T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Zootekni Anabilim Dalı

Transkript

1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Zootekni Anabilim Dalı SİMENTAL IRKI SIĞIRLARDA STAT5A VE MYF5 GEN POLİMORFİZMLERİ İLE SÜT VERİMİ ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI Hazırlayan Xxxxx XXXXXX Danışman Prof. Dr. Xxxxxx XXXXX Yüksek Lisans Tezi Ağustos 2020 KAYSERİ

2 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI SİMENTAL IRKI SIĞIRLARDA STAT5A VE MYF5 GEN POLİMORFİZMLERİ İLE SÜT VERİMİ ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI (Yüksek Lisans Tezi) Hazırlayan Xxxxxx XXXXX Danışman Prof. Dr. Xxxxxx XXXXX Bu Tez Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TYL-xxxxx kodlu proje ile desteklenmiştir. Ağustos 2020 KAYSERİ

3 i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu tezin kendi çalışmam olduğunu, tüm bilgilerin akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda akademik ve etik kuralların gerektirdiği gibi tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel kurallara uygun olarak atıfta bulunduğumu ve kaynaklar listesinde gösterdiğimi belirtirim. Adı-Soyadı : Xxxxxx XXXXX İmza :

4 ii YÖNERGEYE UYGUNLUK ONAYI Simental Irkı Sığırlarda STAT5A ve MYF5 Gen Polimorfizmleri ile Süt Verimi Arasındaki İlişkinin Araştırılması adlı Yüksek Lisans Tezi, Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmıştır. Tezi Hazırlayan Xxxxxx XXXXX Danışman Prof. Dr. Xxxxxx XXXXX Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Xxxxxx XXXXX

5 iii Prof. Dr. Xxxxxx XXXXXX danışmanlığında Xxxxxx XXXXXX tarafından hazırlanan Simental Irkı Sığırlarda Stat5A ve Myf5 Gen Polimorfizmleri ile Süt Verimi Arasındaki İlişkinin Araştırılması adlı bu çalışma jürimiz tarafından Erciyes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Xxxxxx Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir JÜRİ İmza Danışman : Prof. Dr. Xxxxxx XXXXX. (Erciyes Üniversitesi Xxxxxx Fakültesi Xxxxxx Anabilim Dalı) Üye : Doç. Dr. Xxxxxx XXXXX (Erciyes Üniversitesi Xxxxxx Fakültesi Xxxxxx Anabilim Dalı) Üye : Doç. Dr.Xxxxxx XXXXX (XXXXXXX Üniversitesi, Xxxxxx Fakültesi Xxxxxx Anabilim Dalı) ONAY Bu tezin kabulü Enstitü Yönetim Kurulunun... tarih ve. sayılı kararı ile onaylanmıştır.. /../ Prof. Dr. Xxxxxx XXXX Enstitü Müdürü

6 iv TEŞEKKÜR Bu tez projesinin planlanması, yürütülmesi ve yazılması hususlarında göstermiş olduğu destek ve yardımlarından ötürü tez danışmanım Erciyes Üniversitesi Xxxxxx Fakültesi Öğretim Üyesi Prof. Dr. Xxxxxx XXXXX e teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca TYL-xxxxxx proje kodu ile tez projemi destekleyen Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi ve Birim Personeline, tez çalışmamın laboratuar aşamasında yardımcı olan Erciyes Üniversitesi, Xxxxxx Fakültesi, Xxxxxx Anabilim Dalı öğretim elamanları Doç. Dr. Xxxxxx XXXXXX ve Araş. Gör. Xxxxxx ve çalışmalarım süresince birçok fedakârlıklar gösterip, yaşamımın her döneminde bana duydukları güven için aileme en derin duygularla teşekkür ederim. Xxxxxx XXXXXX Kayseri, Ağustos 2020

7 v SİMENTAL IRKI SIĞIRLARDA STAT5A VE MYF5 GEN POLİMORFİZMLERİ İLE SÜT VERİMİ ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI Xxxxxx XXXXXX Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Xxxxxx Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, Ağustos 2020 Danışman: Prof. Dr. Xxxxxx XXXXXX ÖZET Yapılan bu tezde, Simental ırkı sığırda sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü 5A (STAT5A) ve miyojenik faktör (MYF5 ) genleri ile süt verimi arasındaki ilişki Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restiriksiyon Parçacık Büyüklük Polimorfizmi (PCR- RFLP) yöntemiyle araştırılması amaçlanmıştır. Bu çalışmada Kayseri ili ve civarında süt sığırcılığı yapan işletmelerdeki 202 baş Simental ırkı sağmal inek incelenmiştir. STAT5A-AvaI polimorfizminin belirlenmesi amacıyla yapılan PCR işlemi sonunda elde edilen 215 baz çiftlik PCR ürünleri AvaI restriksiyon enzimi ile kesilmiştir. MYF5-TaqI polimorfizminin belirlenmesi için ise yapılan PCR işlemi sonunda elde 512 bç lik PCR ürünleri TaqI restriksiyon enzimi ile kesilmiştir. Belirlenen STAT5A-AvaI ve MYF5- TaqI genotipleri ile günlük ve laktasyon süt verimleri arasındaki ilişkinin önem kontrolü Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) ile değerlendirilmiştir. STAT5A-AvaI polimorfizmi yönünden incelenen Simental ırkı sığırlarda CC genotipini en yaygın (n=148), TT genotipinin ise en az görülen genotip (n=8) olduğu belirlenmiştir. İncelenen örneklerin STAT5A-AvaI polimorfizmi yönünden Hardy- Weinberg (H-W) dengesinde oldukları gözlenmiştir. MYF5-TaqI polimorfizmi yönünden incelenen Simental ırkı sığırlarda GG genotipinin en sık görülen genotip (n=96) olduğu gözlenmişken, AA genotipin ise incelenen Simental ırkı ineklerde en az görülen genotip olduğu (n=20) belirlenmiştir. MYF5-TaqI polimorfizmi yönünden de incelenen Simental ırkı sığırların H-W dengesinde oldukları gözlenmiştir.

8 vi Çalışma sonunda incelenen Simental ırkı sağmal ineklerde STAT5A-AvaI polimorfizmi yönünden CT genotipli sığırların hem birinci hemde ikinci laktasyonda diğer genotiplere göre daha yüksek süt verimine sahip oldukları gözlenmiştir. Buna karışın bu çalışmada incelenen Simental ırkı ineklerde MYF5-TaqI polimorfizmi ile günlük ve toplam laktasyon süt verimleri arasında ilişki olmadığı belirlenmiştir. Çalışma sonunda elde edilen verilen göstermiştir ki STAT5A-AvaI polimorfizmi Simental ırkı sığırlarda günlük ve toplam laktasyon süt verimlerinin iyileştirilmesi amacıyla yapılacak ıslah çalışmalarında kullanılabilme potansiyeline sahiptir. Anahtar Kelimeler: MYF5; RFLP; Simental; STAT5A; Süt verimi.

9 vii INVESTIGATION OF THE RELATIONSHIP BETWEEN STAT5A AND MYF5 GENE POLYMORPHISMS AND MILK YIELD IN SIMENTAL CATTLE BREED Xxxxxx XXXXXX Erciyes University, Graduate School of Healthy Sciences Department of Xxxxxx M.Sc. Thesis, Agust 2020 Supervisor: Prof. Dr. Xxxxxx XXXXXX ABSTRACT In this thesis, the relationship between the Signal Transducer and Activativator of Transcription 5A (STAT5A) and Myogenic Factor 5 (MYF5) genes and milk yield in Simental cattle breed was investigated by the Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) method. PCR products of 215 bp obtained at the end of the PCR procedure to determine the STAT5A-AvaI polymorphism was cut with AvaI restriction enzyme. In order to determine the MYF5-TaqI polymorphism, 512 bp PCR products were cut with TaqI restriction enzyme. The significance control of the relationship between the determined STAT5A-AvaI and MYF5-TaqI genotypes and daily and lactation milk yields was evaluated with One-Way Variance Analysis (ANOVA). It was determined that the CC genotype was the most common (n=148) and the TT genotype was the least common genotype (n=8) in examined Simental cattle for STAT5A-AvaI polymorphism. It was observed that the samples examined were in Hardy-Weinberg (H-W) equilubrium in terms of STAT5A-AvaI polymorphism. It was observed that the GG genotype was the most common genotype (n=96) in the examined Simental cattle for the MYF5-TaqI polymorphism, whereas the AA genotype was the least common in the examined Simental cattle (n=20). Simental cows, which were also examined in terms of MYF5-TaqI polymorphism, were observed to be in H-W equilubrium.

10 viii At the end of the study, it was observed that cattle with CT genotype had higher milk yield in both first and second lactates than other genotypes in terms of STAT5A-AvaI polymorphism in Simental cattle. On the other hand, it was determined that there was no relationship between MYF5-TaqI polymorphism and daily and total lactation milk yields in Simental cows studied in this study. The data obtained at the end of the study showed that STAT5A-AvaI polymorphism has the potential to be used in breeding studies to improve daily and collected lactation milk yield in Simental cattle breed. Keywords: Milk yield; MYF5; RFLP; Simmental; STAT5A.

11 ix İÇİNDEKİLER Sayfa no İÇ KAPAK... BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK SAYFASI... i YÖNERGEYE UYGUNLUK SAYFASI... ii KABUL VE ONAY SAYFASI... iii TEŞEKKÜR... vi ÖZET... vii ABSTRACT... ix İÇİNDEKİLER... ix KISALTMALAR... x TABLO VE ŞEKİLLER LİSTESİ... xiii 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER Süt Sığırcılığında Verim Artımında Gen ve Genetik Polimorfizmlerin Kullanımı Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü 5A (Signal Transducer and Activator of Transcription 5A, STAT5A) Myojenik Factör 5 (Myogenic Factor 5, MYF5 ) GEREÇ VE YÖNTEM Hayvan Materyali Kan Alımı DNA İzolasyonu DNA İzolasyonu İçin Kullanılan Solüsyonlar ve Hazırlanış Formülleri MYF5 için Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) STAT5A için Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ELEKTROFOREZ Jel in Hazırlanması ve Dökülmesi Kuyulara Örneklerin Yüklenmesi ve Sonuçların Görüntülenmesi Tag1 Restriksiyon Enzimi ile PCR Ürünlerinin Kesilmesi AvaI Endonükleaz Enzimi ile PCR Ürünlerinin Kesilmesi İSTATİKSEL ANALİZLER BULGULAR... 24

12 x 4.1. MYF5-TaqI Polimorfizmi STAT5A-AvaI Polimorfizmi MYF5-TaqI Polimorfizmi ve Süt Verimi Arasındaki İlişki STAT5A-AvaI Polimorfizmi ve Süt Verimi Arasındaki İlişki TARTIŞMA VE SONUÇ MYF5-TaqI Polimorfizmi ve Süt Verimi Arasındaki İlişki STAT5A-AvaI Polimorfizmi ve Süt Verimi Arasındaki İlişki KAYNAKLAR EKLER ÖZGEÇMİŞ

13 xi KISALTMALAR µl : Mikro Litre ANOVA : Tek Yönlü Varyans Analizi bç : Baz Çifti BTA19 : Sığır Karyotipinin Somatik 19. Kromozomu BTA5 : Sığır Karyotipinin Somatik 5. Kromozomu DAK : Doğu Anadolu Kırmızısı GAK :Güney Anadolu Kırmızısı ddh 2 O : Bi Distile Su DNA : Deoksiribo Nükleik Asit dntp : Deoksi Nükleosid Trifosfat EDTA : Etilendiamin Tetraasetik Asit g : Gram GH : Büyüme Hormonu Göz : Gözlenen Frekans HCI : Hidroklorik Asit H-W : Hardy-Weinberg Dengesinde Kg L LEP LGSV LTSV l M ml MSTN : Kilogram : DNA Merdiveni : Leptin : Laktasyon Günlük Süt Verimi : Laktasyon Toplam Süt Verimi : Litre : Molar : Mili Litre : Miyostatin MYF3 : Miyojenik Faktör 3 MYF4 : Miyojenik Faktör 4 MYF5 : Miyojenik Faktör 5

14 xii MYF6 : Miyojenik Faktör 6 NaCI ns o C P PCR ph RFLP Sd SDS SGGS STAT 5A SNP TBE TE TNE TÜİK χ2 : Sodyum Klor : İstatiksel olarak önemsiz : Santigrad Derece : probability (anlamlılık) : Polimeraz Zincir Reaksiyonu : Potansiye Hidrojen : Restriksiyon Parçacık Büyüklük Polimorfizmi : Serbestlik Derecesi : Sodyum Dodesil Sülfat : Sağımda Geçen Gün Sayısı : Sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü : Tek Nülkeotid Polimorfizmi : Tris-Borik Asit-EDTA : Tris-EDTA : Tris-NaCI-EDTA : Türkiye İstatistik Kurumu : Ki-Kare Değeri : Aritmetik ortalama : Standart hata

15 xiii TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ Sayfa No Tablo 4.1. Tablo 4.2. Tablo 4.3. İncelenen Simental ırkı sağmal hayvanlarda MYF5-TaqI ve STAT5A-AvaI genotip ve allel frekansları MYF5-TaqI genotiplerine göre ilk iki laktasyon süt verim özelliklerinin istatistiksel karşılaştırılması STAT5A-AvaI genotiplerine göre ilk iki laktasyon süt verim özelliklerinin istatistiksel karşılaştırılması Tablo 5.1. Farklı sığır ırklarında MYF5-TaqI allel ve genotip frekansları Tablo 5.2. Farklı sığır ırklarında STAT5A-AvaI allel ve genotip frekansları Şekil Şekil Şekil Şekil MYF5-TaqI polimorfizminin belirlenmesi için yapılan PCR işlemi sonunda elde edilen 512 bç lik PCR ürünleri L: 100 bç lik DNA merdiveni; a: 512 bç lik PCR ürününün bant görünümü bç lik PCR ürünlernin TaqI restiksiyon endonükleaz enzim kesim sonrası RFLP görüntüsü. L: 100 bç lik DNA merdiveni STAT5A-AvaI polimorfizmi için yapılan PCR işlemi sonunda elde edilen 215 pç lik ürünler. L: 50 bç lik DNA merdiveni; a: 215 bç lik PCR ürününün bant görüntüsü bç lik PCR ürünlerinin AvaI restiksiyon endonükleaz enzim kesim görüntüsü. L: 50 bç lik DNA merdiven... 27

16 1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Dünya nüfusundaki hızlı artış beraberinde, insan beslenmesi için önemli besin maddelerini içeren hayvansal kökenli gıda açığı sorununu gündeme getirmiştir. Bu durum ise tüm dünyada kantitatif özelliklerin iyileştirilerek birim hayvan başına elde edilen verimin artırılması çalışmalarına ilgiyi artırmıştır. Kantitatif özellikler yönünden birim hayvan başına verimin artırılması çalışmalarında, çevre ıslahı ve genetik ıslah olarak iki tür ıslah yöntemi uygulanır. Çevre ıslahında bakım ve besleme şartlarının iyileştirilmesi ön plana çıkarken, genetik ıslah çalışmaları birbiriyle bağlantılı olan birleştirme ve seleksiyon çalışmalarını kapsamaktadır. Çevre ıslahı ile sağlanan optimal bakım ve besleme şartları, ancak eldeki hayvan varlığının genetik potansiyeli ölçüsünde en yüksek verimin elde edilmesine imkan sağlamaktadır. Örnek olarak Türkiye yerli sığır ırkları arasında sütçülük özellikleri ile ön plana çıkan Güney Anadolu Kırmızısı sığır ırkına, mevcut haliyle ne kadar optimum çevre şarları sağlanırsa sağlansın, tüm dünyadaki en önemli sütçü sığır ırkı olan Holştayn ırkının süt verim miktarına yetişemez. Bu görüşü destekler şekilde Ceylanpınar Tarım İşletmesinde yetiştirilen Güney Anadolu Kırmızısı sığır ırkında yıllık süt veriminin 2545,9 kg olduğu rapor edilmiştir (Ertuğrul, 1993). Buna karşın yine Ceylanpınar Tarım İşletmesinde yetiştirilen Holştayn ırkı sığırlarda, süt veriminin 6853 kg olduğu rapor edilmiştir (Gürses ve Bayraktar, 2012). Dolayısıyla çevrenin ıslahı ile elde edilecek verim artışı, ancak eldeki hayvan varlığının genetik kapasitesi kadar olacaktır. Bu nedenle verimlerinin artırılması için eldeki hayvan varlığının genetik kapasitesinin artırılması gereklidir. Bu amaçlada mevcut veya geliştirilecek yetiştirme ve ıslah yöntemlerinin kullanılması zorunludur. Yetiştirme yöntemleri, eldeki hayvan varlığının eksik tarafının iyileştirilmesi amacıyla farklı ırklar arasında çiftleştirmeyi içeren melezleme ve aynı ırktan bireyler arasında yapılan çiftleştirme olan saf yetiştirmeyi içermektedir. Bu çalışmalarda da doğru

17 2 damızlığın genç yaşta seçilmesi ıslah çalışmalarının hem başarısını hemde maliyetini düşürür. Ancak her iki yetiştirme yönteminde de başarıyı artırmak için seleksiyon yapılması gereklidir. Bu arada seleksiyon nedir? sorusu akla gelmektedir. Kısaca seleksiyon, bir sonraki jenerasyonun ebeveynini seçme işidir. Tüm seleksiyon yöntemlerinde asıl amaç, damızlık adayının genetik değerini kolay ve yüksek bir doğrulukta tahmin edebilmektir (Rogberg-Muñoz ve ark., 2011). Klasik seleksiyon uygulamalarında, ıslah edilmesi istenen özelliğin kalitatif veya kantitatif olmasına göre farklı seleksiyon yöntemleri kullanılmaktadır. Yakın zamana kadar çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde, ıslah edilmesi istenilen özelliğin kalıtım derecesine göre seçilen ve bireyin o özellik yönünden verimlerinin değerlendirilmesi esasına dayanan klasik seleksiyon yöntemleri kullanılmıştır (Kovács ve ark., 2006). Ancak jenerasyon aralığının uzunluğu, mevcut klasik seleksiyon yöntemleri ile çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde hızlı bir genetik ilerleme sağlayabilmeyi zorlaştırmaktadır (Tambasco ve ark., 2003). Ayrıca genel olarak çiftlik hayvanlarında ıslah edilmesi istenen süt verimi gibi özellikler, erginlikten sonra ortaya çıkmaları nedeniyle, damızlık adayının belirli bir yaşa kadar işletmede tutulmasını zorunlu kılmaktadır. Bu nedenle çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde, damızlıkların genç yaşta ve doğru olarak nasıl seçilir? Sorusu cevaplaması zor bir sorudur (Bal ve Akyüz, 2014). Çünkü düşük damızlık değere sahip hayvanların işletmelerde tutularak masraf edilmesi, işletmelerde önemli maddi kayıplara neden olmaktadır. Ayrıca yüksek damızlık değere sahip damızlık adaylarının genetik değerlerinin doğru tahmin edilememesi nedeniyle, damızlık dışı bırakılması işletmelerde daha çok maddi kayıplara sebep olur. Bu sorunun çözümünde bireyin yaşı ve cinsiyetinden bağımsız olarak, damızlık adaylarının seçilmesine olanak verecek yöntemlerin geliştirilmesi araştırıcıların ve ıslah firmalarının zihinlerini uzun süre kurcalamıştır. Bu amaçla ilk olarak 1950 li yıllardan itibaren kan grupları, kan ve süt protein polimorfizmlerinin kullanılma seçenekleri araştırılmıştır (Özbeyaz ve ark., 1991; Alpan ve Ertuğrul 1991). Kandaki ve sütteki bu protein sistemleri basit Mendel kalıtımı göstermesi, çevre şartlarından etkilenmemesi ve kolay belirlenebilmeleri nedeniyle araştırıcıları heyecanlandırmışlardır (Elmacı ve Asal, 2000). Ancak incelenen bu sistemlerden bazılarında polimorfizmin az (koyunda, atta,

18 3 sadece 4 protein sisteminin ikiden çok alleli bulunmaktadır), bazılarında ise çok olması (sığırlarda bir lokusta 1200 allel bulunmaktadır), kullanılan protein sisteminin iyileştirilmek istenen özellikle ilişkili olmaması gibi nedenlerden dolayı protein polimorfizmleri ile ıslah çalışmalarında hedeflenen başarı elde edilememiştir (Özbeyaz ve ark., 1991; Alpan ve Ertuğrul, 1991; Aygün ve Mert, 2007). Genel olarak moleküler genetik alanında elde edilen gelişmeler sonunda biyoloji, insan hekimliği, bitki ıslahı ve çiftlik hayvanları ıslahı alanlarında araştırıcılar için yeni bakış açıları ve araştırma alanları açmıştır. Bu alanda yapılan çalışmalar sonunda izole edilmesi kolay olmayan birçok protein yerine bu proteinleri kodlayan gen ve bu genlerdeki polimorfizmlerin belirlenerek, elde edilen genetik verilerin fenotip üzerine etkileri araştırılmaya başlanmıştır. Özellikle 1980 li yıllarda laboratuar ortamında hedef DNA zincirinin çoğaltılmasına olanak sağlayan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yönteminin geliştirilmesi, araştırıcılara seleksiyon amacıyla DNA tabanlı yeni seleksiyon yöntemleri ve araçlarının geliştirilmesinin önünü açmıştır. PCR işleminin yaygınlaşması 2000 li yıllardan itibaren çiftlik hayvanları ıslahı konusunda DNA tabanlı testlerin kullanıldığı genomik seleksiyon çalışmalarında patlamaya sebep olmuştur. Bu sayede yaş, cinsiyet ve proteinin izolasyondaki sorunlar aşılmıştır. Geriye sadece hangi genlerin ve polimorfizmlerin seleksiyon çalışmalarında kullanılabileceği sorusu kalmıştır. Genel olarak canlılarda kantitatif karakterler Mendel kalıtım şekli göstermeyen birçok aditif gen etkisiyle ortaya çıkması bu sorunun cevaplanmasını güçleştirmektedir. Çiftlik hayvanlarında ekonomik önemi olan kantitatif karakterlerin hemen hepsi küçük etkili çok sayıda aditif gen tarafından kontrol edilmektedirler. Ayrıca kantitatif karakterlerin çevre faktörlerinden de etkilenmeleri, yapılan seleksiyon çalışmalarındaki seleksiyon hızını yavaşlatmaktadır (Şahin ve ark., 2013). Diğer taraftan sığır gibi jenerasyon aralığı uzun olan türlerde, hızlı bir genetik ilerleme sağlanabilmesi için jenerasyon aralığının mümkün olduğu kadar kısaltılması gerekmektedir (Özbeyaz ve Kocakaya, 2011). Bir türde veya bir ırkta jenarasyon aralığının kısaltılması, damızlıkların erken yaşlarda seçilmesi ile sağlanabilir. Çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde yapılan klasik seleksiyon yöntemlerinde, damızlık adaylarının ve akrabalarının fenotipik özellikleri referans alınmış, bu verilere göre bir seleksiyon programları uygulanmıştır. Ancak kantitatif karakterler için fenotipik

19 4 göstergeler ile hayvanların genetik kapasiteleri çoğunlukla tam olarak tanımlanamamaktadır. Dolayısıyla bu özellikler için fenotipik verilerle istenilen genetik ilerleme her zaman sağlanamamaktadır (Özdemir ve Doğru, 2008). Bu nedenle üzerinde durulan karakter yönünden damızlık adayının genotipik değerinin doğru tahmin edilmesi büyük önem taşımaktadır (Özdemir ve Doğru, 2008). Yukarıda belirtildiği gibi kantitatif karakterlerin ortaya çıkmasında küçük etkili birçok genin rol oynaması ve bir genin birçok karakter üzerinde etkisinin olması genomik seleksiyon çalışmalarının başarısını düşürmektedir. Bu nedenlerle genetik ıslah çalışmalarında, major etkili ve basit Mendel kalıtım şekli izleyen bazı genlerin kullanılabileceği düşünülmüştür (Cemal ve Karaca, 2006) Moleküler genetik alanında son yılda elde edilen gelişmeler, ıslah edilmesi istenilen özellik ile yüksek korelasyon gösteren bu nedenle de genç yaşlarda ve cinsiyete bağlı kalmadan yüksek verimli damızlıkların belirlenmesine imkan veren genetik markırlardan yararlanmayı mümkün hale getirmiştir (Kabasakal ve ark. 2015). Bu amaçla yapılan çalışmalar sonunda her geçen gün çiftlik hayvanlarında bir verim özelliğinin iyileştirilmesinde markır gen olarak kullanılma potansiyeline sahip yeni gen ve polimorfizmler literatüre eklenmektedir. Süt ve besi sığırlarında bu amaçla yapılan çalışmalar sonunda önemli verim özelliklerinin iyileştirilme çalışmalarında kullanılabilme potansiyeline sahip ve Mendel kalıtım yolu izleyen 3600'den fazla aday gen ve polimorfizmin bulunduğu bildirilmiş (Javanmard ve ark., 2008; Jiangve ark., 2010). Ancak önerilen potansiyel aday genlerin, gerçekten markır gen olup olmadıklarının farklı sürülerde doğrulanması gereklidir. Bu nedenle son yıllarda, hayvan yetiştiriciliğinde önemli verim özellikleri yönünden eldeki popülasyonun iyileştirilmesinde moleküler markırlar ve bu markırlardaki polimorfizmler ile farklı verim özellikleri arasındaki ilişkilerin araştırıldığı çalışmalar önem kazanmıştır. Bu tür çalışmalarda iyileştirilmek istenen özelliğin ortaya çıkması sürecinde görev alan genler ve bu genlerdeki polimorfizmlere özellikle önem verilmiştir. Süt verim özelliklerinin iyileştirilmesi çalışmalarında, süt verimi direk veya indirek olarak etkileyen büyüme, sütün üretilmesi ve indirilmesi, süt kompozisyonu ve süt bileşenlerini kontrol eden genler ile meme sağlığı ile ilişkili genler araştırıcıların ilk dikkatini çeken genler olmaktadır. Süt amacıyla yetiştirilen çiftlik hayvanları türlerinde, süt verim özelliklerinin iyileştirilmesi çalışmalarında büyüme hormomu (GH), sinyal

20 5 dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü 5A (Signal Transducer and Activator of Transcription 5A, STAT5A), leptin (LEP) ve miyojenik faktör 5 (Myogenic Factor 5, MYF5 ) genlerine özellikle ilgi duyulmaktadır (Buchanan ve ark. 2003;Silva ve ark. 2002;Flisikowski ve ark. 2004; Hradeck ve ark. 2008; Dario ve Selvaggi 2011). Yapılan literatür taramasında, Türkiye de yetiştirilen Simental ırkı sığırlarda STAT5A ve MYF5 gen polimorfizminin ve bu polimorfizmler ile Simental ırkında süt verim ilişkisi araştırıldığı bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu tez çalışmasında Türkiye de yetiştirilen Simental ırkı sığırlarda STAT5A ve MYF5 gen polimorfizmi ile süt verimleri arasındaki ilişkinin araştırılması amaçlanmıştır.

21 6 2. GENEL BİLGİLER Değişen yaşam koşulları, şehirleşmedeki artış, bireylerin sağlıklı ve dengeli beslenmedeki farkındalıkları tüketicilerin sağlıklı ve kaliteli besine talebi artırmıştır. Ominivor bir canlı olması nedeniyle sağlıklı beslenme için bir insanın günlük tükettiği besin maddelerinin %50 sinin hayvansal kökenli besinler olması zorunludur (Lorcu ve Bolat, 2012). Ancak artan dünya nüfusu nedeniyle dünya genelinde yeterli, sağlıklı ve güvenilir besin kaynaklarına ulaşması giderek daha çok risk altına girmiştir. Besin kaynaklarının dengeli dağılmayışı dünyada bölgeler arasında önemli farklılıkları da beraberinde getirmiştir (Yılmaz ve Yılmaz, 2012). Üretildiği ülke için süt ve ürünleri için iç talep yüksekliği, sütün bir stratejik ürün olması nedeniyle birçok ülke süt ve ürünleri ithalat ve ihracatında korumacı tedbirler almaktadır. Diğer taraftan birçok ülke süt üreticisini korumak ve bu alanda istihtamın önünü açmak için fiyat desteği sağlamaktadır (Terin, 2014). Bu da sütün insan sağlığı yanı sıra ülke ekonomisi içinde çok değerli bir ürün olduğunu göstermektedir. Memeli canlılarda meme bezinin salgısı olan süt içerdiği protein, yağ, karbonhidrat ve mineral açısından kompleks bir besin maddesidir. Süt insan beslenmesinde özellikle protein, kalsiyum, fosfor, B2 vitamini ve B12 vitamini için oldukça önemli bir besin maddesidir. (Yetişmeyen, 1997). İçerisinde 85 civarında ayrı besin öğesi içeren sütün litresinde yaklaşık olarak 872 g su, 49 g laktoz, 35 g yağ, 35 g protein, 9 g mineral madde ve iz miktarlarda vitaminler, enzimler, organik asitler, koruyucu maddeler, hormonlar, hormon benzeri maddeler ve gazlar bulunmaktadır (Tarakçı ve ark., 2003). Süt içerdiği protein, vitamin ve mineraller nedeniyle sadece bebek ve çocukların değil, her yaştaki bireyler için de son derece değerli ve vazgeçilmez bir gıda maddesidir. Günde bir l süt tüketimi ile günlük kalsiyum ve fosfor ihtiyacının tamamı karşılanabilmektedir. Bu değerli besin maddesinden günde bebekler 700 gr, çocuklar

22 7 400 g, gençler 500 g, yetişkinler 250 g ve yaşlılar ise 350 g tüketmelidirler (Çelik ve ark., 2005). Türkiye de süt üreten tüm işletmeler kayıt altında olmadığı için gerçek süt tüketim miktarını tespit etmek zordur. Ancak satılan paketlenmiş süt miktarı bir ipucu verebilir. Türkiye de kişi başı yıllık ortalama 6 l ambalajlanmış süt tüketilirken, Finlandiya da 139 l, İspanya da 108 l, İngiltere de 100 l ve Yunanistan da ise 65 l ambalajlı süt tüketilmektedir (Erdal ve Tokgöz, 2008). Bu süt tüketim verileri göstermektedir ki her ne kadar Türkiye süt ve süt ürünleri ithalatı yapmasa da bu durumun üretimin kendine yetmesinden değil de süt tüketim alışkanlığının azlığından kaynaklanmaktadır. Dolayısıyla Türk insanının sağlıklı beslenmesi için hem süt tüketim alışkanlığının hemde süt üretim miktarının artırılması zorunludur. Kültürlere göre sığır, manda, koyun, keçi, deve ve at gibi farklı çiftlik hayvanlarından üretilmesine rağmen genel olarak süt denilince insanların aklına sığır sütü gelmektedir. Türkiye de üretilen toplam sütün %91,7 gibi çok büyük bir kısmı sığırdan elde edilmektedir (Turan ve ark., 2017). Hayvansal kökenli gıdalar içerisinde de süt içerdiği besin maddeleri yanında süte dayalı gıda sanayisinde ham madde olarak bir çok ürünün üretimine dahil olması nedeniyle çok önemli bir endüstiyel ham maddedir. Öyleki farklı çiftlik hayvanlarından elde edilen sütün %52,8 i gıda sanayisinde ham madde olarak kullanılmaktadır (Terin, 2014). Yaklaşık yüz elli yıl önce süt dünyada bir sanayi ham maddesi olarak kullanılmaya başlanmıştır. Buna karşın Türkiye de süt endüstrisine ait ilk fabrika 1957 yılında Atatürk Orman Çiftliği nde açılmıştır. Sütün endüstriyel bir ham madde olarak değerinin anlaşılmasının ardından 1963 yılında kurulan Süt Endüstrisi Kurumu (SEK), Türkiye de süt endüstrisinin hızla gelişmesine katkı sağlamıştır. Yetmişli yıllardan itibaren Türkiye de özel sektörde süt endüstrisine girmeye başlamıştır (Turan ve ark., 2017). Gerek SEK in Türkiye nin farklı bölgelerinde açmış olduğu fabrikalar, gerekse özel sektörün süt endüstrisine girmesi, endüstrinin ihtiyaç duyduğu kalite ve miktarda sütün üretilmesi için modern süt sığırı yetiştiriciliğini teşvik etmiştir (Turan ve ark., 2017). Ülkemizde üretilen sütün sadece %34 ü içme sütü olarak kullanılırken kalan kısmı süt ürünlerinin üretiminde kullanılmaktadır (Turan ve ark., 2017). Bu da

23 8 yetiştiricilerin düşük verimli yerli ırkların yetiştiriciliğini bırakarak, yüksek verimli Avrupa orijinli sığır ırklarının yetiştirilmesini zorunlu kılmıştır. İstatistik verilerine bakıldığında özellikle Türkiye süt sığır varlığı açısından önemli bir popülasyon büyüklüğüne sahiptir. Türkiye İstatistik Kurumu 2019 verilerine göre farklı yaşlarda yaklaşık 7.6 baş sağmal inek bulunmasına rağmen Türkiye deki üretilen süt ancak iç talebi karşılayabilmektedir (TÜİK,2019). Türkiye de artan şehirleşme özellikle hayvancılıkla uğraşan genç nüfusu azaltmıştır. Türkiye de köylü-şehirli nüfus oranı 1960 yılından sonra dramatik bir hızla değişmiştir. Türkiye de 1960 yılında toplam nüfusun %68.08 köyde yaşarken 2016 yılında bu oran %7.7 ye düşmüştür. Buna karşın yine 1960 yılında %31.92 olan şehirde yaşayan nüfus, 2016 yılında %92,3 e çıkmıştır. Yine 1960 yılında olan ülke nüfusu, 2016 yılında e çıkmıştır (Bostan, 2017). Köylü-şehirli nüfus oranındaki bu değişim ise herhangi bir bakım ve besleme masrafı olmamasına rağmen düşük verimleri nedeniyle hane gelirine katkısı az olan yerli sığır ırklarının yetiştiriciliğini azaltmıştır. Buna karşın artan şehir nüfusu ve tüketicilerin bilinçlenmesi de başta süt ve süt ürünleri olmak üzere hayvansal kökenli gıda talebini artırmıştır. Bu sebeplerden dolayı Türkiye de daha önce yoğun yetiştiriciliği yapılan yerli sığır ırklarının popülasyon büyüklüğünde hızlı bir azalma gözlenmiştir. Bu görüşü TÜİK verileri de desteklemektedir. TÜİK verilerine göre 2004 yılında baş olan Türkiye yerli sığır varlığı, 2009 yılında başa, 2019 yılında ise başa düşmüştür (TÜİK, 2019). Buna karşın 2004 yılında baş olan kültür-yerli melezi sığır sayısı 2009 yılında başa düşmüş ancak 2019 yılında ise başa çıkmıştır (TÜİK, 2019). Aynı şekilde Türkiye kültür ırkı sığır varlığı 2004 yılında baş iken, kararlı bir artışla 2009 yılında başa, 2019 yılında ise başa çıkmıştır (TÜİK, 2019). Yukarıdaki savı destekler şekilde bu veriler göstermektedir ki Türkiye yerli sığır varlığında 2004 yılından 2019 yılına kadar %56,2 lik bir azalma varken, kültür-yerli melezlerinde %79,8 lik, kültür ırkı hayvan sayısında ise %294 lük bir artış olmuştur. Bu veriler de göstemektedir ki yıllar bazında Türkiye de yüksek verimli sığır varlığında ciddi bir artış olmuştur. Ancak yüksek verimli sığır varlığındaki bu artışa rağmen üreten nüfüsun azalması, tüketen nüfüsun artması üretilen hayvansal kökenli gıda miktarının yetmemesiyle, bu durum ise yüksek

24 9 fiyatla sonuçlanmaktadır. Bu sorunun çözümüne en büyük faktör eldeki hayvan varlığından daha çok ürün elde etmektir. Türkiye de 2018 yılı itibariyle toplam süt üretimi bakımından dünyada 8. sırada iken, ortalama laktasyondaki kültür ırkı inek başına süt verimi 3143 kg gibi oldukça düşük bir rakamdadır (Karaağaç ve Genç, 2019; Zulkadir ve Jarshaji, 2019). Bu rakam ABD de inek başına 9219 kg iken Avrupa Birliği ülkelerinde 6012 kg dır (Mundan ve ark., 2020). Türkiye bulunduğu coğrafya, doğa ve iklim koşulları nedeniyle farklı hayvancılık dalları için oldukça uygun koşullara sahiptir. Herhangi bir hayvancılık işletmesinde karlılık eldeki hayvan varlığının genetik kapasitesi ile doğrudan ilişkilidir. Süt sığırcılığı işletmelerinde gelirin %54-65 i üretilen sütten elde edilmektedir (Şahin ve ark., 2001). Bu nedenle bir sağmal inekten elde edilen sütün maliyetinin (işçilik, sağlık ve besleneme giderleri), süt satışından elde edilen gelirin altında olması gereklidir. Bu da ya elde edilen aynı miktarda sütün maliyetinin düşürülmesi, ya da birim hayvan başına elde edilecek süt miktarının artırılması ile sağlanabilir. Dolayısıyla işletmelerin süt üretimlerindeki başarısı eldeki hayvan varlığının ırkı ve genetik kapasite ile doğrudan ilişkilidir. Genel olarak tüm dünyadaki çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde, eldeki düşük verimli çiftlik hayvanlarının ıslahında Avrupa orijinli ırklar kullanılmıştır. Ancak bu uygulama diğer yetiştiricilik dallarına nazaran en yoğun süt sığırı yetiştiriciliğinde uygulanmıştır. Bu alanda da en çok kullanılan ırk tüm dünyada olduğu gibi Türkiye de de Holştayn ırkı olmuştur. Ancak Türkiye gibi kırmızı et ihtiyacını büyük oranda sığırdan karşılayan ülkelerde, saf sütçü sığır ırkları yerine, etçi-sütçü (Simental-Fleckvieh) veya sütçü-etçi (İsviçre Esmeri) ırklarının yetiştirilmesi de önemli bir seçenektir. Türkiye de son yıllarda etçi-sütçü bir kültür ırkı olan Simental ırkına da ilgi artmaktadır. Saf örneklerinin yanında et verim kabiliyetleri nedeniyle Simental melezleri de yetiştiriciler tarafından çokça tercih edilmektedir (Bakır ve Kibar, 2019). Türkiye deki süt ve kırmızı et sektörlerindeki gelişmeler süt üreticisini, et verimi ve kalitesi yüksek olması nedeniyle, erkek buzağılarından daha fazla gelir elde edeceğini düşündüğü Simental ırkına yönlendirmiştir. Bu gelişmelere bağlı olarak başta Almanya ve Avusturya olmak üzere son yıllarda Türkiye ye önemli miktarda damızlık materyal olarak SIM ırkı gebe düve getirilmeye başlanmıştır. Bu eğilim sonucu SIM Türkiye de

25 10 Holştayn ırkından sonra en fazla yetiştirilen ırk durumuna getirmiştir (Kaygısız ve Harmandar, 2018). Türkiye de ilk olarak 1925 yılında Macaristan dan ithal edilen 15 baş sığırla başlanan Simental yetiştiriciliğine, ırkın Türkiye şartlarına uygun olmadığı gerekçesiyle 1970 yılına kadar ara verilmiştir (Akbulut, 1998; Özkan ve Güneş, 2007; Koç, 2016). Bu tarihten sonra tekrar başlanan Simental yetiştiriciliği için Doğu Anadolu Bölgesinin uygun olduğu bildirilmiş olmasına rağmen, günümüzde Türkiye Simental yetiştiriciliğinde İç Anadolu Bölgesi önemli bir yer tutmaktadır (Deliömeroğlu ve ark., 1996). İsmini Batı İsviçre'nin Bernese Oberland bölgesinde bulunan Simme vadisinden alan Simental sığır ırkı çok yönlü verim özelliği (et+süt+çeki gücü) olan bir sığır ırkıdır (Qanbari ve ark., 2014). Adaptasyon kabiliyeti yüksek olan Simental ırkı dünyada Holştayn ırkından sonra en fazla yetiştirilen Avrupa kökenli sığır ırkıdır (Koç, 2016.). Bu ırk Kuzey Amerika dan, Afrika ya kadar tüm kıtalarda ve birçok ülkede yetiştirilmesine rağmen oransal olarak en çok Avrupa kıtasında yetiştirilmektedir (Koç, 2016). Sarı-beyaz alaca Simental ırkında en çok görülen don iken, bu ırkta kırmızı-beyaz alaca donlu bireylerde görülmektedir. Simental ırkında çoğunlukla baş beyazdır. Ancak büyük olmamakla birlikte başta sarı veya kırmızı lekelerde bulunabilir. Yüksek arazi ırkı olması ve ırkın kombine verimlerinden birininde iş gücü olması nedeniyle Simental ırkında sağlam tırnak, uzun ve kuvvetli sırt, derin ve geniş gögüs ırk özelliğidir. Irkın ergin dişileri ortalama 650 kg, ergin erkekler ise kg canlı ağırlığa sahiptirler (Alpan, 1991; ESK, 2020). Simental ırkında dişi damızlıklar ilk buzağılarını ay arasında verirken, damızlık bir inek fertil hayatı süresince ortalama beş yavru verirler. Sağmal dişiler yıllık %4 yağlı ortalama 4000 kg süt veriler (Alpan, 1991). Almanya da yetiştirilen Simentaller %3.9 yağlı, kg süt verirken (Götz ve ark.,2015), İtalya da yetiştirilen Simentallerin ise %3.86 yağlı 6700 kg süt verdikleri bildirilmiştir (Chessa ve ark., 2015).

26 Süt Sığırcılığında Verim Artımında Gen ve Genetik Polimorfizmlerin Kullanımı Dünyada 1960 yılından itibaren beslenme, hastalık kontrolü ve genetik iyileştirme çalışmaları sonucunda çiftlik hayvanlarındaki farklı verim özelliklerinde (et üreten türlerin karkas ağırlığı, süt ineklerinin süt verimi ve kanatlılarda yumurta üretimi dahil) verim aşağı yukarı % artmıştır (Thornton, 2010). Çiftlik hayvanlarında genetik iyileştirme çalışmaları düşük verimli yerli ırkların yüksek verimli kültür ırkları ile yer değiştirilmesi, düşük verimli yerli ırkların yüksek verimli kültür ırkları ile melezlemeleri ve ırk içi seleksiyon uygulamaları şeklinde yapılmıştır (Georges ve ark., 2019). Bu uygulamalardan, eldeki ırkların yer değiştirilmesi bir sefer, melezleme uygulamaları çevirme melezlemesi uygulanıyorsa en fazla altı kez yapılırken, ister melezleme ister saf yetiştirme olsun seleksiyon uygulamaları devamlı yapılır. Seleksiyon çalışmaları ile elit hayvanların genetik özelliklerinin global ölçüde yayılmasına olanak veren suni tohumlama ve embriyo transferi gibi yardımcı üreme tekniklerinin birlikte kullanımı ile farklı tür ve ırklarda çok önemli genetik ilerlemeler sağlanmıştır. Örneğin, Amerika Birleşik Devletleri'nde 1924 yılında 1890 kg olan inek başına ortalama yıllık süt verimi, 2011 yılında 9682 kg'a yükselmiş ve hayvan başına süt verimindeki bu ilerlemenin %50'den fazlasının seleksiyon uygulamaları sonucu elde edilen genetik ilerleme olduğu bildirilmiştir (Thornton, 2010). Benzer şekilde 1957 ve 2001 yılları arasında et verimi için yapılan genetik iyileştirme çalışmaları sonucunda yem tüketimindeki azalmaya rağmen, pazara sunulan piliçlerin ağırlığı üç kat artmıştır (Havenstein ve ark., 2003; Sigel, 2014). Genel olarak çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde yapılan başarılı seleksiyon uygulamaları sonucunda her yıl yaklaşık olarak %1-3 genetik ilerleme elde edilir (Thornton, 2010). Çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde yapılan seleksiyon çalışmalarında özellikle 2000 li yılların başına kadar çoğunlukla uzun ve masraflı klasik seleksiyon yöntemleri kullanılmıştır. Klasik seleksiyon uygulamaları sığır gibi uzun jenerasyon aralığına sahip türlerde, pubertadan sonra veya kesimden sonra belirlenebilen ve bir cinsiyette görülen özellikler için daha da zor ve masraflıdır. Bu uygulamalar masraflı olmaları nedeniyle dişi damızlıklarda değil de erkek damızlık seçiminde kullanılırlar. Süt verimi için bir klasik seleksiyon uygulaması olan projeni test uygulamasında, her bir boğa adayı için

27 12 yüzlerce ve hatta elde edilecek verilerin doğruluğunun artırılması için binlerce kızının verilerinin değerlendirilmesi gereklidir. Bu işlemin ise boğa adayı başına en az beş yıl verilerin takibi ve analizi ile en az 50 bin dolar maliyeti vardır (Wiggans ve ark., 2017). Bu nedenle yaş ve cinsiyetten bağımsız bir şekilde yüksek damızlık değere sahip damızlıkların başarılı bir şekilde seçilmesine olanak veren farklı seleksiyon uygulamalarına ihtiyaç duyulmuştur. Moleküler genetik alanında elde edilen gelişmeler sonunda, klasik seleksiyon uygulamalarında karşılaşılan kısıtlamalardan sıyrılmış ve klasik seleksiyon uygulamaları ile birlikte kullanılınınca seleksiyonun etkinliğini artırma potansiyeline sahip genomik seleksiyon ve genetik markır destekli seleksiyon uygulamaları çiflik hayvanları yetiştiriciliğinde seleksiyon uygulamalarına dahil olmuştur. Son otuz yıldır, DNA markırlar çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde kalıtsal hastalıkların teşhisi, ebeveyn tayini ve verimle ilişkilerinin araştırılmasına ilgi artmıştır (Wiggans ve ark., 2017). Çiftlik hayvanlarında elli yıl önce akrabalık tayininde kan grupları ve kan protein polimorfizmlerinin kullanılmaya başlanması, araştırıcıların bir takım polimorfizmlerin verimlerin iyileştirilmesinde kullanılıp kullanılamayacağı sorusunu sormalarına yol açmıştır. Özellikle 1980 li yıllarda geliştirilen Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) tekniğinin kolay uygulanmasına izin veren cihazların geliştirilmesi sonrasında, 1990 lı yıllardan itibaren genetik markırların seleksiyon amacıyla süt sığırı yetiştiriciliğinde kullanılıp kullanılmayacağının araştırıldığı çalışmalarda patlama yaşanmıştır (Wiggans ve ark., 2017). Genel olarak ekonomik önemi olan verim özellikleri, ortaya çıkmasında küçük etkili ve toplamalı etkiye sahip birçok genin görev aldığı kompleks poligenik kantitatif özelliklerdir. Dolayısıyla bu özelliklerdeki fenotipik varyasyonlar, çevre ve bireyin genomu boyunca dağılmış olan çok sayıdaki genotipik farklılıkların birlikte etkileri sonucu ortaya çıkmaktadır. Çiftlik hayvanlarındaki ekonomik açıdan önemli olan özelliklerin kalıtım dereceleri (yani fenotipte genetik faktörlerin neden olduğu varyansının oranı) ~% 5 ila% 50 arasında değişmektedir (Georges ve ark., 2019). Dolayısıyla süt verimi gibi kantitatif bir özelliğin iyileştirilmesi için, bu özelliğin ortaya çıkmasında görev alan bir veya birkaç genden yararlanılamaz (Cole ve ark., 2009). Bu küçük etkili genlerin etkileri ancak, bir çok gen ve bu genlerdeki tek nükleotid polimorfizmlerin (SNP) depolandığı SNP çip teknolojisi kullanılarak belirlenebilir. SNP

28 13 çip analizi sonrasında elde edilen verilerin de hassas ve uzmanlık gerektiren istatistik analizler ile değerlendirilmesi gereklidir. Diğer taraftan SNP çip teknolojisi oldukça pahalı bir işlemdir (Andersson, 2001; Misztal, 2006; Wiggans ve ark., 2017). Bu nedenle süt sığır yetiştiriciliğinde dişi damızlıklar genelde göz ardı edilerek sadece projeni test boğalarında, elde edilen projeni test sonuçlarının kuvvetlendirilmesi için kullanılabilir. Nitekim bu uygulamalar tüm dünyaya sperm satan ülkelerde damızlık boğa seçiminde rutin olarak kullanılmaktadır. Bunun sonucu olarak süt verimi gibi kalıtım derecesi orta düzeyde (h 2 =0.3) olan özellikler için genetik değerin her yıl %50-100, döl verimi gibi (h 2 =0.05) özellikler için ise % arttığı bildirilmektedir (Georges ve ark., 2018; 102). Ancak iyileştirilmesi istenen özellik üzerine major etkisi olan gen veya polimorfizmlerin belirlenmesi durumunda, tüm popülasyon oldukça ucuz bir şekilde değerlendirilebilir. Özelde süt sığırı yetiştiriciliğinde, genelde ise tüm çiftlik hayvanları yetiştiriciliğinde fiyat-fayda analizi yapıldığında en optimum yöntem, bilinen kantitatif özellik lokusları ile bağlantılı olan genetik markırlar kullanılarak fenotipten, yaştan ve cinsiyetten bağımsız olarak seleksiyon yapılmasına izin veren markır destekli seleksiyon uygulamalarıdır (Soller, 1994). Bu amaçla yapılan çalışmalarla çiftlik hayvanlarında seleksiyon uygulamalarında kullanılabilecek, genotipleme maliyeti nispeten düşük olan bir çok aday gen ve polimorfizm belirlenmiştir (Wiggans ve ark., 2017). Bu amaçla yapılan çalışmalar sonunda şimdiye dek MSTN geninin sığır ve koyunlarda (Kambadur ve ark., 1997; Clop ve ark., 2006), RYR1, PRKAG3 ve IGF2 genlerinin domuzlarda (Fujii ve ark., 1991; Milan ve ark., 2000; Van Laere ve ark., 2003) et verimi için; DGAT1, GHR ve ABCG2 genlerinin sığırlarda süt verimi için (Grisart ve ark., 2002; Blott ve ark., 2003; Cohen-Zinder ve ark., 2005); PLAG1, HMGA2 ve LCORL genlerinin ise sığırlarda boy uzunluğu ve cidago yüksekliği için (Karim ve ark., 2011; Bouwman ve ark., 2018) major etkili genler olduğu bildirilmiştir. Süt sığırı yetiştiriciliğinin besi sığırcılığından farklı olarak, üretilen sütün günlük paraya çevrilebilmesi, damızlık değerini kaybetmiş damızlıkların kesilmesi, erkek yavruların gerek buzağı iken satılması gerekse besiye alınarak besi sonu kesime sevk edilmesi, dişi buzağı ve gebe düve satışı gibi birçok gelir kaynağı bulunmaktadır. Ancak bu işletmelerde en büyük geliri süt satışı oluşturduğu için sürüde, sağlık ve döl verim

29 14 özelliklerinde gerilemeye sebep olmadan eldeki damızlık hayvanlarda süt verimin artırmak, işletmelerde karlılık için önemlidir. Süt tüm memelilerde yavru beslenmesi için çok değerli besin olduğu için süt verimi etçi sığır ırkları açısından da önemli bir özelliktir. Bu nedenle özellikle süt sığır yetiştiriciliğinde, süt üretiminin artırılmasına yönelik seleksiyon çalışmalarında kullanılma potansiyeline sahip genler bu genlerde bulunan polimorfizmlerin ortaya konulmasına yönelik moleküler genetik çalışmalarda gittikçe artmaktadır (Maryam ve ark., 2016). Farklı sığır ırkları ve popülasyonlarda bu amaçla yapılan araştırmalar sonucunda süt verimi için yapılacak seleksiyon çalışmalarında kullanılabilecek bazı aday gen ve polimorfizmler bildirilmiştir (Jiang ve ark., 2010; Khatib ve ark., 2008). Yine bu amaçla yapılan ilişki analizleri ve kromozom haritalama çalışmaları sonunda sığırlarda süt verimi ile ilişkili bazı lokuslar ve kromozomların bulunduğu gösterilmiştir. Bu çalışmalardan elde edilen bulgular sonunda sığırlarda süt verimi ile ilişkili lokusların otozomal 1. ve 14. kromozomlarda, süt kalitesiyle ilişkili lokusların otozomal 6., 9. ve 21. kromozomlarda (Coppieters ve ark., 1998), sütteki protein ve yağ oranı ile ilişkili lokusların ise 9., 10. ve 20. kromozomlarda bulundukları bildirilmiştir (Vaiman ve ark., 1999). Bu tür çalışmalarda araştırıcılar ilk olarak sütün üretimi (büyüme hormonu, prolaktin vb.) ve süt kompozisyonunu oluşturan süt proteinleri (kapa-kazein vb.) ve peynir altı suyu (beta-laktoglobülin vb.) proteinlerinin üretilmesinden sorumlu genlerdeki polimorfizmler ile süt verim özellikleri arasındaki ilişkileri araştırmışlardır (Bobe ve ark., 1999; Kovács ve ark., 2006) Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü 5A (Signal Transducer and Activator of Transcription 5A, STAT 5A) Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü 5A (Signal Transducers and Activators of Transcription 5A, STAT5A) proteini; canlılarda hücre çoğalması, hücre farklılaşması ve programlı hücre ölümü olan apoptozis mekanizmalarında görev alan ve STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B ve STAT6 olarak isimlendirilen

30 15 yedi üyeden oluşan STAT protein ailesininin bir üyesidir (Bao ve ark. 2010; Dario ve ark., 2011). STAT protein ailesi bu görevlerini sitoplazmada sinyal dönüştürücü ve çekirdekte transkripsiyon aktivatörleri olarak görev yapması ile yerine getirir. Bu görevlerinden dolayı STAT ailesine ait proteinler birçok peptit yapılı hormonun ve sitokinlerin görevlerini yerine getirmelerine aracılık ederler (Kisseleva ve ark., 2002). Somatotropik aksisin bir üyesi olan ve meme bezi faktörü olarak da bilinen STAT5, ilk olarak prolaktin hormonunun transkripsiyon faktörü olarak, prolaktin hormonunun süt proteinleri kodlayan genlerinin transkripsiyonunu aktive etmesinde, prolaktin sinyal yolağı için önemli bir hücre içi aracısı olduğu keşfedilmiştir (Coşier ve ark., 2010). Daha sonra STAT5 nın hücre ve dokularda büyüme hormonunun etkisinin de ana aracısı olduğu da belirlenmiştir (Argetsinger ve Carter-Su, 1996). ilk olarak koyunlarda keşfedilen STAT5 geninin sığır, insan, rat ve farede %90 ı identik olan, STAT5A ve STAT5B olarak adlandırılan iki formu bulunmaktadır (Flisikowski ve ark., 2004; Selvaggi ve ark., 2009; Dario ve ark., 2011). STAT5A geni tarafından kodlanan protein, STAT ailesinin yukarıda belirtilen görevleri dışında, meme bezi hücrelerinde süt proteinlerinin sentezlenmesinde görevli olan prolaktin ve büyüme hormonlarının etkilerini kontrol eder. Bu nedenle STAT5A geninin meme bezininin laktasyona hazırlanması, laktasyonun başlaması ve devam etmesinde de önemli rolü bulunmaktadır (Flisikowski ve ark., 2004). STAT5A geni interferon ve plasental laktogen sinyal yolağında olduğu için hem süt verimi hemde fertilite için oldukça önemlidir (Coizet ve ark., 2018). Sığırlarda 19. kromozom (BTA19) üzerinde bulunan, 19 ekzondan oluşan bç uzunluğunda bir gen olan STAT5A geni 794 amino asitlik bir proteini kodlar (Seyfert ve ark., 2000). Prolaktin ve büyüme hormonlarının görevlerini yerine getirmesindeki aracılık rolü nedeniyle STAT5A geninin çiftlik hayvanlarında süt ve et verimi özellikleri için potansiyel aday gen olduğu düşünülmektedir (Flisikowski ve ark., 2004; Bao ve ark. 2010). Yapılan literatür taramasında, polimorfizm çalışmalarına rastlanılmasına rağmen Simental ırkı sığırlarda STAT5A geni ve 305 günlük süt verimi arasındaki ilişkinin araştırıldığı çalışmalara gerek dünyada gerekse Türkiye de rastlanılmamıştır.

31 Miyojenik Faktör 5 (Myogenic Factor 5, MYF5 ) Zigotun oluşumuyla başlayan büyüme, hücre sayısındaki artışı ve hücrelerde farklılaşmayı da içeren oldukça karmaşık bir süreçtir (Ujan ve ark., 2011). Bu süreçte miyojenik faktör 3 (MYF3), miyojenik faktör 4 (MYF4 veya Myogenin, MyoG), miyojenik faktör 5 (MYF5 ) ve miyojenik faktör 6 (MYF6) olarak adlandırılan dört üyeden oluşan miyojenik belirleme (myogenic determinasyon-myod) gen ailesi önemli görevler üstlenmektedir. Bu ailede bulunan MYF5 ve MYF6 genleri, kas liflerinin uzaması ve büyümesinde önemli rol oynamaktadır. Bu genlerden MYF5 in çiftlik hayvanlarında büyüme ve et kalite özellikleri için potansiyel bir aday gen olabileceği düşünülmüştür (Li ve ark., 2004). Sığırlarda 5. kromozom (BTA5) üzerinde bulunan MYF5 geni 5219 bç uzunluğunda üç ekzon ve iki introndan oluşmaktadır (Li ve ark., 2002; Maak ve ark., 2006). Sığırlarda MYF5 geninin ikinci intronunun 1948 bç pozisyonunda bulunan bir A/G değişimi ile ortaya çıkan SNP nin kas gelişimi ve büyüme üzerine etkili olduğu bildirilmiştir (Drögemüller ve Kempers, 2000). Bu savın doğrulanması amacıyla sığırlarda yapılan bir çalışmada, MYF5 geni ile doğum ağırlığı ve doğumdan sütten kesime kadar ortalama günlük canlı ağırlık artışı, günlük canlı ağırlık artışı ve et kalitesi arasında ilişki olduğu bildirilmiştir (Zhang ve ark., 2007). Yapılan literatür taramasında Kıyıcı ve ark. (2018) tarafından Türkye de yetiştirilen Holştayn ırkında MYF5 geni ile süt verimi arasındaki ilişkiyi araştırıldığı çalışma dışında farklı sığır ırklarında MYF5 geni ile süt verimi arasındaki ilişkinin araştırıldığı farklı bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Kıyıcı ve ark. (2018) tarafından yapılan bu çalışmada GG genotipi ile süt verimi arasında ilişki olduğunu bildirmişlerdir. Ancak yapılan literatür taramasında Tükiye de ve dünyada Simental ırkında MYF5 geni ile süt verimi arasındaki ilişkinin araştırıldığı bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Yapılan bu tez çalışmasında, Türkiye de yetiştiriciliği ve popülasyon büyüklüğü son yıllarda gittikçe artan Simental ırkı sığırlarda farklı verim özellikleri için potansiyel aday gen olan STAT5A ve MYF5 genleri ile 305 günlük süt verimleri arasındaki ilişkinin araştırılması amaçlanmıştır.

32 17 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Hayvan Materyali Çalışma için ERÜ Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulundan onay alınmış ve çalışma etik kurul yönergesine uygun bir şekilde yapılmıştır (Etik Kurul Tarih-Karar No: /72). Bu tez çalışmasında hayvan materyali olarak tamamı 2.laktasyonunu bitirmiş süt verim kayıtları bulunan Kayseri ili ve civarında süt sığırcılığı yapan işletmelerde bulunan 202 baş Simental ırkı canlı sağmal inek çalışma materyalini oluşturmuştur. Çalışmada hedeflenen genotip-fenotip ilişkisinin kurulabilmesi amacı ile herbir örneğin 1. ve 2. laktasyona ait laktasyon süt verimi, 305 günlük süt verimi, laktasyon süresi, ortalama günlük süt verimi, gebelik başına tohumlama sayısı, genel sağlık durumları ve mastitis hastalığı geçirip geçirmedikleri kaydedilmiştir. Laktasyon süt verimi, ineğin günlük süt verimi ölçümleri toplanarak bulunmuştur. Her bir örneğe ait 305 günlük süt verimi hesaplanırken laktasyon süresi 305 günden fazla olanların laktasyon verimleri 305 güne göre düzeltme faktörleri kullanılarak düzeltilmiştir (Kendirck 1955, Alpan 1990). Çalışmada kullanılan DNA örnekleri, işletmenin teşhis amacıyla rutin olarak almış olduğu kanlardan elde edilmiştir 3.2.Kan Alımı Genotipleme amacıyla kullanılan DNA lar, işletmelerin yetkili veteriner hekimleri tarafından projede incelenen Simental ırkı ineklerin vena jugularislerinden 10 ml lik steril vakumlu EDTA lı tüplere alınarak tüplerde hemoliz ve pıhtılaşma olmaması için alt üst edilerek Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Genetik Ana Bilim Dalı laboratuarına uygun koşullarda transfer edilmiştir. Kan örnekleri, DNA izolasyonu yapılıncaya kadar -80 o C de muhafaza edilmiştir.

33 DNA İzolasyonu Çalışmada fenotip verileri bulunan Simental ırkı sığırların MYF5-Tag1 ve STAT5A-Aval polimorfizmleri yönünden genotiplerinin belirlenmesi için yapılan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için gerekli Laboratuar analizlerinde kullanılan DNA lar fenolkloroform-izoamil alkol (25:24:1) yöntemi ile izole edilmiştir (Sambrook ve ark,,1989). İşlemin ilk basamağında steril 1,5 ml lik ependorf tüplerine 100 er μl kan örneği konulmuştur. Ependorf tüpe konulan kan örneklerinin herbirinin üzerine 300 μl 1 x TNE solüsyonu, 30 μl Tris-HCI (ph 8.0), 5 μl proteinaz K (10 mg/ml) ve 10 μl %20 lik SDS solüsyonu eklenerek vorteksle homojenize edilmiş ve önceden 50 C ye ısıtılmış kuru etüvde bir gece bekletilmiştir. İzolasyonun ikinci basamağında bir gece etüvde bekletilmiş örneklerin herbirine 445 μl fenol eklenerek 10 dakika alt üst edilerek homojenizasyon işlemi gerçekleştirilmiş ve devirde +4 C de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda üst faz otomatik pipet yardımıyla yeni bir steril ependorf tüpe alınarak üzerine 445μl fenol-kloroform karışımı eklenmiştir. Homojenizasyon işlemi sonrasında örnekler devirde +4 C de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda üstteki faz otomatik pipet yardımıyla dikkatlice alınarak başka bir steril etiketli ependorf tüpe konulmuştur. Örneklerin üzerine 890 μl -20 C de muhafaza edilen %100 lük saf etil alkol eklenmiştir. Etil alkol eklendikten sonra ependorf tüpler DNA iplikçikleri kümeleşinceye kadar 4-5 kez hafifçe alt üst edilmiştir. Kümeleşen DNA iplikçikleri devirde 10 dakika +4 C de santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda üstteki alkol fazı uzaklaştırılarak tüplerin dibine çökmüş olan DNA peletlerinin üzerine 890 μl %70 lik etil alkol eklenmiştir. Alkol eklenen tüpler devirde+4 C de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda tüpün üst kısmından ayrılan alkol fazı uzaklaştırılmıştır. Tüpler içindeki alkolün tamamen uzaklaşması için etüvde kurumaya bırakılmıştır. Kuruma işlemi tamamlanan tüplerin herbirinin üzerine 100 μl TE buffer (10 mm Tris, 1 mm EDTA ph 8.0) konularak DNA peletinin çözülmesi için bir gece buzdolabında bekletilmiştir. DNA izolasyon işleminin başarılı olup olmadığının kontrolü amacıyla her örnekten 2 şer μl alınarak STAT5A için %2 lik ve MYF5 için %3 lük agoroz jelde 15 dakika elektroforez işlemi gerçekleştirilmiştir. Elektroforez sonunda, jel görüntüleme sistemi Kodak Gel Logic 200 Imaging System ile DNA varlığı kanıtlanmıştır.

34 19 DNA İzolasyonu sonrasında elde edilen örnekler polimeraz zincir reaksiyonunda (PCR) kullanılıncaya kadar +4 C de muhafaza edilmiştir DNA İzolasyonu İçin Kullanılan Solüsyonlar ve Hazırlanış Formülleri; 1 X TNE (Toplam 30 ml) 1.5 ml Tris-HCL (ph 8.0) 3 ml 1 M NaCl 300 μl 0,5 M EDTA (ph 8.0) 25,2 ml ddh 2 O Tris-HCL ph 8.0 (1L) 12.1 g Tris 800 ml distile su HCL ile ph ayarlandıktan sonra distile su ile 1 litreye tamamlanır MYF5 için Yapılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) İncelenen örneklerin MYF5-TaqI polimorfizmi yönünden genotiplerinin belirlenmesi amacıyla yapılacak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) işleminde primer olarak (Şahin ve Akyüz 2017), tarafından önerilen ve ileri dizisi: F:5 -AGAGCAGCAGTTTTG ACAGC-3 ; geri dizisi: R:5 -GCAATCCAAGCTGGATAAGG-3 olan primer seti kullanılmıştır. PCR işlemi için gerekli olan reaksiyon karışımı örnek başına 25 l olacak şekilde stok olarak buz üzerinde hazırlanmış; (0.1 l Taq polimeraz (5 U/ l) + 50 M dntp + 2,5 mm MgCl M ileri primer M geri primer). 0,2 ml lik ependorf tüplere aktarılmasını takiben her bir örnek için 1,5 l DNA eklenerek PCR (Qiagen SensoQuest, Germany) reaksiyonu başlatılmıştır. PCR uygulaması 94 C de 4 dakika ilk denatürasyondan aşamasından sonra, her bir döngüsü; 94 C de 30 saniye, 58 C de 1 dakika, 72 C de 1 dakika, olacak şekilde 38 döngü olarak yapılmıştır. Son döngüyü takiben reaksiyon cihazdaki tüplerin son uzama için 72 C de 4 dakika

35 20 tutulmasından sonra PCR işlemi sonlandırılmıştır. PCR ürünleri Taql enzimi ile kesim işlemine tabi tutulana kadar +4 o C de bekletilmiştir STAT5A için Yapılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) STAT5A-AvaI polimorfizminin belirlenmesi için yapılan PCR işleminde, primer olarak Flisikowski ve ark. (2003), tarafından önerilen ileri: F:5 -CTGCAGGGCTGTTCT GAGAG-3 ve geri: R:5 -TGGTACCAGGACTGTAGCACAT-3 ' olan primer seti kullanılmıştır. PCR işlemi için gerekli olan reaksiyon karışımının hazırlanması, karışımın tüplere aktarılması ve örneklere ait DNA ların ilavesi MYF5-TaqI polimorfizmi için uygulanan protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir. PCR işlemi; 94 o C de 4 dakika ön denatürasyonu takiben, herbir döngüsü; 94 o C de 1 dakika, 64 o C de 1 dakika, 72 o C de 1 dakika, olacak şekilde 34 döngü olarak yapılmıştır. Son döngüyü takiben örneklerin son uzama için 72 o C de 15 dakika tutulmasından sonra PCR sonlandırılmıştır. PCR ürünleri AvaI enzimi ile kesim işlemine tabi tutulana kadar +4 o C de bekletilmiştir ELEKTROFOREZ Elektroforez işleminde tampon çözeltisi olarak Tris-Borik asit-edta (TBE) tampon çözelti olarak kullanılmıştır. Elektroforez çözeltisi 5X yoğunlukta stok solüsyon olarak hazırlanmıştır. Stok solüsyonu; 54 g Tris Base; 27,5 g Borik asit; 20 ml 0,5 M EDTA (ph 8.0) oranında 1 litre distile suda çözdürülerek hazırlanmış ve oda ısısında muhafaza edilmiştir. Hazırlanan stok solüsyon 0,5X oranında seyreltilerek kullanılmıştır Jel in Hazırlanması ve Dökülmesi Çalışmada, jel PRONA Basica agaroz kullanılmıştır. Jel, PCR-RFLP ürünlerinin görüntülenmesi için STAT5A %2 lik, MYF5 için %3 lük agaroz jel hazırlanmıştır. Hazırlanan karışımlar tamamen saydamlaşıncaya kadar ısıtılmıştır. Isıtma işlemi sonunda şeffaflaşan herbir jel üzerine 5 μl oranında Syber Safe (abm, SafeView Classic G108) eklenmiştir. Çalışmada, elektrotlar arasındaki mesafe 10 cm olan Owl marka elektroforez tankı kullanılmıştır. Jel, boyutları 9 x 8 x 0,5 cm olan ve UV ışık geçiren jel teknesine

36 21 dökülmüştür. Jel teknenin içerisine döküldükten sonra jel tarağı jele yerleştirilmiş ve jelin katılaşması beklenmiştir. Tekneye dökülen jelin şeffaf olan görünümünün opak görünüme dönüşmesiyle jelin donduğu anlaşılmıştır. Taraklar, katılaşan jeli yırtmadan dikkatlice çıkarılmış ve jel elektroforez tankına yerleştirilmiştir. Tank içerisine, jelin üstünü tamamen örtecek kadar elektrolit çözeltisi eklenmiştir Kuyulara Örneklerin Yüklenmesi ve Sonuçların Görüntülenmesi PCR reaksiyonu sonunda elde edilen ürünler jel loading dye (Termo Scientific 6x Dna lading dye) karıştırılarak kuyulara otomatik pipet yardımıyla konulmuştur. En son kuyuya da PCR ürünlerinden elde edilecek bantların belirlenmesi için 100 bç lik (MBI Fermentas SMO241) standart DNA merdiveni (DNA Ladder) yüklenerek elektroforez işlemi başlatılmıştır. Elektroforez, 100 V 300 ma de 30 dakika elektrik gerilimi uygulanarak gerçekleştirilmiştir. Jeldeki örneklerin ilerleyişleri izlenerek sürenin sonunda elektroforez bitirilmiş ve jel görüntülenme sehpasında incelenmiştir. Elektroforez sonunda jel teknesi, üzerindeki jel ile birlikte tanktan alınarak jel görüntülenme cihazına konulmuştur. Syber Safe (abm, SafeView Classic G108) ile boyanan DNA molekülü UV ışıkta, flüoresan ışıma göstermiştir ve bu ışımanın görülmesiyle PCR sonunda aranan bantların varlığı kanıtlanmıştır. Elde edilen görüntüye göre UV ışığı altında, beklenen STAT5A ve MYF5 PCR ürünleri için aranan bantların görülmesini takiben fotoğrafları çekilmiştir. Fotoğraf çekimi Kodak Gel Logic 200 Imagine görüntüleme sistemi ile yapılmıştır. PCR ürünleri daha sonra TaqI endonükleaz ve Aval restriksiyon enzimi ile kesilerek, incelenen örneklerin STAT5A ve MYF5 allel ve genotip yapılarının belirlenmesinde kullanılmıştır TaqI Restriksiyon Enzimi ile PCR Ürünlerinin Kesilmesi MYF5-TaqI polimorfizminin belirlenmesi için yapılan PCR işlemi sonunda elde edilen 512 bç lik PCR ürünleri, bireylerin genotiplerinin belirlenmesi için TaqI (Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA) restiksiyon enzimi ile kesim işlemine tabi tutulmuştur. Kesim işlemi, örnek başına son hacim 20 l olacak şekilde hazırlanan karışım üzerine 5 l PCR ürünü ekleyerek yapılmıştır. Kesim işlemi örneklerin 65 o C de 4.30 saat tutulmasını takiben 20 dakika 80 o C de enzim

37 22 inaktivasyonu gerçekleştrilerek tamamlanmıştır. Enzim kesim ürünleri, %2 lik agaroz jel elektroforezi işlemine tabi tutularak genotiplenmiştir. Elektroforez sonunda MYF5- TaqI polimorfizmi yönünden AA genotipli bireylerde 512 bç uzunluğunda tek bant, AG genotipli bireylerde 512 bç, 396 bç ve 116 bç uzunluğunda üç bant, GG genotipli bireylerde ise 396 bç ve 116 bç uzunluğunda iki bant gözlemlenmesi beklenmiştir AvaI Endonükleaz Enzimi ile PCR ürünlerinin Kesilmesi İncelenen Simental ırkı ineklerde STAT5A-AvaI polimorfizmin belirlenmesi için yapılan PCR işlemi sonunda elde edilen 215 bç lik PCR ürünleri AvaI (Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA) restiksiyon endonükleaz enzimi ile kesim işlemine tabi tutulmuştur. Kesim işlemi, örnek başına toplamda 20 l olacak şekilde hazırlanan karışım üzerine 5 l PCR ürünü ekleyerek yapılmıştır. Kesim işlemi, örneklerin 37 o C de 4.30 saat tutulmasını takiben 20 dakika 65 o C de enzim inaktivasyonu gerçekleştirilerek tamamlanmıştır. Enzim kesim ürünleri %3 lük agaroz jel elektroferozi işlemine tabi tutularak genotiplenmiştir. Elektroforez işlemi sonunda STAT5A-AvaI polimorfizmi yönünden CC genotipli bireylerde 181 ve 34 bç lik iki bant, CT genotipli bireylerde 215, 181 ve 34 bç lik üç bant, TT genotipli bireylerde 215 bç lik tek bandın gözlenmesi beklenmiştir 4.0. İstatistik Analizler İncelenen örneklerin MYF5-TaqI ve STAT5A-AvaI polimorfizmleri yönünden genotiplerinin belirlenmesi enzim kesimi sonrasında yapılan agaroz jel elektroforezi görüntülerine göre bireylerin genotiplerinin kaydedilmesi ile yapılmıştır. Bu şekilde bireylerin verimleri ve genotipleri veri setini oluşturmuştur. Q-Q plot, histogram grafiği ve Kolmogorov Smirnov testi ile verilerin normal dağılıma uygunluğu kontrol edilmiştir. Varyansların homojenliği ise Levene testi ile değerlendirilmiştir. Örneklere ait verilerin MYF5-TaqI ve STAT5A-AvaI polimorfizmleri ile süt verim özellikleri arasındaki ilişinin istatistiksel önem kontrolü ise Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) ile yapılmıştır.istatiksel önem kontrolünün anlamlı çıkması durumunda çoklu karşılaştırılmalarda LSD post-hoc testleri kullanılmıştır. İncelenen bireylerin süt verimlerinin tanımlayıcı istatistikleri, ortalama ve standart hata ile gösterilmiş ve

38 23 istatistik analizlerde NCSS 9 programı kullanılmıştır. Fenotip-genotip arasındaki ilişkinin anlamlılık düzeyi ise p<0.05 olarak belirlenmiştir.

39 24 4. BULGULAR 4.1. MYF5-TaqI Polimorfizmi Bu tez çalışmasında MYF5-TaqI polimorfizmi yönünden genotiplerinin belirlenmesi amacıyla yapılan PCR işlemi sonrasında, incelenen örneklerde 512 bç lik PCR ürünleri başarıyla elde edilmiştir (Şekil ). Şekil MYF5-TaqI polimorfizminin belirlenmesi için yapılan PCR işlemi sonunda elde edilen 512 bç lik PCR ürünleri. L: 100 bç lik DNA merdiveni; a: 512 bç lik PCR ürününün bant görünümü Elde edilen 512 bç lik PCR ürünlerinin TaqI enzimiyle kesilmesi sonrasında elde edilen RFLP ürünleri %2 lik agaroz jel elektroforezine tabi tutulmuş ve incelenen örneklerin MYF5-TaqI polimorfizmi yönünden polimorfik oldukları gözlenmiştir. İncelenen Simental ırkı ineklerde AA genotipli bireylerde; 512 bç uzunluğunda tek bant, AG genotipli bireylerde; 512, 396 ve 116 bç uzunluğunda üç bant ve GG genotipli

40 25 bireylerde; 396 ve 116 bç uzunluğunda iki bant genotipleri gözlemlenmiştir (Şekil ). Şekil bç lik PCR ürünlernin TaqI restiksiyon endonükleaz enzim kesim sonrası RFLP görüntüsü (L: 100 bç lik DNA merdiveni; 1, 3,4,9: AA genotipi; 2, 5, 7, 8: AG genotipi; 6,10: GG Genotipi) Çalışma sonunda incelenen örneklerde AA genotipinin en az görülen genotip olduğu (0.10), A allelinin en düşük frekanstaki allel olduğu (0.31), GG genotipinin en çok görülen genotip olduğu (0.48), G allelinin ise en yüksek frekanstaki allel olduğu (0.69) görülmüştür. İncelenen Simental ırkı sığırların bu polimorfizm yönünden Hardy- Weinberg (H-W) dengesinde oldukları gözlenmiştir (Tablo 4.1.) STAT5A-AvaI polimorfizmi İncelenen Simental ırkı örneklerde STAT5A-AvaI polimorfizminin belirlenmesi için yapılan PCR reaksiyonu sonunda 215 bç lik PCR ürünleri başarılı bir şekilde elde edilmiştir (Şekil ).

41 26 Şekil STAT5A-AvaI polimorfizmi için yapılan PCR işlemi sonunda elde edilen 215 pç lik ürünler. L: 50 bç lik DNA merdiveni; a: 215 bç lik PCR ürününün bant görüntüsü. Yapılan PCR işlemi sonrasında, başarılı bir şekilde elde edilen 215 bç lik PCR ürünleri AvaI restiksiyon endonükleaz enzimi ile kesilmiştir. Kesim işlemi sonrasında incelenen örneklerin STAT5A-AvaI polimorfizmi yönünden polimorfik oldukları gözlenmiştir. Elde edilen RFLP bant profiline göre CC genotipli bireylerde;181 ve 34 bç uzunluğunda iki bant; CT genotipli bireylerde; 215, 181 ve 34 bç uzunluğunda üç bant, TT genotipli bireylerde; 215 bç uzunluğunda tek bandın gözlenmesi beklenmiştir. Ancak 34 bç uzunluğundaki bant çok küçük olması nedeniyle %3 lük ağaroz jel elektroforezinde görülememiştir. Buna rağmen diğer bandların varlığı veya yokluğuna göre bireylerin genotipleri başarılı bir şekilde belirlenebilmiştir (Şekil ).

42 27 Şekil bç lik PCR ürünlerinin AvaI restiksiyon endonükleaz enzim kesim görüntüsü. L: 50 bç lik DNA merdiveni. (L: 50 bç lik DNA merdiveni; 1,5:CT genotipi; 2,3,7: CC genotipi; 4,6,8:TT Genotipi) Çalışma sonunda STAT5A-AvaI polimorfizmi yönünden incelenen Simental ırkı ineklerde, TT genotipinin en az görülen (0.04) genotip olduğu T allelinin ise en düşük frekanstaki allel olduğu (0.15) ; CC genotipinin en çok görülen genotip olduğu (0.73), C allelinin ise en yüksek frekanstaki allel olduğu (0.85) belirlenmiştir. İncelenen Simental ırkı sığırların bu polimorfizm yönünden H-W dengesinde oldukları görülmüştür (Tablo 4.1). Tablo 4.1 İncelenen Simental ırkı hayvanlarda MYF5-TaqI ve STAT5A-AvaI genotip ve allel frekanslar Gen MYF5 STAT5A Genotip Frekansı Allel Frekansı AA (Göz-Bek) AG (Göz-Bek) GG (Göz-Bek) A G 0.10 ( ) 0.43 ( ) 0.48 ( ) CC (Göz-Bek) CT (Göz-Bek) TT (Göz-Bek) C T 0.73 ( ) 0.23 ( ) 0.04 (8-4.76) Ki-kare Analizi (X 2 ) ns (Sd=1) ns (Sd=1) Göz: Gözlenen frekans; Bek: Beklenen frekans; Sd: Serbestlik derecesi: ns: istatiksel olarak önemsiz