudada bol miktarda T. gondii saptanmıştır. Türkiye de ilk insan olgusu 1953 yılında Unat ve ark. tarafından bildirilmiş olup T. gondii nin sistematikteki yeri aşağıdaki şekilde gösterilmektedir (108). Phylum Subphylum Classis Subclassis Ordo Subordo Familia Genus Species : Protozoa : Apikomplexa : Sporozoa : Coccidia : Eucoccidiida : Eimeriina : Sarcocystidae : Toxoplasma : gondii 4

17 1939 yılından günümüze kadar birçok laboratuvarda R.H. adı verilen bu laboratuvar suşu, fareler üzerinde üretilmektedir. Bu kadar uzun süredir farelerde sürdürülen R.H. suşunun farelerde oluşturduğu patojenliğin stabilize olduğu, kedilerde ookist oluşturma yeteneğinin kaybolduğu belirtilmiştir (53, 54, 161) Morfoloji ve Hayat döngüsü T. gondii nin üç enfeksiyöz formu takizoitler, bradizoitler (doku kistlerinde) ve sporozoitler (ookistlerde) olup kompleks bir hayat döngüsü oluştururlar (Şekil.1.1). Takizoit: Takizoit (Tachyzoite; tachos=yunanca da hız) ara konağın tüm hücrelerinde, kesin konak kedinin ise bağırsak dışı epitelyal hücrelerinde hızla üreyebilen formdur. Takizotiler hilal şekilli, 2 6 µm boyutlarında, ön ucu konik şekilli ve daha sivri, arka ucu ise daha yuvarlak olup nükleusu orta kısımda yer alan formdur. Takizoit konak hücre içinde tekrarlayan endodiyogeni ile çoğalmaktadır. Bir çok takizoitin bir araya gelmesine klon, terminal koloni veya grup denir (56, 162). Takizoit yapısında apikal ve polar halkalar, konoid roptriler, mikronemler, mitokondri, endoplasmik retikulum, ribozom, yoğun granül, amylopektin granülleri, golgi kompleksi ve birçok membranın bağlanmasından oluşan plastid benzeri apikoplastı barındırmaktadır. Takizoitler konak hücreye aktif penetrasyon veya fagositoz ile girip, parazitofor vakuol (PV) ile çevrelenirler. Takizoitin invazyon hızı ve üremesi T. gondii suşu ve konak hücre türü ile bağlantılıdır. T. gondii suşuna bağlı olarak takizoitin konak hücreye girdikten sonra değişken lag dönemi olduğu, virülan T. gondii suşlarının hücre kültüründe avirülan suşlara göre daha hızlı ürediği ve bazı suşların da daha çok rozet yaptığı belirtilmiştir. T. gondii suşları genetik olarak Tip 1, 5

18 2 ve 3 olarak sınıflandırılsa da bu tipler arasında belirgin yapısal değişiklik saptanmamıştır (56). Aktif enfeksiyon işareti olan takizoitler Sabin Feldman Dye Test, indirek floresan antikor testi (IFAT) ve Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) gibi serolojik tanı testlerinde antijen olarak kullanılmaktadır (56, 86, 101, 108, 123, 124). Sporlanmamış ookisler dışkı ile dış ortama atılır Kesin Konak (Kedi) Plasentadan geçen takizoitler Doku kisti ile enfekte az pişmiş etlerin yenilmesi Ara konaklardaki doku kistlerinin kediler tarafından yenilmesi Besin, su ve topraktaki ookistler ara konak tarafından yenilmesi Kontamine besin ve su Enfekte fetus Ara konaklar Sporlanmış ookist Şekil 1.1. T. gondii hayat döngüsü (56) Bradizoit: Bradizoit (Bradyzoite; brady = Yunanca da yavaş) doku kistinin içinde takizoite göre daha yavaş bölünen formdur. Doku kistleri hücre içinde kalıp büyürken, bradizoitler endodiyogeni ile çoğalırlar. Doku kistlerinin çaplarının

19 µm arasında olabileceği ve bazen iki, bazen de yüzlerce bradizoit içerebilecekleri bildirilmiştir. Bradizoitler yapı olarak takizoitlere benzemekle birlikte daha silindirik hilal şekilli, µm boyutunda, nükleusları arka uçta bulunan formlardır. Bradizoitler kendi üstlerine kıvrılan en çok 3 roptri içerirler. Bradizoit içeren doku kistleri konak hücre içinde kalarak, konak immun sisteminin kontrolü altında, latent enfeksiyona yol açmaktadırlar. Santral sinir sistemi, göz, iskelet kası, düz kas ve kalp kası doku kistlerinin en sık yerleştiği organ ve dokulardır (56, 123, 124, 162). Takizoit inoküle edilen farelerde 3 gün içerisinde doku kisti oluşabildiği bildirilmiştir. Bradizoitlerin proteolitik enzimler ile daha hızlı yıkıldığı, doku kisti veya bradizoit verilen kedilerde enfeksiyon 3-10 gün içerisinde oluşurken, takizoit inoküle edilen kedilerde enfeksiyonun 18 gün sonra başladığı bildirilmiştir. Kediler tarafından yutulan doku kistlerinin duvarı mide ve bağırsaklarda proteolitik enzimlerce parçalanınca serbest kalan bradizoitlerin ince bağırsak epitel hücrelerine penetre olarak üremenin başladığı saptanmıştır. Aseksüel üreme sırasında bağırsak epitel hücrelerinde morfolojik özellikleri takizoitlerden ve bradizoitlerden farklı 5 çeşit T. gondii tipi geliştiği gözlemlenmiş (tip A-E), sadece geç Tip D formunda gösterilen şizogoni ile oluşan merozoitlerin şizontlardan ayrıldığı saptanmıştır. Doku kistleri ile enfeksiyondan 2 gün sonra seksüel üremenin başladığı ve sayısı belli olmayan aseküel üreme döngüsü sonrası şizonttan oluşan merozoitlerin gamet gelişimini başlattıkları öne sürülmüştür. Enterositlere giren bazı merozoitlerin erkek (mikrogametosit) veya dişi (makrogametosit) gametositlere dönüştüğü, makrogametogoni sırasında tek dişi gamet (makrogamet) oluşurken, mikrogametogoni sırasında nükleus parçaya bölünerek erkek gametleri (mikrogamet) oluşturduğu, mikrogametlerin iki uzun flagellaları ile yüzerek olgun makrogametleri dölleyerek zigotu oluşturduğu, bunu parazit etrafında ookist duvarı 7

20 oluşumunun izlediği, enfekte epitel hücresinin parçalanmasıyla ookistlerin bağırsak boşluğuna düştüğü ve dış ortama dışkı ile atıldıkları belirlenmiştir (56, 123, 124, 162). Sporozoit: Seksüel üreme sonucunda oluşan ookistin (çapı: µm) kedi dışkısı ile dış ortama atılmasını takiben çevre ısısı ve oksijen miktarına bağlı olarak çaplarının arttığı (11 13 µm), 1 21 gün içinde sporlanarak enfeksiyöz hale geldikleri görülmüştür. Sporlanan ookistlerin içinde, 6 8 µm boyutlarında elips şekilli iki adet sporokist bulunduğu, her sporokistin ise dört adet µm boyutlarında takizoite benzer sporozoit içerdiği saptanmış, sporozoitlerin, kesin konakta takizoit formuna dönüştüğü izlenmiştir (56). Dayanıklılığı yüksek ookistlerin nemli toprakta 18 ay boyunca canlılığını koruduğu, akut enfekte kedilerin dışkı ile 7 21 gün içinde 10 milyon kist/gün atabildiği ve bu sebeple kedilerin enfeksiyonun doğada yayılmasının en önemli kaynağı olduğu ileri sürülmüştür (123, 124) Epidemiyoloji İnsanların sıklıkla, bradizoit içeren doku kistlerini içeren başlıca domuz ve koyun etlerini çiğ veya az pişmiş olarak yemekle, sporule ookistlerle kontamine gıda, su ve ellerin oral temasıyla sporozoit içeren ookistleri almakla ya da transplasental yolla T. gondii ile enfekte olduğu ortaya konulmuştur. Su kaynaklı salgınlar epidemiyolojik bakış açısını genişletmiştir (12, 14, 18, 161). Günümüzde parazitin sebep olduğu su ve besin kaynaklı salgınlar T. gondii nin kategori B biyoterörizm ajanı ilan edilmesine sebep olmuştur (12, 15, 18, 50, 117, 128, 146, 151). 8

21 Yapılan çalışmalarda T. gondii sıklığı tüm dünyada % arasında değişmektedir ve toplumlar arası seroprevalans farklılıkları bulaşın toplumun beslenme alışkanlıklarına, toprak ve kedi dışkısı ile temasa, kişisel hijyene bağlı olduğunu göstermektedir. Dünyada 500 milyon insanın, Avrupa da doğurgan yaştaki kadınların % 37 ile % 58, yurdumuzda ise % 30 ile 60 ının T. gondii ile enfekte olduğu bildirilmiştir (4, 59, 76, 84). Hayvansal ürünlerin günümüzde daha temiz ortamlarda üretilip tüketime hazırlanması yanında insanların çiğ et tüketiminin risklerine karşı bilinçlendirilmesinin tüm dünyada seroprevalans değerlerinde düşüşlere sebep olduğu belirtilmiştir (150, 161). Toxoplasmosisin az pişmiş veya çiğ sığır, koyun, domuz, geyik eti yemekle (9, 34, 55, 64, 119, 137), pastörize edilmemiş keçi sütü (138) ve kontamine içme suyu içmekle (12, 15, 18), kontamine toprak (146) ve havayla temas etme ile bulaştığı bildirilmiştir (151). Çok merkezli bir çalışmanın sonuçlarına göre toxoplasmosis saptanan hamile kadınlarda enfeksiyon sebebi % ünde az pişmiş et, % 6-17 sında ise toprakla temasa bağlanmıştır. Hayvan etlerinin (domuz ve koyun) yemek için hazırlanması sırasında kullanılan bıçak, et kesme tahtası ve kıyma makinelerinin kullanıldıktan sonra temizlenmeden kullanılmasının çapraz kontaminasyona yol açabileceği ortaya konmuştur (84). Güney Brezilya da oküler toxoplasmosis sıklığının yüksek olduğu ve enfeksiyon kaynağının çiftliklerde üretilen domuz etleri olduğu belirtilmiş, sonuç olarak çiğ et tüketiminin salgınlara sebep olabileceği ve bu nedenle etlerin iyi pişirilerek yenmesinin hastalığı önlemede önemli olduğu bildirilmiştir (84). Günümüzde ookist içeren su kaynaklı salgınlar (12, 15, 18, 50, 117, 146, 151) ve yakın zamanda Avrupa da yapılan çok merkezli büyük bir araştırmada ookist ile 9

22 kontamine su ve toprakla temasın toxoplasmosis salgınlarına neden olduğu gösterilmiştir. Danimarka da domuzlarda T. gondii nin neredeyse elimine edilmiş (<%1) olmasına rağmen toxoplasmosis prevalansının aynı kalması (%45), insan toxoplasmosisinde başlıca kaynağın ookistler olduğu tezini kuvvetlendirmiştir (150). Su kaynaklı toxoplasmosis salgınlarının en büyüğü 1995 yılında İngiliz Kolumbiya sı, Büyük Victoria da bildirilmiş ve epidemiyolojik araştırmada 7718 kişinin T. gondii ile enfekte olduğu ileri sürülmüş, açık içme suyu deposunun sokak kedileri tarafından kontamine edilmesinin salgına sebep olduğu belirlenmiştir (18, 24, 91). Panama da bir A.B.D. askeri birliğinde 1979 yılında ortaya çıkan salgının kaynağının ormanda kontamine bir su kaynağı olduğu düşünülmüştür (37). Güney Brezilya nın Parana eyaleti Santa Isabel do Ivai şehrinde 2001 yılında yüzlerce insanı enfekte eden salgının sebebinin kontamine içme suyu olduğu açıklanmıştır (84). Her yıl A.B.D. de arası konjenital, 1.26 milyon oküler toxoplasmosis vakası (immün sistemi sağlam kişilerde akut akkiz toxoplasmosise bağlı oküler hastalık görülme sıklığı %2 olarak bildirilmiştir), immun sistemi baskılanmış veya yetmezliği olan hastalarda sayısız ensefalit ve diğer sistemik hastalıklar geliştiği belirtilmektedir (84, 98). Toxoplasmosis tanısı alan hastaların tedavi masraflarının yıllık 7.7 milyar doları bulduğu ve A.B.D. de her yıl ortalama 750 kişinin toxoplasmosis veya yol açtığı klinik tablolar nedeniyle öldüğü bildirilmiştir (97, 99,103). NHANES (Ulusal Sağlık ve İnceleme Araştırması) çalışmasında, yılları arasında toplanan serum örneklerinde 6-49 yaş aralığında Toxoplasma seroprevalansını % 10.8 bulunmuştur. A.B.D. de doğan ve yaş aralığında olan kişilerde seroprevalans yıllarında % 14.1 iken de % 9 a 10

23 düştüğü izlenmiş, seroprevalanstaki bu düşüş et üreticilerinin gayretleri ile etteki doku kistlerin azaltılmasına, doktorların, bulaşıcı hastalık merkezlerinin (CDC: Centers for Disease Control) ve diğer örgütlerin et ve et ürünlerinin iyi pişirilmesi, kedi dışkısının toprakla karışmasının önlenmesi, kedilere çiğ et yedirilmemesi ve kedilerin evde tutulması yönündeki yoğun eğitimlerine bağlanmıştır (98). Yurdumuzda hamile kadınlarda toxoplasmosis prevalansı; Şanlıurfa da % 60.4, İzmir ve çevresinde % 55, Aydın da % 30.1 olarak saptanmıştır (4, 59, 76, 130, 144). Konjenital toxoplasmosis Norveç, Belçika ve Fransa da her 1000 doğumun 2 veya 3 ünde, A.B.D. de her canlı doğumdan 1 ile 10 unda görülmektedir (16, 69, 93, 99, 110, 133). Birinci ve ikinci trimesterde oluşan maternal enfeksiyonun bebekte ciddi klinik tablolara yol açtığı, son trimesterde ise çok belirgin anomalilerin saptanmadığı, son trimesterde enfekte olan fetuslarda sinsi ilerleyen enfeksiyonların, bebekler tedavi edilmediği takdirde, gelişme geriliğine, yaşamın 2 veya 3. dekadında retinokoroidite neden olduğu tespit edilmiştir (57, 83, 124, 163). Toxoplasmosise bağlı gelişen retinokoroidit tüm dünyada posterior üveitin en önemli sebepleri arasında gösterilmektedir. Brezilya da posterior üveitlerin % 85 inden sorumlu tutulmaktadır yılında Amerikan oftalmologlar birliği ve CDC nin yaptığı iki yıllık araştırmada aktif toxoplasmik retinokoroidit saptanan vaka sayısının olduğu, buna ek olarak hastada inaktif oküler toxoplasmosis tanısı konduğu belirtilmiştir. Çalışmanın sonucunda A.B.D. de en az 1.26 milyon insanda toxoplasmik retinokoroidit olabileceği tahmin edilmiştir (84). Türkiye de yapılan bir çalışmada üveitli 59 hastanın 23 ünde (% 39) etkenin T. gondii olduğu bildirilmiştir (144). 11

24 1.4. Patogenez ve Patoloji T. gondii zorunlu hücre içi parazit olup kendine ait golgi, ribozom ve mitokondrisi olmasına rağmen hayatta kalabilmek, çoğalmak için konak hücreye ait habitata ihtiyaç duymaktadır. Bu sebeple her an yeni bir hücreyi işgal etmeye çalışır. Konak hücreyi hiç uyarmadan, 20 saniyeden kısa bir süre içinde salgıladığı proteinleri ve aktif penetrasyon hareketleri ile işgal edebilmektedir (aktif invazyon). Parazitin konoidi ile temasta olan konak hücre yüzeyinde invajinasyon meydana geldiği, invaginasyon ilerledikçe parazitin hücre içine ilerlediği ve PV oluşumu ile tamamen hücre içine alındığı bildirilmiştir. Parazit, konak hücre membranında oluşturduğu invajinasyondan içeri girerek etrafında parazitofor vakuolü (PV) oluşturur. PV ün asidifiye olmadığı ve konak hücre lizozomları ile birleşmediği gösterilmiştir. Aksine opsonize olan parazitler ise makrofajlar tarafından 2-4 dakika içinde fagozom içine alınarak kısa süre içinde endosom/lizozomlardan gelen lizozomal enzimlerce yok edilmektedir. T. gondii nin invazyonu sırasında kayarak hareket ettiği bilinmektedir. Apikompleksalara özgü olduğu bilinen bu hareketin parazite in vitro ortamda 10 µm/saniye hız yaptırdığı bildirilmiştir (Şekil 1.2) (105, 123, 124). 12

25 T. gondii ROP Konak hücreye bağlanma sırasında mikronem (MIC) protein salınımı GRA MIC Aktif penetrasyon ve roptri (ROP) protein salınımı sonucu invajinasyon çukuru oluşumu Parazitofor vakuol (PV) oluşumu Mikronem proteinleri PV içine girmez M Parazit PV içine girer PV etrafında konak hücreye ait mitokondri (M) ve endoplazmik retikulum (ER) bulunur Yoğun granül (GRA) içeriği PV içine salgılanır ER Şekil 1.2. T. gondii takizoitinin konak hücreye invazyonu (105) Parazitin ucunda yer alan organellerden mikronem ve roptri kaynaklı proteinlerin invazyon sırasındaki rolleri gösterilmiştir (Şekil 1.3.). Mikronem proteinlerinin [MIC1-12, AMA1, M2AP, SUB1 (subtilaz 1), ROM1 (Rhomboid protein)] ekzositozu, konak hücre invazyonunun başlamasından önce konak hücre ile parazitin apikal ucu arasında gösterilmiştir. Roptri proteinlerinin [ROP1, ROP2, ROP4, ROP5, ROP7-18, SUB2 (subtilaz 2 = subtilisin benzeri serin proteaz), Toxopain-1 (catepsin proteaz), insülinaz, Toxofilin, Rab11 (GTPaz yapısı içerir), NHE2 (sodyum hidrojen değiştirici), BRP1 (bradizoite özgü roptri proteini 1), RON1-5 (roptri proteinleri ile birlikte çalışan roptri boyun proteinleri)] sekresyonunun invazyonun başında oluştuğu ve PV membranı ile ilişkisi olduğu saptanmıştır. Roptrilerin, asidifiye organeller olduğu, hidrolazlar içerdiği ve SUB2 proteazı barındırdıkları gösterilmiştir. Yoğun granül proteinlerinin (GRA1-9) sekresyonunun invazyonun sonuna doğru, PV oluşumdan sonra görülmesi 13

26 görevlerinin PV yapısının düzenlenmesi ile ilişkili olduğu varsayılmaktadır. T. gondii yüzey antijenlerinin (SAG) plazma membranına glikozilfosfotidilinozitol (gpi) çıpası ile bağlandıkları gösterilmiş fakat invazyon sürecindeki rolleri ayrıntılı şekilde ortaya konamamıştır (16, 113, 123, 124, 162). Endoplasmik reticulum Yoğun Granül (GRA) Roptri (ROP) Mikronem (MIC) Nükleus Mitokondri Golgi cisimciği Şekil 1.3. T. gondii takizoiti (154) T. gondii patogenezinde parazit suşu, konağa giren parazit miktarı, konağın genetik ve immunolojik yapısının etkili olduğu bildirilmiştir (16, 53, 54, 56, 61, 123). T. gondii suşları başlıca üç genotipe ayrılmıştır. Genotip 1 in çok virulan olduğu ve az sayıdaki takizoitin bile farelerde ölüme yol açabildiği, Genotip 2 nin insan, koyun veya domuz kaynaklı olabileceği, farelerde avirülan olduğu, sıklıkla kronik enfeksiyona yol açtığı daha nadir izole edilen genotip 3 ün ise farelerde genotip 2 ye göre daha virülan olduğu bildirilmektedir (16, 40, 142). İnsan toxoplasmosis vakalarından elde edilen genotip dağılımı Tablo 1.1., 1.2., 1.3. ve 1.4. de gösterilmiştir. Buna göre insanlarda en sık saptandığı bildirilen tip 2 suşlar genelde gelişmemiş fetuslar ve immun yetmezliği olan hastalar için virülan kabul edilirken, gelişmiş fetuslarda ve immun sistemi sağlıklı bireylerde de asemptomatik 14

27 enfeksiyondan sorumlu tutulmuşlardır. Tip 1 suşlar ise genelde yüksek virülanslı olgularda (akiz oküler toxoplasmosis, dissemine konjenital toxoplasmosis) saptanmaktadır. Ayrıca immun sistemi baskılanmış hastalarda kronik enfeksiyonun reaktivasyonunda ve konjenital enfeksiyon gelişmeyen plasentalarda saptanması immun sistemi sağlam bireylerde asemptomatik enfeksiyondan da sorumlu olabileceklerini düşündürmektedir (162). Farklı T. gondii suşlarının protein ekspresyonlarının birbirinden değişik olduğu ve bunun da parazitte antijenik varyasyona yol açabileceği enfekte insan ve hayvan serumlarının kullanıldığı Western blot çalışmalarında gösterilmiştir (5, 43, 160). Ülke Tablo 1.1. İnsan konjenital toxoplasmosis olgularında genotip dağılımı (162) İzolasyon sayısı Tip 1 Tip 2 Tip 3 Atipik veya rekombinant Miks enfeksiyon Fransa 86 % 8 % 85 % 8 % 5 - Fransa 37 - % Fransa 13 - % İngiltere 19 % 31 % % 31 İspanya 24 % 25 % İspanya 8 % 75 % 12.5 % Brezilya % A.B.D. 17 % 6 % 70 % 18 % 6 - Kolombiya 6 % % Tablo 1.2. Klinik öneme göre konjenital toxoplasmosisli olguların genotip dağılımı (162) Klinik İzolasyon sayısı Annedeki enfeksiyonun süresi (hafta) Tip 1 Tip 2 Tip 3 Atipik Fetal ölüm Yeni doğan ölümü 3 Bilinmiyor Ciddi hastalık Doğumda asemptomatik Enfekte plasenta, enfekte olmayan çocuk

28 Tablo 1.3. İmmun sistemi baskılı kişilerde toxoplasmosis olgularının genotip dağılımı (162) Ülke İzolasyon sayısı Hastalık Tip 1 Tip 2 Tip 3 Atipik veya rekombinant Miks enfeksiyon Fransa 45 AIDS % 13 % 76 % Fransa 55 AIDS % 12.7 % 76.4 % İngiltere 8 AIDS % 50 % 13 % 13 - % 25 İspanya 31 AIDS % 26 % 58 % İspanya 13 AIDS % 23 % 53.8 % Fransa 10 AIDS dışı % 10 % 80 % Fransa 16 AIDS dışı % 19 % 75 % A.B.D. 8 AIDS % % 12.5 % 25 - Tablo 1.4. İmmun sistemi sağlam oküler toxoplasmosisli olgularda genotip dağılımı (162) Ülke İzolasyon sayısı Tip 1 Tip 2 Tip 3 Rekombinant Brezilya Kore A.B.D A.B.D T. gondii nin immun sistemi sağlam, immun sistemi baskılanmış ve enfeksiyonu konjenital olarak alan bireylerde üç farklı patolojik tabloya sebep olduğu belirtilmiştir. İmmun sistemi sağlıklı bireylerde sıklıkla asemptomatik seyrederken, nadiren lenfadenopati/lenfadenit ve toxoplasmik retinokoroidite sebep olabilir. Enfekte lenf bezlerinin makroskopik olarak büyümüş, sertleşmiş ve iç yüzlerinin solduğu gözlenmiştir. Histopatolojik kesitlerde reaktif folliküler hiperplazi, kortikal ve parakortikal merkezlerde epiteloid histiosit infiltrasyonu, epiteloid histiositlerin oluşturduğu düzensiz kümelerin folikül sınırlarına birikip sınırı belirsizleştirmesi, subkapsüler sinüslerin mononükleer hücrelerce fokal distansiyonu saptanmıştır. Toxoplasmik retinokoroiditin immun sistemi sağlam bireylerde toxoplasmosisin en sık görülen klinik formu olduğu öne sürülmektedir. Lezyon genelde inaktif skar (nedbe) dokunun sınırında gelişen tek taraflı, fokal veya 16

29 multifokal retinokoroidit olarak gözlenir (satellite=uydu lezyon). Lezyonun retinada başladığı bazen inflamasyonun koroide geçtiği, T. gondii nin sadece retinadan izole edilebileceği belirtilmiştir. Histolojik olarak genelde retinada ve bazen de koroidde ciddi inflamasyon ve nekroza paralel sekonder gelişen granülomatöz inflamasyon gelişebilmekte, granülomlarda histiositler, lenfositler ve plazma hücreleri gözlenebilmektedir. İmmun sistemi sağlam bireylerde kronik kardiomyopati, deri lezyonları ve dermatomyozit gelişebildiği de yayınlanmıştır (73, 123, 124). İmmun sistemi baskılanmış bireylerde toxoplasmosisin dissemine olmaya meyilli olduğu merkezi sinir sistemi dışındaki organlarda da ciddi patolojilere yol açtığı bildirilmiştir. Toxoplasmik ensefalit sırasında beyin ödemli, şişmiş, unkal, tonsillar veya transtentorial herniasyon bulgularına rastlanılmakta, kesitlerde bazal gangliada, beyin orta kısımlarda, beyincikte ve medulla spinaliste boyutları milimetre ve 5 cm arasında değişen çok sayıda nekroz ve bazen de hemoraji alanları gözlenmektedir. İmmun sistemi ciddi şekilde baskılanmış kişilerde görülen multipl beyin apselerinde üç ayrı bölge gözlemlendiği, merkezde avasküler alan, onun çevresinde bulunan hiperemik inflamasyon alanı, perivasküler alanda lenfositler, plazma hücreleri ve makrofajlar bulunduğu bildirilmektedir. Nekroz oluşan bölgelerin sınırlarında bol takizoit veya kist gözlenebileceği, en dışta ise T. gondii kistlerinin bulunduğu gösterilmiştir (73, 124, 147). İmmun sistemi baskılanmış kişilerde santral sinir sisteminden sonra en sık kalp tutulumuna rastlandığı, bulguların diğer myokardit vakalarından ayrımının zor olduğu bildirilmiştir. Akciğerin üçüncü sıklıkta tutulan organ olarak öne çıktığı, interstisyal pnömoni, nekrotizan pnömoni, konsolidasyon ve plevral efüzyon gibi klinik tablolar gelişebileceği yayınlanmıştır (73, 123). 17

30 Toxoplasmosis in immun sistemi baskılanmış hastalarda pankreas tutuluşu, deride döküntü ve purpurik nodüller, mide antrumunda daralma, ince bağırsak mukozasında nekroz ve kolit, myozit yapabildiği ayrıca karaciğer, testis, prostat, adrenal bezler, böbrekler, kemik iliği, mesane, periton ve pituiter bezi de etkileyebileceği bildirilmektedir (73, 123, 124). Konjenital toxoplasmosisin yenidoğanda genelde retinokoroidit, intrakranial kalsifikasyon, hidrosefali ve konvülziyonlara yol açtığı, hidrosefaliye bağlı olarak beynin büyüdüğü, kalsifikasyonların korteks ve ventrikül çevresine yerleştiği gösterilmiştir. Tüm gri ve beyaz cevherde yaygın olarak görülen nekroz alanlarının boyutlarının farklı olabildiği, Aquaductus Sylvius un veya Monro deliğinin tıkanmasının hidrosefali gelişimine neden olduğu gösterilmiştir. Hücresel infiltrasyon nodülleri santral sinir siteminde toxoplasmosisin ilk bulgusu olarak ortaya çıkmaktadır. Bu nodüllerin mikroglial hücre kümeleri içerdiği, merkezde ödem, nekroz ve çevre nöronlarda dejenerasyon görüldüğü ufak ve orta büyüklükte damarlarda vaskülit gelişimine sık rastlandığı bildirilmiştir. Mikroskopik olarak kronik meningoensefalit tablosunda nekroz alanları, mononükleer hücre infiltrasyonu ve kalsifikasyonların bulunduğu, nekrotik alanların sonradan kalsifiye olmasıyla radyolojik olarak patognomonik bulguların oluştuğu izlenmiştir (73). Takizoit ve kistlerin genelde glial nodüller, perivasküler bölgeler ve inflamasyon gelişmemiş beyin dokusundaki nekrotik odaklar içinde veya yakınında bulunduğu gözlemlenmiştir. Konjenital toxoplasmosisli fetuslarda bebeklik ve çocukluk çağında göz lezyonları ortaya çıkabilmekte, bazen lezyonlar körlüğe bile yol açabilmektedir. Oküler toxoplasmosisli olgularda gözün genelde mikroftalmik olduğu, retina ve koroid makuladan başlayan hasarın tüm göze yayıldığı izlenmiş, 18

31 konjenital toxoplasmosis sebebiyle ölen tüm bebeklerde myokardit geliştiği bildirilmiştir (73, 123, 124) İmmunoloji T. gondii nin yol açtığı enfeksiyonun kuvvetli ve kalıcı hücresel immun yanıt ile kontrol edildiği ve bu immun yanıtın, birçok parazit hastalığında gelişen immünitenin aksine konağa zarar vermemesinin ilginç olduğu belirtilmiştir. Yapılan çalışmalar, hastalığın kontrol altına alınmasında başlıca rolün hücresel immunite ile sağlandığı ve T. gondii, hücre dışı ortamda fazla kalmadığı için humoral (salgısal) immun yanıtın rolünün kısıtlı olduğunu göstermektedir. Ağız yolu ile alınan kistlerde IgA antikorlarının mukozal immunitede önemli rolü olduğu belirtilmiştir (45, 46, 78, 102). Aktifleşmiş T lenfositlerin akut ve kronik enfeksiyonun kontrolündeki önemi üzerinde durulmaktadır (Şekil 1.4.). Özellikle CD8+ T hücreler effektör lenfosit olarak, CD4+ T lenfositler ise immun yanıtın regülasyonunda görev aldığı gözlemlenmiş, hastalığın erken döneminde makrofajların ve doğal öldürücü hücrelerin ilk savunma hattını oluşturdukları bildirilmiştir. Makrofalar, nötrofiller ve özellikle dendritik hücreler tarafından salgılanan interlökin 12 nin (IL-12) Th1 T hücrelerin değişimi ve klonal büyümesini sağlayarak T. gondii ye karşı oluşan immun yanıtta etkili oldukları gösterilmiştir (109, 162). IL-12 nin, doğal katil (natural killer) hücreler ve aktifleşmiş T hücrelerden interferon gama (IFN-γ) salınımına sebep olduğu, IFN-γ nın tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α) ile sinerji göstererek özellikle erken dönemde parazite karşı oluşan makrofajların takizoitleri öldürmesinde rol aldığı izlenmiştir. Bu iki sitokinin 19

32 birleşmesi ile ortama bol miktarda serbest radikal ve nitrik oksit (NO) salındığı, triptofan açlığının uyarılmasıyla parazitin ölümüne yol açtıkları gösterilmiştir. Son çalışmalarda p47 GTPaz ların IFN-γ bağımlı immun yanıtı ayarladığı, PV içinde biriktikleri, PV membran yapısını bozarak anti-parazitik etki oluşturdukları belirtilmiştir (16, 109). NK Sitotoksik etki Toxoplasma gondii Dendritik hücre IL-12 CD4+ Th1 NO, O 2 -, H 2O 2, tripsin açlığı, p47 GTPaz lar CD4+ Th0 IL-12 IFN-γ IL-2 IFN-γ TNF-α IL-2 Makrofaj CD8+ Sitotoksik etki Şekil 1.4. T. gondii enfeksiyonu sırasında oluşan hücresel immun yanıt (109) CD4+ T hücreler ile sinerjitik etki gösteren CD8+ T hücrelerin T. gondii ye karşı korunmada etkili olduğu, CD8+ T hücrelerinin, direk sitotoksik etkileri yanında, IFN-γ salınımı yaparak enfekte hücrelere etki ettikleri bildirilmiştir. CD4+ T (Th1) hücrelerin IFN-γ ve IL-2 salgıladıkları, IL-2 nin T. gondii ile enfekte hücrelere sitotoksik etkili doğal öldürücü hücreler veya sitotoksik T hücreleri uyardığı saptanmıştır. T helper (Th2) hücrelerin IL-4, IL-5 ve IL-10 salgılayarak T. gondii ye karşı koruyucu hücresel immun yanıtın azalması yönünde ayarlama yaptığı (down regulation), bu sitokinleri salgılayan T hücre gruplarının birbirlerinin sitokin 20

33 salınımını da dengeledikleri (IL-10 un IFN-γ nın üretimini inhibe etmesi, IFN-γ nın Th2 gelişimini engellemesi) saptanmıştır. T hücre gruplarından salgılanan IL-7, IL- 15 ve IL-18 in de IFN-γ salınımını arttırdığı (up regulation) belirtilmiştir (16). T. gondii ye karşı gelişen humoral immun yanıt sırasında parazitin yüzeyine ve salgıladığı antijenlere karşı oluşan immunglobulin G (IgG), IgM, IgA ve IgE antikorlarının kompleman ile birleşerek takizoit yıkımına yol açtıkları gösterilmiştir. Ayrıca IgA antikorlarının parazite karşı konağın ilk etkileşimini bağırsak epitelinde bulunan mukus membranında gerçekleştirdiği bildirilmiş, IgA antikorlarının bir yıl veya daha fazla süre ile pozitif kalabildiği gözlenmiştir (16, 36, 38, 124) Klinik Toxoplasmosis immun sistemi sağlam bireylerde genelde belli belirsiz bulgularla, immun sistem yetmezliği olanlarda ise şiddetli semptomlarla seyretmektedir. Bu sebeple toxoplasmosisin oluşturduğu klinik tablolar immun sistemi sağlam ve immun sistemi baskılı hastalarda ayrı ayrı incelenmektedir (123, 162) İmmun sistemi sağlam hastalar Edinilmiş akut T. gondii enfeksiyonu olan hamileler ve erişkinler İmmun sistemi sağlam erişkinlerde (hamileler dahil) T. gondii enfeksiyonunun genelde asemptomatik seyrettiği bilinmektedir. Sadece % vakada tedaviye gerek olmadan bulgularının kendiliğinden iyileştiği bildirilmiştir. Semptomlar; kendiliğinden iyileşen belli belirsiz bulgulardan, uzamış ateş, gece terlemesi, halsizlik 21

34 ve retinokoroidite kadar değişken olabileceği, en sık gözlenen klinik bulgunun, servikal veya oksipital lenfadenopati olduğu, ama diğer lenf bezlerinin de tutulabileceği, tutulan lenf bezlerinin hassas olmadığı, sertliklerinin değişken olduğu, süpüre olmadıkları, nadiren 3 cm çaptan büyük oldukları ve genellikle 4-6 hafta içinde küçüldükleri saptanmıştır (123, 124, 162). Subfebril ateş, gece terlemesi, halsizlik, boğazda yanma gibi gribal enfeksiyonu taklit eden bulguların yanında, nadiren polimyositise ait kas ağrıları, hepatit, myokardit, pnömoni ve ensefalit bulgularının da görülebileceği, son araştırmalarda toxoplasmosis ile şizofreni arasında bir ilişki olabileceği iddia edilmektedir (11, 20, 123, 124, 152, 162). Akut göz lezyonlarının genelde akut akiz T. gondii enfeksiyonlarına bağlı geliştiği, reaktivasyonların (relaps) ise hastalığın latent (gizli) döneminde görüldüğü izlenmiş, retinokoroidit sırasında görmenin bozulduğu, skotom, ağrı, fotofobi ve epifora gelişebildiği, makula tutuluşunda santral görmenin azaldığı veya kaybolduğu yayınlanmıştır (123, 124, 162). Hamile kadınlarda akut T. gondii enfeksiyonu diğer immun sistemi sağlam hastalardan farklı olmadığı, enfeksiyonun genel olarak asemptomatik veya nadiren servikal lenfadenopati ile seyrettiği bu nedenle toxoplasmosisin tanısının konulamadığı ve parazitin fetusta patolojiye sebep olduğu izlenmiştir (123, 124, 162) Konjenital olarak enfekte çocuklar Seronegatif kadınların hamilelik sırasında T. gondii enfeksiyonu geçirmeleri konjenital enfeksiyona yol açmaktadır. Bunun yanında hamilelik öncesinde seropozitif olan gebelerin, immun sistemlerinde bir bozukluk olmadıkça enfeksiyonu fetusa bulaştırmadıkları, ancak konsepsiyondan önceki 1-2 ay içinde toxoplasmosis 22

35 geçiren annelerinbebeklerinde konjenital toxoplasmosis geliştiği ve bu sebeple konsepsiyon öncesindeki 6 8 haftalık döneminde risk oluşturduğu izlenmiştir. İmmun sistem yetmezliği bulunan kadınların (HIV enfekte veya kortikosteroid tedavisi alanlar) hamilelik sırasında latent enfeksiyonu bulaştırarak konjenital enfeksiyona yol açabilecekleri belirtilmiştir (67, 79, 123, 124, 158, 162). Konjenital toxoplasmosis klinik bulgularının annenin enfekte olduğu trimestere bağlı olarak değiştiği, konsepsiyondan hemen önce veya konsepsiyon takip eden dönemde enfekte olan olguların çoğunda fetusa bulaşın gerçekleşmediği, bulaş riskinin birinci trimesterde % 10 25, ikinci trimesterde % 30 54, üçüncü trimesterde % civarında olduğu, erken tanı ile başlayan tedavinin bu oranları azaltabileceği belirtilmiştir (123, 124, 162). Erken tedavi edilmeyen olguların yaklaşık % 85 inde gelişme geriliği veya ileri yaşlarda retinokoroidit geliştiği, en ağır fetal hasarların gebeliğin 26. haftasından önce geçirilen enfeksiyonlarda oluştuğu, haftalar arası gerçekleşen bulaşlarda fetustaki hasarın daha hafif olduğu belirtilmiştir (124, 162). Gestasyonun erken dönemlerinde gerçekleşen bulaşlarda bebeğin santral sinir sistemi tutuluşunun ön planda olduğu, hidrosefali, intrakranial kalsifikasyonlar, retinokoroidit (klasik triad), şaşılık, körlük, duyma bozukluğu, pnömoni, diyare, hipotermi, epilepsi, psikomotor veya mental gerilik, ensefalit, mikrosefali, anemi, sarılık, döküntü ve trombositopeniye bağlı peteşiler ile kendini belli edebilmektedir. Son trimestirde enfekte olan yeni doğanların doğum sırasında asemptomatik bile olsalar, ilerleyen yıllarda retinokoroidit gibi sekellerle karşılaştıkları, sonuç olarak gebelik trimestiri ilerledikçe bulaş riskinin arttığı, gelişen patolojilerin şiddetinin ise azaldığı saptanmıştır (123, 124). 23

36 İmmun sistem yetmezliği bulunan HIV pozitif annelerin bebeklerinde AIDS kliniğine bağlı olarak konjenital toxoplasmosisin yarattığı klinik tabloların daha şiddetli görüldüğü, gelişme geriliği, ateş, hepatosplenomegali, retinokoroidit, epilepsi atakları ve multiorgan tutuluşlarının (santral sinir sistemi, kalp ve akciğer) olabileceği bildirilmektedir (123, 124, 162) İmmun sistem yetmezliği bulunan hastalar HIV ile enfekte hastalar HIV epidemisi sonrası AIDS hastalarında Toxoplasma ensefaliti sıklığının arttığı, HAART ın (Highly Active Anti-Retroviral Theraphy; Yüksek Aktif Anti- Retroviral Tedavi) bulunmasına kadar AIDS hastalarında Toxoplasma ensefalitinin önemli ölüm sebepleri içinde sayıldığı belirtilmektedir. AIDS hastalarında, toxoplasmosisin genellikle santral sinir sistemindeki kistlerin yırtılmasını takiben latent enfeksiyonun reaktivasyonu şeklinde geliştiği bunun sonucunda da AIDS hastalarında sıklık sırasına göre beyin (Toxoplasma ensefaliti), akciğer (pnömoni) ve göz (retinokoroidit) oluştuğu yayınlanmıştır. Toxoplasma ensefalitinde raslanan bulgular hemiparezi (% 39-52), mental durum değişiklikleri (% 30-42), konvülziyon (% 15-29), kafa çifti bozuklukları (% 7-28), konuşma bozuklukları (% 6-26), serebellar semptomlar (% 9-30), meninks irritasyonu (% 10-16) ve paranoid psikoz, demans, anksiyete ve ajitasyon gibi davranışsal/psikomotor bulgular (% 30-42) şeklinde rapor edilmiştir. Bunların dışında nadiren parkinsonizm, fokal distoni, tremor, hemikorehemiballismus, panhipopituitarizm veya diabetes insipitus izlenebilmekte, medulla spinalis tutuluşları tek veya daha fazla eklemi tutan motor ve duyusal bozukluklara, 24

37 mesane ve kolon disfonksiyonu gelişebilmektedir. Servikal-torasik myelopati ve konus medullaris sendromu da olası klinik tablolar arasında yayınlanmıştır. Gastrointestinal tutuluş sonrası karın ağrısı, asit (mide, periton veya pankreas tutulumuna bağlı) veya diyare oluşabildiği, akut karaciğer yetmezliğinin görülebildiği bilinmektedir. AIDS hastalarında gelişen pulmoner toxoplasmosisin genelde ateş, öksürük ve solunum zorluğuna yol açtığı belirtilmiştir (73, 108, 123, 124) Organ transplantasyonu olan hastalar Tüm dünyada organ transplantasyonları arttıkça toxoplasmosise bağlı reaktivasyon sıklığının da arttığını gösteren veriler yayınlanmaktadır. Organ transplantasyonu veya kanser kemoterapisi alan hastalarda, AIDS hastalarına benzer şekilde reaktivasyona bağlı santral sinir sistemi, akciğer ve kalp tutuluşu gözlenebilmektedir. Bunun yanında göz, karaciğer, pankreas, adrenal bezler ile böbreklerin de etkilenebildiği, ilk semptomun genelde ateş olduğu ve semptomların transplantasyonu takiben 3 ay içinde ortaya çıktığı bildirilmektedir (123, 124, 162) Tanı İnsanlarda toxoplasmosis kliniği tipik olmadığından tanı biyolojik, serolojik, histolojik veya moleküler yöntemler ile konulmaktadır. Tanı yöntemleri direkt ve indirekt tanı teknikleri olarak ikiye ayrılır. İndirekt tanı teknikleri serolojik testler yardımı ile toxoplasmosise karşı oluşan antikorların varlığını araştırırken, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR), hibridizasyon, izolasyon ve histoloji gibi direkt tanı teknikleriyle parazitin kendisi veya DNA sının gösterilmesi amaçlanmaktadır. 25

38 İndirek tanı Günümüzde toxoplasmosisin tanısında en sık T. gondii ye özgü antikorları saptayan serolojik yöntemler yararlanılmaktadır. T. gondii ye özgü IgM, IgG, IgA ve IgE antikorlarının saptanması amacıyla kullanılan serolojik testlerde, bütün veya eriyik T. gondii antijenleinden kullanmaktadır. Parazitin bütün olarak kullanıldığı testler arasında Sabin Feldman Dye testi, IFAT, aglütinasyon testi, eriyik antijen kullanan testler arasında ise Avidite testi, İmmunosorbent aglütinasyon testi, Western blot, Enzyme Immun Assay (EIA) veya ELISA yöntemleri bulunmaktadır (75, 81, 123, 125, 162). T. gondii ye özgü IgM antikorların enfeksiyonun ilk bir haftasında artış gösterdiği, daha sonra bir iki yıl içinde azalarak kaybolduğu, genel olarak enfeksiyonun ilk sekiz haftasında IgG yanıtının arttığı ve daha sonra en yüksek seviyedeki platoda bir süre kaldığı, bunu takip eden dönemde azalmaya başladığı ve ömür boyu belli bir düzeyde yüksek kaldığı gösterilmiş, IgA nın bir yıl veya daha fazla süre ile pozitif kalabildiği gözlenmiştir (86, 101, 123, 135, 162). Toxoplasmosis tanısı hamilelik sırasında enfekte olan kadınlar, konjenital enfekte olan fetus ve yeni doğanlar, immun sistemi sağlam olmayan veya baskılanan ve retinokoroiditli hasta gruplarında çok önemlidir. Bu hasta grupları içerisinde klinisyenleri en çok zorlayan tablo hamileliği sırasında ilk defa serolojik test yaptıran ve IgM pozitifliği belirlenen kadınlarda enfeksiyonun başlangıç tarihinin saptanmasıdır. T. gondii ye özgü antikorların immun sistemi sağlam bireylerde uzun süre yüksek konsantrasyonlarda seyretmesi, var olan yöntemlerin yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuç verme olasılıkları, immun baskılayıcı tedavi alan hastalarda genel antikor miktarının düşmesine bağlı olarak serolojik testlerin etkinliğinin 26

39 azalması, indirek tanı testlerinin başlıca sorunları arasında tanımlanmaktadır (123, 124, 131, 135, 162). Hamile kadınlar ve immun sistemi sağlam olmayan hastalarda IgG antikorlarının varlığının saptanması çok önemlidir. Hamilelik öncesi kadınlarda IgG antikoru bulunmamasının kadının hamilelikte risk altında olduğunu, immun sistemi baskılanmış veya yetmezliği olan hastalarda IgG varlığının ise latent enfeksiyonun reaktivasyonu riski taşıdığının göstergesi olarak kabul edilmektedir (123, 124, 162). Hamile kadınlarda yapılan serolojik araştırmalarda ilk tarama sırasında IgM pozitifliği sadece % 5 olguda saptanmış ve bunların ortalama % 4 ünün konjenital toxoplasmosisli bebek doğurduğu bildirilmiştir. Bu sebeple IgM pozitif annenin, enfeksiyonu konsepsiyon öncesi mi, yoksa sonrası mı aldığının belirlenmesi çok önemlidir. Sorunun çözümlenmesinde anneden ardışık alınan iki serum örneğinin paralel çalışılmasıyla antikor yanıtının değişiminin incelenmesinin faydalı olduğu saptanmıştır. Özgün anti-toxoplasma IgM pozitifliği bulunan hastalarda yapılan araştırmalar akut enfeksiyon tanısında en güvenilir yaklaşımın kombine iki test stratejisi olduğu belirtilmiş ve duyarlılığı yüksek bir IgM tanı testi sonrası IgG avidite testinin yapılmasının uygun olacağı sonucuna varılmıştır. IgG Avidite testi immunojenik olarak aktif bölgenin (tek epitop ile tek antikor arasındaki) bağlantı gücünü ortaya çıkarmaya yarayan, spesifik IgG antikorlarının fonksiyonel afinitesinin ölçümü esasına dayanan bir testtir. Yüksek aviditeli IgG antikoru bulunan hastalarda akut enfeksiyonun 3-4 ay önce gerçekleştiği, düşük veya orta derecede aviditesi bulunan IgG antikorların ise (IgG antikorların olgunlaşmasının kişiden kişiye değiştiği için) akut enfeksiyon lehine yorumlanmasına rağmen kesin tanı için yeterli olmadığı belirtilmiştir (26, 75, 123, 162). 27

40 Düşük avidite sonuçlarının bir yıla kadar pozitif kalabildiği bilinmektedir. Yapılan bir çalışmada ise IgM negatif ve IgG pozitif bulunan kadınların % 40 ında düşük veya sınırda aviditesi bulunan IgG antikor bulunmuştur. Bu sebeple düşük veya sınırda aviditesi bulunan IgG antikorların saptanmasında diğer serolojik testlerden de faydalanılmasının önemli olduğu belirtilmiştir (123, 135, 162). Kalifornia, Palo Alto da bulunan Toxoplasma Referans Merkezi, serolojik tanıda altı, Galler de bulunan Singleton Toxoplasma Referans Merkezi beş farklı serolojik test içeren bir panel ile sonuç vermektedir (123). Konjenital enfeksiyonun saptanmasında ISAGA IgM duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek olduğundan referans test kabul edilse de en sık Enzim İmmun Assay (EIA) IgM uygulanmaktadır. Avrupa da gerçekleştirilen bir kohort çalışmada çocuklarda IgM EIA testinin duyarlılığının % 29.3 seviyesinde bulunması daha iyi testlere olan ihtiyacı ortaya koymuştur. Bu sebeple T. gondii ye özgü IgM ve IgG antikorların, rekombinant antijenlerin (GRA1, GRA2, GRA4, GRA6, GRA7, MIC2, MIC3, M2AP, P24, P25, P29, P35, P68, ROP1, ROP2, SAG1) Rekombinant ELISA lar ile saptandığı testlerin geliştirilmesi için çalışmalar sürdürülmektedir (10, 13, 62, 95, 111, 114, 115, 132, 134, 148, 150). Çalışma sonuçları, rutinde yer alan eriyik takizoit antijeni kullanan ELISA lara bir üstünlüğü olduğunu desteklememiştir. En iyi sonuçlar birkaç rekombinant proteinin kombine edildiği Rekombinant ELISA larda sağlanmıştır. Toxoplasma referans merkezleri, aynı rekombinant proteinden bile değişik sonuçlar almışlar ve rutin kullanıma sokmamışlardır (62). Fetus ta ve yeni doğanlarda IgA saptanmasının, IgM saptanmasından daha duyarlı olduğu, IgM ve IgA antikorlarının aynı anda incelenmesinin enfekte bebeklerin ortalama % 75 ini tespit edebileceği gösterilmiştir. Bunun yanında yeni doğanda doğum sırasında anneden bebeğe IgM ve IgA antikorları geçebileceğinden 28

41 IgM ve IgA test sonuçlarının iyi yorumlanması gerektiği, kısa ömürlü olan IgM ve IgA antikorlarını takip ederken, IgM testlerinin 2-4 gün, IgA nın ise 10 gün içinde tekrarlanmasının faydalı olacağı öne sürülmüştür. Bunun yanında konjenital toxoplasmosis şüphesi olan bebeklerde IgM ve IgA antikorları negatif, IgG antikorları pozitif ise (Anneden geçen IgG antikorların 6-12 ay içinde azalıp biteceği bildirilmiştir) bebeğin 6 ay veya daha uzun süre ile IgG takibinin yapılmasının, ayrıca Western blot ile IgG/IgM antikor paternlerinin karşılaştırılmasının faydalı olacağı vurgulanmıştır. Yapılan Western blot çalışmalarında enfekte yeni doğanlarda bulunan bazı bantların annelerde saptanmadığı bildirilmiştir (Şekil 1.5.) (123, 124, 135, 162). Şekil 1.5. Yeni doğan (18) ve annesinden (17) alınan serum örneğine uygulanan IgG Western blot. Serum örnekleri anne ve bebekten doğumdan iki gün sonra alınmıştır. Anne ve Bebek IgG açısından Sabin Felmand Dye testte pozitif, Anne IgM ELISA pozitif, bebek IgM ISAGA pozitif, IgA ELISA her ikisi içinde pozitif, IgE ELISA anne için negatif, bebek için pozitif, plasentadan yapılan T. gondii Polimeraz Zincir Reaksiyonu negatif iken plasentadan T. gondii izole edilmiştir. Kırmızı işaretli ok, bebekte var olup anneden var olmayan bantı göstermektedir (135). Erişkinlerde IgA antikorları en fazla bir yıl süreyle pozitif kaldığından yakın geçmişte gerçekleşen enfeksiyonun gösterilmesinde değerinin az olduğu, IgE antikor 29

42 saptayan testlerin sonuçlarının ise hemen her zaman diğer serolojik testlerle kombine edilerek yapılmasının uygun olacağı belirtilmiştir (123, 135, 162). Konjenital toxoplasmosise bağlı retinokoroidit olgularında lokal antikor üretimi sonucu, alınan vitröz sıvıda T. gondii ye özgü antikorlarının saptanması ile tanı konulabilmektedir (75, 123, 162). İmmun sistemi sağlam olmayan hastalarda latent enfeksiyonun reaktivasyonunun önemli bir risk olduğu belirtilmektedir. Bu hastalarda transplantasyon öncesi taramalarda IgG pozitifliği, reaktivasyon riski olduğunu göstermektedir. Seropozitif hastalarda transplantasyon sonrasında yoğun immun baskılayıcı tedavi sebebiyle antikor seviyesinin düşmesine bağlı serolojik tekniklerin önemi azalmakta ve direk tanı teknikleri ön plana çıkmaktadır. İmmün yetmezlikli hastalarda gözlenen santral sinir sistemi, kalp, akciğer ve karaciğer bulgularında ayırıcı tanıda toxoplasmosis düşünülmesi ve direk tanı teknikleri ile kesin tanının konulması, aynı yaklaşımın AIDS hastalarında da uygulanılması tavsiye edilmektedir (135, 162). Toxoplasmosis indirekt tanısında radyolojik yöntemler (direkt grafi, US, BT, MRG) ve BOS incelenmesinden faydalanılmaktadır. Toxoplasma ensefalitli olgularda BOS bulguları non-spesifik olup, konjenital toxoplasmosisli vakalarda intratekal IgG varlığının ensefalit tanısını desteklediği belirtilmektedir (118, 124). Radyolojik yöntemler içinde ultrason konjenital toxoplasmosisin prenatal tanısında değerli bir yardımcı tanı yöntemi olarak kabul edilir. Toxoplasma ensefalitli hastalarda Gadolinium ile yapılan Manyetik Rezonans Görüntülemenin, Bilgisayarlı Tomografiden daha üstün olduğu bildirilmiştir (73, 108, 118, 123, 124). 30

43 Direk tanı Direk tanı tekniklerinin, serolojik testlerin etkinliğinin azaldığı klinik tablolarda (immun sistemi sağlam olmayan hastalar, konjenital enfeksiyon ve oküler toxoplasmosis hastaları) değerli olduğu belirtilmiştir. Direkt tanı tekniklerinde hastalara ait plasenta, beyin omurilik sıvısı (BOS), bronkoalveoler lavaj sıvısı (BAL), lenf bezi, endomyokard, beyin, kemik iliği aspirasyonu, kan, idrar, vitröz sıvı, plevral sıvı ve asit gibi örneklerde; izolasyon, histolojik yöntemler, lenfosit transformasyonu, lenfosit tiplemesi ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu yöntemleri ile T. gondii nin kendisi veya DNA sı gösterilmeye çalışılmaktadır. Günümüzde en sık kullanılan direk tanı tekniği Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR; Polymerase Chain Reaction, PCR) ile T. gondii DNA sının gösterilmesidir. Nested ve Real Time PZR teknikleri ile konjenital, oküler toxoplasmosis olguları ve immun sistemi sağlam olmayan hasta grubunda oldukça başarılı sonuçlar alınmaktadır. T. gondii PZR en sık amnion sıvısından konjenital enfeksiyonun prenatal tanınmasında kullanılmaktadır. T. gondii PZR ın amnion sıvısındaki duyarlılığının kullanılan gen bölgesine ve gestasyonel yaşa bağlı olarak değiştiği fakat diğer tanı yöntemlerine göre belirgin şekilde üstün olduğu belirtilmektedir. Genelde PZR sırasında T. gondii genomunda 35 kere tekrarlayan B1 geni (Genbankası no: AF179871) araştırılmakta iken, Avrupa da bazı laboratuvarlar arası tekrarlayan AF genini kullanmaya başlamışlardır. Bunun yanında P30 (SAG1) (Genbankası no: M23658), 18 S rdna (Genbankası no: X75429) ve RE (Genbankası no: AF146527) genleri de çalışılmaktadır (21, 65, 96, 135, 162). Gestasyonun 18. haftasından önce alınan amnion sıvısına uygulanan PZR nin güvenilirliği bilinmemektedir. Konjenital toxoplasmosis tanısında amnion sıvısına 31

44 uygulanan PZR nin özgüllüğünün % 100 e yakın olduğu, duyarlılığının ise gestasyonel yaşa bağımlı olarak değişken olduğu belirtilmiş, annede prenatal enfeksiyonun PZR ile tanısında haftalar arasında gerçekleşen enfeksiyonda PZR duyarlılığının, 17. hafta öncesi ve 21. hafta sonrasında gerçekleşen enfeksiyona göre belirgin şekilde daha yüksek olduğu ileri sürülmektedir (P < 0.02) (65, 135, 162). T. gondii takizoitlerinin histolojik kesitlerde veya vücut sıvısı yaymalarında anti-toxoplasma antikorları ile immunperoksidaz, Fluorescein antikor, Wright-Giemsa boyama yöntemleri ve elektron mikroskopi incelemesinin tanıda faydalı olduğu, özellikle immunperoksidaz boyama tekniğinin AIDS hastalarında SSS lezyonlarının tanınmasında çok faydalı olduğu belirlenmiştir (73, 91, 108, 123, 124, 162). Lenfosit proliferasyonu ölçümü ve alt tiplerinin belirlenmesi yönteminin 2 aylıktan daha büyük infantlarda konjenital enfeksiyon tanısını koymakta başarılı bir yöntem olduğu yayınlanmıştır (108). İzolasyon çalışmalarında hastadan alınan örnek in vivo olarak genelde farelere, in vitro olarak hücre kültürü ortamına inoküle edilmektedir (47, 48, 73, 90, 108, 123, 124, 162). İnokülasyon sonrası 30 gün içinde pozitif sonuç verebilen fareye inokülasyon tekniğinin, 6 günde sonuç verebilen hücre kültürüne göre daha duyarlı olduğu belirtilmiş, bu sebeple erken tanı gereken durumlarda hücre kültürüne ekimin daha değerli olduğu vurgulanmaktadır (48) Hücre kültürü ve Toxoplasma gondii Hücre kültürü ortamında T. gondii izolasyonu çalışmaları kandan veya enfekte dokulardan gerçekleştirilmiştir (3, 6, 25, 27, 30, 35, 47, 48, 58, 82, 92, 122, 141). T. 32

45 gondii izolasyonu sırasında insan embriyonik fibroblast hücre (Embryonic fibroblast cell, MRC5) ve insan akut monositik lösemi hücre kültürlerinde (Human acute monocytic leukemia cell, THP1) başarı ile kullanılmıştır (58). T. gondii kronik toxoplasmosisli üç allogeneic hematopoetik kök hücre transplantasyonu hastasının periferik kan buffy coat örneklerinin fibroblast hücre kültürüne ekimi sonrası günde izole edilmiştir (141). AIDS li bir hastanın otopsisinde periferik venöz kan pıhtı örneğinin L hücrelere ekilmesi sonrası 5 gün içinde T. gondii takizoitlerinin ürediği gösterilmiştir (82). T. gondii ye ait üç farklı suş (RH, C ve H) MRC5 hücrelerde başarı ile üretilmiş, RH suşunun hücre kültüründe diğer suşlara göre daha hızlı ürediği belirtilmiştir (48). AIDS hastalarında yapılan bir çalışmada 43 hastaya ait beyin, çizgili kas, karaciğer, kemik iliği aspirasyonu, perikardial veya plevral efüzyon, vitröz sıvı, BAL sıvısı ve kan örneklerinden 62 adet izolasyonun ortalama 4 gün içerisinde gerçekleştirildiği belirtilmiştir (47). Radyolojik bulgu vermeyen diffüz meningoensefalitli bir AIDS hastasından alınan BOS un THP1 hücrelere inokülasyonu sonrası 8 gün içinde T. gondii takizoitlerin saptandığı bildirilmiştir (27). Klinik olarak T. gondii enfeksiyon şüphesi bulunan 14 AIDS li olgunun kan, BAL, uyarılmış balgam ve BOS örneklerinin hücre kültürüne inoküle edilmiş, elde edilen sonuçlara göre kan, BOS ve BAL örnekleri yanında uyarılmış balgamdan da T. gondii nin hücre kültürü ortamında izole edilebildiği gösterilmiştir (35). T. gondii nin hücre kültüründe izolasyonu amacı ile gönderilen örneklerin +4 C ve -20 C de laboratuvara ulaştırılmasının duyarlılığı azalttığı, bu sebeple hücre kültürüne ekim amacı ile gönderilecek örneklerin hızlı ve taze şekilde laboratuvara ulaştırılmasının önemli olduğu belirtilmiştir (92). 33

46 Klinik olarak nekrotizan retinokoroiditi bulunan 11 hastanın etiyolojisi göz içi sıvı ve dokuların hücre kültürüne ekilmesi ile araştırılmış, T. gondii hücre kültürüne ekimi % 91 oranında klinik sonuç ile uyumlu bulunmuştur (122). Günümüzde değişik hücre kültürlerinde izole edilen ve üretilen çeşitli T. gondii suşları tanı testlerinin geliştirilmesinden yeni ilaçların bulunmasına kadar geniş bir bilimsel çalışma yelpazesinde kullanılmaktadır. Bu çalışmalar sırasında T. gondii suşları çeşitli hücre kültürü ortamında sürekli üretilmiş ve suşların kaybolmasının önüne geçilmesi için kriyopreservasyonları gerçekleştirilmiştir. Birçok tanı, ilaç veya patogenez çalışması öncelikle hücre kültürü ortamında gerçekleştirilmekte ve daha sonra hayvan deneylerine geçilmektedir. İnsan sünnet derisi fibroblast hücreleri (Human foreskin fibroblast, HFF), insan serviks epiteloid karsinomu (Human cervix epitheloid carcinoma, HeLa; Henrietta Lacks) ve Madin-Darby Sığır böbrek (MDBK: Madin-Darby bovine kidney), fare makrofaj hücreleri gibi birçok hücre serisi T. gondii ye karşı geliştirilen ilaç çalışmalarında konak hücre olarak kullanılmıştır (32, 33, 39, 94, 100, 112, 126, 127, 145). T. gondii patogenezi ile ilgili çalışmalarda HeLa, Afrika Yeşil maymun böbrek epitel hücresi (Vero: kidney epithelial cells extracted from African Green monkey, Cercopithecus aethiops. Hücre serisi Japon bilim adamları tarafından üretilmiş ve Vero adı esperantoca da doğru ve yeşil böbrek anlamına gelen Verda Reno kelimelerinden türetilmiştir), HFF ve fare embriyonik fibroblast (MEF: Mouse embriyonic fibroblast), Embriyonik fibroblast hücreler (MRC5: Embryonic fibroblast cell), primer fare iskelet kası hücreleri (SkMC: primary mouse culture of skeletal muscle cells), fare periton hücreleri, sıçan nöron-astrosit-mikroglia hücreleri gibi birçok hücre kullanılmaktadır (28, 42, 44, 63, 66, 70, 104, 140, 153). 34

47 Oküler toxoplasmosisin patogenezinin araştırılmasında HFF hücrelerde üretilen T. gondii takizoitleri insan retinal endotel hücreleri (HREC: Human Retinal endothelial cell) ve insan vasküler endotel hücreleri enfekte etmede kullanılmış ve oluşan patogenez incelenmiştir (143, 165). Kore de izole edilen virülan KI-1 suşunun Sarkoma 180 hücrelerinde başarı ile üretildiği bildirilmiştir (29). T. gondii takizoitleri tanı testlerinde kullanılmak üzere çeşitli hücre kültürlerinde üretilmiş, hücre kültüründe üretilen T. gondii takizoitlerinin serolojik tanı testlerinde antijen olarak kullanılmasının, farede üretilen antijene göre daha basit ve ucuz olması, daha az etik sorunlar çıkarması sebebiyle tercih edildiği bildirilmektedir (7, 8, 23, 31, 60). Hücre kültürü kaynaklı antijenin toxoplasmosisin serolojik tanısında, fare kaynaklı antijenin yerini alması amacı ile pek çok çalışma gerçekleştirilmiş ve hücre kültürü kaynaklı antijenin rutin serolojik tanı testlerinde kullanılabileceği bildirilmiştir (7, 8, 31, 60). Hücre kültüründe elde edilen takizoitlerin serolojik testlerde antijen olarak kullanılabilmesi için konak hücre kontaminasyonunun azaltılması için değişik hücre çeşitleri ve hücre kültürü ortamları halen araştırılmaktadır. T. gondii takizoitlerinin 29 C de tutulan Aedes hücre serilerinde canlılığını koruduğu, fakat bölünmediği, Culex ve Anofel hücre serilerinde hiç sonuç alınamadığı ve Vero hücre serisinde ise 35 C de başarılı şekilde sürekli üretiminin yapıldığı bildirilmiştir (22). İnsan Larinks karsinomu hücrelerinde (Human Larynx Carcinoma cell, Hep-2) T. gondii Rh suşu takizoitleri bol miktarda birkaç pasaj boyunca üretilmiştir (19). T. gondii RH suşu takizoitleri bebek hamster böbrek hücrelerinde (baby hamster kidney, BHK-21) üretildikten sonra cam yün filtrasyon fiberinden geçirilen üst sıvıda 35

48 konak hücre kontaminasyonunun azaltıldığı, takizoitlerde sadece % 25 kayıp olduğu ve canlılığın bu işlem sırasında azalmadığı belirtilmiştir (68). T. gondii P suşu takizoitlerinin silikon kaplı cam şişelerde 75 rpm çevrilen ve 37 C de inkübe edilen HeLa hücrelerin oluşturduğu süspansiyonda bol miktarda üretildiği bildirilmiştir (156). Sabin Feldman Dye testinde antijen olarak kullanılmak üzere T. gondii RH suşu takizoitlerinin üremesi Hep-2, Vero, MRC-5 ve AGMPK (Afrika Yeşil maymun primer böbrek; African green monkey primary kidney) hücre kültürlerinde araştırılmış ve en iyi üremenin AGMPK hücrelerinde olduğunu belirtilmiştir. Ayrıca AGMPK hücre kültüründe sürekli üretilen T. gondii takizoitlerinin virülansında ve Sabin Feldman Dye testinde, fare kaynaklı takizoitler ile aralarında belirgin bir fark olmadığı saptanmıştır (P > 0.05) (90). T. gondii takizoitlerinin HeLa hücre kültürü ortamında 6 yıl sürekli üretildiği çalışmanın sonuçlarına göre HeLa/takizoit oranının 12/1 olduğu ortamda en uygun üremenin sağlandığı, 8.7 ve 26.1 mm arasında değişen sodyum bikarbonat (NaHCO 3 ) konsantrasyonunun takizoit üremesini etkilemediği, roux şişelerinde 2-3 günde bir besiyeri değiştirilmesi ile /ml takizoit üretilebildiği, elde edilen takizoitlerin konak hücre kontaminasyonunun azaltılmasına ve antijen olarak kullanılmaya uygun olduğunu belirtilmiştir (155). Bilgisayara dayalı bir sistemle T. gondii takizoitlerine 4 gün aralıklarla 30 gün boyunca HeLa hücre süspansiyonu verilmiş, bu süreç sonunda toplam takizoit elde edildiği bildirilmiştir (139). T. gondii takizoitlerinin hücre kültüründe üretimi sırasında besiyeri ortamına serum ve benzeri maddelerin eklenmesinin konak hücre ve takizoit canlılığını arttırdığı fakat serum proteinlerinin ortamdan uzaklaştırılmaması sebebiyle takizoitlerle gerçekleştirilen çalışmaların sonuçlarının etkilendiği belirtilmiştir. Bu 36

49 sebeple Hep-2 hücreler ve T. gondii takizoitleri serum içermeyen çeşitli besiyerlerinde üretilmiş, en uygun üremenin tek protein (Bovine serum albumin) içeren SHITE ve Iscove besiyerlerinde gerçekleştiği saptanmıştır (80). T. gondii takizoitlerinin TG180 (murine sarcoma cell) hücrelerin spontan mutasyonu ile elde edilen hücre serisinde de başarı ile üretildiği bildirilmiştir (37). Hücre kültünde üretilen T. gondii takizoitlerinden konak hücrelerin ayrıştırılması amacı ile uygulanan yoğunluk santrifüjü yönteminde hücre kültürü üst sıvısına formaldehit ile muamele edilmesi sonrası percol solüsyonunun uygulanmasının konak hücreleri % 99 oranında azalttığı, elde edilen takizoitlerin serolojik testler için çok uygun olduğu ve özellikle IFA testinde başarı ile kullanıldığı belirtilmiştir (77). Bir başka çalışmada U937 hücrelerde üretilen T. gondii takizoitlerindeki konak hücre kontaminasyonunun ters akım elutriasyonu (yıkayarak ayırma) tekniğini kullanarak % 0.17 oranına azaltıldığı bildirilmiştir (51). Serum içermeyen hücre kültürü ortamında üretilen T. gondii takizoitlerinin bütününün antijen olarak kullanıldığı ELISA testinin IFA testi ile uyumlu olduğu belirtilmiştir (129). Primer embriyonel tavuk fibroblastları (Chicken Embrional Fibroblast, CEF) ve Hep-2 hücre kültüründe üretilen T. gondii takizoitlerinin ELISA ve IFA testinde başarı ile kullanılmıştır (3). Vero hücre kültüründe T. gondii üretimi fötal dana serumu (fetal calf serum, FCS), at serumu ve serum içermeyen DefCell adlı madde eklenen RPMI besiyerlerinde araştırılmıştır. FCS içeren besiyerinin takizoit üretiminde at serumu ve DefCell içeren besiyeri kadar başarılı olmadığı, bu sebeple serum içermeyen DefCell besiyerlerinin T. gondii üretiminde kullanılabileceği belirtilmiştir (41). 37

50 Hep-2 DNA sının transfeksiyon ile insan embriyonik akciğer hücrelerine eklenerek oluşturulan hibrid hücrelerde T. gondii parazitlerinin başarı ile üretilebileceği bildirilmiştir (164). İskoçya Toxoplasma Referans Laboratuvarı hücre kültüründe sürdürülen T. gondii RH suşu takizoitlerini rutin serolojik testlerde kullanmak amacı ile bir seri çalışma yapmıştır. HeLa, Lewis akciğer kanser hücreleri (Lewis Lung carcinoma cell, LCC), Vero hücre serileri ve farklı kültür metotlarının kullanıldığı ilk çalışmanın sonuçlarına göre 24 saat FCS içeren ve sonrasında serum içermeyen HeLa hücre kültüründe T. gondii RH suşu takizoitlerinin sürekli, canlılık oranı yüksek ve bol miktarda ürediğini belirtmişlerdir. Bu çalışmada konak hücre kontaminasyonunun azaltılması için düşük devirli santrifüj tekniğinin etkisiz kaldığı ve çok miktarda T. gondii takizoit kaybına yol açtığı bildirilmiştir. Filtrasyon tekniğinin ise T. gondii takizoitlerinde % 5 kayba yol açarken HeLa hücrelerinde % 99 oranında azalma sağladığı tespit edilmiştir (60). İskoçya Toxoplasma Referans Laboratuvarının ard arda yaptığı iki çalışmada Sabin Feldman Dye testinde kullanılan HeLa hücre ve hayvan kaynaklı takizoitlerin benzer sonuç verdiği, hücre kültüründe üretilen T. gondii takizoitlerinin başarılı şekilde aksesuar faktör ile kombine edilmesi durumunda Sabin Feldman Dye testinde kullanılabileceği bildirilmiştir (7, 8). İskoçya Toxoplasma Referans Laboratuvarının yaptığı bir sonraki çalışmada serolojik testlerde antijen olarak kullanılacak hücre kültüründen elde edilen takizoitlerin istenilen zamanda bol miktarda ve canlılık oranını yüksek olarak üretilmesi yanında üst sıvıdaki konak hücre kontaminasyonunun üretim sırasında azaltılmasının önemi ilk defa belirtilmiş, çalışma grubu bu yönde ısı denemeleri yaparak üretim sırasında konak hücre miktarının azaltılmasını sağlamıştır (31). 38

51 T. gondii RH suşu takizoitlerinin Tavuk embryo hücreleri (Chicken embryo cell, CER), Hep-2, MDBK, Vero, Tavşan böbrek hücreleri (rabit kidney cell, RK13), insan rabdomyosarkom (human rhybdo myosarcoma, RDA) ve bir günlük hamsterlerden havuzlanmış böbrek hücreleri (pooled kidney from 1 day old hamsters, BHK) ile FCS içeren ve içermeyen besiyeri ortamında üretildiği çalışmada, flasklar +4 C, oda sıcaklığı ve 37 C de 28 gün boyunca bekletilmiş, elde edilen takizoitler farelere öldürücü dozlarda uygulanarak virülans kaybı değerlendirilmiştir. Bütün hücre tiplerinde serum içermeyen ortamda serum içeren ortama göre daha az T. gondii takizoit üretimi gerçekleşmiş, ekimden 7 gün sonra 37 C den alınan tüm takizoitlerin virülanslarını yitirdiği, 21. günde oda sıcaklığındaki ve +4 C deki flasklardan alınan takizoitlerin Hep-2 hücreleri dışında virülanslarını kaybettiği belirtilmiştir (49). Hücre kültüründe üretilen T. gondii takizoitlerinin gen ekspresyonlarının değişmesiyle ortaya çıkacak antijenik değişikliklerin serolojik testlerin sonucunu etkileyebileceği bildirilmiş, farklı laboratuvarlardan elde edilen T. gondii RH suşuna ait takizoitlerinin genetik çeşitlilik gösterdiği saptanmıştır (52, 71, 72, 85, 121). HeLa hücre kültüründe sürekli üretilen T. gondii RH suşu B ve Q serilerine ait takizoitlerin pasajlar sırasında gen ekspresyonunun değişmediği, J seri takizoitlerinin üremesinin standardize olmadığı, gen ekspresyonunda değişiklikler saptandığı ve serolojik testler için uygun olmadığı bildirilmiştir (121). Döşkaya ve ark. yaptığı ve yer aldığımız çalışmada T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin myeloma X63.Ag8.653, HeLa, Hep-2 ve Vero hücre kültürü ortamlarında sürekli üretim sırasında boyutlarının küçüldüğü, takizoit sayında en fazla artışın görüldüğü myeloma hücre kültüründe boyutların çok küçüldüğü ve kısa sürede virülans kaybı gerçekleştiği izlenmiştir (Şekil 1.6.). Hep-2 hücrelerde üretilen 39

52 takizoitlerin virülanslarının en uzun süre koruduğu, HeLa hücre serisinde üretilen takizoitlerin morfolojilerinin ise en az değiştiği belirlenmiştir (52). İn vitro hücre kültürü ortamında serolojik testlerde antijen olarak kullanılmak üzere bol miktarda takizoit üretiminde kullanılan değişik kültür ortamlarının parazitlerin protein ekspresyonlarında değişikliklere sebep olduğu ortaya konulmuştur (107). Hep-2 hücre kültürü ve fare peritonundan elde edilen T. gondii RH suşu takizoit antijenleri kolon kromotografisi ile saflaştırıldıktan sonra western blot ile oluşan bant paternleri karşılaştırılmış, fareden elde edilen antijen 11 belirgin bant oluştururken (76, 70, 64, 53, 46, 44, 41, 35, 25, 18 ve 13 kda), Hep-2 kültüründen elde edilen antijenin 7 bant (70, 64, 53, 35, 28, 13 ve 10 kda) oluşturduğu bildirilmiştir (1). Değişik hücre kültürlerinde izole edilen ve üretilen çeşitli T. gondii suşlarının kaybolmasının önüne geçilmesi için takizoit kriyopreservasyonları DMSO, gliserol ve FCS nin kriyoprotektan olarak kullanıldığı çalışmalarda başarı ile gerçekleştirilmiştir (17, 116). Kriyopreservasyonda soğultulmuş kriyoprotektan solüsyonu (% 10 DMSO, % 10 FCS içeren büyüme besiyeri) ve taze takizoit kullanımı yanında takizoitlerin önce - 30 C ye yavaşça dondurulması sonrası sıvı nitrojene aktarılmasının uygun olduğu belirtilmiştir (120). 40

53 A B C D E F Şekil 1.6. T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin çeşitli hücre kültürü ortamlarında giemsa boyama ile gösterilmesi. (A) Fare intraperitoneal alandan toplanan takizoitler, (B) Myeloma hücrelerin invazyonu, sürekli üretimin ikinci haftası, (C) sürekli üretimin ikinci ayında myeloma hücrelerin takizoitler tarafından invazyonu, (D, E, F) Sırasıyla Vero, Hep-2 ve HeLa hücrelerde üretilen takizoitlerde boyutların ufalması (Mert Döşkaya dan kişisel izinle alınmıştır). 41

54 1.9. Tedavi Toxoplasmosis tedavisinde enfeksiyonun yeri, hastanın immun durumu ve hamilelik durumu belirleyici faktörlerdir. Bu sebeple tedavi edilecek hastaların gruplara ayrılmasının uygun olduğu bildirilmiştir (Tablo 1.5.). Tedavide standart ilaç kombinasyonu olarak primethamin (pyrimethamine) ve sulfadiazin (sulfadiazine) gibi bir sulfonamid (sulfonamide) veya sulfonamid alerjisi varsa klindamisin (clindamycin) kullanılmaktadır. İlaç tedavisinin takizoitlere etkili, doku kistlerine karşı etkisinin az olduğu ve bunun sonucu olarak tedavinin toxoplasmosisin latent enfeksiyonu ile sonuçlandığı belirtilmiştir. Primethamin (25-75 mg/gün) dihidrofolat redüktaz inhibitörü olup kemik iliği baskılanmasına yol açtığı için, bu etkisini azaltan folinik asit (folinic acid, leucoverin) (5-10 mg/gün) ile birlikte kullanılması tavsiye edilmektedir. Sulfonamidler (3-4 gr/gün) dihidrofolat sentetaz inhibitörü olup folik asit metabolizmasına etkidiklerinden primethamin ile sinerji oluşturdukları belirtilmektedir. Kullanımı sırasında oluşan kemik iliği baskılanmasının folinik asit tedavisine cevap verdiği bilinmektedir. Spiramisin (Spiramycin) makrolid antibiyotik olup, T. gondii apikoplast fonksiyonuna etkili olduğu, serokonversiyon gelişen gebelerde kullanıldığı bildirilmektedir (74, 131, 162). 42

55 Tablo 1.5. Toxoplasma enfeksiyonları ve tedavi seçenekleri (74, 123, 162) İlaç Doz Süre Asemptomatik veya seroloji ile saptanan latent enfeksiyon Tedaviye gerek yoktur İmmun sistemi sağlam hastalarda lenfadenopati, ateş ve halsizlik oluşturan klinik tablo İmmun sistemi sağlam hastalarda yaygın hastalık, laboratuvar kazası veya kan transfüzyonu ile takizoit bulaşı Uzamış lenfadenopati 1 Tedaviye gerek yoktur Primethamin Yükleme dozu: 100 mg/gün 4-6 hafta boyunca (2 dozda) sonra mg/gün + Sulfadiazin 4 8 gr/gün 4-6 hafta boyunca + Folinik asit 5 10 mg/gün Tedavi süresince ve sonrası 1 hafta Hamilelerde akut toxoplasmosis 2 Spiramisin 3 gr/gün (3 dozda) Doğum sonuna kadar veya fötal enfeksiyon kanıtlanana kadar Tanısı konmuş fötal enfeksiyon (gestasyonun haftaları sonrası) 3 Primethamin mg/gün Doğuma kadar + Sulfadiazin 3-4 gr/gün Doğuma kadar + Folinik asit 5 15 mg/gün Tedavi süresince ve sonrası 1 hafta Konjenital toxoplasmosis 4 Primethamin Yükleme dozu: 2 mg/kg/gün 1 yıl 2 gün süre ile, takiben 1 mg/kg/gün 2 ay ve sonra bu doz gün aşırı verilecek + Sulfadiazin 100 mg/kg/gün iki dozda 1 yıl + Folinik asit 5 mg günaşırı Tedavi süresince ve sonrası 1 hafta Kortikosteroid (Prednison)* 1 mg/kg/gün iki dozda Bulgular yatışana kadar Oküler toxoplasmosis Primethamin Yükleme dozu: 200 mg/gün sonra mg/gün İmmun sistemi sağlam olmayan hastalar (AIDS, transplantasyon) Standart tedavi protokolü Alternatif tedavi protokolü Semptomlar yatıştıktan sonra 1 2 hafta + Sulfadiazin gr/gün PO Semptomlar yatıştıktan sonra 1 2 hafta + Folinik asit 5 20 mg haftada üç kere Tedavi süresince ve sonrası 1 hafta Kortikosteroid (Prednison)* Günde 1-2 mg/kg iki dozda Bulgular yatışana kadar Primethamin Yükleme dozu: 200 mg/gün Bulgular yatıştıktan sonra 4 6 hafta sonra mg/gün + Sulfadiazin 4 6 gr/gün (4 dozda) Bulgular yatıştıktan sonra 4 6 hafta veya Klindamisin mg/gün (4 dozda) Bulgular yatıştıktan sonra 4 6 hafta + Folinik asit mg/gün Tedavi süresince ve sonrası 1 hafta Primethamin (P) + Folinik asit Standard tedavi protokolünde Bulgular yatıştıktan sonra 4 6 hafta olduğu gibi + aşağıdakilerden birisi Trimethoprim 10 mg/kg/gün (2 dozda) Bulgular yatıştıktan sonra 4 6 hafta Klaritromisin 2 gr/gün (2 dozda) Bulgular yatıştıktan sonra 4 6 hafta Atovaquone 2500 mg/gün (2 dozda) Bulgular yatıştıktan sonra 4 6 hafta Azitromisin 1200 mg/gün Bulgular yatıştıktan sonra 4 6 hafta Sulfadoxine (S) (Fansidar içerik: P+S) 500 mg/gün Bulgular yatıştıktan sonra 4 6 hafta Dapsone (D) (Maloprim içerik: P+D) 100 mg/gün Bulgular yatıştıktan sonra 4 6 hafta 1 Yükleme dozuna gerek yoktur. 2 Merkezler arası tedavi protokolleri değişkendir. 3 Pyrimethamine+sulfadiazine ve spiramycin protokolleri her ay dönüşümlü uygulanabilmektedir. 4 Merkezler arası tedavi protokolleri değişkendir. * Beyin omurilik sıvısında protein 1g/dl ve aktif retinokoroidit görmeyi bozduğunda (makula, optik sinir başı papillomaküler bölge tutulmuş). 43

56 1.10. Korunma Korunma özellikle seronegatif hamileler ve immun sistemi sağlam olmayan hastalar için önemlidir. Bu sebeple bu hasta gruplarının tarama testleri ile saptanmasının hastalığı önlemede rolü olduğu belirtilmektedir. T. gondii sabun ile öldürülebildiğinden, insanlarda enfeksiyonun engellenmesi için et ile uğraşılmadan önce ve sonrasında ellerin, tüm et kesme aletleri, tahtaları ve diğer malzemelerin su ve sabunla yıkanması önerilmektedir. Et içindeki doku kistleri 67 C ye ısıtma ve - 13 C ye soğutma ile öldürülebilmektedir. Risk altındaki kişilerin genel olarak kedi, toprak ve çiğ etten uzak durmaları, varsa kedilerinin sadece kuru konserve ve pişmiş gıdalarla beslenmesi, kedi dışkı kabı ve çocuk kum havuzu temizliğinin kendileri tarafından yapılmaması (bunun yanında dışkı kabının her gün temizlenmesi gereklidir) önerilmektedir. Bahçe ile uğraşırken mutlaka eldiven giyilmesi, çiğ yumurta, pastörize olmamış süt tüketilmemesi, sebze ve meyvelerin yenmeden önce iyice yıkanmasına dikkat etmeleri gerekmektedir (81, 123). 44

57 İKİNCİ BÖLÜM GEREÇ ve YÖNTEM Toxoplasma gondii canlı takizoit üretiminde fare kullanımına alternatif: Sürekli Hücre kültürü adlı tezin hücre kültürü çalışmaları Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı nda, serolojik testler aşaması ise Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Bilim Dalı nda gerçekleştirilmiştir. Toxoplasmosisin serolojik tanısında tüm dünyada genellikle farelerden üretilen antijen kullanılmaktadır. Bu projede hücre kültürü ortamında toxoplasmosisin serolojik tanısı için kaliteli antijen hazırlanması ve bu sayede antijen üretme amacı ile kullanılan fare sayısının azaltılması amaçlanmıştır. Tez konusu dahilinde ilk olarak HeLa hücre kültürü ortamında T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin sürekli üretilebilmesine yönelik en uygun ortam araştırılması için optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Bu aşamada HeLa hücre kültüründen elde edilen T. gondii takizoitlerinin çalışma süresince korunabilmesi için kriyopreservasyon gerçekleştirilmiştir. Tezin ikinci aşamasında HeLa hücre kültürü ve farede üretilen T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinden elde edilen antijenlerin kalitesi IFAT, ELISA ve Western blot yöntemleri kullanılarak karşılaştırılmıştır. Bu tez Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK Proje no: SBAG 105S022) ve Ege Üniversitesi Bilim Teknoloji Uygulama ve Araştırma Merkezi (EBİLTEM Proje no: 2006 BİL 012) tarafından desteklenmiştir. 45

58 2.1. Hücre kültürü HeLa hücre kültürü, HeLa hücre kültürünün T. gondii takizoit ekimi amaçlı optimizasyonu ve HeLa hücre kültüründe üretilen T. gondii RH Ankara suşu takizoit kriyopreservasyonu çalışmaları Ege Üniversitesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalında gerçekleştirilmiştir Hücre kültürü ve kriyopreservasyon çalışmalarında kullanılan cihaz, solüsyon, besiyeri ve sarf malzemeleri Cihazlar Inverted (Ters) mikroskop: SOLF Xds-1B, Çin CO 2 İnkübatör: Nuaire NU 5500, Amerika Birleşik Devletleri (A.B.D.) Hemositometre 0.1 mm mm 2, Isotherm, Türkiye Hücre sayıcı cihaz: Many Way Counter, Japonya Biyolojik Güvenlik Kabini (Class II): Nuaire Labgard 440, A.B.D. Otomatik Pipet: Maxipette, Grenier Bio-One, Katalog No: , Almanya Sıcak su banyosu: Lauda Aqualine AL12, Almanya Solüsyon ve besiyeri Earle nin tuzlarını ve 2.2 g/l NaHCO 3 içeren Basal Medium Eagle (BME): BME with Earle's salts, with 2.2 g/l NaHCO 3, without L-glutamine, Biochrom, Katalog No: F0225, Almanya 46

59 L-glutamin: L-glutamine (200 mm), Biochrom, Katalog No: K0282, Almanya HEPES tamponu: Hepes Buffer (1 M) (50 ), Biochrom, Katalog No: L1613, Almanya Tripsin % 0.25: Trypsin 0.25 %, (1:250) in PBS without Ca 2+, Mg 2+, Biochrom, Katalog No: L2123, Almanya Fötal sığır serum: Fetal Bovine Serum (FBS), Biochrom, Katalog No: S0113, Almanya Penisilin/Streptomisin: Penicillin/Streptomycin U/ µg/ml, Biochrom, Katalog No: A2210, Almanya Gentamisin: Gentamycin (10mg/ml): Biochrom, Katalog No: A2710, Almanya Amfoterisin B: Amphotericin B (250 µg/ml): Biochrom, Katalog No: A2612, Almanya Hank ın dengeli tuz solüsyonu: Hank s balanced saline solution (HBSS) with 0.35 g/l NaHCO 3, Biochrom, Katalog No: L2015, Almanya Tripan Mavisi: Trypan Blue, Applichem, Katalog No: A0668, Almanya Sarf malzemesi 25-cm 2 flasklar: Filter Cap Cell Culture Flask, Greiner Bio-One, Katalog No: , Almanya 75-cm 2 flasklar: Filter Cap Cell Culture Flasks, Greiner Bio-One, Katalog No: , Almanya Steril pastör pipet: Grenier Bio-One, Katalog No: , Almanya 47

60 Steril 5 ml pipet: Serological Pipettes 5 ml, Grenier Bio-One, Katalog No: , Almanya Steril 10 ml pipet: Serological Pipettes 10 ml, Grenier Bio-One, Katalog No: , Almanya Dimetil sülfoksid: Dimethyl sulfoxide (DMSO) Cell culture grade, Applichem, Katalog No: A3672, Almanya Etanol: Ethanol Absolute, Applichem, Katalog No: A3693, Almanya Steril 15 ml tüp: Grenier Bio-One, Katalog No: , Almanya Steril 50 ml tüp: Grenier Bio-One, Katalog No: , Almanya Steril 1.5 ml tüp: Grenier Bio-One, Katalog No: , Almanya 81 çukurlu kriyo tüp (1,5-2 ml) saklama kutusu: GLW, Katalog No: B50, Almanya Kriyo tüp 2 ml: Grenier Bio-One, Katalog No: , Almanya HeLa hücre kültürü HeLa stok kültürü için Ege Üniversitesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalından elde edilen HeLa hücreleri (Hücre serisi ATCC, American Type Culture Collection kaynaklıdır) kullanılmıştır. HeLa hücrelerinin üretimi Döşkaya ve ark. yararlandığı yöntemle yapılmıştır (52). 25 ve 75-cm 2 flasklar içine sırasıyla 5 ve 15 ml geliştirme besiyeri [Earle nin tuzlarını ve 2.2 g/l NaHCO 3 içeren Basal Medium Eagle (BME), 2mM L-glutamine, 10 mm Hepes ve % 10 fetal calf serum (FCS)] eklenmiştir (Tablo 2.1.). 48

61 Tablo 2.1. Geliştirme besiyeri hazırlanması Malzeme/Solüsyon Kullanılan miktar Ortalama son konsantrasyon BME (2.2 g/l NaHCO 3 ) 450 ml - FCS 50 ml %10 L-glutamin (200 mm) 5 ml 2 mm HEPES (1M) 12.5 ml 25 mm Gentamisin (10 mg/ml) 0.5 ml 2 µg/ml Penisilin (10000 U/ml) 0.5 ml 10 U/ml Streptomisin (10000 µg/ml) 0.5 ml 10 µg/ml Amfoterisin B (250 µg/ml) 2 ml 1 µg/ml HeLa hücre kültüründe inverted mikroskop ile monolayer (tek tabaka hücre) oluştuğu gözlendiğinde, 25 ve 75-cm 2 flasklarda bulunan hücrelerin öncelikle üst sıvıları aspire edilmiş, daha sonra oda sıcaklığındaki Hank s balanced sodium solüsyonundan (HBSS) sırasıyla 5 ve 15 ml alınarak hücreler yıkanmış ve kısa bir süre sonra üst sıvı yeniden pastör pipeti ile aspire edilmiştir. Daha sonra 25 ve 75- cm 2 flasklar içerisine sırasıyla 1 ml ve 3 ml % 4 trypsin eklenmiştir. Hücrelerin ayrıştırılması için trypsin eklenen flasklar ortalama 5 dakika 37 C de bekletilmiş ve daha sonra flaskların alt kısmına hafifçe vurulmuştur. Flask tabanından ayrılan hücreler inverted mikroskopta gözlendikten sonra 25 ve 75-cm 2 flasklar içine sırasıyla 5 ve 15 ml geliştirme besiyeri eklenmiştir. Flasklardan ayrılan HeLa hücrelerinin canlılığı ve sayısı % 0.4 trypan mavisiyle boyanıp, hemositometre ile sayıldıktan sonra belirlenmiştir. Trypan mavisi ile boyama sırasında 1.5 ml tüp içerisinde 25 µl % 0.4 trypan mavisi ve 25 µl serbest kalan hücre karıştırılmıştır. Daha sonra bu karışımdan hemositometre nin karşılıklı iki kenarından 10 µl konulmuş, ışık mikroskopta büyütmede hücrelerin canlılığı ve sayısı değerlendirilmiştir. 49

62 Sonraki aşamada 25 ve 75-cm 2 flasklara sırasıyla ve canlı hücre eklenmiş, üst sıvıda 5 ve 15 ml olacak şekilde geliştirme besiyeri eklendikten sonra 37ºC de, % 5 CO 2 li ortamda inkübe edilmiştir. Inverted mikroskop ile izlenen HeLa hücreleri üç gün içinde flaskların tabanında ortalama % 95 dolulukta monolayer oluşturmuştur. Hücre kültürü için kültürdeki HeLa hücre sayısı ve ekilecek takizoit sayısının belirlenmesi iki aşamada denenerek gerçekleştirilmiştir T. gondii takizoit ekimi için kültürde kullanılacak HeLa hücresi sayısının belirlenmesi HeLa hücre kültürü yapılan 25-cm 2 veya 75-cm 2 flasklarda % 95 dolulukta monolayer oluştuğunda sırasıyla 1 veya 3 ml % 4 trypsin flasklara eklenmiş ve hücrelerin ayrılması için ortalama 5 dakika 37 C de inkübe edilmiştir. Flaskların alt kısmına vurularak serbest kalması sağlanan hücreler, inverted mikroskopta gözlendikten sonra 25 ve 75-cm 2 flasklar içine sırasıyla 5 ve 15 ml geliştirme besiyeri eklenmiştir. Flasklardan ayrılan hücrelerin canlılığı ve sayısı % 0.4 trypan mavisi ve hemositometre kullanılarak bölüm de tarif edildiği gibi belirlenmiştir. Elde edilen hücreler T. gondii takizoit ekimi için HeLa hücre kültürünün optimizasyonunda kullanılmıştır. T. gondii takizoit ekimi için HeLa hücre kültürünün optimizasyon hazırlığında 5 adet 25-cm 2 flaska sırasıyla ; ; ; ve adet HeLa hücresi eklenmiş ve her flasktaki besiyeri, geliştirme besiyeri ile 5 ml ye tamamlanmıştır. HeLa hücreleri 37ºC de, % 5 CO 2 li ortamda 8 saat süre ile inkübe edildikten sonra üst sıvısı aspire edilmiş ve her bir 25-cm 2 flask 5 ml HBSS 50

63 ile yıkanmıştır. Daha sonra flasklara 5 ml idame besiyeri [Earle nin tuzlarını ve 2.2 g/l NaHCO 3 içeren Basal Medium Eagle (BME), 2mM L-glutamine, 10 mm Hepes ve %2 FBS] eklenerek (Tablo 2.2.), 37ºC de, % 5 CO 2 li ortamda 16 saat inkübe edilmiştir. Bu aşamada çeşitli konsantrasyonda HeLa hücresi içerecek şekilde hazırlanan flasklara bir sonraki aşamada T. gondii takizoitleri çeşitli konsantrasyonlarda ekilmiştir. Tablo 2.2. İdame besiyeri hazırlanması Malzeme/Solüsyon Kullanılan miktar Ortalama son konsantrasyon BME (2.2 g/l NaHCO 3 ) 490 ml - FCS 10 ml %2 L-glutamin (200 mm) 5 ml 2 mm HEPES (1M) 12.5 ml 25 mm Gentamisin (10 mg/ml) 0.5 ml 2 µg/ml Penisilin (10000 U/ml) 0.5 ml 10 U/ml Streptomisin (10000 µg/ml) 0.5 ml 10 µg/ml Amfoterisin B (250 µg/ml) 2 ml 1 µg/ml HeLa hücre kültüründe sürekli üretim için ekilecek T. gondii takizoit sayısının belirlenmesi HeLa hücre kültürüne sürekli T. gondii takizoit ekimi için kullanılan T. gondii RH Ankara suşu takizoitleri Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Bilim Dalından elde edilmiştir. BALB/c farelerden T. gondii takizoitleri elde edilmesinde Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Bilim Dalında rutinde kullanılan aşağıda özetlenen yöntemden yararlanılmıştır. Öncelikle BALB/c fareler için enfektif dozda ( /ml lik stoktan 100 µl veya takizoit) T. gondii RH Ankara suşu takizoitleri 6-8 haftalık BALB/c 51

64 farelerin peritoneal boşluğuna inoküle edilmektedir. BALB/c farelerin periton boşluğunda 3-4 günde çoğalan T. gondii RH Ankara suşu takizoitleri, usulüne uygun olarak steril şartlarda serum fizyolojik irrigasyonu sonrası, pastör pipeti kullanılarak 15 ml lik tüplere alınmış, takizoitlerin canlılığı ve sayısı % 0.4 trypan mavisi ile hemositometre kullanılarak bölüm de tarif edildiği gibi belirlenmiştir. HeLa hücre kültürüne sürekli T. gondii takizoit ekim optimizasyonu üç aşamada gerçekleştirilmiştir. İlk aşamada farklı sayıda HeLa hücrelerine, sabit sayıda T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin etkisi incelenmiştir. Bunun için öncelikle bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan ve sırasıyla ; ; ; ve miktarda HeLa hücresi ekilmiş 5 adet 25-cm 2 flask, 5 er ml HBSS ile yıkanmıştır. Flaskların her birine BALB/c farelerden yukarıda anlatıldığı gibi alınan ve steril serum fizyolojik içerisinde bulunan T. gondii takizoitlerinden adet inoküle edilmiştir. Daha sonra flasklara 5 ml idame besiyeri eklenerek 37ºC de, % 5 CO 2 li ortamda 3 gün inkübe edilmiştir. Her test iki ayrı flaskta aynı anda gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon sonunda flaskların üst sıvıları 15 ml lik tüplerde toplanmış, elde edilen üst sıvıdaki takizotlerin canlılığı ve sayısı yanında HeLa hücre kontaminasyonu % 0.4 trypan mavisi ve hemositometre kullanılarak bölüm de tarif edildiği gibi belirlenmiştir. Bir önceki aşamada belirlenen sayıdaki HeLa hücresine farklı sayıda T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin etkisi incelenmiştir. İlk aşamada farklı konsantrasyondaki HeLa hücrelerine belirli konsantrasyondaki T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin etkisi incelenmiş ve adet T. gondii takizoiti inoküle edilen adet HeLa hücresi içeren flaskta en iyi takizoit üremesi gerçekleşmiştir. Bu sebeple ikinci aşamada bölüm de anlatıldığı gibi 2 grup 4 er adet HeLa hücresi içeren 25-cm 2 flask hazırlanmıştır. Flask grupları 5 ml HBSS ile yıkandıktan 52

65 sonra BALB/c farelerden yukarıda anlatıldığı gibi alınan ve steril serum fizyolojik içerisinde bulunan T. gondii takizoitlerinden her gruptaki 4 flaska sırasıyla , , ve adet inoküle edilmiştir. Daha sonra her iki flask grubu 37ºC de, % 5 CO 2 li ortamda 2 ve 3 gün boyunca inkübe edilmiştir. Son aşamada elde edilen veriler ışığında 4 kez ardışık olarak HeLa hücre kültürüne sürekli T. gondii RH Ankara suşu takizoit ekimi yapılmıştır. Her pasaj sekiz adet 25-cm 2 flaskta aynı anda gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon sonunda flaskların üst sıvıları ayrı ayrı 15 ml tüplerde toplanmış, elde edilen takizotlerin canlılığı ve sayısı yanında HeLa hücre kontaminasyonu % 0.4 trypan mavisi ve hemositometre kullanılarak bölüm de tarif edildiği gibi belirlenmiştir HeLa hücre kültüründe üretilen T. gondii takizoit kriyopreservasyonu HeLa hücre kültüründen elde edilen T. gondii takizoitlerinin çalışma süresince korunabilmesi için T. gondii takizoit kriyopreservasyonu Mavin ve ark. nın yöntemi ile gerçekleştirilmiştir (120). Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan adet HeLa hücresi içeren 25-cm 2 flaska BALB/c farelerden bölüm te anlatıldığı gibi alınan adet canlı T. gondii takizoiti ekilip, 37ºC de, % 5 CO 2 li ortamda ortalama 30 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda flaskta bulunan üst sıvı steril pastör pipetiyle çekilmiş ve flask 5 ml HBSS ile yıkanmıştır. Daha sonra T. gondii takizoitleri ile enfekte HeLa hücrelerin flasktan ayrıştırılması için 25-cm 2 flask içerisine 1 ml % 4 tripsin eklenmiş ve ortalama 5 dakika 37 C de bekletilmiştir. Serbest kalan enfekte HeLa hücreler inverted mikroskopta incelendikten sonra 25-cm 2 flask içine steril şartlarda hazırlanan 2-3 ml kriyopreservasyon solüsyonu (% 10 DMSO içeren BME 53

66 besiyeri) eklenmiş ve karışım hızla birer ml olacak şekilde kriyo tüplerine bölünmüş, kriyo tüpler hızlıca kuru buz ve saf ethanol karışımından oluşan solüsyona daldırılıp dondurulduktan sonra -80ºC de bekletilen straform kutuya konulmuş, bir gün sonra kriyo tüpleri straform kutudan çıkarılıp kriyotüp kutularına nakledilmiştir. Kriyopreservasyonu yapılan T. gondii takizoitlerinin çözdürülmesi aşamasında -80ºC de bulunan bir adet kriyo tüp, 37ºC de bulunan su banyosuna konulmuş, hızlıca içerisinde idame besiyeri bulunan 25-cm 2 HeLa hücre flaskına eklenmiştir. Daha sonra flask 37ºC de, % 5 CO 2 li ortamda 3-4 gün inkübe edilmiş ve bu süreçte inverted mikroskop ile izlenmiştir. T. gondii takizoit gelişimi yeterli olmadığında üst sıvı aspire edilip, 5 ml taze idame besiyeri eklenerek ve 37ºC de, % 5 CO 2 li ortamda 7 güne kadar inkübe edilmiştir Serolojik testler Bu bölümde HeLa hücre kültüründe ve BALB/c farelerinde sürekli üretilen T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinden elde edilen antijenlerin kalitesi serolojik testler ile Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Bilim Dalında karşılaştırılmıştır. Hücre kültüründen elde edilen antijenler ile hazırlanan IFAT ve ELISA yöntemleriyle daha önceden serolojik, histopatolojik veya radyolojik olarak toxoplasmosis tanısı almış hastalara ait serum örneklerinde anti-toxoplasma IgG antikorları araştırılmıştır. Western blot yöntemi ile hücre kültüründen elde edilen antijenlerin oluşturduğu bant paterni daha önceden serolojik, histopatolojik veya radyolojik olarak toxoplasmosis ön tanısı almış yedi grup anne ve bebeğine ait serum örneklerinde (toplam 14 serum örneği) anti-toxoplasma IgG antikorları araştırılmış 54

67 ve elde edilen bant paternleri, BALB/c fareden elde edilen antijenlere ait bant paternleri ile kıyaslanmıştır Serolojik testlerde kullanılan cihaz, solüsyon, antikor ve sarf malzemeleri Cihazlar Mikrosantrifüj: Beckman Coulter Microfuge 18, A.B.D. Masaüstü santrifüj: Hettich Universal 16A, Almanya Isıtma bloğu: Major Science MD-02N, Tayvan İnkübatör: Incucell 55, Almanya İmmunfloresan mikroskop: Olympus, BH2-RFCA, Japonya ELISA plak okuyucusu: Bio-Tek ELx808, A.B.D. ELISA plak yıkayıcı: Bio-Tek EN , A.B.D. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve western blot seti ve güç kaynağı: Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, Bio-Rad, Katalog no: , A.B.D. Çalkalayıcı: Behringwerk AG, Almanya ph metre: WTW Inolab, Almanya Vakum cihazı: KNF Neuberger N022AN.18, Almanya 55

68 Antikorlar Fluorescein işaretli anti-insan IgG antikor: Fluorescein labelled anti human IgG (Goat) Fluoline G, Biomerieux, Katalog No: 75692, Fransa Alkaline fosfataz işaretli anti-insan IgG antikor: Anti-Human IgG (γ-chain specific) Alkaline Phosphatase antibody produced in goat, Sigma, Katalog No: A3187, Almanya Peroksidaz işaretli anti-insan IgG antikoru: Anti-Human IgG (γ-chain specific) Peroxidase antibody produced in goat, Sigma, Katalog No: A6029, Almanya Kimyasal sarf malzemeleri Hidroklorik asit: Hydrochloric acid % 37, Carlo Erba, Katalog No: , İtalya Yağsız süt tozu: Non Fat Dry milk, Applichem, Katalog No: A0830, Almanya Tris: Applichem, Katalog No: A2264, Almanya Sodyum klorür: NaCl, Applichem, Katalog No: A2942, Almanya Metanol: Methanol, Merck, Katalog No: , Almanya Glisin: Glycine, Applichem, Katalog No: A1067, Almanya Tween 20: Applichem, Katalog No: A1284, Almanya Akrilamid: Acrylamide % 30, Sigma, Katalog No: A3699, Almanya Amonyum persülfat: Ammonium persulfate, Sigma, Katalog No: A3678, Almanya 56

69 N,N,N,N -Tetrametiletilendiamin: N,N,N,N -Tetramethylethylenediamine, (TEMED), Sigma, Katalog No: T9281, Almanya Sodyum dodesil sülfat (SDS): Sodium dodecylsulfate, Applichem, Katalog No: A2263, Almanya Sodyum hidroksit (NaOH): Ak Kimya, Türkiye Bromfenol mavisi: Bromphenol blue, Applichem, Katalog No: A2331, Almanya β-merkaptoetanol: β-mercaptoethanol, Applichem, Katalog No: A1108, Almanya Coomassie parlak mavisi: Coomassie Brillant blue G-250, Applichem, Katalog No: A3480, Almanya 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidin (TMB): 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, Applichem, Katalog No: A3840, Almanya Sitrik asit: Citric acid, Sigma, Katalog No: C0759, Almanya PBS hazırlanırken ihtiyaç olan kimyasallar (Sodyum klorür hariç) o Potasyum klorid: Potassium chloride (KCl) Carlo Erba, Katalog No: , İtalya o di-sodyum hidrojen fosfat anhidroz: di-sodium hydrogen phosphate anhydrous (Na 2 HPO 4 ), Carlo Erba, Katalog No: , İtalya o Potasyum dihidrojen fosfat: Potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ), Riedel-de Haen, Katalog No: 04243, Almanya Glasial asetik asit: Glacial acetic acid, Applichem, Katalog No: A3686, Almanya Nitro mavisi tetrazolyum klorid: Nitro blue tetrazolium chloride (Nitro-BT), Applichem, Katalog No: A1243, Almanya 57

70 5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat p-toluidin tuzu (BCIP): 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl phosphate p-toluidine salt, Applichem, Katalog No: A1117, Almanya Dietanolamin: Diethanolamin, Merck, Katalog No: , Almanya Magnezyum klorid heksahidrat: Magnesium chloride hexahydrate (MgCl 2 6H 2 O), Merck, Katalog No: , Almanya Dimetilformamid: N,N-Dimethylformamide, Sigma, Katalog No: D4254, Almanya Dimetilasetamid: N,N-Dimethylacetamide, Applichem, Katalog No: A2488, Almanya Hidrojen peroksit: Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) solution 40% (w/v) in water, Carlo Erba, Katalog No: , İtalya Sülfirik asit: Sulfuric acid % 95-98, Merck, Katalog No: , Almanya Gliserol: Glycerol, Sigma, Katalog No: G5516, Almanya Kazein: Cazein, Merck, Katalog No: , Almanya Plastik ve diğer sarf malzemeleri Polivinilidin fluoride (PVDF) transfer membran: Polyvinylidene fluoride Immobilon-P, Millipore, Katalog No: IPVH00010, A.B.D. Sulandırma plağı: 96 well master block 2 ml, Greiner bio one, Katalog No: , Almanya Şişe üstü filtre, por genişliği 0.45 µm: Corning, Katalog No: , A.B.D. Filtre, por genişliği 10 µm: Whatman, Katalog No: , İngiltere 27 gauge enjektör iğnesi: Exelint International, A.B.D. 58

71 Enjektör filtresi, por genişliği 0.22 µm: Macherey-Nagel, Katalog No: , Almanya IFAT lamı: Waldemar Knittel Glasbearbeitungs, Star frost diagnostic slides, Katalog No: K 056, Almanya ELISA Mikroplaklar, 96 çukurlu, tabanı düz: Linbro, MP Biomedicals, Katalog No: 76331, A.B.D. İnsülin enjektörü: 1 ml, U-100 insülin şırınga, Ayset, Türkiye Protein merdiveni: Benchmark Prestained Protein ladder, Invitrogen, Katalog No: Transfer pipet: Pasteur Pipette, LP, İtalya Jele örnek yükleme için pipet ucu: StarLab, Katalog No: I Serolojik testler için antijen hazırlama Bu çalışmada kullanılan T. gondii RH Ankara suşu takizoitleri BALB/c farelerden ve HeLa hücre kültüründen elde edilmiştir. ELISA ve Western blot için eriyik, IFAT için ise partikül (whole) antijen kullanılmıştır. Eriyik ve partikül antijen hazırlanması ile ilgili işlemler sırasıyla bölüm ve de anlatılmaktadır IFAT yöntemi için partikül antijen hazırlama HeLa hücre kültüründen ve BALB/c fareden elde edilen T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinden öncelikle partikül antijen tarif edildiği gibi hazırlanmıştır (75). HeLa hücre kültüründen elde edilen üst sıvıda HeLa hücre artıklarının azaltılması için üst sıvı öncelikle 27 gauge enjektörden geçirilmiş ve sonrasında 59

72 500 g de 5 dakika santrifüj edilmiştir. Daha sonra takizoit içeren üst sıvı pastör pipeti ile 15 ml lik tüpe alınarak 3000 g de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Üst sıvı atıldıktan sonra çökelti 10 ml tuzlu fosfat tampon (PBS, ph: 7.4) eklenerek 3000 g de 10 dakika santrifüj edilmiş ve üst sıvı atılmıştır. Bu işlem iki kez daha uygulanmıştır. Üçüncü yıkama sonrası üst sıvı tüpün dibinde 1 ml PBS (ph: 7.4) bırakılacak şekilde atılmış ve çökelti tekrar sulandırılmıştır. Takizoitlerin sayısı hemositometre kullanılarak bölüm de tarif edildiği gibi hesaplanmıştır. Fare veya hücre kültür proteinlerinden arındırılan takizoitler partikül antijen olarak IFAT yönteminde kullanılmıştır. IFAT yönteminde kullanılan teflon kaplı lamlara ışık mikroskopta büyütmede her sahada ortalama takizoit olacak şekilde pipet yardımı ile yayılmış, lamlar oda ısısında kurutulduktan sonra kullanıma kadar -20 C de saklanmıştır ELISA ve Western blot yöntemleri için eriyik antijen hazırlama ELISA ve Western blot yöntemlerinde kullanılan eriyik antijen BALB/c fare ve HeLa hücre kültüründe sürekli üretim sırasında elde edilen T. gondii RH Ankara suşu takizoitleri ile tarif edildiği gibi hazırlanmıştır (75). ELISA ve Western blot için eriyik antijen hazırlama sırasında bölüm de anlatıldığı gibi 1 ml PBS (ph: 7.4) içerisinde tekrar sulandırılan ve takizoit miktarı sayılan takizoit süspansiyonu 1.5 ml lik tüpe aktarılmış ve g de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası üst sıvısı atılan çökelti üzerine ortalama çökelti kadar distile su eklenmiş ve takizoitlerin parçalanması için 10 defa dondurulup çözdürülmüştür. Daha sonra hücre eriyiği g de 15 dakika santrifüj edilmiş ve üst sıvı insülün enjektörüne çekilerek por büyüklüğü 0.22 µm 60

73 olan şırınga filtresinden geçirilmiştir. Bu aşama sonrasında eriyik antijenler ELISA ve Western blot testlerinde kullanılmıştır İndirek floresan antikor testi (IFAT) Daha önceden serolojik, histopatolojik veya radyolojik olarak toxoplasmosis tanısı almış 30 seropozitif ve 7 seronegatif hastanın serum örneklerinden yararlanarak BALB/c fare ve HeLa hücre kültüründen elde edilen antijenler IFAT yöntemi ile değerlendirilmiştir (75). Bunun için öncelikle hastalara ait serum örnekleri, pozitif ve negatif kontroller sulandırma plağında PBS (ph: 7.4) içinde 1:16, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024 oranında sulandırılmış ve bölüm de tarif edildiği gibi hazırlanan partikül antijenleri içeren teflon kaplı lamların çukurlarına eklenmiştir. Lamlar inkübatörde nemli ortamda 37ºC de 30 dakika inkübe edilmiş ve PBS (ph: 7.4) ile 3 kere 10 dakika yıkanmış ve oda sıcaklığında kurutulmuştur. Daha sonra lamların her bir çukuruna reaksiyonu görülebilir hale getirmek için konjuge (anti-antikor) olarak PBS (ph: 7.4) içerisinde 1:1250 oranında sulandırılan Fluorescein işaretli anti-insan IgG antikordan 10 µl eklenmiş ve nemli ortamda 37ºC de 30 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrasında PBS (ph: 7.4) ile 3 kere 10 dakika cam şaleler içerisinde yıkanan lamlar üzerine ortalama 100 µl kapatma solüsyonu konulmuş [2:8 oranında PBS (ph: 7.4):gliserol karışımı] ve floresan mikroskop ile değerlendirilmiştir. BALB/c fareden ve HeLa hücre kültüründen elde edilen antijenler IFAT yöntemi ile ayrı ayrı çalışılarak elde edilen sonuçlar karşılaştırılmış, her iki antijenin özgüllük ve duyarlılık hesaplamaları yapılmıştır. 61

74 Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) IFAT da kullanılan aynı serum örneklerinden yararlanarak BALB/c fare ve HeLa hücre kültüründen elde edilen antijenler ELISA yöntemiyle değerlendirilmiştir (75). Öncelikle bölüm de tarif edildiği gibi hazırlanan T. gondii RH Ankara suşu takizoitine ait eriyik antijenler, PBS (ph: 7.4) ile son konsantrasyonu /ml olacak şekilde sulandırılmıştır. Daha sonra ELISA mikroplaklarının her bir çukuruna 100 µl eriyik antijen solüsyonu eklenmiştir. Eriyik antijen kaplanan plaklar çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1.5 saat süreyle inkübe edilmiştir. Hastalara ait serum örnekleri, pozitif ve negatif kontroller sulandırma plağında kazein tampon [PBS (ph:7.4) içine final konsantrasyon % 0.5 (v/v) olacak şekilde kazein stok solüsyonundan (% 5 kazein, 100 mm NaOH, 4 M HCl ile ph: ayarlanır) eklenerek hazırlanır] ile 4:1000 oranında sulandırılmış ve inkübasyon sonunda antijen içeriği boşaltılan plağın her bir çukuruna 100 µl sulandırılmış serum örneği eklenmiştir. Her serum örneği çift çukur çalışılmıştır. Sulandırılmış serum örneği eklenen plaklar 20 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde inkübe edildikten sonra içerikleri boşaltılmış ve otomatik ELISA plak yıkayıcıda 3 kere 200 µl PBS (ph:7.4) ile yıkanmış, plak çukurları havlu kağıda vurularak tamamen boşaltılmıştır. Son yıkamadan sonra plak çukurları tamamen boşaltılmış ve her bir çukura 100µl 1:1375 oranında kazein tampon ile sulandırılmış konjuge (peroksidaz ile işaretli anti-insan IgG antikoru) eklenmiştir. Konjuge eklenen plaklar 30 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde inkübe edildikten sonra içerikleri boşaltılmış ve otomatik ELISA plak yıkayıcıda 3 kere 200 µl PBS (ph:7.4) ile yıkanmıştır. Son yıkamadan sonra plak çukurları havlu kağıda vurularak tamamen boşaltılmış ve renk oluşturma için her bir çukura 10:1 oranında karıştırılan TMB 62

75 tampon [70.4 mm Na 2 HPO 4, 36.4 mm Sitrik asit, % 7 (v/v) Dimetilasetamid, % (v/v) H 2 O 2 distile suya eklenerek hazırlanır] ve TMB stok [0.1 mm 3,3',5,5'- Tetrametilbenzidin, % 4 (v/v) Dimetilasetamid distile suya eklenerek hazırlanır, 4 M HCl ile ph: 2.0 ayarlanır] solüsyonundan 100 µl eklenmiştir. Plak karanlık ortamda ortalama 45 dakika bekletildikten sonra reaksiyon her çukura 75 µl 2 N sülfirik asit içeren durdurma solüsyonu eklenerek durdurulmuştur. Absorbans değeri (AD) ELISA plak okuyucusu ile 450 nm dalga boyunda ölçülmüştür. Serum örneklerinden elde edilen AD, negatif kontrollere ait AD (+) 5 standart sapma üzerine çıktığında, hasta pozitif kabul edilmiştir. BALB/c fareden ve HeLa hücre kültüründen elde edilen antijenler ELISA yöntemi ile ayrı ayrı çalışılarak bulunan sonuçlar karşılaştırılmış, özgüllük ve duyarlılık hesaplanmıştır Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ve Western blot Daha önceden serolojik, histopatolojik veya radyolojik olarak toxoplasmosis ön tanısı almış yedi grup anne ve bebeğine ait serum örneklerinden (toplam 14 serum örneği) yararlanarak BALB/c fare ve HeLa hücre kültüründen elde edilen antijenler Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve Western blot yöntemi ile bant paternleri karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. Bu bölümde sırasıyla eriyik antijenlerin örnek tampon ile karıştırılması, SDS-PAGE ve Western blot aşamaları anlatılacaktır. 63

76 Eriyik antijenlerin örnek tampon ile karıştırılması Burada BALB/c fare ve HeLa hücre kültüründe sürekli üretilen T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinden bölüm de tarif edildiği gibi hazırlanan eriyik antijenlerin eşit hacimde örnek tampon ile karıştırılarak jelde yürütülmeye hazır hale getirilmesi anlatılmıştır. Bunun için öncelikle tablo 2.3. te bulunan tarif ile 2x örnek tampon oluşturulmuştur. Daha sonra eşit hacimde 2 örnek tamponu (125 µl) ve takizoit içeren eriyik antijen (takizoit konsantrasyonu /ml olan örnekten 125 µl) karıştırılmış ve ısı bloğunda 100ºC de ortalama 3 dakika kaynatıldıktan sonra sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jeline yüklenmiştir. Tablo 2.3. Stok 2x örnek tamponu hazırlanması a Malzeme/tampon Kullanılan miktar Son konsantrasyon b 0.5 M Tris-Cl (ph 6.8) 1250 µl 125 mm Sodyum dodesil sülfat (SDS) 0.2 gr % 4 (w/v) Bromfenol mavisi (% 100) 500 µl % 10 (v/v) Gliserol 1000 µl % 20 (v/v) β-merkaptoetanol 500 µl % 10 (v/v) Distile su 2000 µl - Toplam 5000 µl - a 2x örnek tamponu β-merkaptoetanol eklenmeden 1.5 ml tüpler içinde 450 ml kısımlara ayrılmış ve -20ºC de saklanmıştır. Gerektiğinde çözdürülen 450µl örnek tamponu içine 50µl β-merkaptoetanol eklenerek kullanıma hazır hale getirilmiştir. b 2x örnek tamponu antijen ile aynı oranda karıştırılınca 1x örnek tamponu (son konsantrasyon 62.5 mm Tris-Cl (ph 6.8), %2 (w/v) SDS, % 5 bromfenol mavisi, % 10 gliserol, % 5 β-merkaptoetanol) oluşmaktadır Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Örnek tamponu ile karıştırıldıktan sonra ısı bloğunda inkübe edilen antijenler % 12 lik sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jelinde ayrıştırılmıştır. Alt ve üst olmak üzere iki farklı jel hazırlanmıştır. 64

77 Alt jel hazırlanışı Bunun için öncelikle % 12 lik alt (ayrıştırıcı) jel içeriği 50 ml tüp içerisinde sırasıyla tablo 2.4. te belirtilen miktarlarda % 30 akrilamid, 0.45 µm filtreden geçirilmiş alt jel tamponu [1.5 M Tris-Cl ph: 8.8 ve % 0.4 SDS (w/v)], distile su, % 10 (w/v) amonyum persülfat, TEMED karıştırılması ile hazırlanmış ve bir transfer pipet kullanılarak hızlıca jel oluşturma için üretici firmanın (Bio-Rad) yöntemine göre hazırlanan iki cam arasına, tarak hizasının 2-3 mm aşağısına kadar aktarılmıştır. Daha sonra iki cam tabaka arasına 200 µl distile su aktarılmış ve dakika oda sıcaklığında polimerizasyonun gerçekleşmesi beklenmiştir. Tablo 2.4. Mini Protean III elektroforez sistemi için % 12 lik alt jel içeriğinin hazırlanışı a Malzemeler 1 mm cam aralığı için 0.75 mm cam aralığı için % 30 akrilamid 4.0 ml 3.2 ml Alt jel tamponu 2.5 ml 2 ml Distile su 3.5 ml 2.8 ml % 10 amonyum persülfat 50µl 40µl TEMED 10µl 8µl a iki adet jel için Üst jel hazırlanışı Alt jel polimerize olunca üst kısımdaki fazla su bir vakum cihazı veya kağıt mendil ile uzaklaştırılmıştır. Daha sonra üst (yükleme) jel içeriği 50 ml tüp içerisinde sırasıyla tablo 2.5. te belirtilen miktarlarda % 30 akrilamid, 0.45 µm filtreden geçirilmiş üst jel tamponu [0.5 M Tris-Cl ph: 6.8 ve % 0.4 SDS (w/v)], distile su, % 10 (w/v) amonyum persülfat, TEMED karıştırılması ile hazırlanmış ve bir transfer pipet kullanılarak hızlıca iki cam arası tam dolacak şekilde aktarılmıştır. Mini Protean SDS-PAGE sistemi içinde gelen taraklar [0.75 mm cam aralığı için 10 örneklik tarakta örnek yükleme çukur (çukur en derinlik boy ölçümü: 0.5 cm 65

78 0.75 mm 1 cm) hacmi 37.5 µl dir. Ortalama 25 µl örnek taşmadan kolaylıkla yüklenebilmektedir] yerleştirilmiştir. Tarak kullanılmadan aynı antijen tüm jel boyunca ayrıştırılacak ise üst jel üzerinde ortalama 0.5 cm kadar (oluşturulan boşluk en derinlik boy ölçümü: 8 cm 0.75 mm 0.5 cm olup hacmi ortalama 300 µl dir. Ortalama 250 µl örnek taşmadan kolaylıkla yüklenebilmektedir) boşluk bırakılmış ve üst jel karışımı iki cam tabaka arasına transfer pipet ile eklenmiştir. Daha sonra iki cam arasına 200 µl distile su aktarılmış ve dakika oda sıcaklığında polimerizasyonun gerçekleşmesi beklenmiştir. Tablo 2.5. Mini Protean III elektroforez sistemi için üst jel içeriğinin hazırlanışı a Malzemeler 1 mm cam aralığı için 0.75 mm cam aralığı için % 30 akrilamid 0.67 ml ml Üst jel tamponu 1.25 ml ml Distile su 3 ml 1.5 ml % 10 amonyum persülfat 25 µl 12.5 µl TEMED 5 µl 2.5 µl a iki adet jel için Jel polimerize olunca üst kısımdaki fazla su bir vakum cihazı veya kağıt mendil ile uzaklaştırılmıştır. Polimerize olan iki adet jel üretici firmanın yöntemine göre hazırlanan plastik behere yerleştirilmiş ve yürütme tamponu [62.5 mm Tris, % 0.05 SDS (w/v), 200 mm Glisin] eklenmiştir. Daha sonra protein merdiveni (7.5 µl) ve/veya örnek tamponu ile karıştırılmış antijenler (ortalama 25 µl) jele yüklenmiştir. Örneklerde bulunan proteinleri ayrıştırmak için hazırlanan jele güç kaynağı ile ortalama 20 dakika 60 volt, daha sonra 110 volt akım uygulanmıştır. Elektroforez sonunda elde edilen jellerden biri boyama solüsyonu [% 45 methanol (v/v), % 10 glasial asetik asit (v/v), % 0.1 Coomassie mavisi G-250 (w/v) distile suya eklenerek elde edilir] ile çalkalayıcı üzerinde gece boyunca mumele 66

79 edilmiştir. Jel üzerindeki fazlalık Coomassie mavisi boya çıkarıcı solüsyon [% 45 methanol (v/v), % 10 glasial asetik asit (v/v) distile suya eklenerek elde edilir] ile çalkalayıcı üzerinde gün boyunca çalkalanarak azaltılmıştır Western blot Western blot üretici firmanın yöntemine göre mini-trans blot (Bio-Rad) sistemi ile uygulanmıştır. Bunun için öncelikle polivinilidin fluoride (PVDF) transfer membranı iki dakika saf metanol ve sonrasında 10 dakika transfer tampon (25 mm Tris, 192 mm Glisin, % 20 (v/v) metanol distile suya eklenerek hazırlanır) içerisinde tutulmuştur. Daha sonra sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi sonunda proteinleri ayrıştırılmış antijen örnekleri bulunan % 12 lik jel, transfer tampon içerisinde PVDF transfer membranı ile karşı karşıya getirilmiştir. PVDF transfer membranı ve jelin, dış yüzlerine birer filtre kağıdı ve fiber tampon eklenip, jel tutucu kaset içine yerleştirilip, sıkıştırılmıştır (Şekil 2.1.). Jel tutucu kaset içinde buz soğutma ünitesi ve +4 C de tutulan transfer tampon bulunan plastik beher içerisine yerleştirilmiştir. Güç kaynağı ile jelden PVDF transfer membranına doğru 1 saat boyunca 100 volt akım uygulanmıştır. Şekil 2.1. Jel tutucu kasetin oluşturulma sırası ve yönü 8. Jel tutucu kasetin kapağı 7. Fiber tampon 6. Filtre kağıdı 5. PVDF transfer membran 4. Jel 3. Filtre kağıdı 2. Fiber tampon 1. Jel tutucu kasetin kapağı 67

80 Transfer sonrasında PVDF transfer membranı % 6.25 yağsız süt tozu içeren 1 TBS-T tamponunda (20 mm Tris-Cl ph: 7.8, 0.5 M NaCl, % 0.5 Tween 20) 30 dakika oda sıcaklığında çalkalanarak bloke edilmiştir. Bu aşamada bir falçata yardımı ile PVDF transfer membranı boylamasına parçaya bölünmüştür. Toxoplasmosis ön tanısı almış yedi grup anne ve bebeğine ait serum örnekleri (toplam 14 serum örneği) ile negatif ve pozitif kontrol serumları 1/100 oranında 1 TBS-T tamponunda sulandırılmış, ayrı membranlar ile 1.5 saat oda sıcaklığında çalkalanarak inkübe edilmiştir. Daha sonra PVDF transfer membranı 1 TBS-T tamponu ile 3 kez kısa süreli ve 3 kez de üçer dakika yıkanmıştır. Yıkama sonrası PVDF transfer membranlar, 1 TBS-T tamponunda 1/2500 oranında sulandırılmış konjuge (alkaline fosfataz işaretli anti-insan IgG antikoru) ile bir saat oda sıcaklığında çalkalanarak inkübe edilmiştir. Membran 1 TBS-T tamponu ile 3 kez kısa süreli ve 3 kez de üçer dakika boyunca yıkanmış ve daha sonra 1 TBS tamponu (20 mm Tris-Cl ph:7.8, 0.5 M NaCl) ile 3 kez kısa süreli ve 3 kez de üçer dakika daha yıkanmıştır. Blotların görüntülenmesi için 250:2:1 oranında karıştırılan Dietanolamin tampon (% 10 Dietanolamin, 4 M HCl ile ph: 9.8 ayarlanır, 0.5 mm MgCl 2 6H 2 O), % 70 (v/v) Dimetilformamid içinde çözdürülen % 4.1 (w/v) Nitro-BT ve Dimetilasetamid içinde çözdürülen % 4.3 (w/v) BCIP karıştırılarak hazırlanan solüsyon, PVDF transfer membranı üzerine eklenmiş ve karanlık ortamda 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edildikten sonra distile su ile reaksiyon durdurulmuştur İstatiksel analiz Çalışma sırasında elde edilen veriler Microsoft Excel 2003 programı ile işlemden geçirilmiş ve istatistiksel analiz Prism 3.03 programı (GraphPad, San 68

81 Diego, CA) ile gerçekleştirilmiştir. BABL/c farelerden ve HeLA Hücre lültüründen elde edilen antijenlerle hazırlanan ELISA ve IFAT testlerinin özgüllük ve duyarlılığı hesaplanmış ve karşılaştırılmıştır. ELISA testinde farklı antijenlerden elde edilen absorbans değerleri arasındaki ilişkiyi göstermek için Pearson korelasyon (correlation) analizi kullanılmıştır. Elde edilen Pearson korelasyon katsayısının (r) değerlendirilmesi Tablo 2.6. da gösterilmiştir. Antijenlere ait absorbans değerleri arasındaki farkı ortaya koyabilmek için lineer regresyon analizi [y = a (+) b denkleminde y: HeLa hücre kültürü kaynaklı antijen, : BALB/c kaynaklı antijen, a: Regresyon doğrusunun kesişim değeri (Sabit değer), b: Regresyon doğrusunun eğimi] yapılmıştır. Testler arasındaki farkları değerlendirmek için % 95 güvenlik aralığı bulunan two-tailed unpaired t testi kullanılmıştır. Aksi belirtilmediği takdirde, 0.05 ve daha küçük P değerleri anlamlı olarak yorumlanmıştır. Tablo 2.6. Pearson korelasyon katsayısının değerlendirilmesi a R değeri Yorum r = 0 İki grup arası ilişki yok 0 < r < 1 İki grup birlikte artmaya veya azalmaya meyilli r = 1 İki grup arasında tam pozitif korelasyon -1 < r < 0 İki gruptan biri artarken diğeri azalır r = -1 İki grup arasında tam negatif (ters) korelasyon a r -1 ve +1 arasında değişir 69

82 ÜÇÜNCÜ BÖLÜM BULGULAR T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin HeLa hücre kültürü ve BALB/c farelerde sürekli üretimi ile elde edilen antijenler daha önceden toxoplasmosis tanısı almış hastalara ait serum örneklerinin kullanıldığı IFAT, ELISA ve Western blot yöntemleri ile karşılaştırılmıştır. Bunun yanında HeLa hücre kültüründe sürekli üretilen T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin kriyopreservasyonu gerçekleştirilmiştir T. gondii takizoit ekimi için kültürde kullanılacak HeLa hücresi sayısının belirlenmesi Bölüm te anlatıldığı gibi üretilen HeLa hücreler sırasıyla ; ; ; ve adet olacak şekilde ekilmiştir. Flaskların inverted mikroskop ile yapılan değerlendirmesinde ve miktarda HeLa ekimi yapılan flaskların sıkışık şekilde tamamen dolu ve üst sıvı renginin koyu sarı olduğu görülmüştür ve adet HeLa hücresi ekilen flask tabanının HeLa hücreleri ile ortalama yarı yarıya dolu ve üst sıvı renginin pembe olduğu gözlenmiştir adet HeLa hücresi eklenen flaskta HeLa hücreler arasında gözlenen boşlukların, takizoit ekimi için uygun olan tama yakın doluluk oranına ulaştığı ve üst sıvı renginin de pembe olduğu dikkati çekmiştir. Bu aşamada çeşitli konsantrasyonda HeLa hücre içerecek şekilde hazırlanan flasklar bir sonraki aşama 70

83 olan HeLa hücre kültürüne T. gondii RH Ankara suşu takizoit ekimi için kullanılmıştır HeLa hücre kültüründe sürekli üretim için ekilecek T. gondii takizoit sayısının belirlenmesi HeLa hücre kültürüne T. gondii takizoit ekimi üç aşamada gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.1.). İlk aşamada farklı konsantrasyondaki HeLa hücrelerine belli konsantrasyondaki T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin etkisi incelenmiştir. Bunun için 5 adet 25-cm 2 flaska sırasıyla ; ; ; ve adet olacak şekilde HeLa hücreleri ekilmiştir. Daha sonra flaskların her birine adet T. gondii RH Ankara suşu takizoiti ekilmiştir. Flasklar 3 gün boyunca 37ºC de, % 5 CO 2 li ortamda inkübe edilmiştir. Bu süreç sonunda flaskların üst sıvılarındaki takizoit konsantrasyonu, takizoit canlılık oranı ve HeLa hücre kontaminasyonu tablo ve grafik 3.1. de gösterilmiştir. Tablo 3.1. HeLa hücre ve T. gondii RH Ankara suşu takizoit etkileşimi sonucu elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu 25-cm 2 flaska ekilen HeLa hücre sayısı HeLa / takizoit oranı Üst sıvıda Canlı Takizoit ( 10 6 /ml) a Üst sıvıda Ölü takizoit ( 10 6 /ml) a Üst sıvıda Toplam Takizoit ( 10 6 /ml) a Canlılık oranı (%) HeLa kontaminasyonu ( 10 6 /ml) a / / / / / a Optimizasyonda kullanılan 25-cm 2 flasklarda ortalama 5 ml idame besiyeri bulunmaktadır. Elde edilen takizoit veya HeLa konsantrasyonu iki flaskın ortalama değeridir. 71

84 Grafik 3.1. Farklı konsantrasyondaki HeLa hücrelerine belirli sayıdaki T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin etkisi sonunda 25-cm 2 flaskın 5 ml üst sıvısından elde edilen ortalama takizoit miktarı, canlılığı ve HeLa kontaminasyonu Hücre sayısı (x10 6 ) Flaska ekilen takizoit Canlı takizoit Ölü takizoit Toplam takizoit HeLa kontaminasyonu 0 4/1 2/1 1/1 1/2 1/4 HeLa/takizoit oranı İkinci aşamada belirli sayıdaki HeLa hücrelere farklı sayıda T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin etkisi incelenmiştir. İlk aşamada adet T. gondii takizoiti inoküle edilen adet HeLa hücresi içeren flaskta en iyi sonuç alınması sebebiyle 2 grup 4 er adet adet HeLa hücresi içeren 25-cm 2 flask hazırlanmıştır. Flask gruplarına sırasıyla , , ve adet T. gondii RH Ankara suşu takizoitleri inoküle edilmiştir. Birinci ve ikinci grup flasklar sırasıyla 2 ve 3 gün süreyle 37ºC de, % 5 CO 2 li ortamda inkübe edilmiştir. Her iki grup flaskların bu süreç sonunda üst sıvılarındaki takizoit konsantrasyonu, takizoit canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu tablo ve grafik 3.2. ile tablo ve grafik 3.3. de gösterilmiştir. 72

85 Tablo 3.2. HeLa hücre ve T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 3 günlük etkileşimi sonucu elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu 25-cm 2 flaska ekilen takizoit miktarı HeLa / takizoit oranı Üst sıvıda Canlı Takizoit ( 10 6 /ml) a Üst sıvıda Ölü takizoit ( 10 6 /ml) a Üst sıvıda Toplam Takizoit ( 10 6 /ml) a Canlılık oranı (%) HeLa kontaminasyonu ( 10 6 /ml) a / / / / a Optimizasyonda kullanılan 25-cm 2 flasklarda ortalama 5 ml idame besiyeri bulunmaktadır. Elde edilen takizoit veya HeLa konsantrasyonu iki flaskın ortalama değeridir. Grafik 3.2. HeLa Hücre kültüründe T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 3 günlük etkileşimi sonunda 25-cm 2 flaskın 5 ml üst sıvısından elde edilen ortalama takizoit miktarı, canlılığı ve HeLa kontaminasyonu Hücre sayısı (x10 6 ) Flaska ekilen takizoit Canlı takizoit Ölü takizoit Toplam takizoit HeLa kontaminasyonu 0 1/8 1/2 1/1 2/1 HeLa/takizoit oranı 73

86 Tablo 3.3. HeLa hücre ve T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 2 günlük etkileşimi sonucu elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu 25-cm 2 flaska ekilen takizoit miktarı HeLa / takizoit oranı Üst sıvıda Canlı Takizoit ( 10 6 /ml) a Üst sıvıda Ölü takizoit ( 10 6 /ml) a Üst sıvıda Toplam Takizoit ( 10 6 /ml) a Canlılık oranı (%) HeLa kontaminasyonu ( 10 6 /ml) a / / / / a Optimizasyonda kullanılan 25-cm 2 flasklarda ortalama 5 ml idame besiyeri bulunmaktadır. Elde edilen takizoit veya HeLa konsantrasyonu iki flaskın ortalama değeridir. Grafik 3.3. HeLa Hücre kültüründe T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 2 günlük etkileşimi sonunda 25-cm2 flaskın 5 ml üst sıvısından elde edilen ortalama takizoit miktarı, canlılığı ve HeLa kontaminasyonu Hücre sayısı (x10 6 ) Flaska ekilen takizoit Canlı takizoit Ölü takizoit Toplam takizoit HeLa kontaminasyonu /8 1/2 1/1 2/1 HeLa/takizoit oranı HeLa hücre ve T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 3 günlük etkileşimi sırasında en bol takizoit üretimi HeLa takizoit ekim oranı 1/1 olan flasklarda /ml olarak gerçekleşirken, takizoit canlılık oranı % 78.7 ve HeLa kontaminasyonu /ml olmuştur. Canlılık oranının % 83.3 ile en yüksek bulunduğu HeLa takizoit ekim oranı 2/1 olan flasklarda /ml takizoit üretilmiş fakat HeLa kontaminasyonu /ml olarak bulunmuştur. HeLa takizoit ekim 74

87 oranının 1/8 olduğu flasklarda üretilen /ml takizoitin canlılık oranı % 16.6 iken HeLa kontaminasyonu bu flasklarda /ml olduğu saptanmıştır. HeLa hücre ve T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 2 günlük etkileşimi sırasında bütün flasklarda canlılık oranı % 100 seviyesine çıkmış ve HeLa kontaminasyonu ise /ml arasında değişmiştir. İki günlük etkileşim sırasında en bol takizoit üretimi HeLa takizoit ekim oranının 1/8 olan flasklarda /ml olarak gerçekleşirken, bu flasklarda canlılık oranının 3 günlük etkileşime göre artarak % 100 e çıktığı ve HeLa kontaminasyonunun ise ortalama 10 kat azalarak /ml seviyesine indiği saptanmıştır. HeLa hücre ve T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin 2 ve 3 günlük etkileşimi sonucunda elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu karşılaştırıldıktan sonra 8 adet HeLa hücresi içeren 25-cm 2 flaska, HeLa/takizoit oranı 1/8 olacak şekilde T. gondii RH Ankara suşu takizoiti ekimi yapılmış ve 2 şer gün aralıklarla 4 ardışık pasaj gerçekleştirilmiştir. Flaskların üst sıvılarından elde edilen canlı ve ölü takizoit konsantrasyonları tablo ve grafik 3.4. te gösterilmiştir. Sürekli üretim sırasında 8 flaskın üst sıvısından en bol takizoit üretimi 1. pasajdan elde edilirken, üretim her pasajda giderek azalmış, canlılık oranı ilk üç pasajda % % 99.4 arasında değişmiş ve HeLa kontaminasyonu /ml arasında bulunmuştur. Buna karşın 4. pasajda üretimin daha da düşmesi yanında canlılık oranının aniden % 70 seviyesine inmesi ve HeLa kontaminasyunun da /ml seviyesine çıkması ile pasaj sonlandırılmıştır. Elde edilen takizoitler serolojik testlerde antijen olarak kullanılmıştır. 75

88 Tablo 3.4. HeLa hücre/takizoit oranının 1/8 olduğu ortamda 2 gün aralıkla sürekli T. gondii üretimi sonucu elde edilen takizoit miktarı, canlılık oranı ve HeLa kontaminasyonu 25-cm 2 flaska ekilen takizoit miktarı ( 10 6 ) Üst sıvıda canlı takizoit ( 10 6 /ml) a Üst sıvıda ölü takizoit ( 10 6 /ml) a Üst sıvıda toplam takizoit ( 10 6 /ml) a Canlılık oranı (%) HeLa kontaminasyon ( 10 6 /ml) a 1. pasaj pasaj pasaj pasaj a Optimizasyonda kullanılan 25-cm 2 flasklarda ortalama 5 ml idame besiyeri bulunmaktadır. Elde edilen takizoit ve HeLa konsantrasyonu 8 flaskın ortalama değeridir. Grafik 3.4. HeLa hücre/takizoit oranının 1/8 olduğu ortamda 2 gün aralıkla sürekli T. gondii takizoit üretimi sırasında sekiz adet 25-cm 2 flaskın ortalama 40 ml üst sıvısından elde edilen takizoit miktarı, canlılığı ve HeLa kontaminasyonu Hücre sayısı (x10 6 ) Flaska ekilen takizoit Canlı takizoit Ölü takizoit Toplam takizoit HeLa kontaminasyonu Pasaj sayısı 76

89 A B C D Şekil 3.1. T. gondii takizoitlerinin HeLa hücre kültüründe üretimi (A) 25-cm 2 flaskın x 20 büyütmedeki görünümü, (B-D) 25-cm 2 flaskın x 40 büyütmede çeşitli görünümleri 3.3. HeLa hücre kültüründe üretilen T. gondii takizoit kriyopreservasyonu Kriyopreservasyon adet HeLa hücresine adet canlı T. gondii takizoiti eklendikten sonra ortalama 30 saat inkübe edilen 25-cm 2 flasklarda gerçekleştirilmiştir. T. gondii RH Ankara takizoitleri ile işgal edilmiş ve patlamaya hazır HeLa hücreleri % 4 trypsin ile flask tabanından ayrıştırılmış ve kriyopreservasyon solüsyonu ile karıştırılıp kriyo tüplerde dondurulmuştur. Çalışma sırasında gerektiğinde donmuş T. gondii RH Ankara suşu takizoitleri içeren HeLa 77

90 hücreler çözdürülerek HeLa hücreleri enfekte etmede ve BALB/c farelerde toxoplasmosis oluşturulmasında başarı ile kullanılmıştır Serolojik testler Serolojik testler sırasında IFAT, ELISA ve Western blot yöntemi kullanılarak BALB/c farelerde ve HeLa hücre kültüründe iki gün aralıklarla sürekli üretilen T. gondii RH Ankara suşu takizoit kaynaklı tam ve eriyik antijenler karşılaştırılmıştır. Antijen kaliteleri IFAT ve ELISA yöntemleri kullanılarak serum örneklerinde bilinen anti-toxoplasma IgG antikorlarıyla değerlendirilmiştir. Fare ve hücre kültürü antijenlerinin Western blot yöntemi ile daha önceden toxoplasmosis tanısı almış anne ve bebeklerine ait serum örneklerinde anti-toxoplasma IgG antikorlarının bant paternleri karşılaştırılmıştır İndirek floresan antikor testi (IFAT) HeLa hücre kültüründe iki gün aralıkla 4 ardışık pasajdan ve BALB/c fareden elde edilen T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinden tam antijenler üretilmiş ve beş grup teflon kaplı lama bölüm te anlatıldığı gibi yayılmıştır. IFAT ile daha önceden toxoplasmosis tanısı almış 30 seropozitif ve 7 seronegatif hastaya ait serum örneklerinde anti-toxoplasma IgG antikorları araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar tablo 3.5. te gösterilmiştir. HeLa hücre kültürüne T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin iki gün aralıkla ekiminden elde edilen 1., 2., 3. ve 4. pasaj kaynaklı antijenlerin duyarlılıkları sırasıyla % 90 (27/30), % 73.3 (22/30), % 40 (12/30), % 30 (9/30) ve her bir antijenin özgüllüğünün % 100 olduğu saptanmıştır. 78

91 Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) BALB/c fareden ve HeLa hücre kültüründe iki gün aralıkla 4 ardışık ekimden elde edilen T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinden üretilen eriyik antijenler ELISA testinde anti-toxoplasma IgG antikorları araştırılması için kullanılmıştır. ELISA sırasında eşit miktarda takizoit içeren plak çukurlarına daha önceden toxoplasmosis tanısı almış 30 seropozitif ve 7 seronegatif hastaya ait serum örnekleri eklenerek elde edilen absorbans değerleri tablo 3.5. te gösterilmiştir. HeLa hücre kültürüne T. gondii RH Ankara suşu takizoitlerinin iki gün aralıkla ekiminden elde edilen 1., 2., 3. ve 4. pasaj kaynaklı eriyik antijenlerin duyarlılıkları sırasıyla % 100 (30/30), % 76.6 (23/30), % 40 (12/30), % 10 (3/30) ve her bir antijenin özgüllüğünün % 100 olduğu saptanmıştır. 79

92 Tablo 3.5. HeLa hücre kültüründe iki gün aralıkla 4 ardışık pasajdan ve BALB/c fareden elde edilen antijenler ile gerçekleştirilen IFAT IgG ve ELISA IgG sonuçları BALB/c 1. pasaj 2. pasaj 3. pasaj 4. pasaj ELISA IFAT ELISA IFAT ELISA IFAT ELISA IFAT ELISA IFAT N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 256 N N N N N N 16 N N N N N 64 N 16 N N N N N N N N N N N N N 16 N N N N N N N N N N N 256 N N N N 16 N N N N N 16 N N N N N N N 16 N N 16 N N N N 256 N N N N N N N 256 N N N N N N N N N 64 N N N N N N 256 N N N 30 seropozitif ve 7 seronegatif hastanın serum örnekleri 1:16, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024 oranında sulandırılmıştır. 80

93 2500 y = x (+) r : y = x (+) r : HeLa 1. pasaj kaynakli antijen HeLa 2. pasaj kaynakli antijen BALB/c fare kaynakli antijen BALB/c fare kaynakli antijen 2500 y = x (+) r : y = x (+) r : HeLa 3. pasaj kaynakli antijen HeLa 4. pasaj kaynakli antijen BALB/c fare kaynakli antijen BALB/c fare kaynakli antijen Grafik 3.5. HeLa hücre kültüründe iki gün aralıkla 4 ardışık pasajdan ve BALB/c fareden elde edilen antijenler ile gerçekleştirilen ELISA IgG absorbans değerlerinin Pearson korelasyon ve regresyon analizi BALB/c fare ve iki gün aralıkla 4 ardışık HeLa hücre kültüründen elde edilen antijenlerle gerçekleştirilen ELISA IgG testi absorbans değerleri arasındaki ilişkiyi saptamak için korelasyon analizi uygulanmıştır. Buna göre 1., 2., 3. ve 4. pasajdan elde edilen antijenlerin BALB/c fare kaynaklı antijenle pozitif yönlü doğrusal ilişkisi olduğunu gösteren Pearson korelasyon katsayısı (r) sırasıyla r = (P<0.0001), r = (P<0.0001), r = (P<0.0001) ve r = (P<0.0001) bulunmuştur. Pozitif yönlü doğrusal ilişki kurulan BALB/c fare ve HeLa hücre kaynaklı antijenler arasındaki farkı ortaya koymak için lineer regresyon analizi 81

94 yapılmıştır. Buna göre BALB/c fare antijeni (bağımsız değişken; ) ile 1., 2., 3. ve 4. pasajdan elde edilen antijenler (bağımlı değişken; y) arasındaki fark sırasıyla y = (+) 34.01, y = (+) 26.96, y = (+) 60.70, y = (+) bulunmuştur. Bu sonuçlara göre BALB/c fare antijenine ait absorbans değerleri ile en uyumlu ve arasında en az fark olan, bunun yanında duyarlılık ve özgüllüğü en yüksek olan HeLa hücre kültürü kaynaklı antijenin, birinci pasajdan elde edildiği saptanmıştır (Grafik 3.5.) Western blot Western blot yöntemi ile öncelikle BALB/c fare ve HeLa hücre kültüründe iki gün aralıkla 4 ardışık ekimi yapılan T. gondii RH Ankara suşu takizoiti kaynaklı eriyik antijenler kalitatif (nitel; qualitative) yönden karşılaştırılmıştır. Eşit miktarda takizoit içeren antijenler toxoplasmosis pozitif kontrol serum havuzu ile karşılaştırıldığında antijenler ile anti-toxoplasma IgG antikorlarının oluşturduğu bant paternleri şekil 3.1. da gösterilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre BALB/c fare kaynaklı antijen bant paternine kalitatif olarak en yakın HeLa hücre kültürü kaynaklı antijenin, 1. pasajdan elde edildiği saptanmıştır. 82

95 (A) (B) kda 37.1 kda 25.9 kda 19.4 kda 25.9 kda 19.4 kda Şekil 3.2. BALB/c fare ve iki gün aralıkla 4 ardışık HeLa hücre kültürü pasajından elde edilen antijenlerin A) SDS-PAGE ve B) Western blot yöntemi ile karşılaştırılması. 1. sütun: Protein merdiveni; 2. sütun: BALB/c fare den elde edilen antijen; 3. sütun: 1. pasaj dan elde edilen antijen; 4. sütun 2. pasajdan elde edilen antijen; 5. sütun: 3. pasaj dan elde edilen antijen; 6. sütun: 4. pasaj dan elde edilen antijen. Western blot yöntemi sırasında BALB/c fare ve HeLa hücre kültürü 1. pasaj kaynaklı eşit miktarda T. gondii RH Ankara suşu takizoiti içeren antijenler kullanılarak toxoplasmosis ön tanısı almış yedi grup anne ve bebeğine ait serum örneklerinde (toplam 14 serum örneği) anti-toxoplasma IgG antikorları araştırılmış ve oluşan bant paternleri karşılaştırılmıştır. HeLa hücre kültüründe sürekli üretim sırasında takizoit miktarının giderek azalması sebebiyle (Tablo 3.4.) anne ve bebek serum örneklerinde 2., 3. ve 4. pasajlardan elde edilen antijenlerle Western blot çalışması yapılmamıştır. Western blot sonuçları BALB/c fare ve HeLa hücre kültürü 1. pasaj kaynaklı antijenler 1., 2., 3., 4. ve 5. grup anne ve bebek serumlarında anti-toxoplasma IgG antikorlarının benzer bant paterni vermesi, antikor kaynağının anne olduğunu göstermiştir. Her iki antijen 6. ve 7. grup anne ve bebek serum örneklerinde farklı bant paterni vermiştir. 6. ve 7. gruptaki anneler seronegatif olduğu için bebeklerde 83

96 saptanan bant paterninin kaynağının anne kaynaklı antikorlar olmadığı düşünülmüştür (Şekil 3.2.). Ayrıca Western blot yönteminde kullanılan pozitif kontrol, 7 grup anne ve bebeklerine ait anti-toxoplasma IgG antikorların oluşturduğu bant paternlerinin BALB/c fare kaynaklı antijende, HeLa hücre kaynaklı antijene göre kalitatif olarak daha belirgin olduğu gözlenmiştir (Şekil 3.2.). (A) (B) B A B A B A B A B A B A B A N P B A B A B A B A B A B A B A N P Şekil 3.3. BALB/c fare (A) ve HeLa hücre kültürü 1. pasaj kaynaklı (B) eşit miktarda T. gondii RH Ankara suşu takizoiti içeren antijenler kullanılarak toxoplasmosis ön tanısı almış yedi grup anne ve bebeğine ait serum örneklerinde anti-toxoplasma IgG antikorları araştırılması ve oluşan bant paternlerinin karşılaştırılması. B: bebek; A: anne; N: negatif; P: pozitif. 84