Özlem Abacı-Günyar 1*, Alev Haliki-Uztan 1, Handan Ataol Ölmez 2, İlhan Ozkarakaş 2

Transkript

1 Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi TR (Eski adı: OrLab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi) Yıl: 2014 Cilt: 12 Sayı: 2 Sayfa: İZMİR KARABURUN YARIMADASINDA DALINDA OLGUNLAŞAN HURMA ZEYTİNLERDEN PHOMA MULTIROSTRATA'NIN İZOLASYONU VE TANILANMASI: OLEA EUROPAEA (OLEACEAE) DAN İLK KAYIT Özlem Abacı-Günyar 1*, Alev Haliki-Uztan 1, Handan Ataol Ölmez 2, İlhan Ozkarakaş 2 Özet Hurma zeytin Türkiye'de sadece Karaburun Yarımadasında görülen ve dalında olgunlaştıktan sonra tüketiciye sunulan bir zeytin türüdür. Zeytin taneleri, ağaçta iken, yörenin ekolojik koşullarının da yardımıyla, kendiliğinden olgunlaşarak yenebilecek duruma gelir. Bu durum zeytin henüz ağaç üzerinde iken, taneleri infekte eden bir fungus türü ile gerçekleşmektedir. Çalışmamızda İzmir Karaburun Yarımadasından toplanan hurma zeytinden izole edilen Phoma sp. nin fenotipik ve genotipik yöntemler ile tanılanması yapılmıştır. Sonuç olarak çalışmamız Olea europaea'dan Phoma multirostrata izolasyonu için ilk kayıttır. Anahtar kelimeler: Hurma zeytin, Phoma multirostrata, Olea europaea, Karaburun, İzmir Giriş Zeytin dalından koparıldığında, başta oleuropein olmak üzere içerdiği yoğun fenolik maddeler nedeniyle, doğrudan tüketilemeyecek düzeyde acılığa sahiptir. Meyveye yapılan birtakım işlemler (kırma, ezme, çizme vb.) sonrasında salamura işlemine tabi tutularak, acılık veren bu maddelerin meyve dokusundan uzaklaştırılması ve muhafazası amaçlanmaktadır. Urla, Seferihisar ve Karaburun'da yetiştirilen Erkence zeytin çeşidinde, meyveler daha dalında iken gerçekleşen olgunlaşmaya hurmalaşma' denilmektedir. Bu olgunlaşma periyodunda, hiçbir işleme tabi tutulmaksızın tüketilebilir hale gelen zeytin meyvesi ise hurma zeytin olarak bilinir. Ülkemizde bugüne kadar yapılan çalışmalarda, hurmalaşmaya neden olarak Phoma oleae'nin neden olduğu bildirilmektedir. Uluslararası yayınlarda hurmalaşmaya etken olan Phoma fallens ve Phoma insulana'nın zeytinlerde olgunlaşmaya neden olduğu belirtilmektedir (1). Coelomycetous Phoma Sacc. Emend Boerema & Bollen türleri genellikle topraktan izole edilen, bitkilerde primer patojen, fırsatçı patojen, saprofit veya endofit olarak bulunmaktadır (2). * 1) Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bornova-İzmir 2) Zeytincilik Araştırma İstasyonu, İzmir. Yazışmalardan sorumlu yazarın e-posta adresi: ozlemabaci@yahoo.com 20

2 Morfolojik tanının zorluğundan dolayı, Phoma türlerinin tanısında kullanılacak hızlı güvenilir moleküler yöntemlere ihtiyaç vardır (3). Bu çalışmada İzmir Karaburun Yarımadasından toplanan hurma zeytinden izole edilen Phoma sp.'nin fenotipik ve genotipik yöntemler ile tanılanması amaçlanmıştır. Materyal ve Metot İzolasyon: Zeytin taneleri %70'lik alkolde yarım saat bekletilerek yüzey sterilizasyonu yapılmıştır. İzolasyonda PDA (potato dextrose agar), MEA (Malt Ekstract Agar) ve işlem görmemiş zeytinin etli kısmını içeren MEA ortamları kullanılmıştır. Yüzey sterilizasyonu yapılan zeytin taneleri steril bistüri ile kesilmiş, parçalar ve kabuğun iç kısmından kazıma yöntemi ile alınan örnekler belirtilen ortamlara aktarılmıştır. Petriler 27 ºC'de inkübasyona bırakılmıştır. Kültürel ve Morfolojik Çalışmalar: Morfolojik çalışmalarda Oatmeal Agar and Malt Extract Agar (MEA) kullanılmıştır. İzolatın fenotipik identifikasyonu Phoma Identification Manual (Boerema ve ark., 2004)'e göre yapılmıştır (2). İnokülasyondan 8 gün sonra koloni boyutu ölçülmüştür. Morfolojik karakteristikler sporulasyonun ardından kaydedilmiştir. İnkübasyonun ikinci haftası sırasında petriler 13 saat NUV (Near visible ultraviolet) ışığında ardından 11 saat koloni pigmentasyonu ve piknidyum oluşumu için karanlıkta inkübe edilmiştir (2). Moleküler Çalışmalar: DNA izolasyonu Liu ve ark. tarafından uygulanan yöntemde bazı modifikasyonlar uygulanarak gerçekleştirilmiştir (4). Nüklear ribozomal DNA ITS1-5.8-ITS2 (ITS) bölgesi ITS1ve ITS4 primerleri ile amplifiye edilmiştir. (5). LR0R ve LR7 primerleri 28 S RNA bölgesi amplifikasyonu için kullanılmıştır (6). Çalışmamızda amplifiye edilmiş ITS bölgesi ve 28 S rdna bölgesi baz sırası tayini İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü Biyoteknoloji ve Biyomühendislik Merkezi Araştırma Laboratuvarı'nda yaptırılmıştır. Elde edilen veriler Finch TV (Blast) ve Ap E programı kullanılarak değerlendirilmiştir. Tür tayini araştırmacıların kullanımına açık olan Gen Bankası nın web sayfasında, nükleotid dizilerinin kıyaslanarak benzerliklerin incelenmesi ile yapılmıştır. Dendogramlar MEGA 4,0 programı ile çizilmiştir. Sonuçlar Fenotipik çalışmalar Gerhar Boerema ve arkadaşları tarafından 2004 yılında yayınladıkları Phoma Identification Manual' isimli esere göre yapılmıştır (2). Moleküler yöntemler ile Phoma multirostrata olarak saptanmış izolat TEM Karaburun Izmir 2B, 4B, 9C ve 10C'de gösterildiği gibi septalı konidyuma sahiptir. Fakat, Phoma Identification Manual e göre Phoma multirostrata Phoma seksiyonu içerisine sokulmuştur ve seksiyon septasız konidyuma sahiptir. Moleküler identifikasyon için ITS ve LSU bölgesi analiz edilmiştir. Sonuç olarak izolatımız Phoma multirostrata olarak saptanmıştır. 21

3 Şekil 1: İzolasyon amacı ile kullanılan zeytin içeren MEA ortamında 27 ºC'de 7 gün sonunda görüntü Şekil 2: Zeytin kabuğunun iç yüzeyinden kesit alınarak hazırlanan preparatın mikroskobik görüntüleri: A: Piknidyum, B: Piknidiospor İzolasyon petrisinden alınan izolat işlem görmemiş zeytinin etli kısmını içeren MEA ortamlarına aktarılarak saf kültürü elde edilmiştir. Şekil 3: Zeytinli Ortamda Elde Edilen Saf kültür 22

4 Şekil 4: Zeytinli ortamda A: Piknidyum, B: Piknidiosporlar Şekil 5: Oatmeal agar (OA) da 1 haftalık inkübasyonun ardından A: Kültürün görüntüsü, B: Kültürün ters yüzey görüntüsü Şekil 6: Malt Extract Agar (MA) da 1 haftalık inkübasyonun ardından A: Kültürün görüntüsü, B: Kültürün ters yüzey görüntüsü 23

5 Şekil 7: Oatmeal agar (OA) da 2 haftalık inkübasyonun ardından A: görüntüsü, B: Kültürün ters yüzey görüntüsü Kültürün Şekil 8: Malt Extract Agar (MA) da 2 haftalık inkübasyonun ardından A: kültürün görüntüsü, B: Kültürün ters yüzey görüntüsü Şekil 9: Oatmeal Agar ortamında A ve B: piknidyum, C: piknidiosporların mikroskobik görüntüsü 24

6 Şekil 10: Malt Extract Agar ortamında A: piknidyum, C: piknidiosporların mikroskobik görüntüsü Phoma multirostrata CBS Phoma multirostrata CBS TEM Karaburun Izmir Phoma multirostrata CBS Phoma insulana CBS Venturia inaequalis CBS Şekil 11: TEM Karaburun Izmir şusunun 28 S rdna bölgesi için Mega 4,0 programı kullanılarak oluşturulan filogenetik dendrogram. Filogenetik ağaç, 1041 bç uzunluğunda diziler baz alınarak neighbor-joining metod kullanılarak oluşturulmuştur. Skala her 100 nükleotitte 1 nükleotid değişikliğini göstermektedir (bootstrap analizleri 1000 tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir). Dalların yanındaki rakamlar istatistiksel bootstrap değerlerini göstermektedir (20 nin altındaki değerler verilmemiştir). İlgili dizi GenBAnk'ta Phoma 28S nuc_1 JN aksesyon numarası ile depolanmıştır. Tartışma Aseksuel Phoma genusu 9 seksiyona ayrılmıştır. Phoma, Heterospora, Paraphoma, Peyronellaea, Phyllostictoides, Pilosa, Plenodomus and Sclerophomella. (2, 7). Bu seksiyonlar sadece tek veya birkaç morfolojik ve fizyolojik özelliğe göre oluşturulmuştur (6, 7). Fakat bazı seksiyon spesifik karakteristikler sadece tek bir türde olabildiği için bu ayırım belirsizdir, çünkü moleküler biyolojik çalışmalar ile doğrulanmamıştır. Bu seksiyonlara ayırma morfolojik identifikasyonda son derece yararlı olduğu düşünülen bir identifikasyon sistemi olmakla birlikte bu sınıflamanın yapay olduğu kanıtlanmıştır (6). Phoma seksiyon Phoma, klamidosporu olmayan, septalı konidyumu olmayan, piknidyal süsü veya duvar kalınlaşması olmayan bir gruba yerleştirilememiş dejenere ve yeterince anlaşılmamış türlerin yer aldığı bir depo gibi düşünülmektedir (2, 6). 25

7 Şekil 12: TEM Karaburun Izmir şusunun ITS1-5.8S-ITS2 bölgesi için Mega 4,0 programı kullanılarak oluşturulan filogenetik dendrogram. Filogenetik ağaç, 378 bç uzunluğunda diziler baz alınarak neighbor-joining metod kullanılarak oluşturulmuştur. Skala her 100 nükleotitte 1 nükleotid değişikliğini göstermektedir (bootstrap analizleri 1000 tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir). Dalların yanındaki rakamlar istatistiksel bootstrap değerlerini göstermektedir (20 nin altındaki değerler verilmemiştir). İlgili dizi GenBAnk'ta Phoma ITS nuc_1 JN aksesyon numarası ile depolanmıştır. Aveskamp ve ark'nın yaptıkları filogenetik analiz mevcut Boeremaean alt bölümlerinin evrimsel açıdan yanlış olduğunu göstermiştir. Aveskamp ve ark.'larının yaptıkları çalışmaya göre Phoma türleri Pleosporales içerisinde 6 farklı clade ayrılmıştır. Türlerin çoğunluğu Didymellaceae familyasında sınıflandırılmıştır. Çalışmamızda izole ettiğimiz ve moleküler yöntemler ile tanıladığımız Phoma multirostrata türü Didymellaceae familyasında Group O içerisinde yer almaktadır. Bu grup içerisinde Phoma multirostrata, P. pereupyrena ve Phoma insulana türleri yer almaktadır. Bugüne değin Olea europaea'dan Phoma fallens, Phoma incompta ve Phoma insulana nın izolasyonu rapor edilmiştir (2,6). Phoma fallens meyve üzerinde lekeler ile ilişkilidir, Phoma incompta solgunluğa sebep olan spesifik bir patojendir., Fakat, Phoma insulana is zeytin meyvesinin doğal olgunlaşma sürecine katılır. Zeytin taneleri, ağaçta iken, yörenin ekolojik koşullarının da yardımıyla, kendiliğinden olgunlaşarak yenebilecek duruma gelir. Bu durum zeytin henüz ağaç üzerinde iken, taneleri infekte eden bir fungus türü ile gerçekleşmektedir. Çalışmamızda İzmir Karaburun Yarımadasından toplanan hurma zeytinden izole edilen Phoma sp. nin fenotipik ve genotipik yöntemler ile tanılanması yapılmıştır. Sonuç olarak çalışmamız Olea europaea'dan Phoma multirostrata izolasyonu için ilk kayıttır. Teşekkür: İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü Biyoteknoloji ve Biyomühendislik Uygulama ve Araştırma Merkezi ve Esra Ersoy Ömeroğlu'na teşekkür ederiz. 26

8 Kaynaklar 1- Liu D, Coloe S, Baird R, Pedresen J (2000). Rapid minipreparation of fungal DNA for PCR. J Clin Microbiol 38: Boerema GH, Gruyter J de, Noordeloos ME, Hamers MEC (2004). Phoma Identification Manual. Differentiation of specific and infra-in taxa in culture. CABI publishing, Wallingford, U.K. 3- Aveskamp MM, De Gruyter J, Crous PW (2008). Biology and recent developments in the systematics of Phoma, a complex genus of major quarantine significance. Fungal Diversity 31: Aveskamp MM, de Gruyter J, Murace MA, Perello A, Woudenberd JH (2009). Groenewald, JZ, Crous, PW, DNA phylogeny reveals polyphyly of Phoma section Peyronellaea and multiple taxonomic novelties. Mycologia 101(3): , DOI: / Aveskamp MM, de Gruyter J, Woudenberg JHC, Verkley GJM, Crous PW (2010). Highlights of the Didymellaceae: A polyphasic approach to characterise Phoma and related pleosoralean genera. Stud Mycol 65: Ölmez HA, Özkarakaş İ, Haliki-Uztan A, Abacı Ö, Irmak Ş, Öztürk-Güngür F, Susamcı E, Tusu G, Köseoğlu O, Altunoğlu Y(2011). Hurma Zeytin (Poyrazın Getirdiği Zenginlik). Meta Basım Matbaacılık Hizmetleri, İzmir. 7- Gruyter, J., Woudenberg, J.H.C., Aveskamp, M.M., Verkley, G.J.M., Roenewald, J.Z., Crous, P.W., 2013, Redisposition of Phoma-like anamorphs in Pleosporales, Studies in Mycology, 75,