MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI

Transkript

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI

2 Protein Saflaştırma Bir proteinin amino asit kompozisyonu ve dizisinin aydınlatılması öncelikle ilgili proteinin saf olarak eldesini gerektirir. Gerçekçi bir yaklaşım ile % 100 saflık beklemek mu mku n değildir.!!! Bir proteinin saflaştırma stratejisinde bir seri ayırma metodu ve adımı yer alır. Her bir protein için saflaştırma prosesi ilgili protein için spesifiktir.

3

4

5

6

7

8 Saflaştırma stratejisi geliştirmede protein özellikleri

9 Protein Saflaştırılması Planlama- Strateji Kaynak seçimi

10 Protein Saflaştırılması Planlama- Strateji

11 Kaynak seçimi sonrası protein saflaştırılmasına başlamadan önce göz önu ne alınması gereken kriterler;; Sıcaklık İyonik şiddet ve ph Organik çözgenler ve deterjanlar Protein Konsantrasyonu Köpu k/film oluşumu Proteolitik enzimler

12 Protein Saflaştırılması Planlama- Strateji Protein saflaştırmasında sabit yöntem yoktur. Genel strateji göz önu ne alınarak ayrılacak proteinin özelliklerine göre yöntemler araştırıcı tarafından seçilir. (Boyut/Kuẗle, Çözu nu rlu k, Yu k, Hidrofobisite, Afinite vb. )

13

14 Saflaştırma sırasındaki kayıplar Saflaştırma prosedu ru nde adım sayısı mu mku n mertebe azaltılmalıdır!!!

15 Saflaştırmada hedeflenen protein miktarı, saflaştırma seviyesi ve amacı;; protokol seçimini etkilemektedir.

16

17 Saflaştırma Etkinliği

18

19

20

21

22 Protein Saflaştırılmasında Kullanılan Temel Teknikler Ön Ayırma Teknikleri 1. Hu cre Parçalama/ Homojenizasyon/ Ekstraksiyon 2. Berraklaştırma 3. Ekstraktın Deriştirilmesi İleri Du zeyde Ayırma Teknikleri Kromatografik Teknikler Konvansiyonel Sıvı (LC;; du şu k basınç) FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography;; orta basınç) HPLC(High Performance Liquid Chromatography;; yu ksek basınç) Saflık Kontrolü ve Karakterizasyon Elektroforetik Teknikler PAGE, SDS-PAGE, IEF, 2D-PAGE vb. (Saflık kontrolu, Fraksiyonlama, Moleku l kuẗlesi ve İzoelektrik nokta tayini, alt birim ve izoenzimlerin belirlenmesi)

23 Ön Ayırma Teknikleri 1. Hu cre Parçalama/ Homojenizasyon /Ekstraksiyon

24

25

26 Ön Ayırma Teknikleri-2;; Berraklaştırma İzolasyon sırasında farklı adımlarda partiku llerin uzaklaştılması. En çok kullanılan iki teknik;; * Santrifu j Diferansiyal, Yoğunluk Gradient;;Subselu ler fraksiyonlama * Filtrasyon(mikrofiltrasyon) Partiku llerin boyutu ve yoğunluğu hangi tekniğin kullanılacağını belirler.

27

28

29

30

31 Mikrofiltrasyon Boyuta bağımlı;; Membranlar mikroporöz Yarı geçirgen bir membrana hidrostatik basınç uygulaması ile mikron boyutlu partiku llerin sıvılardan uzaklaştırılması Mikrofiltrasyonun farklı uygulamaları: Biyoreaktörlerden hu crelerin toplanması Solu syonlardan viru s uzaklaştırılması Meyva suyu ve meşrubatların berraklaştırılması Hu crelerin uzaklaştırılması fermentasyon ortamından Su saflaştırılması Hava filtrasyonu Sterilizasyon

32 Ön Ayırma Teknikleri-3 Ekstraktın Deriştirilmesi Ultrafiltrasyon Liyofilizasyon (Dondurarak kurutma) Çöktürme İzoelektrik çöktürme İyonik şiddeti azaltarak çöktu rme Salting in İyonik şiddeti arttırarak çöktu rme Salting out Organik çözgenler ile çöktu rme Organik polimerler ile çöktu rme Denaturasyon ile çöktu rme Diyaliz (Vakum diyalizi, tuz giderilmesi)

33 Ekstraktın Deriştirilmesi-1 Ultrafiltrasyon Molekül kütle ve şekillere göre ayrılma Etkin kuvvet;; santrifu j veya basınç

34

35 Ekstraktın Deriştirilmesi-1 Ultrafiltrasyon Ultrafiltrasyon son zamanlarda birçok üstünlüğü yüzünden proteinlerin konsantrasyonunda tercih edilir bir yöntem olmuştur. Bu üstünlükleri: Yumuşak bir yöntem olduğundan proteinlerin bioaktivitelerini etkilemez. % 99 gibi bir verim elde edilir. Diğer yöntemlere göre hızlıdır. Çok az yardımcı ekipman (teçhizat) gerektirir. Düşük molekül kütleli moleku llerin ortamdan uzaklaştırılması Tampon değişimi

36 Ultrafiltrasyon Çözeltiden hücreleri ve hücre parçalarını uzaklaştırmak için kullanılır. Bu amaçla kullanılan membran filtrelerin delik (por) büyüklükleri µm arasındadır. Bu delikler hücre parçalarını tutacak ama protein gibi makromolekülleri geçirecek şekilde ayarlanmıştır. En çok kullanılan membranlar 3, 10, 30, 50, ve 100 kda molekül ağırlarındaki proteinleri geçirmeyecek şekilde ayarlanmıştır. Ultrafiltrasyon membranları genellikle selüloz asetat veya selüloz nitrattan yapılmışlardır. Polivinil klorür veya polivinil karbonat da kullanılabilir.

37 Ultrafiltrasyon Ultrafiltrasyonda genellikle karıştırıcılı-hücre sistemi kullanılır. Hücrenin dibinde bulunan ağ şeklindeki bir süporun (taşıyıcı) üzerine membran yerleştirilir ve konsantre edilecek çözelti membranın üzerine dökülür. Genellikle azot gazı ile basınç uygulanır. Filtrenin (membranın) delik büyüklüğünden daha küçük olan moleküller, su, tuzlar v.s. alta geçerken filtrenin üzerinde tutulan protein çözeltisi böylece konsantre olur (Şekil 3). Bu moleküllerin membranı tıkamasını önlemek için devamlı karıştırma uygulanır. Büyük miktarlardaki ultrafiltrasyonlarda endüstriyel ölçekte, yerine kartuş şeklindeki membranlar kullanılır.

38 Ekstraktın Deriştirilmesi-2 Dondurarak kurutma;; Liyofilizasyon Liyofilizasyon;; uzun proses zamanı gerektirir ve tuz vb. moleku llerinde aynı anda deriştirilmesi ile sonlanır!!!

39

40

41

42

43

44

45

46

47 Protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir iyon değişim kromatografisi adımı için bu tuzun giderilmesi gerekir, bunun için diyaliz yapılır.

48 Porların büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir.

49 Diyaliz Diyaliz edilecek protein karışımı bir diyaliz torbasına konur, torba da büyük hacimli bir tampon çözeltisi içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra torbanın dışındaki ve içindeki çözelti dengelenir, iki taraf küçük moleküller bakımından aynı bileşime sahip olur. Diyaliz sistem dengeye ulaşıncaya kadar devam eder. Diyaliz İşlemi ile tuzların uzaklaştırılması

50 İleri Ayırma Teknikleri Protein Saflaştırılmasında genellikle kolon kromatografisi (Afinite kromatografisi, İyon değişim kromatografisi, Jel filtrasyon kromatografisi) kullanılır. Kromatografi, bir karışımdaki maddelerin bir sabit faz üzerinde farklı hızlarda sürüklenmesi sonucunda birbirinden ayrılması temeline dayanır. Maddeleri sürükleyen ise bir sıvı ya da gaz olabilir. Karışımdaki maddeler sabit faz tarafından ne kadar alıkonuyorsa o oranda yavaş ilerler. Örneğin;; sıkışık bir trafikte taksiler durmuş iken motosikletlerin daha hızlı ilerlemesi gibi Ya da trafik kontrolünde taşıtlar durdurulurken yayaların ilerlemesi gibi

51 Ayırmanın Prensibi

52 Ayırmanın Prensibi

53 Ayırmanın Prensibi

54 Ayırmanın Prensibi

55 Ayırmanın Prensibi

56 Ayırmanın Prensibi

57 Ayırmanın Prensibi

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76 Sabit faza öyle bir molekül tutturulur ki;; sadece ilgilendiğimiz molekülle etkileşir ve onu kolonda tutar.

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92 Proteinler izoelektrik noktalarının üzerindeki ph değerlerinde ( ) yüklüdürler ve elektriksel alanda anoda göç ederler;; izoelektrik noktanın altındaki ph değerlerinde ise (+) yüklüdürler ve katoda göç ederler. Bu özellikleri nedeniyle protein karışımlarının ayrılmasında elektroforez yönteminden geniş çapta yararlanılır. Bu teknik proteinlerin elektriki alanda göçüne dayanır.

93 Çapraz bağlı bir polimer (JEL) katı destek ortamını oluşturur.

94 KULLANILAN JELLER: NİŞASTA AGAROZ Agaroz jel elektroforezi: 50 kb a kadar büyüklükteki nükleik asitlerin ayırt edilmesi SELÜLOZ ASETAT POLİAKRİLAMİT (EN GENİŞ ÇAPTA) Poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE): proteinler ve DNA sekans analizinde 500 bç nin altındaki nükleik asitleri ayrılabilir

95 POLİAKRİLAMİT Kovalent çapraz bağlar sonucunda porlu (gözenekli) polimer (JEL) oluşur.

96

97 POLİMERİZASYON BAŞLATICI FOTOKİMYASAL KİMYASAL Amonyum persülfat

98 KATALİZÖR TEMED (N,N,N',N' -TETRAMETİLENETİLENDİAMİN

99 Poliakrilamit-matriks Akrilamid- ana gövdeyi oluşturur N,N metilen bisakrilamitçapraz bağlanmalardan sorumludur N,N,N,N tetrametiletilen diamin (TEMED)- katalizör Amonyum persülfat (APS)- radikal oluşumupolimerizasyonun başlaması

100 Poliakrilamit jelde por büyüklüğü, akrilamit ve bis içeriğini ifade eden % T ve % C bis terimleri ile belirlenir. % T, total akrilamit % si (ağırlık/hacim);; % C bis ise bis in monomere oranı (ağırlık/ağırlık) olup formüllere göre hesaplanırlar:

101 Akrilamid (g) + Bis (g) % T = x 100 Hacim (ml) Bis (g) % C bis = x 100 Akrilamid (g) + Bis (g)

102 Bu formüllere göre: %20 T ve %5 C bis içeren bir jelde %20 total akrilamit (akrilamit + bis) bulunur ve total akrilamitin % 5 i bis tir. % T arttıkça por çapı küçülür. %5 C bis her türlü % T koşulunda optimum por büyüklüğünün oluşmasına yol açar.

103 Çeşitli akrilamit konsantrasyonlarında ayrımı yapılabilecek polipeptit ağırlıkları Akrilamit konsantrasyonu pp.ağırlığı (kda)

104 PAGE Uygulamaları Araştırmalarda sıklıkla kullanılır. Protein ve nükleik asitlerin saflıklarının kontrolü Oligonukleotit sekans analizi Proteinlerin molekül ağırlıklarının ve izoelektrik ph larının belirlenmesi Protein ve enzim eldesi İzoenzimlerin belirlenmesi Western blotlama vb.

105 GRADİENT JELLER Jelin üst kısmındaki (başlangıç) porlar alt kısmından daha büyük!

106

107 DİKEY JEL ELEKTROFOREZ SİSTEMLERİ TÜP JEL ELEKTROFOREZ SİSTEMLERİ

108 GÜÇ KAYNAĞI

109 Kullanılan prosedüre göre hazırlanan monomer karışımı, elektroforez aletinin jel dökme aparatında, jelin çeşitli kalınlık ve ebatta hazırlanabilmesine olanak veren, sandviç şeklinde hazırlanmış iki cam (jel kaseti) arasına veya jel tüplerine doldurulur, tarak takılır ve polimerizasyona bırakılır. Oksijen polimerizasyonu engellediğinden, monomer karışımının havası alınmalıdır. Bu da karışımdan inert bir gaz geçirerek, vakum uygulayarak ya da ultrasonik su banyosunda bekletilerek sağlanır.

110 Jel karışımı tüp ya da kaset içine döküldüğünde, üst yüzeydeki gerilim nedeniyle ortaya çıkan eğimli yüzey, bant dağılımının bozuk olmasına yol açar. Bunu önlemek için, polimerizasyon başlamadan önce jelin yüzeyi çok ince bir su veya su ile doyurulmuş 2-butanol tabakası ile kapatılır. Aletin tank bölümüne yerleştirilir. Bu yerleştirimden sonra jel tamponla temas edecek ve elektrik akımının geçmesi sağlanacaktır.

111 DİKEY ELEKTROFOREZ

112 Elektroforezde kesiksiz ( continuous ) ve kesikli ( discontinuous ) olmak üzere 2 farklı tampon sistemi kullanılabilir. Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı jel vardır;; tanklarda ve jelde aynı tampon kullanılır. Kesikli sistemde ise jel farklı tamponlarla hazırlanmış iki kısımdan oluşur: (1) Büyük porlu yükleme ( stacking ) jeli;; (2) Küçük porlu ayırma ( separating ) jeli.

113 Resim şu anda görüntülenemiyor. katot Resim şu anda görüntülenemiyor. Kuyucuklar (cepler) Resim şu anda görüntülenemiyor. Yükleme jeli tampon Proteinlerin poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE) yöntemiyle ayrılması (dikey sistem). Ayırma jeli anot tampon plastik conta

114 Bu sistemde kullanılan tank tamponları da jel tamponlarından farklıdır. Bu farklılık jel boyunca bir ph ve voltaj gradientinin oluşumuna yol açar. Böylece daha seyreltik örneklerle çalışılabilir ve daha iyi bir ayrışım elde edilir.

115 Elektrik akımı geçirmek üzere anot ve katot bağlantıları yapılır ve güç kaynağı çalıştırılır: Protein elektroforezinde elektriksel parametrelerden biri, genellikle akım sabit tutulur. Bu durumda proteinlerin göç hızı da sabittir, ancak direnç artıkça ısı açığa çıkar. İşlem sabit voltajda gerçekleştirilirse, direnç artıkça göç hızı düşer, ancak ısı artmaz.

116 İŞLEM TAMAMLANIĞINDA: Boyama yapılarak ayrılan proteinler gözle görünür hale getirilir. En çok kullanılan boyar madde Coomassie blue dur. Daha duyarlı bir boyama tekniği ise gümüş boyamadır. Jel boyandıktan sonra fotoğrafı çekilebilir, ya da densitometre ile taranarak analiz edilebilir. Jelde ayrılmış radyoaktif örneklerin analizi için otoradyografi yöntemlerinden yararlanılır. Membrana transfer ( blot-transfer ) teknikleri de son yıllarda geniş çapta kullanım alanı bulmaktadır. (Western blotting ve immünoblotting)

117 GÜMÜŞ BOYAMA Coomassie Brilliant Blue 0.1 µg proteine duyarlıdır. Ag boyama Coomassie Brilliant Blue ya göre en az 100 kat daha hassas duyarlı.

118 Duyarlılık yüksek olduğu için TEMİZLİK çok önemlidir. Cam eşyalar çok temiz olmalı, Tüm çözeltiler filtre edilmeli, Daima eldiven giyilmeli (fakat üzerinde pudra kalmamalı), Eğer mümkünse her adım için ayrı bir kap kullanılmalıdır.

119 Kullanımdan sonra Ag çözeltileri LAVABOYA DÖKÜLMEMELİDİR! Seyreltik (0.1 N) HCl çözeltisine dökülerek zararsız AgCl şekline çevrilmelidir. Böylece potansiyel patlayıcı Ag komplekslerinin oluşması önlenmelidir.

120 Ag boyama Önceden Coomassie ile boyanmış jele Hiç boyanmamış jele de uygulanabilir. En iyi sonuç birkaç gün boyunca iyice boyası uzaklaştırılmış jellerde alınır. Bu tip jeller % 50 Metanol-%10 Asetik asit karışımı içinde 30 dak bekletilerek fikse edilmeli, daha sonra da %5 Metanol-%7 Asetik asit karışımıyla 30 dak yıkanmalıdır.

121 SONUÇLARIN KAYIT ALTINA ALINMASI Özellikle gümüş boyamada en iyi bant görüntüsünün ne zaman oluşacağı belirsizdir. Onun için boyamanın son aşamalarında 3-4 dakika aralıklarla birkaç kez fotoğraf çekilir.

122 Coomassie blue AgNO3

123 JELLERİN KURUTULMASI Jel, kurutularak da saklanabilir. Otoradyografi yapılacaksa mutlaka kurutulmalıdır. Ancak bu işlem oda sıcaklığında filtre kağıdı üzerinde bekletme şeklinde yapılamaz, çünkü jel büzülür ve kırılır. Bu amaçla geliştirilmiş aletler vardır. Ancak sistem basit olduğu için pratik olarak geliştirmek de mümkündür.

124 ÇEŞİTLİ JEL KURUTMA DÜZENEKLERİ

125 JEL KURUTMA ALETİ

126 JEL GÖRÜNTÜLEME SİSTEMİ

127 Western blotting

128 Protein elektroforezi iki farklı koşulda gerçekleştirilebilir: DOĞAL JELLER: DENATÜRE JELLER: Doğal jel elektroforezinde kullanılan tamponlar, deterjan ve diğer denatüre edici maddeleri içermediğinden, prosedür doğal koşullarda gerçekleşir. Proteinler aktivitelerini korurlar. biyolojik

129 PAGE Elektroforez Çeşitleri Native PAGE, Native Gradient PAGE, Urea PAGE, SDS PAGE, SDS Gradient PAGE IEF, 2D PAGE, Western Blot SDS-PAGE- Proteinlerin denatüre edildikleri sistem NATIVE PAGE- Proteinlerin denatüre edilmeden doğal halleriyle analiz edildikleri sistem

130 Proteinlerin denatürasyonu neden gereklidir? Molekülün büyüklüğü ve üç boyutlu yapısı bulunduğu ortamdaki hareketini etkiler. Aynı büyüklükteki protein molekülünün ikincil, üçüncül ve dördüncül yapılarının kaldırılması aynı hızda hareketini sağlar. Deterjan kullanımı-denatürasyon- SDS Hidrofobik etkileşimleri çözer, negatif yükü nedeniyle protein yapısına negatif yük katar.

131 SDS-PAGE SDS yapısı SDS öncesi Yüklü R grupları Proteinlerin üç boyutlu yapısını kırar Protein-lineer yapı ve negatif yük kazanır SDS sonrası Hidrofobik alanlar Eğer proteinler denatüre edilip elektriksel ortama bırakılırsa proteinlerin hepsi aynı hızda, büyüklüklerine bakılmaksızın pozitif kutba doğru hareket edeceklerdir

132 SDS-PAGE Vakit alıcıdır. Oksijen varlığı polimerizasyonu engeller, bu sebeple cam plakalar arasına dökülür. Gözenek oluşumu kimyasal bir işlem olduğundan çok düzenli ve tek tip gözenek büyüklüğünde matriks oluşturulur. Gözenek büyüklüğü kullanılan akrilamid miktarı ile ters orantılıdır. 7% poliakrilait jel %12 lik olandan daha büyük gözenek içerir. Akrilamit nörotoksiktir. Polimerleşince tehlike arzetmez. Çok sayıda çapraz zincirler ve dallanmalar küçük moleküllerin daha hızlı hareketini sağlar.

133

134

135

136

137 SDS-PAGE: SODYUM DODESİLSÜLFAT- POLİAKRİLAMİT JEL ELEKTROFOREZİ SDS, polipeptidlerin ana iskeletini çevreleyerek proteinleri denatüre eden anyonik bir deterjandır. Ayrıca proteine, yapının uzunluğuna bağlı olarak değişen oranda bir negatif yük kazandırmaktadır. Polipeptidler SDS ve indirgeyici bir ajanla işleme sokulduğunda, aynı yük yoğunluğuna sahip, fakat farklı uzunlukta ( ) yüklü yapılar haline dönüşürler.

138 SDS-PAGE Polipeptidlerin molekül ağırlıklarının belirlenmesine olanak verir. Proteinleri denatüre ettiği için (alt birimler ayrıldığı için) proteinin monomerik mi, oligomerik mi olduğunu anlamamıza yardım eder. Ancak biyolojik aktivite ortadan kalkar.

139 SDS-PAGE SDS-PAGE;; sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE, proteinleri ayırmada kullanılan moleküler biyoloji tekniğidir. SDS-PAGE, DNA ve RNA moleküllerini de ayırabilir.

140 SDS-PAGE

141

142

143

144 SDS-PAGE ile Proteinlerin Moleküler Ağırlığının Belirlenmesi Aynı jel üzerinde moleküler ağırlığı bilinmeyen protein (Örnek=samples) ile bilinen protein (STANDARDS) elektroforezde aynı jel üzerinde yürütülüp boyanır.

145

146 Her bir Standart bandın ilerleme yolu yükleme boyasının gittiği yolun uzunluğuna bölünür: R f değeri

147

148 Her bir Standart bandın ilerleme yolu yükleme boyasının gittiği yolun uzunluğuna bölünür: R f değeri Calculate the relative mobility (Rf) of each band in the standards and your samples by measuring the distance each band migrated from the top of the separating gel, and then dividingthis distance bythe distance migrated bythe dye front. Using the molecular weight protein standards, plot log MW (y- axis) versus relative mobility (x- axis). Add a linear trendline; be sure to print the equation of the line and the correlation coefficient on theplot. Using the standardcurve, calculate the molecularsize of each protein sample.

149 Shown above (on the left) is an SDS- polyacrylamide gel that has been stained with a dye in order to view the proteins. Lane one of the left figure represents a set of standards, while lane 2 represents a protein that has been purified. The molecular weight Mr of the protein can be estimated, by comparing its relative migration to that of the standards. The relation is that the relative migration is dependent on the log of the molecular weight.

150 1.5M Tris- Cl, ph 8.8 Ayırma Jeli

151 Toplayıcı Jel ve Protein Örneklerinin 0.5M Tris- Cl, ph 6.8 dh 2 O+ Tris- HCI + Gliserol + SDS + β- merkaptoetanol+ Bromophenol Blue) Hazırlanması

152

153 Protein Bandlarının Boyanması Protein bantlarının görüntülenmesi için jeller boya solüsyonuna bırakılır. Boyama oda sıcaklığında yapılır. Fazla boyanın uzaklaştırılması için (%45 Methanol, %10 asetik asit, %45 dh2o) uygulanır.

154

155 Kullanılan tampon Yürütme tamponu Jel içerisinde ve elektroforez tankında istenilen değerde ph değerinin sabitlenmesinisağlar. Tris-glisin-SDS tamponu 0.025MTris,0.192MGlisin,%0.1SDS, ph8.3 Bu tampon sistemi bir poliakrilamit matrikste moleküler ağ etkisiyle denatüre protein-sds kompleksini ayırır. Matrisin por büyüklüğü proteinlerin ayrılma etkinliğini belirler ve proteinlerin moleküler ağırlığına bağlıdır

156 Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta (0,5-2,0 mm) tutulan iki cam tabaka arasında ve genelde 8-10 cm ya da cm boyutunda hazırlanır. DNA dizileme çalışmalarında daha çok cm boyutunda hazırlanır. Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar. Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır, kuyucuklar tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok etmek üzere tamponla yıkanır. Jel kaseti iki tampon arasına yerleştirilir;; kuyucuklara örnekler konulur ve akım geçirilir. Elektroforez bitiminde görüntüleme için jel uygun boya ile boyanır.

157 Jelin hazırlanması ve dökümü Kuyucuklar İstifleme jeli Ayırma (koşturma) jeli Tampon

158 Koşturma jeli (tamponu 1.5MTris-Cl, ph8.8) Toplam jelin¾ ünü oluşturur. Elektroforez sırasında separasyonun sağlandığı kısım Gözenekli bir yapıdadır. Jelde gözeneklerin büyüklüğü jeli oluşturmak için birbirlerine çapraz bağlarla bağlanan akrilamid monomerlerinin konsantrasyonu ile ilgilidir. % Akrilamid & örnek moleküler ağırlığına göre belirlenir

159 Por büyüklüğü ve akrilamid konsantrasyonuna göre proteinlerin ayrılmaları

160 İstifleme (yükleme) jeli (tamponu 0.5 M Tris-Cl, ph6.8) Separasyon jeli polimerleşince onun üzerine dökülür ve hemen ardından üzerine tarak yerleştirilerek örnek kuyucukları oluşturulur

161 Örnek hazırlığı ve jele yükleme Protein izolasyonu Konsantrasyonunun belirlenmesi Örneklerin denatürasyonu: örnek tamponu ile karıştırmak;; 95 o C de 5-10 dak. İnkübasyon Yükleme (örnek tamponu) : 0.125M Tris, %4 SDS, %20 Gliserol, %10 β-merkaptoetanol, Bromophenol blue

162 Camların %70 lik alkol ve saf su ile temzilendikten sonra düzeneğe yerleştirilmesi ve jellerin dökülmesi tarağın yerleştirilmesi

163 Örneği denatüre etme, jeli tanka yerleştirme

164 Örnek yükleme, düzeneğin tamamlanması

165 Koşturma- boyama- yıkama

166 Jellerin boyanması Coomassie Blue boyama Coomassie R: Jel üzerinde yaklaşık 100 ng proteini tespit edebilir Coomassie G: 10 ng proteini tespit edebilir Floresan boyalar Spesifik, 1 ng dan daha az proteinleri tespit edebilir, nükleik asitleri boyamaz Silver staining (gümüş boyama): Hassas bir teknik, Proteinlerin jel matriksine tespiti, gümüş iyonlarının proteinlere bağlanması, formamid ile redüksiyon, görüntülenme

167

168

169

170

171 Sistematik Biyolojide Kullanım Alanları Taksonomi Yaygın ancestor çalışmaları Genà mrnaà Protein

172

173

174 Saflaştırma amaçlı kullanılan en önemli elektroforez tekniği ise izoelektrik odaklama, isoelectric focusing (IEF) dir. Bu teknikte ayırım, karışımdaki proteinlerin izoelektrik noktalarındaki (pi) farklılık temeline göre gerçekleşir. Bu teknikte protein karışımı ph gradienti içeren bir jele uygulanır.

175 Protein gradientte yüksüz hale geçtiği yere geldiğinde göçünü (hareketini) durdurur. Bu nokta proteinin izoelektrik noktasıdır. ph gradirenti Amfolit denen (asit ya da baz gibi davranabilen) maddelerle sağlanır. ph 6-8 aralığında gerçekleştirilen izoelektrik odaklamada katod amonyak tamponuna (ph 10) ve anod asetat tamponuna (ph 4) yerleştirilir. Anod bir asit (H + ), katod bir baz çözeltisine (OH - ) değmelidir.

176

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

192

193 PROTEİN ANALİZİ KONTROL ALZHEIMER HASTASI

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

205

206

207 TEŞEKKÜRLER

208 Proteinleri tanımlama deneyleri Proteinlerin kimyasal özelliklerini göstermek veya doğrulamak için yapılan deneylerdir. Denatürasyon ve çökme tepkimeleri ile tanımlanma deneyleri Sülfosalisilik asit ile çöktürme Konsantre nitrik asit ile çöktürme Triklorasetik asit (TCA) ile çöktürme Isıtma ile çöktürme Renk tepkimeleri ile tanımlanma deneyleri Biüret tepkimesi ile mor renkli kompleks oluşması Aminoasitleri tanımlama deneyleri de proteinleri tanımlamak için yapılabilir.

209

210

211

212

213

214 Proteinleri tanımlama deneyleri- idrar örneğinde protein

215

216

217

218

219