ATLARIN RHODOCOCCUS EQUI İNFEKSİYONUNDA BULAŞMA KAYNAĞININ VE İZOLATLARIN PATOJENİTESİNİN ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ATLARIN RHODOCOCCUS EQUI İNFEKSİYONUNDA BULAŞMA KAYNAĞININ VE İZOLATLARIN PATOJENİTESİNİN ARAŞTIRILMASI Mehmet Ali KANAT MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Prof.Dr. Ömer M. ESENDAL 2006-ANKARA

2 ii

3 İÇİNDEKİLER iii Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Çizelgeler ii iii v vi 1. GİRİŞ Tarihçe Etiyoloji Epidemiyoloji Patogenezis Klinik Belirtiler Tanı Klinik Tanı Nekropsi Bulguları Laboratuar Muayeneleri Bakteriyoskopi Kültür Hayvan Deneyi Seroloji Sağaltım Koruma GEREÇ VE YÖNTEM Örneklerin Toplanması Besiyerleri ve Test Ortamları İndikatör Maddeler ve Ayıraçlar Deney Hayvanları İzolasyon Çalışmaları 23

4 iv 2.6. İdentifikasyon Çalışmaları Fare Patojenite Testi BULGULAR İzolasyon Sonuçları İdentifikasyon Sonuçları Fare Patojenite Sonuçları TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER 37 ÖZET 38 SUMMARY 39 KAYNAKLAR 40 ÖZGEÇMİŞ 47

5 ÖNSÖZ v Sanayi devriminden önce, gerek tarımsal amaçlı gerekse askeri kuvvetlerin ihtiyacı açısından at önemliydi. Günümüzde de atlar sportif amaçlı kullanılmaları nedeni ile önemini hala korumaktadırlar. Özellikle, sportif amaçlı kullanılan atların piyasa değerinin oldukça yüksek olması at sağlığına verilen önemi arttırmaktadır. Ayrıca, insan ve hayvan sağlığında geniş bir kullanım alanı olan hiperimmun serumların (yılan antivenomu, akrep antivenomu, tetanos antitoksini, gazlı kangren antitoksini, vs.) üretiminde bünyesel yatkınlığı ve yüksek kan volümü nedeniyle at, dünyada yaygın bir şekilde hala kullanılmaktadır. Bu nedenlerden dolayı atlarda verim düşüklüğüne ve ölümlere neden olabilecek infeksiyonların araştırılıp gerekli önlemlerin alınması gerek insan ve hayvan sağlığı gerekse ekonomik açıdan önemlidir. Dünyadaki at popülasyonunun korunması ve devamı açısından tay ölümleri de önemli bir sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. Taylarda ölümlere neden olan birçok etkenler vardır, bunlardan birisi de Rhodococcus equi infeksiyonudur. Özellikle, at çiftliklerindeki toprak ve atların dışkı örneklerinden patojen Rhodococcus equi yaygınlığının ortaya konulması at yetiştiriciliğinin geleceği açısından çok önemlidir. Bu infeksiyonda bulaşma kaynaklarının araştırılması ve gerekli önlemlerin alınması önemlidir. Bu çalışmada, potansiyel bulaşma kaynağı olan at dışkıları ve atların yaşama alanlarındaki topraklardan etken izolasyonlarını yaparak bu izolatların patojenitelerinin araştırılması başlıca amaç olarak ele alınmıştır.

6 ÇİZELGELER vi Çizelge 1. At çiftliklerinde Rhodococcus equi infeksiyonunun görülme 5 sıklığı ile buralardan izole edilmiş olan R. equi suşlarının patojenite oranları arasındaki ilişki. Çizelge 2. Dışkı örnekleri alınan atların yaşları, cinsiyetleri ve sayıları. 16 Çizelge 3. Padok numaraları ve bunların her birinden alınan toprak 16 örneği sayısı. Çizelge 4. Rhodococcus equi nin genel karekterleri. 17 Çizelge 5. Dışkı örneklerinden R. equi izolasyonu yapılan atların 28 cinsiyetleri ve yaşları. Çizelge 6. Toprak örneklerinden izole edilen R. equi izolatlarının 29 padoklara göre dağılımı. Çizelge 7. İzole edilmiş olan R. equi izolatlarının identifikasyonunda 30 kullanılan testler ve sonuçları. Çizelge 8. Fare patojenite testi sonuçları. 31

7 1-GİRİŞ 1 Rhodococcus equi 1-6 aylık taylarda kronik purulent pnömoni, ülseratif enterokolitis, purulent lenfadenitis, aseptik polisynovitis, septik artritis, osteomyelitis, yaygın deri altı apseleri, selülitis (Zink ve ark., 1986), endoftalmitis (Hillman ve ark., 1989) ve nefritis ile birlikte, hepatik ve renal apselere (Barton ve Hughes, 1980) neden olan Gram pozitif bir kokobasildir. Etken aynı zamanda immun sistemi zayıflamış insanlarda letal pnömonilere de neden olmaktadır (Lasky ve ark., 1991, Harvey ve Sunstrum, 1991, Drancourt ve ark., 1992). Sadece Amerika da tay ölümlerinin % 3 üne bu etkenin neden olduğu bildirilmiştir (Madigan ve ark., 1991). 1.1-Tarihçe Mikroorganizma ilk kez Magnusson tarafından 1923 yılında suppuratif pnömonili taylardan izole edilmiş ve Corynebacterium equi olarak isimlendirilmiştir (Barton ve Hughes, 1980). Lütje 1923 yılında aynı etkeni suppuratif pnömonili taylardan izole etmiş ve etkenin Corynebacterium pyogenes equi roseum olarak isimlendirilmesi gerektiğini ileri sürmüştür (Barton ve Hughes, 1980). Jensen 1934 ve daha sonra Krasil nikov 1966 yılında mikroorganizmanın Mycobacterium genusu üyelerine benzediğini belirleyerek etkenin Mycobacterium equi olarak isimlendirilmesi gerektiğini bildirmişlerdir (Barton ve Hughes, 1980). Holth ve Amundsen tarafından 1936 yılında organizmanın domuzlarda da hastalık yaptığı anlaşılınca, Plum 1940 yılında mikroorganizmanın Corynebacterium Magnusson-Holth olarak isimlendirilmesi gerektiğini öne sürmüştür (Barton ve Hughes, 1980). Holtman 1945 yılında kronik pnömonili bir buzağıdan izole ettiği mikroorganizmanın Magnusson tarafından 1923 yılında tanımlanan mikroorganizma ile benzer olduğunu saptamış ve konakçıya bağlı kalmaksızın etken tarafından infeksiyonun oluşturulduğunu belirtmek için Cornyebacterium purulentus ismini önermiştir (Barton ve Hughes, 1980).

8 2 Bousfield ve Goodfellow (1976) etken isimlendirilmesi ile ilgili tarihsel gelişimi gözden geçirmiş ve o zamana kadar yapılan çalışmaları özetleyerek, bir tanesi Rhodococcus equi olacak şekilde 10 tür içeren Rhodococcus genusunu yeni bir genus olarak açıkça ifade etmişlerdir (Goodfellow ve Alderson, 1977). Rhodococcus cinsi mikroorganizmalar Actinobacteria sınıfı, Actinomycetales takımı, Nocardiaceae familyasında sınıflandırılmışlardır (Goodfellow, 1987; Bell ve ark.,1998, Paracıkoğlu, 2006). 1.2-Etiyoloji Rhodococcus equi Gram pozitif boyanma özelliğinde olmasına karşın eskimiş kültürlerde Gram negatif olarak da boyanabilen, pleomorfik bir bakteridir. Etken irin içinde ve katı besiyerlerinde oval veya kokoid, sıvı besiyerlerinde ise uzun çomak şeklinde görülebilir (Rogosa ve ark. 1974; Barton ve Hughes, 1980). Etken katı besiyerlerinden hazırlanan boyalı preparatlarda V, X, Z harfleri şeklinde diziler veya kümeler şekilde, sıvı besiyerlerinden hazırlanan preparatlarda ise flamentöz formda görülebilir (Dafaala ve ark., 1960). Etken yaklaşık 0,5 1 x 1 2 µm boyutlarında, aerobik, hareketsiz, sporsuz ve kapsüllüdür. Optimal olarak C ler arasında üreme yeteneğine sahiptir (Goodfellow ve Alderson, 1977). Glukoz maya özeti agarda kenarları düzgün, portakal renginden kırmızıya kadar değişebilen S tipli koloniler meydana getirir. Trypticase soy agarda 30 C de saatlik inkübasyondan sonra 2 mm büyüklüğünde parlak mukoid ve S tipli koloniler oluşturur (Barton ve Hughes, 1980). Kanlı agarda ise 37 C de saat içinde nonhemolitik, krema benzeri görünümde, nemli, parlak ve pembe renkli mukoid koloniler meydana getirir. Selektif bir besiyeri olan, nalidiksik asit-novabiosin, siklohekzimid-potasyum tellürit (NANAT) ta ise aerobik ortamda 37 C de saat içinde gri renkte, mukoid, değişik boylarda, nemli, parlak, birleşmekte meyilli koloniler oluşturur (Woolcock ve ark., 1979; Takai ve Tsubaki, 1985). R. equi sıvı besiyerlerinde kolay üreyerek, yaygın bulanıklık, dipte tortu ve yüzeyde granüllü bir görüntü meydana getirir (Barton ve Hughes, 1980).

9 3 Rhodococcus equi biyokimyasal aktivitesi zayıf bir mikroorganizmadır. Karbonhidratları fermente etmez, jelatinaz, H 2 S, oksidaz testleri negatiftir. Buna karşın üreaz, nitrat redüksiyon ve katalaz testleri pozitiftir (Rogosa ve ark., 1974; Barton ve Hughes, 1980; Mutimer ve Woolcock, 1981; Takai ve ark., 1986). Rhodococcus equi, % 0,5 lik formaldehite, güneş ışınlarına ve kuruluğa karşı dirençlidir. Etken aynı zamanda 60 C de ve % 2,5 luk oksalik asitte 1 saat canlılığını koruyabilir, 80 C de 10 dakika içinde ölür. Kontamine marazi maddelerden yapılacak izolasyonlarda etkenin bu özelliklerinden de faydalanılır. R. equi basit bir sıvı besiyerinde şayet yılda birkaç kez pasajlanır ise 15 yıl veya daha fazla bir süre, pasajlanmadığı takdirde ise ancak birkaç yıl patojenitesini koruyabilir (Barton ve Hughes, 1980). Nakazawa ve ark. (1983) aglütinasyon testi ile R. equi nin 27 adet serotipi olduğunu göstermişlerdir. Prescott (1981a) ise, değişik türlerden (at, domuz, insan, kedi, köpek ve inek) elde edilmiş izolatlar üzerinde yaptığı çalışmada R. equi nin 7 kapsüler serotipi olduğunu, serotiplerin dağılımının izolatların orijinine bağlı olduğunu fakat serotipler ile virulens arasında herhangi bir ilişki olmadığını ortaya koymuştur. 1.3-Epidemiyoloji Rhodococcus equi toprakta yaygın olarak bulunur ve infeksiyonun en önemli bulaşma kaynağı topraktır (Jubb ve Kennedy, 1970) ve parklardan, bahçelerden ve meralardan rahatlıkla izole edilebilir (Takai ve ark., 1986; Takai ve ark., 1996). Woolcock ve ark. (1979) R. equi için selektif bir besiyeri olan nalidiksik asitnovabiosin, siklohekzimid-potasyum tellürit (NANAT) ı formüle etmişlerdir. Bu besiyeri etkenin topraktan ve dışkıdan sorunsuz bir şekilde izolasyonuna büyük katkı sağlamıştır. Etken at ve tay dışkılarında ve ayrıca at yetiştiriciliği yapılan bölgelerdeki topraklardan kolaylıkla izole edilebilmektedir (Woolcock ve ark., 1980; Barton ve Hughes, 1984; Prescott, 1987).

10 4 Rhodococcus equi infekte atlar tarafından çayır ve meralara bırakılan dışkılarda kolayca üreyebilir ve bu odaklar infeksiyonun en önemli kaynağını oluştururlar (Barton ve Hughes, 1984). At çiftliklerinde bulunan padokların uzun süre kullanılması da etkenin yoğun bir şekilde üremesine neden olarak bulaşmayı arttırmaktadır (Prescott ve ark., 1984). R. equi yüzeysel topraklarda rahatlıkla üreyebildiği halde toprak yüzeyinin 30 cm altında veya daha derin bölgelerde üreyemez. Toprakta etkenin üremesinde ısı ve nem önemli rol oynamaktadır. At ve toprak arasındaki siklus etkenin üremesi üzerinde olumlu bir etki yapmaktadır (Barton ve Hughes, 1984; Takai ve ark., 1986). Etken ile kontamine olmuş topraktan 1 yıl sonra bile izolasyon yapılabilir (Barton ve Hughes, 1980). Kuru ve rüzgarlı hava koşullarında at tavlalarının havasından etken yoğun bir şekilde izole edilebilir (Takai ve ark., 1987). Hastalığın prevelansı tozlu çevrelerde ve kuru havalarda artış gösterir (Falcon ve ark., 1985). Rhodococcus equi yetişkin atların dışkılarından değişik oranlarda izole edilebilir (Debey ve Bailie, 1987; Takai ve ark., 1986). İzole edilen bakteri yoğunluğu ise bakteri/gram dır. Bir aylığa kadar olan tay dışkılarından izole edilen bakteri yoğunluğu ise bakteri/gram dır. Tay dışkısındaki bu bakteri yoğunluğu 8 10 haftalık oluncaya kadar devam eder. Bu dönemlerde taylar hastalığa yakalanmaya oldukça duyarlıdırlar. Tay dışkısındaki bakteri yoğunluğu daha sonra yetişkin atların dışkısındaki bakteri yoğunluğana düşer. Dışkılarında yoğun bir şekilde ( bakteri/gram) R. equi çıkaran taylar ise hasta olarak değerlendirilirler. Bu şekilde yoğun şekilde bakteri içeren tay dışkıları çevre kontaminasyonunda büyük bir rol oynarlar ve spasyal olarak infeksiyon kaynağının genişlemesine neden olurlar (Takai ve ark., 1986). Rhodococcus equi konakçı vücuduna solunum ve sindirim sisteminden girer (Johnson ve ark., 1983; Yager, 1987). Taylarda ise en temel giriş yolu, genellikle, solunum sistemidir. Klinik R. equi infeksiyonuna diğer türlerde nadir olarak rastlanır (Barton ve Hughes, 1980; Prescott, 1991).

11 Rhodococcus equi infeksiyonu taylarda, genellikle, sporadik olarak görülür ve olguların çoğunda subklinik bir seyir izler (Zink ve ark., 1986). 5 Rhodococcus equi infeksiyonlarının en önemli özelliği yaşa bağlı olması ve konakçı spesifitesi göstermesidir. Üç aylıktan küçük tayların infeksiyona daha duyarlı olması; maternal antikorların kaybolması ve immun sistemin tam olarak gelişmemiş olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Viral infeksiyonlar ve paraziter infestasyonlar da hastalığın konakçıya yerleşmesini kolaylaştırmaktadır (Hillidge, 1986; Freestone ve ark., 1989; Prescott, 1991). Rhodococcus equi infeksiyonunun karakteristik özelliklerinden biri de at çiftliklerinin bir kısmın da sporadik, bir kısmında endemik ve büyük bir bölümünde ise görülmemesidir (Prescott, 1987). 5 At çiftliklerindeki Rhodococcus equi infeksiyonunun, at barınaklarındaki virulent R. equi kontaminasyonunun yoğunluğu ile doğru orantılı olduğu tespit edilmiştir (Takai ve ark., 1991b), (Çizelge 1.). Çizelge 1. At çiftliklerinde Rhodococcus equi infeksiyonunun görülme sıklığı ile buralarda izole edilmiş olan R. equi suşlarının patojenite oranları arasındaki ilişki (Takai, 1991b). İnfeksiyonun görülme Sıklığı Endemik Sporadik Görülmeyen R. equi kontaminasyonu Toprak ve dışkı izolatlarının patojenite prevalansı Yüksek >20% Orta 5 10% Düşük <5% 1.4-Patogenezis Rhodococcus equi nin virulens faktörlerini ortaya koymak için birçok çalışma yapılmıştır. Farelerde yürütülen deneysel infeksiyon çalışmaları sonucunda bakterinin değişik virulens faktörlerine sahip olduğu gösterilmiştir (Bowles ve ark.,

12 6 1987; Nakazawa ve ark., 1983; Takai ve ark., 1991a). Rhodococcus equi nin hücre duvarında bulunan glikolipidler, kapsüler antijenler ve equi faktörlerin bütün R. equi suşlarında bulunur. Bu komponentlerin virulens üzerine etkilerinin bulunmadığı ortaya konulmuştur (Chirino-Trejo ve ark., 1987; Gotoh ve ark., 1991). R.equi nin kapsüler antijenleri fagozom ile lizozomun birleşmesini engellemektedir. Ancak yapılan rutenyum boyaması ile izolatların kapsüler antijenleri arasında kantitatif bir farklılık görülmemiştir (Woolcock ve Mutimer, 1978). Equi faktörler (kolesterol oksidaz ve fosfolipaz-c) R. equi nin sentezlediği ekzoenzimlerdir ve yüksek bir antijeniteye sahiptir (Machang u ve Prescott, 1991). R. equi nin equi faktörleri ile Staphylococcus aureus un β-toksininin etkileşmesi sonucu equi faktörler koyun, at ve sığır eritrositlerini lize ederler (CAMP testi). R. equi nin identifikasyonunda bu özellik önemli bir kriterdir (Prescott ve ark., 1982). Rhodococcus equi nin patojenitesi fagositoza ve fare makrofajlarında intrasellüler öldürmeye karşı dirençli olması ile ilişkilidir (Mutimer ve Woolcock, 1980). Rhodococcus equi intrasellüler bir bakteri olduğu için infeksiyonda hücresel immünite büyük rol oynar (Prescott ve ark., 1979). Deneysel olarak infekte edilmiş olan tayların alveolar makrofajlarının yetişkin atlarınki kadar aktive oldukları görülmüştür (Hietala ve Ardans, 1987). Magnusson tarafından 1923 yılında pnömonili taylardan izole edilen ve birçok kez pasajlanmış olan R. equi ATCC 6939 suşu, taylarda deneysel infeksiyon oluşturmamıştır. Bunun nedeni olarak etkenin birçok kez pasajlanmasına bağlı olarak 85 kb lik plazmidini kaybedip kda luk antijenleri sentezleyememesinden kaynaklandığı tespit edilmiştir (Takai ve ark., 1991a; 1991b; Tan ve ark., 1995). Rhodococcus equi 38 C de sürekli pasajlandığı takdirde 85 kb lik plazmidini kaybetmiş mutantlar elde edilmektedir. Elde edilen mutantların kda luk antijenleri sentezleyemediği ve fare patojenite testinde farelerde ölüm meydana getirmediği görülmüştür (Takai ve ark., 1991a; Sekizaki ve ark., 1995).

13 7 Plazmidini kaybetmiş apatojen R. equi suşlarının üreme hızlarının 38 C de, patojen olan plazmidli suşlara göre daha fazla olduğu ve 37 C deki üreme hızlarında ise herhangi bir fark olmadığı ortaya konmuştur (Takai ve ark., 1994). Rhodococcus equi nin patojenitesinin tespitinde fare patojenite testi ( Takai ve ark., 1991a; 1991b, Takai ve ark., 1993) önemlidir. Plazmide sahip ve kda luk antijenleri sentezleyen izolatların 5x10 6 bakteri içeren süspansiyonlarının (0,2 ml) enjekte edildiği farelerde ölüm şekillenirken, plazmide sahip olmayan ve kda luk antijenleri sentezleyemeyen izolatların böyle bir özelliklerinin olmadığı tespit edilmiştir (Takai ve ark., 1991a; 1991b, Takai ve ark., 1993, Takai ve ark., 1994). Rhodococcus equi nin patojenitesi ile ilişkili kda luk antijenlerin sentezlenmesinde, ısı ve ph olmak üzere iki çevre faktörünün etkili olduğu, 85 kb lik plazmidi taşıyan izolatların kda luk antijenleri C de bol miktarlarda sentezlemelerine rağmen C lerde ise sentezleyemedikleri, antijen sentezinin en fazla olduğu inkübasyon şartlarının ise 37 C ve ph 6,5 olduğu, şayet ortam ısısı 37 C de tutulup ph 8 e çıkarılırsa yine antijen sentezinin gerçekleşmediği tespit edilmiştir (Takai ve ark., 1992). Patojenite ile ilgili kda luk antijenlerin tripsinin proteolitik etkisine duyarlı olduğu ve bakterinin hücre yüzeyinde sentezlendiği ifade edilmiştir (Takai ve ark., 1991c; Takai ve ark., 1992). Rhodococcus equi fakültatif intrasellüler bir patojendir ve makrofajların içinde canlılıklarını sürdürerek çoğalabilirler (Hondalus ve Mosser, 1994). Etkenin hücre içinde yaşamasında ve granülomatöz lezyonlar oluşturmasında bünyesinde barındırdığı mycolik asit içeriğinin ve tipinin önemi çok fazladır (Gotoh ve ark., 1991). Etkenin oluşturduğu lezyonlarda mononükleer hücre infiltrasyonu ve dev hücreleri görülebilir (Dafaala ve ark., 1960). Domuzların servikal lenf bezlerinde meydana gelen lezyonlar tüberküloz lezyonlarına benzemektedir (Barton ve Hughes, 1980)

14 1.5-Klinik Belirtiler 8 Konakçının bağışıklık durumu, infeksiyonun bulaşma yolu, vücuda giren etken sayısı, infeksiyon süresi ve tedaviye başlanma zamanı infeksiyonda görülen semptomları ve hastalığın seyrini etkileyen önemli faktörler arasında yer almaktadır (Yager, 1987). Hastalık genellikle; -Bronkopnömoni -İntestinal form -Aseptik polisinovitis -Septik artritis ve osteomiyelitis ve -Karışık form Olmak üzere beş tipte klinik seyir gösterir (Giguere ve Prescott, 1997). Taylarda en sık görülen klinik seyir tipi, yaygın apse oluşumu ve suppuratif lenfadenitis ile birlikte seyreden kronik suppuratif pnömonidir (Zink ve ark., 1986). Akciğer tahribatının yavaş ilerlemesi ve bazı tayların bunu rahatlıkla atlatabilmelerinden dolayı hastalığın erken klinik teşhisi oldukça zordur. Erken dönemdeki semptomlar; solunum sayısında ve vücut ısısında meydana gelen hafif bir artıştır. Bu semptomlar, genellikle, fark edilemediğinden hastalık rahatlıkla ilerler ve kronikleşen hastalık akut bir hastalıkmış gibi yanılgıya düşülebilir. İnfeksiyonun ilerlemesinden sonra tayda; iştahsızlık, halsizlik, ateş, solunum sayısında artış, solunum güçlüğü (karın kasları solunuma katılır) gibi semptomlar görülür (Giguere ve Prescott, 1997). Kondüsyonu iyi olan taylarda kilo kaybı hastalık ilerledikçe fark edilir. Bazı taylarda aniden ortaya çıkan şiddetli halsizlik, akut solunum bozukluğu ve yüksek ateş gibi semptomlar görülebilir. Bu tip olgular sağaltım uygulansa dahi, genellikle, ölümle sonuçlanır. (Martens ve ark., 1982; Zink ve ark., 1986; Takai ve ark., 1995).

15 Hastalığın intestinal formunda; ateş, depresyon, iştahsızlık, kilo kaybı, kolik ve diyare gibi semptomlar görülür (Zink ve ark. 1986; Baldwin ve ark., 1992). 9 Akciğerlerin dinlenmesi halinde ıslık seslerine benzer yaş raller duyulur ve solunum hırıltılıdır. Bu patolojik akciğer sesleri hayvanın ölüme kadar devam eder ve şiddeti infeksiyonun şiddeti ile orantılı olarak artış gösterir (Bain, 1963; Zink ve ark., 1986). Plevral effüzyon, periferal apse durumlarında ve ilerlemiş konsolidasyon bölgelerinde akciğer sesleri duyulmayabilir (Falcon ve ark., 1985). Akciğerlerin iyi bir şekilde dinlenebilmesi için tayın ağız ve burnunun bir torba ile kapatılarak solunumun hızlandırılması gerekebilir, fakat solunum güçlüğü çeken hayvanlarda bu yapılmamalıdır. Apseli bölgeler, konsolidasyonlu bölgeler ve plevral effüzyonlu bölgeleri tespit etmek amacıyla perküsyon yöntemi ile de muayene yapılmalıdır (Giguere ve Prescott, 1997). Rhodococcus equi infeksiyonuna yakalanmış pnömonili tayların yaklaşık yarısında intestinal bulgulara da rastlanılabilir. Ancak bu taylar solunum sistemi ile ilgili klinik semptomlar göstermelerine rağmen intestinal bulgular ile ilgili semptomlar göstermeyebilirler. İntestinal lezyonlar nekropsi muayenesi ile ortaya konabilir. Hastalığın intestinal formunda; ateş, depresyon, iştahsızlık, kilo kaybı, kolik ve diyare gibi semptomlar görülür (Zink ve ark. 1986; Baldwin ve ark., 1992). Rhodococcus equi infeksiyonuna yakalanmış tayların yaklaşık 1/3 ünde tibiotarsal eklemde polisinovitis ve eklem hareketlerinde kısıtlanmalar görülür. Bazen tüm eklemler etkilenebilir. Eklem effüzyonunun şiddeti hareketli olmayan bölgelerde fazladır, birçok olguda topallık görülmez. (Sweeney ve ark., 1987; Kenney ve ark., 1994). Hasta tayların akciğer ve gastrointestinal sistemine yerleşmiş olan bakteri septisemi yaparak septik artrit ve osteomiyelite neden olabilir. Bazı durumlarda etken septisemi yapmadan direkt olarak da septik artrit ve osteomiyelite neden olabilir.

16 10 Aseptik polisinovitis ve septik artritis bakteriyolojik ve sitolojik muayene sonucu birbirinden ayırt edilebilir. Klinik olarak topallık ve bölgede şişlik görülür (Collatos ve ark., 1990; Desjardins ve Vachon, 1990; Firth ve ark., 1993). Rhodococcus equi taylarda ülseratif lenfanjit, selülit, deri altı apseleri (Smith ve Jang, 1980; Dewes, 1972; Zink ve ark., 1986; Perdrized ve Scott, 1987), uveitis (Beech ve Sweeney, 1991), endoftalmitis (Blogg ve ark., 1983), nefrit ile birlikte hepatik ve renal apselere neden olabilir (Ellenberger ve Genetzki, 1986). Etken yetişkin atlarda çok nadir olarak akciğer, kolon, lenf bezleri ve yara infeksiyonuna neden olabilir (Roberts ve ark., 1980; Ellenberger ve Genetzki, 1986; Zink ve ark., 1986). 1.6-Tanı Rhodococcus equi infeksiyonunun görülmediği bir at çiftliğinde kontaminasyon sonucu bu etkenin neden olduğu solunum yolu infeksiyonunu diğer akciğer patojenlerinin neden olduğu infeksiyonlardan klinik olarak ayırmak oldukça zordur. Hastalığın gizli seyretmesi ve başlangıçta hiçbir klinik semptom görülmemesi erken teşhisi zorlaştırır ve olguların çoğu ancak nekropsi muayenesi ile teşhis edilebilir. Tanıdaki bu gecikme hastalığın morbidite ve mortalitesinin artmasına neden olur (Prescott ve Hoffman, 1993) Klinik tanı Tam kan sayımı, kan fibrinojen seviyesi ve radyografi teşhise yardımcı olabilir. İnfeksiyona yakalandığından şüphelenilen hayvanlarda plazma proteinleri ve fibrinojen seviyelerini de içine alacak şekilde tam kan sayımı yapılmalıdır. R. equi infeksiyonlarında kan fibrinojen seviyesi, nötrofil ve monosit sayısında artış görülür (Falcon ve ark., 1985; Sweeney ve ark., 1987). Akciğer grafisine bakıldığında infeksiyonun şiddeti hakkında ön bilgi edinilebilir fakat, bu her zaman güvenilir

17 11 değildir (Zink ve ark., 1986). Radyolojik muayenede 3 aylıktan küçük taylarda nodüller akciğer lezyonları ve lenfadenopati görülmesi R. equi infeksiyonunu düşündürebilir fakat 3 aylıktan büyük taylarda Streptococcus zooepidemicus infeksiyonu da düşünülmelidir (Lavoie ve ark., 1994). Rhinopneumonitis virusunun neden olduğu yaz nezlesinden patolojik akciğer seslerinin olmaması ve bu hastalıkta burun akıntısının görülmesi ayırıcı tanıda önemlidir. R. equi infeksiyonu bazen alerjiye bağlı farenjit ile karışabilir, ancak bu hastalıkta hayvanda yüksek ateş görülmez ve patolojik akciğer sesleri yoktur (Bain, 1963) Nekropsi Bulguları Akciğerlerde yaygın milier pyogranülamatöz pnömoni görülür. Bu lezyonlar 1 2 cm çapı büyüklüğündedir. Lezyonların büyüklüğü hastalığın ne kadar ilerlediği konusunda fikir verir (Martens ve ark., 1982). Apse çevrelerinde doku reaksiyonları görülür. Kısa süreli infeksiyonlarda bronş ve bronşiollerde makroskopik lezyonlar görülmeyebilir. Çok uzun süreli infeksiyonlarda akciğerler doğal yapısını tamamen yitirir. Küçük apselerin içeriği sarı renkli iken büyük apse odaklarının içeriği peynirimsi sarıdır ve de kalsifiye olmuş gibi serttir. Mediastinal lenf yumrularındaki apselerin dağılımı düzenli değildir. Nadiren karaciğer, böbrek ve sekumda da apseler görülebilir. Perakut olgularda sadece akciğerlerde lezyonlar görülür (Bain, 1963; Zink ve ark., 1986). Sadece taylarda intestinal lezyonların meydana geldiği R. equi infeksiyonunun oranı yaklaşık % 4 civarlarındadır. Bu olgularda multifokal ülseratif enterokolitis, tifilitis, mezenterik ve kolonik lenf nodüllerinde granülomatöz veya suppuratif yangı görülür. Bazı olgularda mezenterik lenf düğümlerinin birinden orijin alan büyük abdominal apse görülebilir ve bu apse ince ve kalın bağırsaklarda yapışmalara neden olabilir (Zink ve ark. 1986; Baldwin ve ark., 1992).

18 12 Bazı olgularda kolon mukozası, submukozası ve mezenterik lenf nodüllerinde yaygın granülomatöz yangı ile birlikte asites görülebilir, bu vakalarda prognoz kötüdür (Giguere ve Prescott, 1997). Polisinovitis durumunda sinovial sıvının sitolojik muayenesinde; aseptik mononükleer pleositozis görülür ve eklem sıvısında etken izole edilemez (Sweeney ve ark., 1987; Kenney ve ark., 1994). Bu vakalarda sinovial membranın histolojik muayenesinde lenfoplazmasitik sinovitis görülür. Anti equi IgG kullanılarak flüoresan antikor tekniği ile sinovial membranda immunglobulin tespit edilebilir (Madison ve Scarratt, 1988) Laboratuvar Muayeneleri Bakteriyoskopi Rhodococcus equi, trakeobronşial aspirat sedimentinden yapılan preparatlarda Gram pozitif, pleomorfik çomaklar şeklinde görülür (Falcon ve ark., 1985). Apse içeriklerinden yapılan preparatlarda ise Gram pozitif koklar şeklinde görülür ve stafilokoklar ile karışabilir (Knight, 1969). Trakeadan yapılan kültürlerde etken izolasyonu teşhiste büyük önem taşır fakat etkenin fakültatif intrasellüler olması yanlış negatif sonuçlara neden olabilir (Hillidge, 1986) Kültür Hastalığın kesin tanısında kültür çok önemlidir. Etkenin izole ve identifiye edileceği trakeo-bronşial aspirat optik endoskopi ile alınır. Şayet şüpheli hayvana antibiyotik uygulanmış ise materyal 48 saat sonra alınmalıdır. Yapılan kültürler 72 saat inkübasyona bırakılmalı antibiyotik alınmış olması durumunda inkübasyon süresi uzatılmalıdır (Prescott ve Hoffman, 1993).

19 13 Rhodococcus equi, kanlı agarda aerobik ortamda, 37 C de 48 saat inkube edildikten sonra kendine has kenarları düzensiz, nonhemolitik, somon pembesi renkte, ıslak görünümlü, birleşmeye meyilli, mukoid koloniler oluştururlar (Barton ve Hughes, 1980). CAMP testi pozitiftir (Prescott ve ark., 1982) Hayvan deneyi Rhodococcus equi infeksiyonunun görülmediği at çiftliklerinde yetişkin at ve tayların dışkılarından etken izole edilmesi R. equi infeksiyonunun varlığının göstergesi değildir. Çünkü normal at ve tayların dışkılarından etken izole edilebilir. Önemli olan bu etkenlerin 85 kb lik plazmide sahip olması ve kda luk antijenleri sentezleyebilmeleridir. Patojen olan bu etkenlerden hazırlanan (5x10 6 ml/bakteri) inokulumdan, 0,2 ml kuyruk veninden farelere verildiği takdirde 10 gün içinde farelerde ölümler görülür (Fare patojenite testi). (Nakazawa ve ark., 1983; Takai ve ark., 1986; Debey ve Bailie, 1987) Seroloji Rhodococcus equi suşları equi faktörler olarak bilinen membranolitik ekzo enzimler üretirler (Prescott ve ark., 1982). Bu enzimler kolesterol oksidaz ve fosfolipaz-c içerirler. Agar Jel İmmuno Difüzyon (AGID) testi ile bu enzimlere karşı presipitan antikorlar tespit edilebilir (Nakazawa ve ark., 1987; Gaskin ve ark.,1990). Corynebacterium pseudotuberculozis ten elde edilen fosfolipaz-d veya Staphylococcus aureus tan elde edilen beta toksini, R. equi ekzo enzimleri ile temas edince memeli eritrositlerini parçalayarak hemolize neden olur (Linder ve Bernheimer, 1982). Şayet şüpheli tayın kanında R. equi ekzo enzimine karşı antikor var ise bu sinerjik hemoliz bloke olur. Sinerjistik Hemoliz İnhibisyon (SHI) testi ile bu durum ortaya konabilir ( Prescott ve ark., 1984; Skalka ve Svastova, 1985).

20 14 Takai ve ark. (1985) ELISA tekniği kullanarak tween 20 ile tip suşu olan ATCC 6939 dan ekstrakte ettiği antijeni kullanarak şüpheli taylardan R. equi IgG antikor titrelerini tespit etmiş ve hasta taylardaki titrenin (OD 0,3) normal taylardan daha yüksek olduğunu göstermiştir. Özgür ve ark. (2002) yine aynı teknik ile yaptıkları çalışmada klinik olarak hasta olan taylarda IgG antikor titrelerinin normal taylara göre yüksek olduğunu (OD 0,3) tespit etmişlerdir. 1.7-Sağaltım Rhodococcus equi in vitro olarak birçok antibiyotiğe duyarlıdır ancak etken intrasellüler patojen olduğu için, makrofajlar içinde yaşar ve çoğalabilir (Hondalus ve Mosser, 1994). Hastalıkta kalın kazeöz materyal ile çevrelenmiş granülomatöz lezyonlar oluştuğu için invitro etkili olan birçok antibiyotik in vivo etkisiz kalır. Etken in vitro olarak gentamisine duyarlı olduğu halde Sweeney ve ark. (1987) yaptıkları çalışmada 17 olguyu penisilin+gentamisin ile tedavi etmeye çalışmışlar fakat başarısız olmuşlardır. Rhodococcus equi makrofajların fakültatif intra sellüler patojeni olduğu için tedavide kullanılacak antibiyotiklerin yağda çözünebilir ve makrofajlara infiltre olabilir özellikte olmaları gerekir (Prescott, 1981b). Rifampisin ve eritromisin ile kombine yapılan tedavilerde olumlu sonuçlar alınmış ve olguların % 88 i tedavi edilmiştir (Sweeney ve ark., 1987). Deneysel olarak infekte edilen farelerde yapılan çalışmalarda vankomisin + imipenem ve vankomisin + rifampisin kombinasyonları ile yapılan tedavilerde olumlu sonuçlar alınmıştır (Nordmann ve Ranco., 1992). Rhodococcus equi nin taylarda neden olduğu pnömoni ve akciğer apselerinin sağaltımında, (3 x 25 mg/kg) eritromisin ve (2 x 5 mg/kg) rifampisinin 4 9 hafta boyunca kullanılması etkili bulunmuştur (Hillidge, 1987; Nordmann ve Ranco, 1992).

21 1.8-Koruma 15 Ağız yolu ile canlı R. equi ile immünize edilen taylar daha sonra deneysel olarak infekte edilmeye çalışılmış ve taylarda infeksiyon meydana getirilememiştir (Chirino-Trejo ve ark., 1987). R. equi hiper antiserumu verilen taylarda da deneysel infeksiyon oluşturulamamıştır (Martens ve ark., 1989). Hayvan gübreliklerinin, barınak ve meralardan uzaklaştırılması infeksiyonun önlenmesi açısından önemlidir. Çünkü yapılan izolasyon çalışmasında en fazla izolasyon gübreliklerden yapılmıştır (Debey ve Bailie, 1987). At çiftliklerinde uzun süre kullanılan padok ve çayırlardaki Rhodococcus equi kontaminasyonu incelenmiş, padok ve çayırların uzun süre kullanılmasının etkenin üremesi ve taylarda infeksiyon meydana gelmesini arttırdığı ortaya konarak, padok ve çayırların uzun süreli kullanılmaması gerektiği ileri sürülmüştür (Prescott ve ark., 1984). Bu çalışmada, serum atlarının barındırıldıkları bir at çiftliğinden alınan toprak ve dışkı örneklerinden etken izolasyonu yapılıp, izolatların fare patojenite testi ile patojeniteleri araştırılarak, bu bölgenin bulaşma kaynağı olup olmadığının tespit edilmesi amaçlanmıştır.

22 2-GEREÇ VE YÖNTEM Örneklerin Toplanması Bir antiserum üretim çiftliğinde bulunan farklı yaş ve cinsiyetteki at ve tayların toplam 60 tanesinden dışkı örnekleri alındı (Çizelge 2). Bu atların sadece ilkbahar ve yaz dönemlerinde barındırıldıkları 4 adet padoktan da yine toplam 60 adet toprak örneği alındı (Çizelge 3). Çizelge 2. Dışkı örnekleri alınan atların yaşları, cinsiyetleri ve sayıları. Yaşı Cinsiyeti Adet 3 6 ay 7 12 ay 1 3 yaş 3 yaş ve üstü TOPLAM ERKEK 1 DİŞİ 3 ERKEK - DİŞİ 1 ERKEK 3 DİŞİ 2 ERKEK 30 DİŞİ Çizelge 3. Padok numaraları ve bunların her birinden alınan toprak örneği sayısı. Padok No Alınan toprak örneği sayısı 1 nolu padok 15 2 nolu padok 15 3 nolu padok 15 4 nolu padok 15 TOPLAM 60

23 Alınan materyaller selektif besiyerine ekilerek izolasyona gidildi ve izolatlar çeşitli testlere tabi tutularak (Çizelge 4.) identifikasyonları yapıldı. Farklı yaşlarda ve cinsiyetteki atlardan ve toprak örneklerinden izole edilerek R. equi olarak değerlendirilen izolatlar fare patojenite testine tabi tutuldu. Bu test sonucu patojen olan izolatlar tespit edildi. Çizelge 4. Rhodococcus equi nin genel karakterleri (Rogosa ve ark., 1974; Barton ve Hughes, 1980; Mutimer ve Woolcock, 1981, Prescott ve ark., 1982; Linder ve Bernheimer, 1982) Karakterler Koloni morfolojisi NANAT Kanlı agar Mikroskobik morfoloji Gram boyama Katalaz testi Oksidaz testi Nitrat redüksiyon Hareket Üreaz O/F Jelatin hidrolizasyon Beta hemoliz CAMP Maltoz Sukroz Laktoz Glikoz H 2 S Sonuçlar Gri, parlak, mukoid, nemli, Nonhemolitik, pembe, ıslak görünümlü, mukoid Pleomorfik, kokobasil Gram pozitif Pozitif Negatif Pozitif Hareketsiz Pozitif Negatif Negatif Nonhemolitik Pozitif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Besiyerleri ve Test ortamları Nalidiksik asit-novabiosin-siklohekzimid-potasyum tellürit ( NANAT) besiyeri:

24 18 Rhodococcus equi nin dışkı ve toprak örneklerinden ilk izolasyonunda selektif bir besiyeri olan NANAT besiyeri kullanıldı (Woolcock ve ark., 1979). Tryptone soya broth (Oxoid) 30 g Yeast extract (Oxoid) 1 g Bacto agar (Difco) 15 g Distile su 1000 ml Karışım eritilip ph sı 7,2 ye ayarlandı. Otoklavda 121 C de 15 dak. sterilize edilip, 45 C ye kadar soğutuldu ve steril koşullarda aşağıda belirtilen maddeler ilave edilerek besiyeri petri kutularına döküldü. Besiyerlerinin sterilite kontrolü yapıldıktan sonra ilk izolasyonda kullanıldı. Nalidiksik asit 20 µg/ml Novabiosin 25 µg/ml Siklohekzimid 40 µg/ml Potasyum Tellürit % Kanlı agar (Difco B45): Standart suşlar (ATCC ve ATCC 6939) ve izolatların hemoliz yönünden değerlendirilmesinde ve CAMP testinde % 5 koyun kanlı agar kullanıldı. Temel besiyeri: Sığır kalbi özütü 500 g Tryptose 10 g NaCl 5 g Agar 15 g Temel besiyerinden 40 g alınarak 1000 ml distile suda ısıtılarak eritildi ph 6.8 e ayarlandı, otoklavda 121 C de 15 dakika tutularak steril edilip 50 C ye kadar soğutuldu. Defibrine koyun kanından 50 ml eklenerek karıştırıldı ve petrilere döküldü. Brain heart infusion broth (Difco B37): Fare patojenite testlerinin yapılması amacıyla izolatların bu besiyerindeki 48 saatlik kültürleri kullanıldı. Temel besiyeri:

25 19 Sığır beyni infusyonu 200 g Kalp kası infusyonu 250 g Proteose pepton 10 g Bacto dekstroz 2 g NaCl 5 g Disodyum fosfat 2.5 g Temel besiyerinden 37 g alınıp 1000 ml distile suda ısıtılarak eritildi ve ph 6,5 olacak şekilde ayarlandı. Tüplere tasnif edilerek otoklavda 121 C de 15 dakika tutularak steril edildi. Nutrient agar (DifcoB1): İzolatların katalaz ve oksidaz testlerini yapmak amacı ile bu besiyerinde üretilen koloniler kullanılmıştır. Ayrıca fare patojenite testinde kullanılacak olan inokulumdaki bakteri yoğunluğunu tespit amacı ile yapılan koloni sayımı da bu besiyerinde yapıldı. Temel besiyeri: Sığır eti özütü (Bacto) 3 g Bacto pepton 5 g Bacto agar 15 g Temel besiyerinden 23 g alınıp 1000 ml distile suda ısıtılarak eritildi ve ph 6,8 olacak şekilde ayarlanarak otoklavda 121 C de 15 dakika tutularak steril edildikten sonra petrilere döküldü. Peptonlu su: Karbonhidrat fermantasyon testlerini yapmak amacı ile indikatör olarak % 0,0025 oranında brom timol mavisi ve son konsantrasyonu % 1 olacak şekilde test edilecek karbonhidrat (maltoz, sukroz, laktoz, glikoz) katılmış peptonlu su kullanıldı.

26 20 Pepton 10 g NaCl 5 g Saf su 1000 ml Maddeler ısıtılarak eritildi, ph 7.2 ye ayarlanıp otoklavda 121 C de 15 dakika tutularak steril edildi. Hidrojen sülfit deneyi için ise aşağıda belirtilen peptonlu su kullanıldı, Pepton 2 g Cystin 0,01 g Distile su 100 ml Maddeler distile suda ısıtılarak eritildi ve ph sı 7,2 ye ayarlandı. Tüplere 5 er ml konarak 121 C de 15 dakika sterilize edildi. Hugh ve Leifson ortamı: Pepton 2 g Sodyum klorür 5 g K 2 HPO 4 0,3 g Bromtimol mavisi (% 1) 0,3 ml Agar 3 g Distile su 1000 ml İndikatör katılmadan önce, maddeler 1 litre sıcak suda eritildi, ph sı 7,1 e ayarlandı ve indikatör katılarak homojen bir renk alıncaya kadar karıştırıldı. Besiyeri tüplere 5 er ml miktarında dağıtıldı, otoklavda 121 C de 20 dakika sterilize edildi. Glikoz son konsantrasyon % 1 olacak şekilde ilave edildi. Hazırlanan besiyeri Oksidasyonfermentasyon (O/F) testinde kullanıldı. Jelatinli ortam: İzolatların identifikasyonu amacı ile jelatin hidrolizasyon testinde kullanıldı. Buyyon 100 ml Jelatin g

27 21 Jelatin buyyon içinde +4 C de bir gece bekletildi, daha sonra ısıtılarak eritildi, ph sı 7,2 ye ayarlanarak tüplere 5 10 ml miktarlarında taksim edildi ve 110 C de dak. sterilize edilerek kullanıldı. Nitratlı buyyon: Nitrat redüksiyon testinin yapılmasında kullanıldı. Pepton 5 g Potasyum nitrat 1 g Distile su 1000ml Distile su içinde pepton ve potasyum nitrat eritildikten sonra içinde durham tüpü bulunan tüplere 5 ml miktarında taksim edildi ve otoklavda 121 C de 15 dak. sterilize edildi. Üreli sıvı ortam: İzolatlara ve standart suşlara üreaz testi bu ortamda yapıldı. Üre: 4 g KH 2 PO 4 (0,2 M) 50 ml NaOH (0,2 N) 35 ml Distile su (amonyaksız) 115 ml Maddeler distile su içinde eritilerek ph 7,2 ye ayarlandı, tüplere 0,5 ml miktarında taksim edilip ağızları mantar ile kapatıldı ve üreaz testi bu ortamda yapıldı. Standart Suşlar: Japonya Kitasato Üniversitesi öğretim üyelerinden Shinji Takai den temin edilmiş olan, ATCC 6939 ve ATCC suşları standart suşlar olarak kullanıldı. Fare patojenite testinde kda luk antijenleri sentezleyemeyen ATCC 6939 suşu

28 negatif kontrol, bu antijenleri sentezleyen ATCC suşu ise pozitif kontrol olarak kullanıldı (Takai ve ark., 1991c; Takai, 1997) İndikatör maddeler ve ayıraçlar: Brom timol mavisi: Karbonhidrat fermantasyon testinde indikatör madde olarak besiyerlerine katıldı. Bromtimol mavisi 0,4 g NaOH (H/20) 11,8 ml Distile su 88,2 ml Bromtimol mavisi havana konarak NaOH ile iyice karıştırılıp eritildi, daha sonra balona aktarılıp distile su katılıp karıştırıldı ve renkli şişelerde oda ısısında saklandı. Nessler ayıracı: Üreaz deneyinde kullanıldı. Nessler tuzu 68 g NaOH 85 g Distile su 800 ml Önce Nessler tuzu 100 ml distile suda eritildi, sodyum hidroksit ise ayrıca 800 ml distile suda ayrıca eritildi. Her iki eriyik karıştırılıp 1000 ml ye tamamlandı Deney hayvanları: İzolatların ve standart suşların fare patojenite testlerinde Refik Saydam Hıfzıssıhha merkez Başkanlığı na bağlı, Serum Üretim ve Deney Hayvanları Laboratuar

29 Şefliğinde yetiştirilmekte olan dişi, g ağırlığında 216 adet Swissalbino ırkı konvansiyonel fare kullanıldı İzolasyon Çalışmaları At ve tay dışkıları: Tavlalarda bağlı olan veya padoklarda serbest dolaşan at ve taylara ait dışkı örnekleri, hayvanlar bizzat takip edilip taze olarak steril petri kutularına toplandı ve atların kalça numaraları, yaşları ve cinsiyetleri kaydedildi. Toplanan dışkı örnekleri birkaç saat içinde oda şartlarına alındı ve daha sonra selektif besi yeri olan NANAT besi yerine ekim yapıldı. Petriler aerobik ortamda 37 C de 48 saat inkübasyona bırakıldı. Meydana gelen gri, birleşmeye meyilli, parlak ve mukoid koloniler identifikasyonda kullanmak amacı ile değerlendirmeye alındı (Takai ve ark., 1991b). Toprak örnekleri: Atların ilkbahar ve yaz döneminde serbest olarak dolaştıkları dört adet padoktan yaklaşık 0 20 cm derinliklerden steril petri kutularına alınan toprak örnekleri 24 saat içinde laboratuvara getirilip steril distile su ile nemlendirildikten sonra öze ile NANAT besiyerine ekimleri yapıldı. Petriler 37 C de 48 saat inkübasyona bırakıldıktan sonra üreme olup olmadığı kontrol edilerek gri renkte, birleşmeye meyilli, parlak mukoid koloniler identifikasyon çalışmalarında kullanılmak üzere değerlendirilmeye alındı (Takai ve ark., 1986).

30 2.6. İdentifikasyon Çalışmaları: 24 Gram boyama: Rhodococcus equi için selektif bir besiyeri olan NANAT besiyerinde üreyen mukoid, parlak, gri renkte, birleşmeye meyilli kolonilerden biri alınarak normal buyyona pasajlandı saat aerobik ortamda 37 C de inkübasyona bırakıldı. Buradan alınan kültüre Gram boyama yapıldı ve Gram pozitif kokobasiller değerlendirmeye alındı. Hareket muayenesi: Selektif besiyerinden alınan şüpheli koloniler normal buyyona pasajlandı saat aerobik ortamda 37 C de inkübasyona bırakıldı. Bu taze kültürden hareket muayenesi yapılarak hareketsiz izolatlar değerlendirmeye alındı (Arda, 1985). Katalaz testi: Selektif besiyerinden normal buyyona pasajlanmış olan izolatlardan nütrient agara ekim yapılarak 24 saat inkübasyona bırakıldı. Meydana gelen kolonilerin üzerine % 3 lük H 2 O 2 den 5 damla damlatıldı ve kabarcık çıkaran izolatlar katalaz pozitif olarak değerlendirilip dikkate alındı (Arda, 1985). Oksidaz testi: Ayıraca (tetrametil-p-fenilendiamin) batırılmış filtre kağıdı üzerine normal agarda üretilmiş olan izolatların kolonilerinden öze ile alınarak konuldu ve 5 10 saniye içinde mor renk oluşumu takip edildi. Mor renk oluşumuna neden olmayan negatif izolatlar değerlendirilmeye alındı (Arda, 1985).

31 Hemoliz: 25 İzolatların taze normal buyyon kültürlerinden, % 5 koyun kanlı agara tek koloni düşecek şekilde ekim yapıldı. Pembe pigment oluşturan mukoid ve nonhemolitik izolatlar değerlendirilmeye alındı. Üreaz testi: Üreli sıvı ortamda izolatların normal agardan toplanan kolonileri ile yoğun emülsiyonu hazırlandı ve su banyosunda 3 saat 37 C de bekletildi. Daha sonra tüplere 0,1 ml Nessler ayıracından kondu ve 3 4 dakika içinde değerlendirildi. Tüplerdeki sarıdan koyu kahverengine kadar değişen renklerde presipitasyon görülmesi pozitif olarak değerlendirildi ve bu izolatlar değerlendirilmeye alındı (Arda, 1985). Nitrat redüksiyon testi: İzolatlar nitratlı buyyona ekildi ve 30 C de 5 gün inkübasyona bırakıldı. Daha sonra tüplere Griess-Ilosvay ayıracı A ve B den 1 er ml katıldı. Birkaç dakika içinde kırmızı renk oluşumu pozitif olarak değerlendirildi. Bu pozitif izolatlar değerlendirilmeye alındı (Arda, 1985). Hidrojen sülfit (H 2 S) deneyi: Bu deney için hazırlanan peptonlu suya izolatlar ekildi ve besiyeri ile temas etmeyecek şekilde kurşun asetatlı şerit kağıtlar tüplere yerleştirildi. Kültür 37 C de 2 7 gün inkübasyona bırakıldı. Her gün kontroller yapıldı ve kağıt ucunda kararma olup olmadığı kontrol edildi. Kağıt ucunda meydana gelen kararma pozitif olarak değerlendirildi. Negatif olan kültürlere 0,5 ml 2N HCl ilave edilerek negatifliğin

32 kesin kontrolü yapıldıktan sonra bu negatif izolatlar değerlendirilmeye alındı(arda, 1985). 26 Jelatin hidrolizasyonu: Buyyona ekilmiş olan izolatlardan iğne uçlu öze ile alınan mikroorganizmalar jelatin buyyona batırılarak ekildi ve 30 C de 28 gün inkübasyona bırakıldı. Kültürlerde ekim hattı boyunca erime olup olmadığı kontrol edildi. Negatif olan izolatlar değerlendirilmeye alındı (Barton ve Hughes, 1980; Arda, 1985). Oksidasyon- fermentasyon testi (O/F): İzolatların her birinden iki adet Hugh ve Leifson ortamına ekim yapıldı. Tüplerden birinin üzeri sadece pamuk tampon ile kapatılırken diğerinin üzeri aynı zamanda parafin ile kapatıldı. Kültürler 28 gün boyunca 30 C de inkübasyona bırakıldı. Tüpler her gün kontrol edildi ve her iki tüpte de renk değişikliği yapmayan negatif izolatlar değerlendirilmeye alındı (Barton ve Hughes, 1980; Arda, 1985). Karbonhidrat fermentasyon testleri: İzolatlar bu testte glikoz, sukroz, laktoz, maltoz yönünden değerlendirildi. Karbonhidratları içeren besiyerlerine izolatları içeren her bir kültürden 0,1 ml miktarında ekimler yapıldı. 30 C de inkübasyona bırakıldı ve 28 gün boyunca her gün kontrol edildi. Asit ve gaz oluşumuna neden olmayan nonfermantatif izolatlar değerlendirilmeye alındı (Barton ve Hughes, 1980; Arda, 1985).

33 CAMP testi: 27 Beta hemolizin oluşturan stafilokok kültüründen kanlı agara petri kutusunun çapı boyunca agarı ikiye ayırır tarzda genişçe ekim yapıldı. Şüpheli izolatlar bu hatta dik olarak ekildi. Kültürler 37 C de saat inkübasyona bırakıldı. İki kültürün birbirine değdiği yerde beta hemoliz oluşturan izolatlar değerlendirilmeye alındı (Prescott ve ark., 1982; Arda, 1985) Fare patojenite testi: İzolasyon çalışmalarından sonra elde edilen izolatlara yapılan testler ile identifikasyonu yapılan Rhodococcus equi suşlarına fare patojenite testi uygulandı (Takai ve ark., 1991a). İzolasyonu ve identifikasyonu yapılmış olan R. equi suşları ve standart suşlar; -Brain heart infüzyon buyyonuna ekildi ve 37 C de 48 saat inkübasyona bırakıldı. -Bu kültürlerin her birinden 0,1 ml alınarak 10 katlı seri dilusyonlar yapıldı kültürlerin geri kalan kısmı santrifüj edilerek üst kısımdaki besiyeri döküldü ve aynı hacimde % 10 gliserollü BHI buyyonu ilave edilerek 1 er ml lik mikrosantrifüj tüplerine porsiyonlanıp 80 C de saklandı. -İzole edilmiş olan suşların ve standart suşların stok kültürlerindeki bakteri yoğunluğunu tespit etmek amacı ile bunların steril fizyolojik tuzlu su ile hazırlanan her bir dilüsyonundan (10, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6, 10 7 ) iki adet nutrient agara (90 cm) 0,1 ml miktarında ekimler yapıldı. -Ekim yapılan petriler 37 C de 48 saat inkübasyona bırakıldı. -Bu süre sonunda koloni sayımları yapıldı. -Alınan sonuçlara göre stok kültürlerden 5x10 6, 5x10 7 ve 5x10 8 bakteri/ml içeren dilüsyonları hazırlandı. -İzole edilmiş olan suşların ve standart suşların hazırlanmış olan bu dilüsyonlarının her biri 3 adet fareye kuyruk venasından 0,2 ml verildi. -Fareler 10 gün boyunca gözlenerek ölümler kaydedildi.

34 3-BULGULAR İzolasyon sonuçları Serum Çiftliğinde bulunan farklı yaş ve cinsiyetteki at ve taylardan 60 adet dışkı örneği ve bu atların barındıkları 4 adet padoklardan alınan 60 adet toprak örneğinden izolasyon çalışmaları yapıldı. İlk izolasyonda selektif besiyeri olan NANAT ın kullanılması izolasyonda büyük yarar sağladı. P. aeruginosa koloni yapısının farklı oluşu nedeni ile rahatlıkla Rhodococcus equi den ayırt edildi. At ve taylardan alınmış olan 60 adet dışkı örneğinden toplam 12 adet R. equi izolasyonu yapıldı (Çizelge 5.). Bu atların barınmakta oldukları 4 adet padoktan alınmış olan 60 adet toprak örneğinden ise 10 adet izolasyon yapıldı (Çizelge 6.). İzolatlar sera farm (SF) olarak 1 den 22 ye kadar kodlandı. Çizelge 5. Dışkı örneklerinden R. equi izolasyonu yapılan atların cinsiyetleri ve yaşları. Atın yaşı Cinsiyeti İzolat no 3 ay Dişi SF 1 3,5 ay Erkek SF 2 8 ay Dişi SF 3 1 yaş Dişi SF 4 2 yaş Dişi SF 5 2,5 yaş Erkek SF 6 3 yaş Erkek SF 7 5 yaş Dişi SF 8 7 yaş Erkek SF 9 8 yaş Erkek SF 10 9 yaş Erkek SF yaş Dişi SF 12

35 29 Çizelge 6. Toprak örneklerinden izole edilen R.equi izolatlarının padoklara göre dağılımı. Padok no Alınan örnek sayısı İzolat sayısı ve nosu 1 nolu padok 15 3 (SF 13, SF 14, SF 15) 2 nolu padok 15 4 (SF 16, SF 17, SF 18, SF 19) 3 nolu padok 15 1 (SF 20) 4 nolu padok 15 2 (SF 21, SF 22) TOPLAM İdentifikasyon sonuçları: Toplanan örneklerden elde edilen izolatlar çeşitli testlere (Çizelge 4.) tabi tutularak identifikasyonları yapıldı (Çizelge 7.) Bu incelemeler ve testler sonucunda izole edilmiş olan toplam 22 adet izolatın Rhodococcus equi olduğu tespit edildi Fare patojenite testi sonuçları: İzole edilmiş olan toplam 22 adet Rhodococcus equi izolatının patojeniteleri ortaya konmak amacı ile standart suşlar ile birlikte fare patojenite testine tabi tutuldu. Farelerin kuyruk venalarından 0,2 mililitresinde 10 6, 10 7, ve 10 8 bakteri bulunan inokulum verilerek 10 gün boyunca fareler gözlendi. Bu gözlem sonucunda sadece pozitif kontrol olarak kullanılan ATCC standart suşundan hazırlanan inokulumun verildiği farelerde ölüm görüldü. Enjeksiyonun yapıldığı üç fareden birincisinde 5. gün, diğer ikisinde ise 7. günde ölüm görüldü. Negatif kontrol olarak kullanılan ATCC 6939 suşu ve çalışmada izole edilen 22 adet izolatın inokule edildiği farelerde ise 10 gün boyunca yapılan gözlemlerde ölüm görülmedi (Çizelge 8).

36

37 Çizelge 8. Fare patojenite testi sonuçları. 31 Test edilen izolat 1.gün 2.gün 3.gün 4.gün 5.gün 6.gün 7.gün 8.gün 9.gün 10.gün sonuç ve standart suş SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF ATCC6839* ATCC33701** Φ 00 ΦΦ ΦΦΦ *: Negatif kontrol **:Pozitif kontrol 0: Canlı Φ: Ölü

38 4-TARTIŞMA 32 Rhodococcus equi infeksiyonu dünyanın birçok ülkesinde 0 6 aylık taylarda ölümlere neden olmaktadır ve en önemli bulaşma kaynağı infekte taylar, patojen etken ile kontamine gübrelikler ve topraktır. Hastalığın çoğunlukla klinik semptomlara neden olmadan ilerlemesi erken teşhisi güçleştirmektedir. Teşhislerin büyük bir bölüme postmortem muayenelerde ortaya çıkmaktadır. Bu nedenlerden dolayı, infeksiyonun önlenmesinde periyodik dışkı ve barınak topraklarının bakteriyolojik kontrolleri, at ve tayların serolojik taramaları üzerinde durulması gereken konulardır. Yapılan bu çalışmada, serum üretiminde kullanılan atların barındığı bir at çiftliği araştırma alanı olarak seçildi. Farklı yaş ve cinsiyetteki 60 adet atın dışkısı ve 4 adet padoktan alınan 60 adet toprak örneği incelemeye alınıp R. equi için selektif bir besiyeri olan NANAT kullanılarak izolasyonlar yapıldı. At ve taylardan alınan dışkı örneklerinin 12 (% 20) tanesinde etken izole edilirken, toprak örneklerinden 10 (% 16,6) tanesinden etken izole edildi. Bu izolatların patojenite araştırmalarında fare patojenite testi kullanıldı. Yapılan test sonucunda izolatların tümünün patojen olmadıkları ortaya konuldu Woolcock ve ark. (1979) 127 at dışkısının 90 tanesinde (% 70,9) etken izole etmişlerdir, ancak bu dışkıları incelenen atların infeksiyon durumunu belirtilmemiştir. Debey ve Bailie (1987) tarafından yapılan epidemiyolojik çalışmada hastalığın hiç görülmediği çiftlikteki değişik yaş ve cinsiyetteki 26 adet atın 8 tanesinin (% 30,76) dışkısından etken izole etmişlerdir. Bu çalışmada ise infeksiyonun görülmediği sağlıklı, farklı yaş ve cinsiyetteki atlara ait 60 adet dışkının 12 tanesinde (% 20) Rhodococcus equi izolasyonu yapıldı. Fakat yapılan bu çalışmada patojen etken izole edilemediği için incelenen hayvanların yaş ve cinsiyetleri ile hastalığın yaygınlığı arasında ilişki olup olmadığı konusunda bir değerlendirme yapılamadı.