NİKLOZAMİD UYGULAMASININ EPİTELYAL OVARYUM KANSERİ HÜCRE HATTI OVCAR-3 ÜZERİNE ETKİLERİ. Ayşe ÇAKIR GÜNDOĞDU

Transkript

1

2 NİKLOZAMİD UYGULAMASININ EPİTELYAL OVARYUM KANSERİ HÜCRE HATTI OVCAR-3 ÜZERİNE ETKİLERİ Ayşe ÇAKIR GÜNDOĞDU YÜKSEK LİSANS TEZİ HİSTOLOJİ-EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TEMMUZ 2015

3

4 ETİK BEYAN Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tez Yazım Kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; Tez içinde sunduğum verileri, bilgileri ve dokümanları akademik ve etik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, Tüm bilgi, belge, değerlendirme ve sonuçları bilimsel etik ve ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, Tez çalışmasında yararlandığım eserlerin tümüne uygun atıfta bulunarak kaynak gösterdiğimi, Kullanılan verilerde herhangi bir değişiklik yapmadığımı, Bu tezde sunduğum çalışmanın özgün olduğunu, bildirir, aksi bir durumda aleyhime doğabilecek tüm hak kayıplarını kabullendiğimi beyan ederim. Ayşe ÇAKIR GÜNDOĞDU 06/07/2015

5 iv NİKLOZAMİD UYGULAMASININ EPİTELYAL OVARYUM KANSERİ HÜCRE HATTI OVCAR-3 ÜZERİNE ETKİLERİ (Yüksek Lisans Tezi) Ayşe ÇAKIR GÜNDOĞDU GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Temmuz 2015 ÖZET En ölümcül jinekolojik kanser türü ovaryum kanseridir ve mevcut kemoterapötik yöntemler hastaların çoğunda yetersiz kaldığından yeni tedavi seçenekleri üzerine yoğunlaşılmaktadır. Antihelmintik bir ilaç olan niklozmid in anti-tümör etkilerinin gösterildiği çok sayıda çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada, niklozamid in epitelyal ovaryum kanserine olan etkileri in vitro yöntemlerle araştırıldı. Niklozamid in OVCAR-3 hücrelerine sitotoksik etkilerini saptamak ereğiyle MTT testi uygulandı. İlacın apoptozis üzerine etkileri TUNEL yöntemiyle tespit edildi. Hücrelerdeki β-katenin düzeyi immunositokimyasal yöntemle analiz edilerek tümör hücrelerinin çoğalmasında işlev gören Wnt/β-katenin sinyal yolağına niklozamid in etkisi belirlendi. Aynı deneyler rutinde kanser tedavisinde kullanılmakta olan 5-fluorourasil için de yürütüldü. İki ilaç için elde edilen bulgular birbirleri ve kaynak verileri ile karşılaştırılarak değerlendirildi. Niklozamid in 2 μm dozda OVCAR-3 hücrelerinin çoğalmasını engellediği belirlenirken, 5-fluorourasil in sitotoksik etkisi 20 μm dozda görüldü. Niklozamid in apoptozisi belirgin olarak arttırdığı ancak bu etkinin 5-flourourasile e karşı daha zayıf olduğu tespit edildi. Sitozolik β-katenin tutulumunun niklozamid uygulaması ile anlamlı olarak azaldığı gözlemlendi. Çalışmada elde edilen bulgulara göre, niklozamid in OVCAR-3 hücreleri üzerine düşük dozlarda etkin olduğu, apoptozisi uyarma ve β-katenin bağımlı Wnt sinyal yolağını baskılayarak hücre çoğalmasını engellediği belirlendi. Bu özellikleri sayesinde niklozamid in ovaryum kanseri tedavisinde günümüzde kullanılan kematörapötiklere alternatif bir ilaç olabileceği sonucuna varıldı. Bilim Kodu : 1033 Anahtar Kelimeler : OVCAR-3, niklozamid, 5-fluorourasil, Wnt/β-katenin Sayfa Adedi : 135 Danışman : Prof. Dr. Gülnur TAKE KAPLANOĞLU İkinci Danışman : Prof. Dr. Hülya SİVAS

6 v EFFECTS OF NICLOSAMIDE TREATMENT ON EPITHELIAL OVARIAN CANCER CELL LINE OVCAR-3 (M. Sc. Thesis) Ayşe ÇAKIR GÜNDOĞDU GAZI UNIVERSITY INSTITUTE OF HEALTH SCIENCES July 2015 ABSTRACT Ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy and since the current chemotherapeutic drugs are not effective enough, new methods of treatment are sought for. Niclosamide is an anthelminthic drug and it has been extensively studied for its anticarcinogenic effects. In the present study, it is aimed to investigate the possible in vitro effects of niclosamide on ovarian cancer. Human ovarian epithelial adenocarcinoma cell line OVCAR-3 was used in the experiments. MTT was applied to investigate the cytotoxic effect of niclosamide and it was found that 1 μm and 2 μm concentrations significantly reduced cell viability. The effects of the drug on apoptosis were tested by TUNEL method. The β-catenin levels in the cells were analyzed immunocytochemically in order to assess the potency of niclosamide on Wnt/β-catenin signaling pathway that function in cell proliferation. All the assays were also performed for 5-fluorouracil used as a therapeutic agent in cancer treatment routinely and it was found that 10 μm and 20 μm concentrations inhibited cell viability significantly. The data for both drugs were assessed in comparison with each other and the references. Niclosamide at 2 μm concentration inhibited OVCAR- 3 cell proliferation whereas 5-fluorouracil was cytotoxic at 20 μm concentration. Niclosamide led to an increase in apoptosis while this effect was weaker compared with 5- fluorouracil. Niclosamide treatment inhibited cytosolic β-catenin accumulation significantly. The results indicate that niclosamide is effective on OVCAR-3 cell line at low concentrations, induces apoptosis and suppresses cell proliferation by inhibiting Wnt/ β-catenin signaling pathway. Taken together, these findings support clinical explorations to reposition niclosamide for ovarian cancer treatment as an alternative for current chemotherapeutics. Science Code : 1033 Key Words : OVCAR-3, niclosamide, 5-fluorouracil, Wnt/β-catenin Page Number : 135 Advisor : Prof. Dr. Gülnur TAKE KAPLANOĞLU Co-Advisor : Prof. Dr. Hülya SİVAS

7 vi TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim ve çalışmalarım süresince engin bilgi ve deneyimleri ile yol gösterici olan, tezimin tamamlanmasında büyük desteklerini gördüğüm değerli hocam Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Başkanımız sayın Prof. Dr. Deniz ERDOĞAN başta olmak üzere; yüksek lisans eğitimim boyunca gerek bilgi ve deneyimleriyle, gerekse manevi desteği ve neşesiyle her konuda ve her zaman yanımda olan değerli hocam, tez danışmanım sayın Prof. Dr. Gülnur TAKE KAPLANOĞLU na; lisans eğitimimden bugüne manevi desteğini benden esirgemeyen, bilgisine ve şahsına saygı duyduğum, yüksek lisans çalışmalarımda da araştırma laboratuvarının kapılarını sonuna kadar açarak yanımda olan ikinci danışmanım sayın hocam Prof. Dr. Hülya SİVAS a (Anadolu Üniversitesi Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı); eğitimime önemli katkıları ve hayata dair bana öğrettiklerinden dolayı Anabilim Dalımızdaki çok değerleri hocalarım Prof. Dr. Celal ILGAZ a, Prof. Dr. Candan ÖZOĞUL a, Prof. Dr. Suna ÖMEROĞLU na ve Prof. Dr. Çigdem ELMAS a sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum. Tezimde kullandığım hücreleri hediye eden sayın Doç. Dr. Ayşe Tansu KOPARAL (Anadolu Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı) ve çalışmalarım için maddi ve manevi desteklerini gördüğüm Uzm. Dr. İskender KAPLANOĞLU na (Etlik Zübeyde Hanım Kadın Hastalıkları Eğitim ve Araştırma Hastanesi) çok teşekkür ediyorum. Deneylerim süresince büyük yardımlarını gördüğüm, çok sevdiğim ve onlarla arkadaş olduğum için kendimi şanslı hissettiğim sevgili arkadaşlarım Araş. Görevlisi C. Merve SEYMEN e ve Reyhan VAROL a; Anabilim Dalımızda görev yapan Recep ORHAN a ve tüm asistan arkadaşlarıma teşekkür ediyorum. Hayatımı kolaylaştırmayı kendine görev edinen, her zaman ve her koşulda en büyük destekçim, sevgili eşim Güven Çağdaş GÜNDOĞDU ya; uzakta da olsalar sevgileriyle bana güç veren, hayattaki en büyük varlıklarım ablam Zeynep ÇAKIR DEMİRTAŞ ve kardeşim Kısmet ÇAKIR a; cennetten beni izlediğini düşündüğüm, elini hep omuzumda hissettiğim, beni ben yapan, kızı olduğum için gurur duyduğum ve ona layık bir evlat olmak için elimden geleni yapacağım canım babam merhum Mustafa ÇAKIR a sonsuz minnetlerimi sunuyorum.

8 vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... ABSTRACT... TEŞEKKÜR... İÇİNDEKİLER... ÇİZELGELERİN LİSTESİ... ŞEKİLLERİN LİSTESİ... RESİMLERİN LİSTESİ... iv v vi vii x xi xii SİMGELER VE KISALTMALAR... xiv 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Ovaryumların Gelişimi Oogenezis Ovaryumların Anatomisi Ovaryumların arterleri Ovaryumların venleri Ovaryumların lenf damarları Ovaryumların sinirleri Ovaryumların Histolojisi Ovaryum medullası Ovaryum korteksi Ovaryum follikülleri Ovulasyon... 17

9 viii Sayfa Korpus luteum Atretik folliküller Ovaryumların Fizyolojisi Ovaryumların işlevlerinin düzenlenmesi Kanser Kanser hücrelerinin sınıflandırılması Anjiogenezis ve metastaz Kanserin genetik esası Hücre döngüsünün düzenlenmesi ve kanser Kanser hücrelerinin kökeni Apoptozis Kaspazlar Apoptozis oluşum yolları Apoptozisin belirlenmesinde kullanılan yöntemler Apoptozis ve kanser Ovaryum Kanseri Epidemiyoloji ve dağılım Etiyoloji ve risk faktörleri Ovaryum tümörlerinin histolojik sınıflandırması Ovaryum kanseri tedavisinde kemoterapi uygulamaları Wnt Sinyal Yolağı Wnt sinyal yolağının bileşenleri Wnt sinyal yolağının düzenlenmesi Ovaryum kanserinde Wnt sinyal yolağındaki değişiklikler... 53

10 ix Sayfa Wnt sinyal yolağının potansiyel terapötik hedefleri Niklozamid GEREÇ VE YÖNTEM Çalışmada Kullanılan Hücreler Hücre Kültürü Çalışmada Kullanılan İlaçların Dozlarının Hazırlanması MTT İçin Hücrelerin Hazırlanması In vitro Sitotoksisite Testi (MTT Yöntemi) TUNEL ve İmmunositokimyasal Yöntemler İçin Hücrelerin Hazırlanması TUNEL Yöntemi β katenin İçin İmmunositokimyasal Yöntem İstatistiksel Analiz BULGULAR MTT Bulguları TUNEL Bulguları β katenin İmmunositokimya Bulguları TARTIŞMA SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ

11 x ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Ovaryum tümörlerinin histolojik sınıflandırması Çizelge 2.2. Yüzey epitelyal-stromal ovaryum tümörlerinin sınıflandırması Çizelge 4.1. Gruplar arasında TUNEL-pozitif hücrelerin istatistiksel olarak karşılaştırılması Çizelge 4.2. β-katenin tutulumu gösteren OVCAR-3 hücrelerinin ortalama ve standart sapma değerleri... 96

12 xi ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 4.1. Niklozamid in OVCAR-3 hücreleri üzerine sitotoksik etkisinin MTT yöntemi ile değerlendirilmesi Şekil FU nun OVCAR-3 hücreleri üzerine sitotoksik etkisinin MTT yöntemi ile değerlendirilmesi Şekil 4.3. Gruplar arasında TUNEL-pozitif hücrelerin karşılaştırılması Şekil 4.4. İmmunreaktivite gösteren hücrelerdeki β-katenin tutulumu yoğunluğu Şekil 4.5. Gruplar arasında β-katenin immunreaktivitesinin karşılaştırılması... 95

13 xii RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 4.1. Kontrol OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x400) Resim 4.2. Kontrol OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x1000) Resim 4.3. DMSO uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x400) Resim 4.4. DMSO uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x1000) Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x400) Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x1000) Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x400) Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x1000) Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x400) Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x1000) Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x400) Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL tutulumu (TUNEL x400) Resim Kontrol OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) Resim Kontrol OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) Resim DMSO uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)... 82

14 xiii Resim Sayfa Resim DMSO uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000)... 91

15 xiv SİMGELER VE KISALTMALAR Simgeler Açıklamalar cm dk gr gy kg L mg ml mm nm sn α β μm μm Santimetre Dakika Gram Gray Kilogram Litre Miligram Mililitre Milimetre Nanomolar Saniye Alfa Beta Mikrometre Mikromolar Kısaltmalar Açıklamalar 5-FU APAF-1 APC CO 2 DAB DES DKK DMSO Dsh 5-fluorourasil Apoptotik proteaz aktive edici faktör-1 Adenomatöz polipozis koli Karbondioksit Diaminobenzidin Dietilstilbestrol Dikkopf Dimetil sülfoksit Dishevelled

16 xv Kısaltmalar Açıklamalar EGF EMT FACS FBS FDA Epidermal büyüme faktörü Epitelyal-mezenşimal değişim Floresan aktive hücre ayırma Fetal sığır serum Food and drug administration FGF9 Fibroblast büyüme faktörü 9 FITC FSH Fzd GnRH GSK3β H 2O 2 IHC LH LRP MET MTT NFκB OD PBS PI3K ROS S100A4 SFRP Fluorescein isothiocyanate Follikül stimüle edici hormon Frizzled Gonadotropin serbestleştirici hormon Glikojen sentaz kinaz 3 beta Hidrojen peroksit İmmunohistokimya Lüteinize edici hormon Düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör ile ilişkili protein Mezenşimal-epitelyal değişim 3-(4,5dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrozolyum bromid Nüklear faktör kappa B Optik dansite Fosfat buffer saline Fosfoinositid 3-kinaz Reaktif oksijen türleri S100 kalsiyum bağlanma proteini A4 Fzd reseptörü salgı proteinleri ailesi STAT3 Sinyal dönüştürücüleri ve aktivatörleri 3 TdT TUNEL WHO Terminal deoksinükleotidil transferaz TdT-mediated dutp-biotin nick-end labeling Dünya sağlık örgütü WIF1 Wnt-inhibitör faktör 1

17

18 1 1. GİRİŞ Kanser, hücrelerin büyüme ve çoğalmasını kontrol denetleyen düzeneklerde ortaya çıkan bozukluklardan kaynaklanan bir hastalıktır. Kanser batı toplumlarında her üç insandan birinde görülmekte ve bunların beşte biri yitirilmektedir [1]. Görülme sıklığının ve öldürücülüğünün yüksek olması nedeniyle dünyanın en önemli sağlık sorunlarından biridir. 1970'li yıllarda ülkemizde nedeni bilinen ölümler arasında 4. sırada yer alan kanser, son yıllarda kalp-damar sistemi hastalıklarından sonra 2. sıraya yükselmiştir [2]. Tanı ve tedavisinde karşılaşılan zorluklar, kanser hastaları ve yakınlarının sosyal ve ekonomik açıdan büyük sorunlarla karşılaşmalarına neden olmaktadır [3]. Ovaryum kanseri, görülme sıklığı yönünden akciğer, meme, kolon ve pankreas kanserlerinden sonra beşinci sırada yer alırken, jinekolojik kanserler arasında en fazla ölüme neden olan kanser türüdür [4, 5]. Ülkemizde ovaryum kanserinin dağılımı ise 7,5/ dir [2]. Dağılımının yaşla birlikte arttığı ve kanser tanısı konulan hastaların yaklaşık yarısının 63 ve üzeri yaşta olduğu bilinmektedir. Her kadının yaşam boyu ovaryum kanserine yakalanma olasılığı yaklaşık %1,37 olup, bu hastalık nedeniyle ölüm yaklaşık %1 dir [6]. Ovaryumlar, farklı embriyolojik kökenli dokuların (germ, stromal ve epitelyal hücreler) bir araya gelmesiyle oluşmuş, kanser gelişimine yatkınlığı bulunan organlardır. Ovaryum kanseri, bu hücrelerin hızla çoğalması ile ortaya çıkmaktadır [7, 8]. Ovaryum tümörleri Dünya Sağlık Örgütü nce (WHO) kökenleri ve yapısal görünüşlerine göre sınıflandırılmıştır [9]. Bu sınıflandırmaya göre, ovaryum yüzey epitelinden köken alan tümörler, primer ovaryum tümörlerinin %85-90 ini oluşturmaktadır. Yüzey epiteli kökenli ovaryum tümörleri, hücre tipine (seröz, müsinöz, endometrioid, berrak hücreli, transisyonel hücreli, yassı hücreli, karışık epitelyal ve indiferansiye), büyüme şekline (kistik, solid, yüzeyel), fibröz stroma miktarına ve invazyon durumuna (benign, sınırda ve malign) göre alt sınıflara ayrılırlar [9, 10]. Uzun süre belirti görülmemesi, ovaryum kanseri olgularının yaklaşık %70 inin ileri düzeydeyken tanımlanmasına neden olmaktadır [11]. Günümüzde kullanılan tarama teknikleri, cerrahi girişimler, kemoterapi, radyoterapi ve diğer yöntemlerdeki ilerlemeler,

19 2 ovaryum kanseri tedavisinde sınırlı bir iyileşme sağlamıştır. Ancak, kanserinin başlaması ve ilerlemesi sırasında ortaya çıkan moleküler ve genetik değişiklikler ile ilgili bilgiler yeterli düzeyde değildir. Onkogenez sürecinde görev alan moleküllerin yapısal ve işlevsel özelliklerinin ortaya çıkarılması, ovaryum kanserinin tanı ve tedavisi için yeni hedeflerin belirlenmesi yönünden önemlidir [12, 13]. Jinekolojik kanserler arasında kemoterapiye en iyi yanıt veren ovaryum kanseridir. Bununla birlikte, hastaların %75 inden fazlasında kullanılan ilaca karşı gelişen dirençlilik nedeniyle ölüm oluşmaktadır [14]. Ovaryum kanseri tedavisinde etkinliği belirlenmiş olan çok sayıda sitotoksik ajan bulunmaktadır. Platin bileşikleri (sisplatin, karboplatin), klasik alkilleyiciler (isofosfamid, siklofosfamid), antrasiklinler (doksorubisin, epirubisin), paklitaksel, hekzametilmelamin, 5-fluorourasil (5-FU), etoposid, metotreksat, mitomisin-c, tamoksifen ve medroksiprogesteron asetat bunlardan bazılarıdır [15]. Ovaryum kanserinde kullanılan standart tedavi platin bazlıdır. Platin bazlı kemoterapi, epitelyal ovaryum kanseri olan hastalarda sağkalım oranını arttırmakla birlikte, gelişen platin dirençliliği nedeniyle olguların %75 inde hastalık yinelemektedir [14, 16]. Son yıllarda yapılan çalışmalarla yeni biyolojik ajanların bulunması, ovaryum kanserinde tedavinin iyileşmesine yönelik beklentileri arttırmıştır. Ovaryum kanseri biyolojisi ile ilgili yeni bilgiler elde edilmesiyle, tedavide kullanılabilecek çeşitli sinyal dönüşüm yolakları, büyüme faktörü reseptörleri, hücre döngüsü düzenleyicileri ve anjiyogenik düzenekler gibi moleküler hedefler tanımlanmıştır [17]. Wnt sinyal yolağı, hücre çoğalması, hücre canlılığı, hücre kutuplaşması, kök hücrelerin hücre geleceğinin belirlenmesi ve kendilerini yenilemeleri gibi çeşitli süreçlerde işlev görür. Wnt ligandlarının miktarı ya da Wnt sinyal dönüşümü için gerekli olan proteinlerin işlevlerinde oluşan değişiklikler sonucu embriyonik gelişimde çeşitli defektler ortaya çıkar. Buna ek olarak, yetişkinlerdeki anormal Wnt sinyalleri çeşitli hastalıkların etiyolojisine de katkıda bulunabilir [18]. Wnt sinyal yolağının ovaryum kanseri ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Endometrioid ovaryum kanserleri, genellikle β-katenin geninde oluşan mutasyonlardan kaynaklanırken, seröz, berrak hücreli ve müsinöz ovaryum kanserlerinde Wnt/β-katenin yolağında mutasyon enderdir [19]. Çalışmalar, tüm ovaryum kanserlerinin karsinogenezis aşamasında

20 3 mutasyon geçirmemiş olsa bile Wnt/β-katenin yolağının önemli bir işleve sahip olduğunu göstermektedir [20]. Wnt/β-katenin hedef genleri, hücre çoğalması ve apoptozisi düzenlemeleri nedeniyle kanserin başlaması ve ilerlemesini de denetlerler [21]. Niklozamid (C13H8Cl2N2O4; ticari ismi Niclocide), 1960 yılından beri insanlarda çeşitli tenya tedavilerinde kullanılan FDA (Food and Drug Administration) tarafından onaylanmış antihelmintik bir ilaçtır [22-24]. Bu ilacın etki yolu tam olarak bilinmemekle birlikte, tenyaların ph homeostazını bozduğu ve mitokondriyonlarında oksidatif fosforilasyonu baskıladığı düşünülmektedir [25]. Çalışmalarda niklozamid in memelilerde çok düşük bir toksisiteye sahip olduğu (ratlardaki oral LD50 değeri >5000 mg/kg) görülmüştür [26, 27]. In vivo ve in-vitro çalışmalarda normal doku ve hücrelere karşı belirgin bir niklozamid toksisitesi gözlenmemiş ve herhangi bir yan etki belirlenmemiştir [28]. Niklozamid son yıllarda çeşitli kanser türlerinde denenerek kanser hücrelerine olan terapötik etkileri ve etki yolları araştırılmaktadır. Kanser tedavisi için yeni ilaçlar geliştirilmesinde, diğer hastalıklar için kullanılan, güvenliği kanıtlanmış, FDA tarafından onaylı ilaçların kullanılması etkileyici bir yaklaşımdır [25]. Nüklear faktör kappa B (NFκB), inflamasyon, anti-apoptotik yanıt oluşumu ve karsinogenezis süreçlerinde önemli role sahip bir yolaktır [29]. Akut miyeloid lösemi kök hücrelerine niklozamid uygulandığında, niklozamid in NFκB yolağını baskılayarak kök hücreleri öldürdüğü, normal kemik iliğindeki progenitör hücrelere karşı ise çok düşük bir sitotoksisiteye sahip olduğu görülmüştür [27]. Benzer şekilde multiple myeloma hücrelerinde de niklozamid in NFκB yolağını baskıladığı belirlenmiştir [30]. Hücre çoğalması, hücre canlılığı, immün yanıt oluşumu ve anjiyogenezis süreçlerinde önemli role sahip olan STAT3 (transkripsiyonun sinyal dönüştürücüleri ve aktivatörleri 3) yolağının prostat, meme, baş ve boyun kanserleri, myeloma gibi birçok kanser türünde aşırı aktive olduğu bilinmektedir [31, 32]. Niklozamid in prostat kanseri [33], multiple myeloma [30] ve küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde, STAT3 yolağını baskılayarak hücre çoğalmasını azalttığı ve apoptozisi uyardığı bulunmuştur. Niklozamid uygulaması ile

21 4 in vivo ve in vitro STAT3 baskılanması yoluyla, akciğer kanseri tedavisinde kullanılan bir ilaç olan erlotinib e karşı kazanılan dirençliliğin giderilmesini sağlamıştır [34]. Çalışmalar, embriyonik gelişim sürecinde önemli bir role sahip olan Wnt/β-katenin sinyal yolağının aşırı aktive olduğunda tümör gelişimine neden olduğunu göstermiştir. Düşük dozlarda niklozamid uygulaması, prostat ve meme kanseri hücrelerinde Wnt/β-katenin sinyal yolağını baskılamış ve apoptozisi uyarmıştır [25]. In vivo ve in vitro çalışmalarda niklozamid in kolon kanserinde de Wnt/β-katenin sinyallerini baskılayarak tümör gelişimini durdurduğu belirlenmiştir [28]. S100 kalsiyum bağlanma proteini A4 (S100A4), metastaz oluşumunun temel bileşenleri olan hücre göçü, invazyonu, adezyonu ve anjiyogenezde önemli role sahip bir proteindir [35]. Safra kesesi, meme, özofagus, mide, pankreas, karaciğer, akciğer ve kolon kanseri gibi birçok kanser türünde S100A4 aşırı ifadelenmektedir [36] farklı bileşiğin görüntülendiği bir çalışmada, niklozamid in S100A4 promotör aktivitesini en etkili şekilde baskılayan bileşik olduğu ve güçlü bir antimetastatik etki gösterdiği belirlenmiştir [37]. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi, bazı kemoterapötik ilaçların tümör hücrelerini öldürmede kullandıkları önemli bir yoldur [38]. Niklozamid in, akut miyeloid lösemi kök hücrelerinde ROS üretimini arttırarak hücre ölümüne neden olduğu gözlemlenmiştir [27]. DNA hasarı içeren solid tümörler için etkili bir tedavi yöntemi olan radyoterapi de ROS üretimini arttırarak işlev görür. Ancak, çevre dokuların hasar görmesini engellemek için radyoterapinin oldukça düşük dozlarda uygulanması gerekmektedir. Akciğer ve kolon kanserlerinde yapılan çalışmalarda niklozamid in ROS üretimini arttırdığının bulunması, radyoterapi ile kombinasyon halinde kullanılması halinde bu ilacın kanser hücrelerinin radyasyona karşı duyarlılığını arttırabileceğini göstermektedir [39]. Niklozamid uygulamasının ovaryum kanseri kök hücrelerinin in vivo ve in vitro gelişimini baskıladığını rapor edilmiştir [40]. Primer ovaryum kanseri hastalarının asitlerinden izole edilen tümör hücrelerinde niklozamid ve karboplatin kombinasyon terapisinin Wnt/βkatenin yolağının baskılanmasına neden olarak hücre çoğalmasını azalttığı ve hücre ölümünü arttırdığı görülmüştür [41].

22 5 Bu çalışmada, antihelmintik bir ilaç olan niklozamid in OVCAR-3 (insan ovaryum adenokarsinoma epitelyal hücre hattı) hücreleri üzerine olan etkileri araştırılmıştır. Bu erekle, niklozamid in sitotoksik etkisinin belirlenmesinde MTT (3-(4,5dimetiltiazol-2il)- 2,5-difeniltetrozolyum bromid) yöntemi, apoptozisin değerlendirilmesinde TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp-biotin nick-end labeling) yöntemi ve niklozamidin Wnt/β-katenin sinyal yolağı üzerine etkilerinin belirlenmesinde immunositokimya yöntemi kullanılmıştır. Elde edilen bulgular, rutinde kanser tedavisinde kullanılmakta olan 5-FU için yapılan deneylerden elde edilen bulgular ve kaynak verileriyle karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir.

23 6

24 7 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Ovaryumların Gelişimi Embriyonun cinsiyeti genetik açıdan döllenme sırasında belirlenir. Ovum X kromozomu taşıyan spermiyum döllenirse XX (dişi), Y kromozomu taşıyan spermiyum ile döllenirse XY (erkek) kromozom yapısına sahip zigotlar oluşur [42-45]. Cinsiyet organlarının geleceğinin belirlenmesindeki esas etken, Y kromozomunun kısa kolu üzerindeki cinsiyet belirleyici bölge olan SRY geni ve bu gen tarafından kodlanan bir protein olan testis belirleyici faktör (TBF) dür. TBF nin var olması durumunda fetusun cinsiyeti erkek, yokluğunda ise kızdır [42, 44-46]. Embriyonun cinsiyeti, ovumu dölleyen spermiyum tipi ile döllenme sırasında belirlenmiş olmasına karşın, embriyonik gelişimin 7. haftasına kadar gonadlar erkek ya da dişi yapısal özelliklerini kazanmamışlardır. 7. haftadan önce genital sistem her iki cinste de birbirine benzer olduğundan bu dönem seksüel gelişimin farklanmamış evresi olarak isimlendirilir [43-46]. Gonadlar, karın arka duvarını döşeyen mezotel (mezodermal epitel), bunun altındaki mezenşim (embriyonik bağ dokusu) ve ilkel germ hücreleri olarak üç kaynaktan köken alır [42, 47]. Gonadlar ilk olarak, gelişimin 5. haftasında, karın arka duvarında, retroperitoneal bölgede, mezonefroz un medialindeki kölom epitelinin kalınlaşması ve altındaki mezenşimal hücrelerin çoğalarak yoğunlaşması sonucu bir çift kabartı halinde belirirler. Mezonefroz ve dorsal mezenter arasında, orta hattın her iki yanında, uzunlamasına ortaya çıkan bu kabartılar gonadal kabartı ya da gonadal sırt ismini alırlar. Gelişimin 6. haftasına değin gonadal kabartılar içinde germ hücreleri görülmez [44-46]. Epiblasttan köken alan ilkel germ hücreleri, primitif çizgi boyunca hareket ederek 3. haftada vitellüs kesesinin allantoise yakın duvarındaki endoderm hücreleri arasına yerleşirler. Embriyonun katlanması ile vitellüs kesesinin arka parçası embriyonun içine girer. Bu sırada ilkel germ hücreleri ameboid hareketlerle son bağırsağın mezenterinin dorsali boyunca ilerleyerek, 5. haftanın başında ilkel gonadlara ulaşırlar. 6. haftada da gonadal kabartıları işgal ederler. Stella, fragilis genleri ve kemik morfogenetik protein 4

25 8 (BMP-4) etkisiyle hücre bu yolu izleyerek gonadal kabartılara gelir ve buraya ulaşan hücrelerin göçleri sonlanır. Gonadların ovaryum ya da testise faklanmalarında ilkel germ hücrelerinin uyarıcı etkisi vardır. Bu hücreler gonadal kabartılara ulaşmazlarsa gonadlar gelişemez [43-46]. Germ hücreleri ilkel gonadlara ulaşmadan hemen önce ve ulaştıklarında, gonadal kabartılardaki epitel hücreleri çoğalarak altlarındaki mezenşimin içine doğru ilerler ve burada ilkel cinsiyet kordonları denilen düzensiz şekilli epitelyal kordonlar oluştururlar. İlkel cinsiyet kordonları her iki cinste de yüzey epiteliyle bağlantıdadır. 6 haftalık bir embriyoda, kordonlar mezenşim içinde çoğalmayı sürdürerek birbirleri ile anastomozlar yapan çok sayıda hücre kordonu oluştururlar. İlkel germ hücreleri ise kordonlar arasına yerleşir. Erken evrede erkek ve dişi gonadlar birbirinden ayırt edilemezler. Bunlara farklanmamış gonad denir [42, 44-46]. Farklanmamış gonad, dışta korteks ve içte medulladan oluşur. Embriyo XX kromozomuna sahipse, farklanmamış gonadın medullası geriler ve korteksi ovaryuma farklanır. Germ hücrelerini içeren ilkel cinsiyet kordonları, kordon özelliklerini yitirip düzensiz hücre kümelerine ayrılırlar. Ovaryumun daha çok medulla bölgesinde yerleşmiş olan bu hücre kümeleri bir süre sonra yok olur ve yerlerini damarlı bir stromaya (medulla) bırakırlar. Bu sırada çoğalmayı sürdüren yüzey epitelinden 7. haftada kortikal kordonlar ismi verilen ikinci nesil kordonlar gelişir. Kortikal kordonlar yalnızca kortekste bulunurlar. Kortikal kordonların büyüklüğü artar ve ilkel germ hücreleri bunların içine yerleşir. 16. haftada bu kordonlar her biri bir ya da daha çok sayıda ilkel germ hücresini çevreleyen izole hücre kümelerine (ilkel folliküller) ayrılırlar. Bu germ hücrelerinden zamanla oogonyumlar oluşur. İlkel folliküllerin her biri, oogonyum ve yüzey epitelinden köken alan, tek sıralı yassı follikül hücrelerinden yapılıdır. Folliküllerin çevresindeki mezenşim dokusu ise ovaryum stromasını oluşturur [42, 44, 48] Oogenezis Doğum öncesi (prenatal) olgunlaşma İlkel germ hücreleri genetik olarak dişi gonadlara ulaşır ulaşmaz oogonyumlara farklanırlar. Oogonyumlar mitoz bölünmelerle çoğalırlar ve 3. ayın sonunda yassı epitel

26 9 hücreleriyle çevrili kümeler halinde dizilirler. Oogonyumların çoğu mitozla bölünmeyi sürdürürken, bir kısmı bölünmesini I. mayoz bölünmenin profaz evresinde durdurarak primer oosit haline dönüşür. Oogonyumların çoğalması hızla sürerek gelişimin 5. ayında ovaryum içindeki germ hücrelerinin sayısı en yüksek düzeye, yaklaşık 7 milyona ulaşır. Ancak bu sırada başlayan hücre ölümü nedeniyle çok sayıda oogonyum ve primer oosit atretik hale gelir. 7. aya gelindiğinde yüzeye yakın az sayıdaki oogonyum dışındaki oogonyumların büyük bir kısmı yozlaşmış olur. Canlı kalan oositlerin tümü I. mayoz bölünmenin profaz evresine girer ve her biri ayrı ayrı tek katlı yassı epitel hücreleriyle çevrelenir. Yassı epitel hücreleriyle çevrelenmiş primer oositlere ilkel follikül denir [42, 44, 47]. Doğum sonrası (postnatal) olgunlaşma Doğumdan hemen önce primer oositlerin tümü I. mayoz bölünmenin profaz evresine girmiştir. Bunlar metafaz evresine girmezler ve puberteye değin profazın diploten evresinde dinlenme halinde kalırlar. Bu süreçte oositin olgunlaşması, follikül hücrelerince salgılanan ve oosit olgunlaşmasını engelleyen bir peptid olan oosit olgunlaşmasını baskılayan madde (OMI) tarafından durdurulur. Doğumda ovaryumlarda kadar primer oosit bulunur. Bunların çoğu puberteye kadar atretik hale gelir ve puberte başlangıcında bu sayı e düşer. Üreme evresinde bunlardan yalnızca kadarı ovulasyonla atılır [44, 47]. Puberteyle birlikte her ovaryum döngüsünde ilkel folliküllerden kadarı olgunlaşır. Diploten evresindeki primer oosit büyümeye başladığında, çevresindeki yassı follikül hücreleri önce kübikleşir ve bu durumdaki follikül tek sıralı primer follikül ismini alır. Daha sonra kübik follikül hücreleri çoğalarak çok katlı bir epitel katmanına dönüşürler. Çoğalan bu follikül hücrelerine artık granüloza hücreleri, oluşturdukları katmana ise granüloza hücre katmanı denir. Follikül bu haliyle çok sıralı primer follikül olarak isimlendirilir [44, 48, 49]. Granüloza hücreleri, teka folliküli ismi verilen bir kılıfla çevre bağ dokudan ayrılır. Granüloza hücreleri ve oosit tarafından salgılanan, glikoprotein yapısında, renksiz, hücre içermeyen, koyu boyanan ve asidofilik özellikte bir madde olan zona pellusida da oositin çevresinde bir katman oluşturur [42, 44, 48]. Follikül büyümeyi sürdürürken teka

27 10 follikülinin hücreleri, içte salgı yapan hücrelerden oluşan teka interna ve dışta fibroblast benzeri hücreler içeren bağ dokusundan yapılı teka eksterna olarak iki katmana farklanır [42, 44]. Gelişim sürdükçe granüloza hücreleri arasında içi hiyaluronik asitten zengin, viskoz bir sıvıyla dolu boşluklar ortaya çıkar. Bunlar birleşerek antrum denilen tek bir boşluk oluştururlar. Antrum oluştuktan sonra follikül artık sekonder (veziküler) follikül ismini alır [42, 44, 49]. Sekonder follikülün boyutu arttıkça, başlangıçta hilal şeklinde olan antrum zamanla genişler. Granüloza hücreleri ile çevrilmiş olan oosit bir tarafında baskıya uğrar ve bunun sonucunda antrum boşluğunun içine doğru belirgin bir uzantı oluşur. Oositi çevreleyen granüloza hücreleri bozulmadan kalarak kumulus ooforus denilen bir tepecik yaparlar. Oosit ile doğrudan ilişkili olan kumulus ooforus hücreleri radiyal şekilde düzenlenerek korona radiata yı biçimlendirirler. Korona radiata oositten zona pellusida aracılığıyla ayrılır ve ovulasyonda oositle birlikte atılır [42, 44, 49]. Ovulasyona yakın evrede follikül giderek büyür ve Graaf follikülü nü (olgun follikül) oluşturur. Follikülün çevresinde steroide benzer yapıda bir madde salgılayan ve kan damarlarından zengin teka interna ve ovaryum stromasıyla kaynaşan, kollajen lifler ve iğ şekilli hücrelerden oluşan teka eksterna yer alır. Bir Graaf follikülü 25 mm veya daha fazla çaptadır, korteksin tüm derinliğini kaplar ve medullaya doğru bir çıkıntı yapar. Ovaryumun serbest yüzünde ise dışa doğru stigma denilen bir şişkinlik oluşturur [42, 44, 49]. Her ovaryum döngüsünde adet follikül gelişmeye başlar ancak bunlardan sadece bir tanesi tümüyle olgunlaşabilir. Diğer folliküller atretik hale gelirler. Sekonder follikülün olgunlaşması sırasında lüteinize edici hormonda (LH) bir artış olur. LH artışından saat sonra, yani ovulasyondan hemen önce Graaf follikülü aşamasında iken, primer oosit I. mayoz bölünmeyi tamamlar. Bunun sonucunda her biri 23 çift yapılı kromozom içeren ancak büyüklükleri farklı iki yavru hücre oluşur. Bunlardan biri sitoplazmanın tümüne yakınını alan sekonder oosit; diğeri ise çok az sitoplazma içeren 1. kutup cismidir. 1. kutup cismi, sekonder oositin hücre zarıyla zona pellusida arasındaki perivitellin boşlukta yer alır. Sekonder oosit bundan hemen sonra II. mayoz bölünmeye girer ancak ovulasyondan 3

28 11 saat önce metafaz evresinde duraklar. II. mayoz bölünme, sekonder oosit bir spermiyumla döllendiğinde tamamlanır. Döllenme gerçekleşirse, sekonder oosit dişi pronükleusu içeren olgun ovum halini alır. Bu sırada 1. kutup cismi de ikinci bir bölünme geçirebilir ve bölünme sonucunda oluşan 2. kutup cismi atılır. Döllenme gerçekleşmediğinde sekonder oosit ovulasyondan 24 saat sonra dejenere olur [42, 44, 48] Ovaryumların Anatomisi İlkel germ hücreleri, vitellüs kesesinden yaklaşık onuncu torasik vertebra düzeyinde karın arka duvarının mezenşimine göç ederler ve buradaki gonadal kabartılarla birlikte ovaryumların gelişimine katılırlar. Ovaryumların karın arka duvarından pelvise inişi, gubernakulum ovarii nin denetiminde gerçekleşir. Gubernakulum ovarii, yukarıda ovaryumların alt uçlarından, tuba uterinaların uterusa girdiği yere yakın bir bölgede uterusa tutunur. Aşağıda ise gelecekte labium majörü oluşturacak olan bölgedeki fasiaya tutunur. İleri evrede gubernakulumun kraniyal parçası ligamentum ovarii propriumu oluştururken, kaudal parçası ise ligamentum teres uteri olarak kalır [50]. Ovaryumlar, minör pelvisin lateral duvarlarına yakın konumdaki fossa ovarica (Waldeyer in ovaryan çukuru) ismi verilen çukurlarda yerleşik yanlardan basık oval biçimli bir çift organdır. Her bir ovaryum gri-pembe renkli, 3-3,5 cm uzunluğunda, 2-3 cm genişliğinde, 1-1,5 cm kalınlığında ve 3-5 gr ağırlığındadır [49, 51]. Ovaryumlar, ligamentum latum uterinin arka-üst yüzüne tutunurlar. Tuba uterinaların arka-altında yer alırlar [50]. Ovaryumların yüzey doku niteliği yaşla birlikte değişmektedir: puberteye değin peritonla örtülü olup parlak ve pürüzsüzdür, puberteden sonra folliküllerin yırtılarak oositlerin atılması sonucu mat ve pürtüklü hale gelir, menopoz sonrası kadınlarda ise atrofik ve buruşuk görünümdedir [42, 52, 53]. Fossa ovarica üstten arteria iliaca externa, arkadan arteria iliaca interna ve üreterler, aşağı önde ise ligamentum latum uterinin tabanı ile sınırlanır. Fossa ovarica nın dibinde, peritonun altından a.-v. obturatoria ve n. obturatorius geçer [50, 54, 55]. Ovaryumlar anatomik olarak facies lateralis ve medialis olarak iki yüze; extremitas tubaria (üst uç) ve extremitas uterina (alt uç) olarak iki uca; margo mesovaricus (ön kenar) ve margo liber (arka kenar) olmak üzere iki kenara sahiptir [52-57].

29 12 Facies lateralis, düze yakın içbükey şekillidir ve fossa ovarica yı örten paryetal peritona oturur. Facies medialis daha konvekstir ve bu yüz peritonla kaplı olmayıp tuba uterina ile örtülüdür. Ovaryumun üst ucu olan extremitas tuberia, tuba uterinanın infundibulum parçası ile komşudur. Bu uca fimbria ovarica ve lig. suspensorium tutunur. Lig. suspensorium, iliac damarların ön tarafında yukarı doğru uzanan bir periton kıvrımı olup, içinde a.-v. ovarica ile plexus ovaricustan ovaryuma gelen dallar bulunur. Extremitas uterina, üst uca göre daha dar olan alt uçtur. Alt uç aşağı doğru yönelerek lig. ovarii proprium aracılığı ile uterusun cornu uteri sine tutunur. Lig. ovarii proprium, embriyonal yaşamdaki gubernakulum ovarii nin en üst kısmının bir kalıntısı olup lig. latum uteri içinde bulunur ve bol miktarda elastik ve düz kas lifleri içerdiğinden boyu değişebilir. Margo mesovaricus ismi verilen ön kenara lig. latum uteri nin bir bölümü olan mesovarium tutunur ve bu kenarda damar, sinir ve lenfatiklerin ovaryuma girip çıktıkları hilum ovarii yer alır. Serbest olması nedeniyle arka kenara margo liber denir. Öne karşın daha konveks ve künt olan bu kenar a. iliaca interna, v. iliaca interna ve üreter ile komşudur [50, 53, 54] Ovaryumların arterleri Ovaryumların arterleri, aorta abdominalisten 1. lumbar vertebra düzeyinde ayrılan sağ ve sol arteria ovarica lardır [56]. A. ovarica, lig suspensorium içinde ilerleyerek mesovariuma gelir ve burada a. uterinanın bir dalı olan ramus ovaricus ile anastomoz yaptıktan sonra hilum ovariiden ovaryuma girer ve ovaryumda folliküller çevresinde zengin kapiller ağları oluşturur [42, 54]. Damarların çapı döngü evrelerine göre değişir: follikül gelişimi sırasında damar çapı artarken ovulasyondan sonra azalır [42, 54, 56] Ovaryumların venleri Ovaryumları direne eden venler, arterleri izleyerek hilum ovariiden çıktıktan sonra, ovaryum ve tuba uterina yakınlarında lig. latum içinde plexus pampiniformis denilen venöz ağı oluştururlar. Pleksustaki venler birleşerek v. ovarica yı oluştururlar. V. ovarica sağda v. cava inferiora, solda v. renalis sinistra ya açılır [42, 50, 54].

30 Ovaryumların lenf damarları Ovaryumun lenf damarları kan damarları ile birlikte uzanarak nodi lymphatici preaortici ve nodi lymphatici aortici lateralis lere açılırlar [42, 54] Ovaryumların sinirleri Ovaryuma sinirler, plexus hypogastricus inferior ve a. ovarica çevresindeki plexus ovaricus tan gelir. Parasempatiklerini n. vagus tan, sempatiklerini ise n. splanchnicus minör ve bir kısmını torakal medulla spinalis segmentlerinden alır. Bu sinirlerin ovaryum içindeki dağılımları ve işlevleri tam olarak bilinmemektedir [54, 58] Ovaryumların Histolojisi Ovaryumlar, tek katlı yassıdan alçak kübiğe değişen epitel ile sarılıdır. Germinal epitel olarak isimlendirilen bu hücresel katman, gelişmekte olan ovaryumları çevreleyen mezotelyal epitelden köken alır ve mezovaryumu kaplayan mezotelyum ile süreklilik gösterir. Germinal epitel ismi, geçmişte bu epitelin germ hücrelerini oluşturduğuna inanılması nedeniyle verilmiştir, ancak yanlıştır. Günümüzde, ilkel germ hücrelerinin gonad dışı kökenli oldukları ve embriyonik vitellüs kesesinden gonadların korteksine göç edip burada farklılaşarak ovaryumun oluşmasını uyardıkları bilinmektedir. Germinal epitelin hemen altında (epitel ile korteks arasında), az miktarda damar içeren sıkı düzensiz kollajenöz bir bağ dokusundan oluşmuş tunika albuginea yer alır [48, 49, 59, 60]. Her bir ovaryum hücresel yapılı bir korteks ve bol damarlı gevşek bağ dokusundan oluşan bir medulla olmak üzere iki kısma ayrılır. Korteks ve medulla arasındaki sınır histolojik olarak belirgin değildir [60] Ovaryum medullası Ovaryumun merkez bölgesinde bulunan medulla, elastik ve çok sayıda kollajen lif içeren gevşek bağ dokusundan oluşmuştur. Bağ dokusu bol fibroblast kapsar. Medulla ayrıca, hilustan ovaryuma giren büyük ve kıvrımlı kan damarları, lenf damarları ve sinir lifleri içerir [60]. Hilus yakınında bir kaç düz kas hücresi bulunur. Menstruasyon öncesi

31 14 dönemdeki kadınlarda medulla, östrojen salgılayan epithelioid interstisyal hücre kümeleri de içerir. Ovaryum medullasındaki bir diğer epithelioid hücre grubu hilus hücreleridir. Hilus hücre sitoplazması testislerin Leydig hücrelerine eşdeş yapı sergiler. Bu hücreler androjen salgılarlar [59, 60] Ovaryum korteksi Ovaryum korteksi, medullayı çevreler. Korteks, stroma (interstisyal kompartıman), fibroblast benzeri stromal hücreler (interstisyal hücreler) ve stroma içine gömülü, gelişimin farklı evrelerindeki ovaryum folliküllerinden oluşur [49, 60]. Stroma, kollajen, elastik ve retiküler lifler kapsar. Folliküllerin çevresindeki stromada ayrıca dağınık yerleşimli düz kas lifleri bulunur. Ovaryum follikülleri, ortada büyük bir oosit ve onu çevreleyen tek ya da çok sıralı follikül hücrelerinden oluşan yuvarlak ya da oval yapılardır [49, 59]. Ovaryum korteksinde çeşitli gelişim evrelerinde 3 tip ovaryum follikülü bulunur [49]: İlkel follikül, Büyümekte olan folliküller, Primer follikül Sekonder (ya da antral) follikül Olgun (Graaf) follikül Ovaryum follikülleri İlkel folliküller İlkel folliküller ilk olarak fetal gelişimin üçüncü ayında görülürler. Olgun ovaryumda bu folliküller tunika albuginea nın hemen altındaki korteks stromasında yer alırlar. İlkel folliküllerde oosit, tek katlı yassı follikül hücreleriyle çevrelenmiştir. Folliküler hücreler birbirlerine dezmozom tipi bağlantı birimleriyle bağlıdır. Follikül hücreleri bir bazal lamina ile ovaryum stromasından ayrılmışlardır. Follikül içindeki oosit yaklaşık μm çapındadır. Oosit, bir ya da daha fazla belirgin çekirdekçik içeren eksantrik yerleşimli büyük bir çekirdek kapsar. Sitoplazmasında, Golgi kese ve veziküllerinin, endoplazmik retikulumun, birçok mitokondriyonun ve lizozomların birlikte oluşturduğu bir küme olan

32 15 Balbiani cisimciği bulunur. Oosit sitoplazması ayrıca, az sayıda anüler lameller içerir. Anüler lameller, bir çekirdek zarf kesitleri dizisidir [49, 59, 60]. Büyümekte olan folliküller Primer folliküller İlkel folliküller büyüyerek primer follikülleri yaparlar. Bu gelişim sırasında oositte, folliküler hücrelerde ve onları çevreleyen stromal dokuda değişiklikler oluşur [49, 60]. Oosit, yaklaşık μm ye değin büyür ve çekirdeği (germinal vezikül) genişler. Golgi kompleksleri ve çok sayıda mitokondriyonlar hücrenin her tarafına dağılmıştır, GER de bulunan ribozom sayısı artmıştır ve sitoplazmada bol miktarda serbest ribozomlar bulunur [60]. Oositi çevreleyen yassı follikül hücreleri çoğalarak kübik şekil alırlar. Follikül hücrelerinin kübik şekil aldığı bu evredeki follikül tek sıralı follikül hücre katmanı içeren primer follikül olarak isimlendirilir [48, 49, 60]. Oosit tek katlı kübik ya da prizmatik follikül hücrelerince çevrelendiğinde ve çapı μm ye ulaştığında, oosit ve follikül hücrelerince özel proteinler salgılanır ve bunlar bir araya gelerek hücre dışı bir örtü olan zona pellusidayı oluştururlar. Zona pellusida, oosit ile follikül hücreleri arasında yerleşik, onları birbirinden ayıran şekilsiz bir katmandır. İnsandaki zona pellusida, ZP1, ZP2, ZP3 olarak üç farklı sülfatlı asidik glikoproteinden oluşmuştur. Işık mikroskobunda zona pellusida asidofilik boyalarla ve Periyodik Asit- Schiff (PAS) ayıracı ile koyu boyanan homojen ve elektron yoğun bir katman olarak görülür. Folliküler hücrelerin filopodları zona pellusidaya uzanır, oosit zarı ile bağlantı kurar ve arada oluklu bağlantılar (gap junction) bulunur, bunlar folliküler gelişim süresince oosit ile iletişim kurarlar. Bu bağlantılar mayoz bölünmenin ilerleyebilmesi için oldukça önemlidir [49, 60]. Oositi çevreleyen tek katlı follikül hücreleri hızla mitoz bölünmeye uğrayarak stratum granülozum denen çok sıralı bir epitel oluştururlar. Böylece oosit artık birkaç folliküler hücre katmanı ile sarılmıştır ve buna çok katlı follikül hücre katmanı içeren primer follikül ya da preantral follikül ismi verilir. Follikül hücreleri de artık granüloza hücreleri olarak isimlendirilirler. Granüloza hücrelerinin çoğalması, primer oosit

33 16 tarafından üretilen sinyal molekülü aktivin aracılığıyla gerçekleştirilir. Bazal lamina, granüloza hücrelerinin en dış katmanıyla stroma arasındaki yerini korur [49, 60]. Granüloza hücreleri çoğalırken, çok katmanlı follikül hücresi içeren primer follikül çevresindeki stromal hücreler, bazal laminanın hemen dışında teka folliküli ismi verilen bağ dokusu hücreleri kılıfı oluştururlar. Teka folliküli daha sonra iki katmana ayrılır: Teka interna: Bol kan damarı ve salgı yapan kübik hücreler içeren iç katmandır. Teka internanın tamamen farklılaşmış hücreleri, steroid üreten hücrelerin genel yapı özelliklerini sergilerler ve hücre zarlarında LH reseptörleri kapsarlar. LH uyarımına yanıt olarak östrojen hormonunun öncülü olan androjenleri sentezler ve salgılarlar. Bu hücreler ayrıca fibroblastlar, kollajen lif demetleri ve endokrin organların belirgin özelliği olan zengin küçük damar ağına sahiptir. Granüloza hücreleri kalın bir bazal lamina ile teka internadan ayrılmışlardır [49, 60]. Teka eksterna: Fibröz bağ dokusundan yapılmış dış katmandır. Esas olarak düz kas hücreleri ve kollajen lif demetlerinden oluşmuştur. Teka follikülinin iki katmanı ve teka eksterna ile stroma arasındaki sınır belirgin değildir [49, 60]. Sekonder (antral) folliküller Granüloza hücrelerinin çoğalması sonucu primer follikülün çapı artar ve korteks stromasının derinliklerine doğru ilerler. Granüloza hücre katmanı, 6-12 hücre katı kalınlığına ulaşınca, granüloza hücreleri arasında içi sıvı dolu boşluklar oluşmaya başlar. Hiyaluronan bakımından zengin olan bu sıvı likör folliküli olarak isimlendirilir [49]. Likör folliküli, granüloza hücrelerince üretilen glikozaminoglikanlar, proteoglikanlar ve steroid-bağlayıcı proteinler içerir. Bunlar yanında, LH ve follikül stimüle edici hormon (FSH) salınımını düzenleyen progesteron, estradiol, inhibin, folliostatin ve aktivin gibi hormonları da kapsar. Hipofiz bezinin ön lobundan salınan FSH ın etkisiyle granüloza hücre katı ve likör folliküli içeren boşluk sayısı artar [60]. Sıvı birikimi sürdükçe, granüloza hücreleri arasındaki küçük boşluklar birbirleriyle birleşirler ve sonunda antrum ismi verilen hilal şeklinde tek bir boşluk oluşur. Antrum içeren follikül artık sekonder follikül ya da antral follikül olarak isimlendirilir [49, 60]. Eksantrik yerleşimli ve yaklaşık 125 μm çapında olan oosit daha fazla büyüyemez. Büyümenin

34 17 sınırlandırılması, granüloza hücrelerince antral sıvıya salgılanan OMI tarafından sağlanır [49]. Sekonder follikülün büyüklüğü arttıkça, birkaç granüloza hücre katmanı ile çevrili olan antrumun da genişliği de artar. Diğer bölgelerde hemen hemen eşit kalınlıkta olan granüloza hücre katmanı, oosit ile ilişkili olduğu bölgede kumulus ooforus ismi verilen ve antruma doğru çıkıntı yapan bir tümsek oluşturur. Oositin hemen çevresini saran kumulus ooforus hücrelerine korona radiata denir. Korona radiata, kumulus hücrelerinden oluşur ve ovulasyonda oositle birlikte atılır [49]. Bu evrenin sonuna doğru, stromal hücreler büyür ve teka interna kendisini ve granüloza hücrelerini besleyen kapillerlerce istila edilir. Bu evreye ulaşan folliküllerin çoğu atreziye uğrar, ancak atretik folliküller ile ilişkili bazı granüloza hücreleri dejenere olmaz. Dejenere olmayan bu hücreler, menopoz sonuna kadar az miktarda androjen salgılayan interstisyal bezleri oluştururlar. Az sayıda sekonder follikül, olgun follikülleri oluşturmak için gelişmeyi sürdürür [60]. Olgun (Graaf) folliküller Granüloza hücrelerinin çoğalmayı sürdürmesi ve likör folliküli üretiminin sürmesi sonucu, ovulasyon evresinde çapı 25 mm ye ulaşan olgun follikül oluşur. Graaf follikülleri olarak da bilinen olgun folliküller, boyutlarının büyük olması nedeniyle, ovaryum korteksinin tüm kalınlığını kaplar ve ovaryumun yüzeyinde şeffaf bir çıkıntı şeklinde gözenebilirler [49, 60]. Antrum genişledikçe, granüloza hücre katmanı incelir. Granüloza hücreleri arasındaki boşluk arttıkça, ovulasyona hazırlık olarak kumulus-oosit kompleksi ile geri kalan granüloza hücreleri arasındaki bağlantı zayıflar. Olgunlaşmanın bu aşamasında teka katmanları daha belirgin bir hale gelir. Teka interna hücrelerinin sitoplazmalarında yağ damlacıkları belirir ve hücreler steroid üreten hücrelerin yapısal özelliklerini kazanırlar [49] Ovulasyon Sekonder oositin Graaf follikülünden atılması ovulasyon olarak isimlendirilir. Menstrual döngünün ortasında (28 günlük sürenin 14. gününde), gelişmekte olan Graaf follikülü ve

35 18 bazı sekonder folliküllerce üretilen östrojen hormonu, kanda östrojen yoğunluğunun artmasına neden olur. Bu artış nedeniyle gerçekleşen negatif geribildirim ile hipofiz bezinin ön lobundan FSH salınımı durur ve ani bir LH salınımı gerçekleşir. LH düzeyindeki ani artış sonucu ovaryumlara kan akışı artar ve teka eksterna içindeki kapillerler plazma sızdırmaya başlayarak ödem oluşturur. Ödem oluşumu ile eş zamanlı olarak, Graaf follikülü çevresine histamin, prostaglandinler ve kollejenazlar salınır. Buna ek olarak follikülde, plazminojenin plazmine dönüşmesini katalizleyen enzim olan plazminojen aktivatörü düzeyi artar ve yeni oluşan plazmin, granüloza katmanının proteolizini kolaylaştırarak ovulasyonun gerçekleşmesini sağlar [60]. Ovulasyondan hemen önce ovaryum yüzeyi, Graaf follikülünün tunika albuginea ya baskı yaparak çıkıntı oluşturduğu bölgede kan desteğini yitirir. İnce duvarlı, soluk renkli, damarsız olan bu bölge makula pellusida ya da folliküler stigma ismini alır. Graaf follikülünün duvarı stigmaya değer, stigma bölgesindeki bağ dokusu yozlaşır ve yırtılır. Böylece periton boşluğu ve Graaf follikülünün antrumu arasında bir açıklık oluşur. Korona radiata ve kumulus ooforus hücrelerince çevrelenmiş olan sekonder oosit, bir miktar likör folliküli ile birlikte bu açıklıktan periton boşluğuna atılır ve ovulasyon gerçekleşir [49, 60]. Ovulasyon sırasında tuba uterinanın distal, fimbriyalı ucu ovaryumun yüzeyine iyice yaklaşır ve oositi içeren kumulus kütlesi fimbriyalarca tuba uterinanın karına açılan deliğine doğru süpürülür. Kumulus kütlesi fimbriyaya sıkıca tutunur ve tuba uterinayı döşeyen silyalı hücrelerce aktif olarak lümene alınır. Böylece kumulus kütlesinin peritoneal boşluğa geçişi engellenir. Ovulasyondan sonra sekonder oosit yaklaşık 24 saat canlı kalır. Bu süre içinde döllenme gerçekleşmezse sekonder oosit tuba uterinadan geçerken yozlaşır ve fagosite edilir [49, 60] Korpus luteum Graaf follikülü ovulasyonda yırtılınca sekonder oosit serbestleşir, geriye kalan granüloza ve teka hücrelerinden oluşan follikül duvarı ise korpus luteum (sarı cisim) ya da luteal bez olarak bilinen geçici bir yapıyı şekillendirir. Follikülü kollabe olur, içeriye doğru çok sayıda çöküntü ve kıvrıntılar yapar. Teka internadaki kapillerlerden follikülün lümenine doğru olan kanama, merkezi bir pıhtısı bulunan korpus hemorojikumun oluşmasına neden olur. Daha sonra, stromadan gelen bağ dokusu eski follikül boşluğuna girer. Granüloza hücrelerini teka interna hücrelerinden ayıran bazal membran parçalanır ve önceden

36 19 damarsız olan granüloza hücrelerinin vasküler invazyonu gerçekleşir. Hipofiz bezi ön lobundan salgılanan LH, luteinizasyon denilen bir süreç ile granüloza hücrelerini ve teka interna hücrelerini belirgin yapısal değişiklikler oluşturacak şekilde etkiler ve artık bu hücreler sırasıyla granüloza lutein hücreleri ve teka lutein hücreleri ismini alır. Hücrelerin sayısı ve oylumu artar, çok köşeli hale gelirler. Hafif eozinofilik boyanırlar, sitoplazmalarında çok sayıda lipid damlacıkları birikir. Her iki hücre tipi de steroid salgılayan hücrelerin genel yapı özelliklerini gösterirler. Büyük ve granüloza hücresi kökenli merkezi yerleşimli hücreler olan granüloza lutein hücreleri, progesteron hormonu sentezler ve salgılarlar. Progesteron hormonu, uterus endometriyumunu döllenmiş ovumun implantasyonuna hazırlar ve meme bezlerinin büyümesini uyarır. Teka lutein hücreleri, daha küçük ve teka interna katmanı hücrelerinden kökenlenen, daha koyu boyanan, periferik yerleşimli hücrelerdir. Bunlar, östrojen hormonu sentezler ve salgılarlar. Gebelik gerçekleşirse, korpus luteum ilk 8 hafta varlığını sürdürür, plasenta geliştikten sonra ise steroid hormon yapım işlevini üstlenir. Gebelik oluşmamışsa, korpus luteum yavaş yavaş geriler, progesteron hormonu yapımı durur ve korpus albikans (beyaz cisim) olarak isimlendirilen beyaz renkli skar bir yapıya dönüşür [49, 61] Atretik folliküller Normal üreme döngüsü süresince doğumda adet olan ovaryum folliküllerinin yaklaşık 400 kadarı tam olarak olgunlaşır. Folliküllerin çoğu fetal gelişim sırasında başlayıp, puberte, erişkinlik ve menapozda devam edecek şekilde ya ilkel follikül evresinde ya da daha ileri bir gelişim evresinde dejenere olurlar. Kalıntıları ise ovaryumlarda atretik folliküller olarak kalır. Atrezi yani folliküllerin gerilemesinde ilk olarak oosit büzülür ve sitolize ilerler. Bunu izleyen folliküler hücrelerin dejenerasyon sürecinde ise hücreler piknotikleşir, birbirinden ayrılır ve otolize uğrarlar. Zona pellusida şişer ve uzun süre bu şekilde kalabilir. Teka hücreleri vasküler kordonlar şeklinde düzenlenirler, dejenere olurlar ve daha sonra yerlerini bağ dokusu doldurur. Stromada çok sayıda makrofaj bulunur. Atretik folliküllerde tipik olarak granüloza hücreleri ile teka eksterna arasında bazal lamina kalıntıları görülür. Bu haliyle bazal lamina kalın, kısmen çökmüş, eozinofilik camsı membranlar şeklinde ayırt edilir [61].

37 Ovaryumların Fizyolojisi Ovaryumların birçok işlevi vardır: (1) oogenezis, (2) oositin olgunlaşması, (3) ovulasyon ve (4) dişi cinsiyet steroid hormonları (östrojen ve progesteron) ile peptid inhibin salgılanması. Ovulasyondan önce, oositin olgunlaşması ile ovaryumların endokrin işlevleri ovaryumdaki tek bir yapıda yani follikülde gerçekleşir. Ovulasyondan sonra, artık oosit içermeyen follikül, sadece endokrin işlevi olan korpus luteuma dönüşür [62] Ovaryumların işlevlerinin düzenlenmesi Ovaryumların işlevleri, hipotalamo-hipofizer-ovaryan eksen ismi verilen bir geri bildirim sistemince düzenlenir. Hipotalamus: Ovaryumların işlevlerinin denetiminde rol oynayan temel hipotalamik bölgeler, preoptik ve supraoptik çekirdeklerdir. Bu alanlardaki parvoselüler nöronlar, hipotalamik serbestleştirici hormon ya da gonadotropin serbestleştirici hormon (GnRH) sentezleyip salgılarlar. GnRH, gövdede ön hormon olarak sentezlenen bir peptid hormondur. Aktif şekle dönüştürülerek hipofizer portal sisteme salgılanır [63-65]. Hipofiz bezi: GnRH, hipofiz portal dolaşımı aracılığıyla hipofiz bezi ön lobundaki gonadotrop hücrelere ulaştırılır ve buradan gonadotropinler olarak isimlendirilen FSH ve LH salgılanır [63-65]. Ovaryumlar: Ovaryumların endokrin bölümü, esas olarak folliküllerle ilgilidir ve teka ile granüloza hücrelerini kapsar. Bu hücreler, hipofiz bezinden ovaryumlara iletilen FSH ve LH a yanıt olarak östrojen ve progesteron salgılarlar [63-65]. Ovaryumlar ve endometriyum, hipofiz bezi, ovaryum follikülleri ve korpus luteum tarafından salgılanan hormonların miktarlarındaki değişimler ve bunların karşılıklı etkileşimleri sonucu menstrual döngü denilen siklik değişimler geçirir. Menstrual döngü, kadın yaşamının üreme evresinde gebelik olmadığında, her 28 günde bir yinelenen yapısal ve fizyolojik değişiklikleri içerir [61]. Ayın belirli günlerinde, endometriyumun fonksiyonel katmanının nekrozu ve dökülerek vaginal kanama (menstruasyon) yoluyla atılması ile özelleşmiş olan bu döngü, ortalama 28 günde bir yinelenir. Menstrual

38 21 döngünün ilk 14 günü folliküler evre (preovulatuvar evre), ikinci 14 günü ise luteal evre (postovulatuvar evre) olarak isimlendirilir [59, 61, 63, 65]. Ovulasyon evresi ise yaklaşık olarak 14. günde olaylanır. Graaf follikülünün büyüdüğü ve sekonder oositin geliştiği folliküler evrede FSH ve LH pikine yol açmak üzere östrojenler giderek artarken, progesteron düşük düzeyde kalır. Luteal evrede, östrojen ve progesteron hormonu salgılayan korpus luteum oluşur [65]. Menstrual döngünün düzenli bir şekilde gerçekleşmesi için hipotalamo-hipofizer-ovaryan eksenin düzgün çalışması gereklidir [59]. Menstrual döngü sürecinde gonadotropinlerin etkisiyle ovaryumdaki değişiklikler düzenli bir şekilde sürer. Gonadotropin salgısının düzenlenmesi ise hipotalamusun denetimindedir. Hipotalamus bu düzenleme işini, hipofizer portal sisteme salgıladığı GnRH ile sağlar [63, 65]. Ovaryumlar gonadotropinlerle uyarılmadıkları sürece inaktif durumda kalırlar. Fetal yaşam boyunca ovaryumlar, plasentadan salınan bir gonadotropik hormon olan koryonik gonadotropin (hcg) ile uyarılırlar ve işlev görürler. Ancak doğumdan sonraki birkaç hafta içinde bu uyarı kaybolur ve ovaryumlar puberte öncesi evreye değin inaktif kalırlar [63, 64]. Puberte öncesi evrede ovaryumlardaki primer oositler, tek katlı yassı follikül hücreleriyle çevrilmiş ilkel folliküller halindedirler. Oositin beslenmesini sağlayan folliküler hücreler aynı zamanda oositlerin olgunlaşmasını baskılayan bir faktör olan OMI yi salgılarlar. Puberte ve sonrasında ise hipofiz bezi ön lobundan FSH ve LH salgılanmasıyla bu etki ortadan kalkar ve folliküler büyümeye başlar [64]. Menstrual döngünün ilk bir kaç günü içinde FSH ve LH salınımında hafif bir artış olur. Özellikle artan FSH ın etkisiyle primer folliküllerden bir kısmı büyümeye başlar. Folliküler evre denilen bu evrenin sonlarına doğru büyüme hızlanır [64]. Ovulasyon öncesinde, folliküllerden birisi daha fazla büyüyerek olgunlaşır. Olgunlaşan bu follikülden bol miktarda östrojen hormonu salgılanır. Östrojen hormonu, hipotalamusa etki ederek hipofiz bezinden LH salgılanması uyarır. LH artışı, hızlı büyüyen follikülün sıvı ve hormon salgısının hızla yükselmesine neden olur. Östrojen hormonu ayrıca hipofiz bezinin ön lobundan daha fazla FSH salgılanmasını baskılamak için, hipotalamusu etkiler. Böylece diğer folliküllerin daha fazla büyümesini engellenir. Büyümesi baskılanan folliküler, dejenere olarak atretik hale gelirler [59, 63, 64].

39 22 Ovulasyondan yaklaşık 2 gün önce, hipofiz bezi ön lobundan LH salgılanma hızı belirgin bir şekilde artar. Ovulasyondan yaklaşık 16 saat önce, LH miktarı 6-10 katına çıkar. FSH da aynı süreç içinde 2-3 kat artar [63, 64]. LH miktarının aniden yükselmesiyle follikülde bazı değişiklikler oluşur. Olgunlaşan follikül büyür, ovaryum yüzeyinde yerel bir kabarıklık ortaya çıkar ve bu kabarıklığın tepesinde stigma denilen damarsız bir alan gözlemlenir. Follikül duvarında hızla yeni kan damarları oluşurken folliküler dokuda prostoglandin miktarı artar. Prostoglandinler ovaryum duvarında yerel kasılmalara neden olur. Follikül sıvısında bulunan plazminojen, granüloza hücrelerince sentezlenen plazminojen aktivatör ile plazmine dönüştürülür. Plazmin, follikül duvarının dejenere olmasını sağlar. Sonuç olarak, follikülün büyümesi ve stigmanın dejenerasyonu ile follikül yırtılır, yerel kasılmaların da etkisiyle korona radiata ve kumulus ooforus hücrelerince çevrelenmiş olan sekonder oosit ovaryumdan dışarı atılır ve ovulasyon gerçekleşir. Periton boşluğuna atılan oosit ovaryumun yüzeyine çok yaklaşmış olan tuba aterinaların fimbriyalarınca yakalanarak tüp içine alınır [63, 64]. Oosit ovulasyonla atıldıktan sonra geriye kalan follikül duvarındaki granüloza ve teka hücreleri yaşamlarını çevredeki damarlar yoluyla sürdürmeye devam ederler. LH ın etkisiyle, sitoplazmalarında sarımsı bir pigment biriken bu hücreler luteal hücrelere dönüşürler ve oluşan bu yapı korpus luteum ismini alır. Teka lutein hücreleri, androstenedion ve testosteron gibi androjenler ile östrojen ve progesteron hormonları sentezleyip salgılarlar. Granüloza lutein hücreleri ise relaksin ve progesteron hormonları sentezler ve salgılar. Ayrıca, teka lutein hücrelerinden gelen androjenleri FSH ın etkisiyle östrojene dönüştürürler. Döllenme olmadığında, korpus luteum ovulasyondan sonraki günde en büyük boyutuna ulaşır, bu aşamadan sonra luteal hücrelerin dejenerasyonu ile giderek küçülür, salgı işlevi azalır, salgısı lipit özelliğini yitirir ve korpus albikans denilen skar dokusu haline gelir. Bu sırada korpus luteumun dejenerasyonu ile östrojen ve progesteron hormonu düzeyleri azaldığından menstruasyon başlar. Gebelik gerçekleşirse, gelişmekte olan embriyonun sinsityotrofoblast hücrelerince salgılanan ve LH ile hemen hemen aynı özelliklerde diğer bir hormon olan hcg hormonu korpus luteumun dejenerasyonu engeller. Böylece korpus luteum büyümesini sürdürür ve gebelik korpus luteumuna dönüşür. 4. ayın sonuna değin progesteron hormonu salgılamaya devam eden bu yapı, 4. aydan sonra yavaş yavaş dejenere olur [63, 64].

40 23 Ovaryumlardan salgılanan dişi cinsiyet hormonları, steroid yapıda olan östrojenler ve progestinlerdir [66]. Kadın plazmasında β-östradiyol, östron ve östriyol olarak 3 tip doğal östrojen vardır. Östrojenler, büyük ölçüde ovaryumlardan az bir miktarda da böbreküstü bezi korteksinden salgılanırlar. Ovaryumlarda östrojen hormonu üretimiyle yükümlü olan yapılar, olgun follikülün teka interna hücreleri, granüloza hücreleri ve korpus luteumdur. Ovaryum folliküllerinden salınan östrojenlerin en önemlisi, östrojenik gücü östrondan 12 kat, östriyolden ise 80 kat daha fazla olan β- östradiyoldur [64-66]. Östrojenlerin en belirgin işlevleri, dişi üreme organlarının şekillenmesini ve sekonder dişi cinsiyet özelliklerinin oluşmasını sağlamaktır. Ayrıca, ovaryum folliküllerinin büyümesini, endometriyumun kalınlaşmasını, tüm genital yolların epitel katmanının büyümesini ve düz kasların büyümesini sağlarlar. Meme uçları ve genital bölgede pigmentasyonu arttırırlar. Memede, stromal dokunun ve kanal sisteminin gelişmesini sağlarlar. FSH salınımını düzenlerler. Plazma kolestrol miktarını düşürürler. Uterus kan dolaşımını ve servikste mukus yapımını arttırırlar. Tuba uterinaların hareketini, silya etkinliğini çoğaltırlar. Endometrial hücrelerde progesteron reseptörü sayısını arttırırlar [63, 64]. Progestinler içinde en önemli olan hormon, 21 karbonlu bir steroid olan progesterondur. Plazmada küçük miktarlarda bulunan ve progesteron ile aynı etkiye sahip olan bir diğer progestin ise, 17-α-hidroksiprogesteron dur [64]. Progesteron, gebe olmayan normal kadınlarda, menstrual döngünün ikinci yarısında korpus luteumdan, gebelikte ise 4. aydan sonra plasentadan salgılanır [63]. Progesteronun en temel işlevi, endometriyumu blastosistin implantasyonuna hazırlamaktır. Bunun yanı sıra, uterus kasılmalarının şiddetini ve sıklığını azaltarak implante olmuş blastosistin atılmasını engeller. Tuba uterinaları döşeyen mukozada sekresyon evresiyle ilgili değişimleri başlatır ve böylece zigotun implantasyondan önce beslenmesini sağlar. Miyometriyum hücreleri üzerinde östrojen karşıtı bir etki göstererek oksitosine duyarlılığını azaltır. Servikste mukus yapımının azalmasını ve koyulaşmasını sağlar. Memedeki lobül ve alveolerin gelişmesini hızlandırarak, salgı yapmalarını uyarır. Termojenik etkisi nedeniyle, ovulasyonda bazal vücut sıcaklığının artmasına neden olur [63, 64].

41 Kanser Kanser, hücrelerin büyümesi ve çoğalmasını denetleyen düzeneklerde ortaya çıkan hatalarından kaynaklanan bir hastalıktır [67, 68]. Kanser, basit bir deyişle denetimsiz hücre çoğalması olarak tanımlanabilirken, kanser hücreleri birçok başka biyolojik özellikler de içerirler. Hücre kültüründe kontak inhibisyondan kaçabilme, bölünebilmek için dış sinyallere gereksinim duymama, çoğalmayı baskılayan sinyallere duyarsızlık gösterme, apoptozisten kaçabilme, anjiogenezi uyarabilme ve metastaz yapabilme bu özelliklerden bazılarıdır [67]. Genetik denetim sistemlerince düzenlenen büyüme sinyalleri, büyümeyi engelleyici sinyaller ve ölüm sinyalleri sayesinde yaşam boyunca hücre çoğalması ve ölümü sürekli bir denge halinde tutulur [68, 69]. Bazı yetişkin dokularında, hücrelerin sürekli olarak çoğalmasıyla dokunun yenilenmesi sağlanır. Örneğin, bağırsak epitel hücreleri ve bazı beyaz kan hücreleri sadece birkaç gün yaşayıp ölür ve yerine yenileri gelirken, deri hücreleri genellikle 2-4 hafta yaşarlar ve daha sonra ölerek dökülürler. Ancak, yetişkinlerde pek çok diğer dokudaki hücreler (karaciğer hücreleri, kalp kası hücreleri ve sinir hücreleri gibi) yara iyileşmesi süreci dışında çoğalmazlar ve uzun süre hatta canlının tüm yaşamı boyunca işlevsel kalabilirler. Bu normal çoğalma oranlarını denetim altında tutan düzeneklerde meydana gelen bozukluklar, aşırı hücre bölünmesine neden olur ve bunun sonucunda kanser oluşur [67, 70] Kanser hücrelerinin sınıflandırılması Normal hücreler, embriyonik evrede köken aldıkları dokulara göre sınıflandırılırlar. Tümörlerin sınıflandırılması da normal hücrelere benzer şekilde yapılır ve buna göre tümörler iki esas sınıfa ayrılırlar. Epitel dokudan (bağırsak epiteli, deri ve sinir epiteli gibi) köken alan malign tümörler karsinoma, mezenşimal dokudan (kas, kan ve bağ doku öncülleri gibi) köken alanlar ise sarkoma olarak isimlendirilir. Karsinomalar, insan kanserlerinin %90 dan fazlasını oluşturan en yaygın tümörlerdir. Tümörlerin çoğu solid kitleler halinde büyürken, sarkomaların özel bir sınıfı olan lösemiler kanda bireysel hücreler olarak çoğalırlar. Malign sarkomanın bir diğer tipi olan lenfomalar ise lenfosit ve plazma hücrelerinin oluşturduğu solid tümörlerdir. Malign beyin tümörleri sinir hücrelerinden köken alırken, glioblastomalar beyindeki glia hücreleri kökenlidir [67, 71].

42 25 Tümörler özellikle yaşlı bireylerde sıklıkla ortaya çıkar ancak bu tümörlerin çoğu bölgesel ve küçük boyutlu olduğundan düşük risk oluştururlar. Benign tümör olarak isimlendirilen bu tümörlere en iyi örneklerden biri benign bir deri tümörü olan siğillerdir. Benign tümör hücreleri işlev ve yapı yönünden normal hücrelere çok benzerler [67, 71]. Bu hücrelerin dokuda bir arada tutulması, normal hücrelerde olduğu gibi hücre adezyon molekülleri aracılığıyla olup, köken aldıkları dokularda bulunurlar. Benign tümörlerin büyüklüğü genelde fibröz bir kapsül ile belirlenir. Bu tümörler, sadece büyüklükleri normal bir işleve engel olursa ya da hormonlar gibi biyolojik olarak aktif maddeleri aşırı miktarda salgılarlarsa ciddi sağlık sorunlarına neden olurlar. Örneğin, benign bir hipofiz bezi tümörünün büyüme hormonunun aşırı salgılanmasına neden olması sonucu baş, eller ve ayakların aşırı büyümesi olarak tanımlanan akromegali oluşur [67]. Malign tümör hücreleri normal hücrelerden daha hızlı büyür, bölünür ve normal bir ölüm seyri göstermezler. Malign hücrelerin en önemli özellikleri yakın dokulara yayılma yetenekleri olup, hücreler çoğalmaya devam ettikçe yayılır ve yeni tümörlere köken oluştururlar [67, 71]. Uterus ya da memede olduğu gibi bazı malign tümörler en azından bir süre kapsülle sınırlandırılarak belli bir bölgede kalabilirler. Bu tümör hücreleri de zamanla çevre dokulara yayılır ve metastaza neden olur [67]. Kanser hücreleri genellikle normal hücrelerden ya da benign tümör hücrelerinden daha az farklılaşmış olmalarıyla mikroskobik olarak ayırt edilebilirler. Belli bir dokudaki malign hücreler, çekirdek/sitoplazma oranının yüksek olduğu, çekirdekçiklerin belirgin olduğu, mitotik hücrelerin artan bir düzeyde olduğu ve farklılaşmış yapıların kısmen az bulunduğu hızlı büyüyen hücrelerin özelliklerini sergilerler [67] Anjiogenezis ve metastaz Primer ve sekonder tümörlerin her ikisinin de büyüyebilmesi için yeni kan damarlarının oluşması gereklidir. Yeterli kan desteği sağlanmadığında bir tümör yaklaşık 10 6 hücreden oluşan ve 2 mm çapında bir küre halini alıncaya değin büyüyebilir. Bu durumda, yeterli besinin sağlanması için tümör yüzeyindeki hücrelerin bölünmesi ve tümörün iç kısmındaki hücrelerin ölümü arasında bir denge kurulur. Hormonlar sentezlenmedikçe, bu tip tümörlerde sorunlar ortaya çıkar [67, 72]. Bununla birlikte pek çok tümör, tümörü saracak ve besleyecek yeni kan damarlarının oluşumunu uyaran ve anjiogenezis olarak

43 26 isimlendirilen bir süreci tetikler. Anjiogenezis, (1) yakın damarları çevreleyen bazal membranların proteolitik enzimlerce parçalanması, (2) endotel hücrelerinin aktive olması ve çoğalarak tümör içine göç etmesi, (3) tübül oluşumu ve olgunlaşma, damar stabilizasyonu ve hücre dışı matriksin yeniden şekillenmesi aşamalarını içerir [73]. Tümörlerin çoğu anjiogenezisi uyarıcı büyüme faktörleri üretirler. Bazı tümörler ise kendilerini çevreleyen normal hücrelere benzer faktörleri sentezletip salgılatırlar. Birçok tümör tarafından salgılanan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), bazik fibroblast büyüme faktörü (bfgf), trombosit kökenli büyüme faktörü (PDGF), transforme edici büyüme faktörü α ve β (TGFα ve TGF β) ve tümör nekroz faktörü α (TNFα) gibi faktörler anjiyogenik özelliktedir [73, 74]. Oluşan yeni kan damarları büyüyen tümörü besler, tümör boyutunun artmasını sağlar ve yeni zararlı mutasyonların ortaya çıkma olasılığını arttırır [72]. Anjiogenezis, yalnızca tümörün büyümesi için değil, metastaz için de gerekli bir süreçtir. Yeni damarlar oluşmadığı sürece tümör hücreleri metastaz yapamazlar. Bu nedenle anjiogenezis malignitenin bir göstergesidir [67]. Kanser hücrelerinin yeni dokulara yayılma süreci olan metastaz, gelişigüzel olmayan, çok aşamalı ve oldukça karmaşık bir süreçtir. Tümör hücrelerinin yeni damarlar oluşturmaları ve büyüme faktörleri üretmeleriyle metastaz kolaylaşır. Hareketli ve yayılmacı hücreler bu süreç için en tehlikeli hücrelerdir. Büyüme faktörleri ve kolayca büyüyen yeni damarlar üretebilen kemik, kan damarları ve karaciğer gibi dokular, kanser hücrelerine sağladıkları destek nedeniyle metastaza en açık olan dokulardır. Çoğalmayı önleyici faktörler, proteolitik enzim baskılayıcıları ve anjiogenezis engelleyici faktörler üretebilen dokular ise metastaza karşı daha dayanıklı olurlar [67, 75]. Metastaz, invazyon-metastaz kaskadı olarak isimlendirilen ve primer tümörlerdeki epitel hücrelerince gerçekleştirilen biyolojik olaylardan oluşur. Metastaz sürecinde (a) hücre dışı matriks ve stromal hücre katmanlarının istila edilmesi, (b) kan damarlarının lümenlerine geçiş, (c) dolaşım sisteminde canlı kalma, (d) uzaktaki organlara yerleşme, (e) damarlardan uzak dokuların parankimasına geçme, (f) mikrometastazlar yapmak üzere bu yabancı mikroçevrelerde yaşama, (g) metastatik bölgelerde çoğalma (metastatik kolonizasyon) aşamaları gerçekleşir [76].

44 27 Bir organ ya da dokudaki normal hücreler, hücre adezyonu ve bazal membran gibi fiziksel engeller sayesinde bulundukları yerden ayrılamazlar. Kanser hücreleri ise bir aktin hücre iskeleti olan ve invadopodia olarak isimlendirilen hücre uzantıları sayesinde matrikse girebilirler [77]. Kanser hücreleri bazal membranı geçip metastaz yapabilmek için onu parçalamalıdırlar. Bazı durumlarda ise hücreler zar boyunca göç edebilirler. Pek çok tümör hücresi, serum protein plazminojenini aktif bir proteaz olan plazmine dönüştüren plazminojen aktivatör olarak isimlendirilen bir protein salgılar. Artan plazmin uyarısı, diğer proteazların işlevlerinin de yardımıyla plazma membranını sindirerek metastazı kolaylaştırır ve böylece tümör hücreleri bu zardan geçebilirler. Plazma membranı dağılınca bazı tümör hücreleri kana geçer ancak primer tümörden kaçan bir hücre çok küçük bir olasılıkla başka bir dokuda kolonize olur ve sekonder metastik tümör oluşturur. Yeni tümörlere köken oluşturacak hücreler daha sonra bir kılcal damarın endotel hücre katmanına yapışır ve damar boyunca ya da damarın içinden geçerek alttaki dokuya ulaşır [67, 78]. Tümör hücrelerinin oluşumu ve metastaz sırasında hücre iskeletinde de önemli değişiklikler olur. Bunlar, aktin hücre iskeletini düzenleyen Rho ve diğer küçük GTPaz ları kodlayan genlerin ifadesindeki değişikliklerden kaynaklanabilir. Örneğin normal hücrelerde aktin/miyozin kasılmasını uyaran bir proteini kodlayan RhoC geni tümör hücrelerinde aşırı ifade edilir ve artan RhoC aktivitesi metastazı uyarır [67]. Metastaz malignitenin en kesin göstergesi olmakla birlikte, tüm malign tümörler metastaz yapma yeteneğinde değildir. Derideki bazal hücreli karsinoma ve merkezi sinir sistemine ait tümörler, köken aldıkları dokuda oldukça invaziv olup en geç evrede metastaz yaparlar. Osteojenik sarkoma gibi bazı tümörler ise hastada saptandıklarında akciğerlere metastaz yapmış durumdadırlar [67, 74] Kanserin genetik esası Kanser gelişimi, proto-onkogen ve tümör baskılayıcı genler olarak iki büyük gen grubunda ortaya çıkan mutasyonlarla ilişkilidir [68, 79]. Proto-onkogenler, normalde hücrelerin sinyal iletim yolaklarında (hücre büyümesi, çoğalması, farklılaşması ve apoptozis) görev alan birçok proteinin üretimiyle yükümlü genlerdir. Proto-onkogenlerde oluşan mutasyonlar, bu genleri onkogenlere dönüştürerek aşırı uyarılmalarına neden olur. Tümör

45 28 baskılayıcı genler ise normalde hücre bölünmesini baskılayan proteinleri kodlarlar. Bu genlerin bir ya da bir kaçı mutasyonlar nedeniyle inaktif olduğunda aşırı hücre bölünmesi gerçekleşir [79, 80]. Koruyucu genler olarak isimlendirilen daha özelleşmiş üçüncü bir gen sınıfı da kanser ile ilişkilidir. Normal hücrelerde genomun bütünlüğünü sağlayan koruyucu genler inaktif duruma geçtiklerinde, ek mutasyonlara uğrayarak büyüme denetiminin bozulmasına ve kansere neden olurlar [67, 80]. Kanser hücrelerinin çoğu, çok sayıda mutasyon biriktirmiş olmaları nedeniyle bir ya da daha fazla DNA onarım sisteminden yoksundurlar. DNA onarım enzimlerini kodlayan genler gibi koruyucu genlerde oluşan işlev yitim mutasyonları, onkogenleri uyaran ya da tümör baskılayıcı genleri baskılayan mutasyonların hücrelerce düzeltmesini engeller [67, 80, 81]. Bir tümörün oluşması için gerekli mutasyonların birikmesi genellikle uzun yıllar sürdüğünden kanserlerin çoğu ileri yaşlarda ortaya çıkar. İnsan yaşamı boyunca çok sayıda hücre mutasyona uğrar. Hızla çoğalan hücreler daha çok sayıya ulaştıkça, ileri genetik değişiklikler geçirip daha tehlikeli hale gelebilirler. Kanser günümüzde yaygın bir olgu olup, bunun nedeni insan ömrünün uzaması ve hastalıklara karşı evrimsel seçilimin yetersiz oluşudur [67, 71]. Kansere neden olan mutasyonlar genelde yaşam boyu etkin kalınan bazı kimyasal maddeler ve radyasyon gibi karsinojenlerden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, onkogenez ya da tümörogenez ismi verilen kanser oluşum süreci, çevre ve genetik arasındaki etkileşim nedeniyle gerçekleşmiş olur. Kansere neden olan mutasyonlar çoğunlukla eşey hücrelerinden çok somatik hücrelerde oluşur ve bunlar bir sonraki nesle aktarılmaz. Eşey hücrelerinde taşınan bazı kalıtsal mutasyonlar ise ileride kansere yakalanma olasılığını arttırırlar [67, 68, 75]. Genetik hasar sadece tek bir somatik hücrede olsa bile, hasarlı hücrenin bölünmesi sonucu hata yavru hücrelere de aktarılır ve böylece genetik değişikliğe uğramış hücrelerden oluşan bir koloni (klon) ortaya çıkar. Birden fazla gende ortaya çıkan bir seri mutasyon ise gittikçe daha hızlı çoğalan bir hücre tipi yaratarak ve normal büyüme sınırlandırmasından kaçarak ek mutasyonların ortaya çıkması için uygun bir ortam oluşturur. Bu hücreler, normal epitel dokudan ayrılabilme ve gerekli oksijeni karşılamak için damar büyümesini uyarabilme yeteneği gibi özellikler de kazanarak normal hücrelere göre avantajlı hale gelirler. Sonuç olarak hücre klonları büyüyerek tümöre dönüşür. Bazen, bu primer

46 29 tümördeki (benign tümör) hücreler metastaz yaparak sekonder tümörleri (malign tümör) oluştururlar. Kanser nedeniyle gerçekleşen ölümlerinin çoğu hızla çoğalan ve metastaz yapan tümörlerin yayılmasından kaynaklanır. Bu nedenle yalnızca malign tümörler kanser olarak tanımlanmaktadır [67, 71, 82]. Kanserde onkogenlerin rolü Kültüre alınmış hücreleri transforme hücrelere dönüştürebilen bir proteini ya da hayvanlarda kanseri uyarabilecek bir proteini kodlayan herhangi bir gen onkogen olarak isimlendirilebilir. Onkogenlerin çoğu, yabanıl tip ürünleri hücre büyümesini ya da kanser oluşumu için farklı özellikleri destekleyen normal hücresel genler olan proto-onkogenlerde ortaya çıkan mutasyonlar sonucu oluşur [83, 84]. Örneğin, hücre içi bir sinyal dönüşüm proteinini kodlayan Ras geni bir proto-onkogendir. Bu genden oluşan mutant ras D geni ise bir onkogendir ve kodladığı protein büyümeyi uyarıcı sinyalin fazla ya da denetimsiz bir şekilde salınmasına yol açar. Diğer farklı proto-onkogenler de büyümeyi uyarıcı sinyal proteinleri ile onların reseptörlerini, anti-apoptotik proteinleri ve bazı transkripsiyon faktörlerini kodlar [67, 85]. Proto-onkogenlerin onkogene dönüşmesi genellikle bir işlev kazandırıcı mutasyon ile gerçekleşir. Proto-onkogenlerden onkogen oluşumunu sağlayan farklı düzenekler bulunmaktadır: - Nokta mutasyonları (kolorektal ve pankreatik kanserlerdeki ras mutasyonu) - Kromozomal translokasyon ile genlerin yeniden düzenlenmesi (kronik miyeloid lösemide kromozomal translokasyon sonucu oluşan brc-abl onkogeni) - Gen amplifikasyonu (nöroblastomada N-myc geni) - Delesyonlar (ebrb-2, src, raf ve abl gibi tirozin kinazları kodlayan genler) Proto-onkogenlerin onkogenlere dönüşümüne neden olan işlev kazandırıcı mutasyonlar genetik olarak dominanttır ve kanser uyarımı için iki allelden sadece birinde mutasyon olması yeterlidir [83, 84].

47 30 Kanserde tümör baskılayıcı genlerin rolü Tümör baskılayıcı genlerce kodlanan proteinler normalde hücre çoğalmasını baskılayarak tümör oluşumunu engeller. Bu genlerde oluşan mutasyonlar sonucu hücre gelişimi ve bölünmesi daha fazla baskılanamaz. Tümör baskılayıcı genlerce kodlanan protein sınıflarından bazıları şöyle sıralanabilir [67]: - Hücre döngüsünün belirli bir aşamasının ilerlemesini düzenleyen ya da baskılayan hücre içi proteinler (G1 evresi için p16 ve Rb proteinleri gibi) - Hücre çoğalmasını baskılayan gelişimsel sinyallerin ve salgılanan hormonların reseptörleri ya da sinyal dönüştürücüleri (TGFβ ve Ptc reseptörleri gibi) - Hasarlı DNA ya da kromozomal anomalilerin varlığında denetim noktası proteinleri (p53 gibi) - Apoptozisin ilerlemesinde görevli proteinler - DNA onarımında görev alan ve koruyucu genlerce kodlanan enzimler Tümör baskılayıcı genlerde oluşan mutasyonlar genellikle çekinik olduklarından işlev yitimine (hücre gelişimini baskılama yeteneğinde yitim oluşması) neden olurlar. Ancak, mutasyona uğramış normal genin her iki kopyası da mutasyona uğramadığı sürece hücrelerde işlevsel değişiklik olmaz [68, 86]. İki gende birden mutasyon oluşması şu şekilde gerçekleşir: ilk mutasyon bir üreme hücresindedir, daha sonra genin bir somatik hücredeki ikinci kopyasında ikinci mutasyon oluşur. Genin iki kopyasında da mutasyonu olan hücre denetimsiz olarak çoğalmaya başlar. Erken çocukluk evresinde retinada ortaya çıkan bir kanser türü olan kalıtımsal retinoblastoma buna örnek olarak verilebilir. Anne ya da babadan birinde RB tümör baskılayıcı genin bir kopyasında mutasyon bulunması durumunda, %50 olasılıkla bu mutant gen çocuğa iletilir. Bu geni alan çocukta, yaşamın ilk yıllarında yaklaşık %90 olasılıkla RB geninin ikinci kopyasında da bir mutasyon gerçekleşir. Bu bireylerde daha sonra retinoblastoma gelişir. Bununla birlikte retinoblastoma her zaman kalıtımsal değildir. Somatik hücredeki RB geninin her iki kopyasında da mutasyon oluşmasıyla da retinoblastoma ortaya çıkabilir. Retinoblastlar hızlı bölünen hücreler oldukları ve bu hücrelerden binlerce bulunduğundan, bir mutant kopya içeren bireylerde ikinci bir mutasyonun ortaya çıkma olasılığı oldukça yüksektir. Retinoblast hücreleri sadece sekiz yaşından küçük çocuklarda bulunduğundan, bu hastalık

48 31 yalnızca çocuklarda görülür. Yetişkinlerde ise RB mutasyonları, diğer kanser türlerine yatkınlığa yol açabilir [85, 86]. Kanserde koruyucu genlerin rolü Kanser oluşumunda rol oynayan üçüncü gen grubu, DNA onarımında görev alan ve kromozom yapısının sürekliliğini sağlayan koruyucu genlerden oluşur. Hücrelerde dış kökenli karsinojen ya da mutajenin olmadığı durumlarda bile normal hücresel süreçler nedeniyle fazla miktarda hasarlı DNA üretebilir. Depürinasyon (pürin kaybı) ve alkilasyon tepkimeleri nedeniyle DNA da yaklaşık değişikliğin oluştuğu varsayılmaktadır. Bu nedenle DNA onarım sistemleri hücrelerin önemli bir savunma sistemidir [67, 68]. İyonize radyasyon, UV ışınları ve çeşitli kimyasallar gibi çevresel etkenler DNA hasarına yol açabilirler. DNA replikasyonunda oluşan aksaklıklar da mutasyonlara neden olabilir. Koruyucu genlerin kodladığı proteinler, kromozomlarda oluşan hasarları onararak hücrede mutasyonların ortaya çıkma olasılığını azaltırlar. Bir DNA onarım geni mutasyona uğradığında, DNA onarımı engellenir ve daha fazla mutasyon oluşarak hücrede birikir. Bu mutasyonlar hücrede kanserle ilgili değişikliklerin ortaya çıkma olasılığını arttırabilir [67, 68, 70]. XP (Xeroderma pigmentosum) olarak isimlendirilen bir DNA onarım geninde bir hasar oluştuğunda, birey ultraviyole ışınlarına oldukça duyarlı bir hale gelir ve tüm cilt kanseri türlerine yakalanma olasılığı yaklaşık bin kat artar. Bilinen sekiz XP geninden yedisi baz kesip çıkarma onarımında rol alan proteinleri kodlar. Bu düzeneğin eksikliğinde, hücre döngüsünü denetleyen ya da hücre büyümesi ve ölümünü düzenleyen genler mutasyona uğrar. Kalıtsal polipozis olmayan kolorektal kanser genleri yanlış baz eşleşmesi onarım sisteminin bileşenlerini kodlar. Bu bileşenlerdeki mutasyon, kolon kanserinin görülme yüzdesini arttırır. Benign polipten kanserleşmeye giden süreç de normalden çok daha hızlı ilerler, çünkü hücrelerde onarım sistemleri olmadığından sürekli yanlış eşleşme mutagenezi görülür [67, 81] Hücre döngüsünün düzenlenmesi ve kanser Normal hücreler, hücre döngüsüne uygun olarak düzenli bir şekilde büyür ve bölünürler. Hücrelerin G1, S, G2 ve mitoz olarak 4 esas evre içeren hücre döngüsüne girmeleri ve döngü içerisinde ilerlemeleri çeşitli proteinlerince denetlenmektedir. Bu proteinler, G1 ve

49 32 G2 evresinde hücrenin büyümesini, S evresi süresince DNA sentezinin gerçekleşmesini, mitoz süresince ise kromozom ayrılmasını ve hücre bölünmesinin düzenlenmesini sağlarlar. Ayrıca, hasarlı DNA içeren hücrelerin, DNA ları replike olmadan önce ya da kromozom ayrılmasından önce G2 evresinde tutuklanmasını sağlarlar ve bu sayede hasarın onarımı için zaman kazanılır. Hasarı onaramayan tutuklu hücreler ise programlı hücre ölümü ile intihara yönlendirilir ya da en azından bölünmeleri engellenir. Bu düzenin bozulması sonucu kanser ortaya çıkar. Hücre döngüsünün düzenlenmesiyle ilgili bu karmaşık düzenekler onkojenik mutasyonların birincil hedefidir [69, 86, 87]. Hücre döngüsünün denetimini sağlayan temel moleküller siklin-bağımlı kinazlardır. Her bir siklin-bağımlı kinaz, kendisine bağlanarak onu uyaran belirli bir D tipi siklin ile kompleks oluşturur. Kompleksin bir parçası olan kinaz, hücre döngüsünün ilerlemesi için gerekli olan çeşitli proteinlere fosfat ekleyen bir enzimdir. Eklenen fosfatlar proteinin yapısını değiştirir ve işlevine bağlı olarak proteini uyarır ya da baskılar. Hücre döngüsünün farklı evrelerine giriş noktalarında özgül siklin-bağımlı kinaz/siklin kompleksleri bulunur. Ayrıca hücrenin S ve mitoz evresine girmek için hazırlanmasına yardımcı olan bazı faktörler de vardır [86, 87]. Hücre döngüsünün düzenlenmesinde görev alan proteinlerden biri p53 tür. p53, DNA ya bağlanan ve p21 adlı proteinin transkripsiyonunu uyaran bir transkripsiyon faktörüdür. p21, hücrenin G1 evresine ilerlemesi için gerekli olan bir siklin-bağımlı kinazın uyarılmasını engeller. Bu sayede hücre, DNA sının replikasyondan önce onarılması için zaman kazanmış olur. DNA hasarı onarılamayacak ölçüde büyükse, p53 hücreyi intihar etmesi için tetikler. Kansere neden olan en yaygın mutasyon, p53 proteinini kodlayan gende oluşan mutasyondur. Birçok kanser türüne yakalanmaya kalıtsal yatkınlık olarak bilinen Li-Fraumeni sendromu (ailesel kanser sendromu), oosit ya da spermiyumdaki p53 mutasyonundan kaynaklanır. Siklin-bağımlı kinazları baskılayarak hücre döngüsünü durduran diğer proteinler p16 ve RB dir. Bunların tümü tümör baskılayıcı proteinlerdir [68, 87] Kanser hücrelerinin kökeni Onkojenik mutasyonların kanseri tetiklemesi, bunların genelde bölünen hücrelerde ortaya çıkarak yavru hücrelere aktarılmasıyla gerçekleşir. Böyle mutasyonların nöronlar ve kas

50 33 hücreleri gibi bölünmeyen hücrelerde oluşması durumunda ise genellikle kanser oluşmaz. Yetişkinlerde kas ve sinir hücresi tümörlerinin sık görülmemesinin nedeni de budur. Ancak, eritrositler, bağırsak yüzeyini kaplayan emici hücreler ve deriyi oluşturan keratinleşmiş hücreler gibi farklılaşmasını tamamlamış ve bölünmeyen hücrelerden oluşan dokularda da kanser oluşabilir. Bu dokularda karsinogenezi başlatan farklılaşmış hücreler değil, onların öncülleridir [67]. Canlının yaşamı boyunca sürekli olarak bölünebilme yetisine sahip kök hücrelerin DNA larında onkojenik mutasyonların birikmesi sonucu bu hücreler kanser hücrelerine dönüşebilirler. Onkojenik mutasyonlar, hücrelerin anormal çoğalma erkine sahip olmalarına ve genellikle normal farklılaşma sürecine girememelerine neden olur. Apoptozisi önleyen ya da anormal bir şekilde büyümeye yol açan onkojenik mutasyonlar daha farklılaşmış ancak hala çoğalabilen progenitör hücrelerde de oluşabilir. Böyle mutasyonlar hematopoietik progenitör hücrelerde çeşitli tipte lösemilere neden olabilir [88, 89]. Kanser kök hücre teorisine göre, tümör dokusunda kanser hücrelerinin kendilerini yenileme ve farklılaşma erkine sahip alt grupları bulunabilir. Bu hücreler kanser kök hücresi ya da kanser başlatıcı hücre olarak isimlendirilirler [90]. Çalışmalar kan, meme, beyin, dalak, baş ve boyun, kolon, deri ve ovaryum kanserlerinde kanser kök hücrelerinin bulunduğunu göstermektedir. Bu hücrelerin, kanserin başlaması, ilerlemesi ve alışılagelmiş tedavi yöntemlerine karşı direnç göstermesiyle yükümlü oldukları düşünülmektedir [89] Apoptozis Çok hücreli organizmalarda, mitoz bölüme ile artan hücre sayısı hücre ölümleriyle dengelenir. Dokularda daha fazla gereksinim duyulmayan hücreler, hücre içi haberci sistemlerinin uyarılmasıyla intihara sürüklenir. Bu süreç Yunanca da apo (ayrı) ve ptozis (düşen) sözcüklerinin birleştirilmesi ile oluşmuş ve sonbaharda yaprak dökümünü anlamına gelen apoptoz aracılığı ile gerçekleşir [91-93]. Apoptozis, çeşitli hücre dışı etmenler ya da genetik faktörlerle uyarılan ve hücrenin kendisinin programladığı bir düzenek aracılığıyla hücre ölümünü denetleyen aktif bir işlemdir [94]. Hücre ölümü fizyolojik koşullarda meydana geldiği için bu ölüm şekli fizyolojik hücre ölümü olarak da isimlendirilir [92, 95].

51 34 Apoptozis, normal gelişim sürecinde ve olgun organizmadaki çeşitli hücre tiplerinin harabiyete uğrayarak yitimine neden olur. Normal gelişimde apoptozis, el ve ayak parmak taslakları arasındaki ara dokunun ortadan kalkması, omuriliğin şekillenmesi, erkek fetüste Müller kanalının gerilemesi gibi birçok süreçte gerçekleşir [67, 92, 96, 97]. Apoptozis organizmadaki hücre sayısının sabit tutulmasını ve immün sistem işlevlerinin gerçekleşmesini sağladığından, yalnızca intrauterin gelişme sırasındaki organogeneziste değil, farklılaşmış dokuların olgunlaşmasında da gereklidir [67, 94]. Tümör hücreleri, virüsle kontamine olmuş hücreler, kendine hasar veren immün hücreler gibi istenmeyen ve zararlı hücrelerin ortadan kaldırılması ve bunlara karşı savunma oluşturulmasında apoptozis işlev görür [67, 98]. Normal dokularda mitoz bölünme ve apoptozis arasındaki denetimli dengenin apoptozis lehine ya da aleyhine bozulması, bir çok hastalığın patogenezine katkıda bulunur. AIDS, nörodejeneretif hastalıklar, insülin bağımlı diyabet, hepatit C enfeksiyonu, miyokard enfarktüsü, aterosklerozis gibi hastalıklarda apoptozis artarken, otoimmün hastalıklar ve kanserde yavaşlar [92]. Ölüm sinyalini alan bir hücrede çekirdek kromatini yoğunlaşır, parçalanma gerçekleşir ve en sonunda hücre fagositoza uğrar. Apoptozis sırasında hücrede ortaya çıkan dış değişiklikler, hücrelerin oylum yitirerek büzüşmesi, hücre yüzeyinde küresel kabarcıkların oluşumu ve fosfatidil serin adlı fosfolipidin hücreden dışarı çıkmasıdır. Apoptozisin neden olduğu iç değişiklikler ise sitoplazmanın yoğunlaşması, mitokondriyonların sitokrom-c gibi apoptozisi uyaran faktörleri serbestleştirerek parçalanması, kromozamal DNA ların bazlık parçalara ayrılması ve hücre canlılığı ve metabolizmasında önemli olan birçok proteinin benzer şekilde parçalanmasıdır [67, 98]. In-vitro çalışmalar apoptozisin ani gerçekleşen bir olgu olduğunu ve apoptotik uyarından sonra hücrenin hızla ortamından uzaklaştırıldığını göstermektedir. Sitoplazmanın yoğunlaşarak zardan uzaklaşmasından apoptotik cismin oluşumuna değin tüm apoptotik olaylar zinciri sadece birkaç dakika sürer. Bununla birlikte apoptotik hücrelerin fagositozu için daha uzun bir süre gerekir. Bu işlem saate değin sürebilir [94] Kaspazlar Apoptozisin düzeneği tam olarak açıklanamamasına karşın, apoptozisle ilişkili en önemli olayın kaspazların uyarımı olduğu bilinmektedir [99]. Kaspazlar, kalsiyum bağımsız hücre

52 35 içi sistein proteaz sınıfının en önemli bölümünü oluştururlar. Çoğu proapoptotik olan bu endoproteazlar, sitoplazmada inaktif öncüller olarak bulunurlar. Apoptoziste görev alan 14 kaspaz tanımlanmıştır. Kaspazlar biyolojik işlevlerine göre, sitokin uyarımı yapanlar (kaspaz 1, 4, 5, 11, 12, 13, 14), apoptozisi başlatanlar (kaspaz 2, 8, 9, 10) ve apoptozisi yürüten efektör kaspazlar (kaspaz 3, 6, 7) olarak üç grupta sınıflandırılırlar [99, 100]. Başlatıcı kaspazlar, apoptotik uyarıyla başlayan ölüm sinyallerini efektör kaspazlara iletilirler. Efektör kaspazlar da ilgili proteinlerin parçalanmasını sağlayarak apoptotik hücre morfolojisinin oluşmasına neden olurlar [99]. Çalışmalarda, kaspaz-3 ün apoptozis sürecinde en önemli role sahip olduğu ve kaspaz-9 un kaspaz-3 e benzer özellikler taşıdığı görülmüştür. Kaspaz-3 ün DNA aktivasyonuna neden olduğu ve DNA kırılmalarında görev aldığı düşünülmektedir [99]. Birçok malign hücre tarafından ifade edilen bir kaspaz baskılayıcı ailesi olan apoptozis inhibitörleri (IAP), kaspazları seçici bir şekilde baskılayarak apoptotik düzeneği durdurur. Bu baskılayıcı proteinler aynı zamanda hücre döngüsüne etki etme yoluyla da apoptozisi durdurabilirler. Kaspazların ifadesinde ortaya çıkan değişiklikler bazı otoimmün hastalıklara, nörolojik bozukluklara ve kanser oluşumuna katkıda bulunabilirler [99, 101]. Kaspazlar apoptozisin belirteçleri olarak kullanılabilirler. Sitoplazmadaki kaspaz ifadelenme miktarı belirlenerek hücrenin apoptotik durumu izlenebilir [93, 102] Apoptozis oluşum yolları Mitokondriyon/sitokrom-c aracılı apoptozis (intrinsik yol) İntrinsik yolun temelinde, mitokondriyal geçirgenliği düzenleyen pro-apoptotik ve apoptotik moleküllerin bir dengesi vardır. Apoptozisin baskılanmasında görev alan en önemli protein, mitokondriyal membranın dış yüzünde yerleşik Bcl-2 dir. Bcl-2 ailesine ait 20 den fazla protein apoptozisin düzenlenmesinde işlev görür. Stres durumunda, bu proteinlerden anti-apoptotik Bcl-2 ve Bcl-x mitokondriyal membrandan uzaklaşırlar ve yerlerini Bak, Bax ve Bim gibi pro-apoptotik proteinler alır. Bcl-2/Bax oranının azalmasına bağlı olarak mitokondriyal membran geçirgenliği artar ve sitokrom-c serbest hale geçer [93]. Sitokrom-c, normal koşullarda mitokondriyon iç zarındaki elektron taşınım sisteminde ATP oluşturulmasında görev alan bir proteindir. Mitokondriyal stres

53 36 durumunda sitokrom-c mitokondriyondan sitoplazmaya salınır ve böylece hücrede geri dönüşümsüz bir olaylar dizgesi başlar. Sitokrom-c mitokondriyondan apoptozis-uyarıcı faktör (AIF) ile birlikte salınır [99, 101]. Normalde Bcl-2 ye bağlı olan apoptotik proteaz aktive edici faktör-1 (APAF-1) de sitokrom-c salınımıyla birlikte Bcl-2 den ayrılarak sitoplazmada serbestleşir. Sitokrom-c APAF-1 e bağlanarak onu uyarır. Bu aktivasyonun ardından ATP nin katılımıyla apoptozom ismi verilen bir kompleks oluşur. Apoptozom, inaktif prokaspaz-9 un aktif kaspaz-9 a dönüşmesini sağlar. Aktif kaspaz-9 ise efektör kaspazlardan biri olan prokaspaz-3 ü aktifleştirir. Aktif kaspaz-3, kaspaz deoksiribonükleotid inhibitörünü (ICAD) kaspaz aktif deoksiribonükleotide (CAD) dönüştürür ve böylece kaspaza bağlı apoptozis düzeneği başlar [93, 98, 99]. Dış sinyallerle apoptozisin tetiklenmesi (ekstrinsik yol) Apoptozisin uyarımı genelde, tümör nekroz faktör reseptörü (TNFR) gen ailesinin üyeleri olan ve hücre ölüm reseptörleri olarak bilinen Fas reseptörü (FASR) ve TNFR-1 in ligandları ile uyarılmaları sonucu gerçekleşir. Bu reseptörler hücre ölümünü başlatan kaspaz kaskadını aktive ederler. Fas FASR reseptörlerine, TNF ise TNFR-1 reseptörlerine bağlanır ve ölüm uyarıcıları olan FADD (Fas ile ilişkili ölümcül bölge) ve TRADD ı (tümör nekrozis faktörü reseptörü ile ilişkili ölümcül bölge) uyarır. Bu sitozolik ölüm reseptörleri prokaspaz-8 e doğrudan bağlanarak kaspaz-8 uyarımına neden olurlar. Aktif kaspaz-8 ise, efektör kaspazlardan biri olan prokaspaz-3 ü aktifleştirir ve böylece apoptozis başlar [98, 99, 103]. Endoplazmik retikulum aracılı apoptozis Endoplazmik retikulum (ER), protein sentezi, protein katlanması, strese karşı hücresel yanıt oluşturulması ve hücre içi kalsiyum düzeyinin düzenlenmesinde işlev görür. ER de uzun süreli stres oluşması, hücre ölümüne katkıda bulunarak farklı nörodejeneratif hastalıkların oluşumunda rol oynayabilir. Çalışmalar, nöronlar ve diğer hücrelerde bulunan kaspaz-12 nin ER stresi ile ilişkili apoptoziste önemli bir işlevi olduğunu göstermiştir. Uzun süreli ER stresi sonucu sitoplazmadaki aktif kaspaz-12 hareketi kolaylaşır ve bunun sonucunda kaspaz-9 aktifleşir. Böylece ER stresinden kaynaklanan apoptozis başlamış olur [99].

54 Apoptozisin belirlenmesinde kullanılan yöntemler Hematoksilen-eozin boyama yöntemi: Hematoksilen çekirdek kromatinini boyadığından apoptotik hücreler çekirdek yapılarına göre değerlendirilebilir. Bu yöntemle, hücre ya da sitoplazma küçülmesi, kromatin yoğunlaşması ve çekirdek zarının altında toplanması, çekirdeğin küçülmesi ya da parçalanması gözlenebilir [104]. Giemsa boyama yöntemi: Hematoksilen-eozin boyamadaki gibi apoptotik hücrelerin tanınmasında çekirdek yapısı esas alınır. Sitoplazma sınırlarının daha iyi seçilebilmesi dışında HE boyasından belirgin bir üstünlüğü yoktur [95]. Floresan mikroskopi yöntemi: DNA ya bağlanabilen floresan boyalar, kromatini görünür hale getirirler. Canlı ve ölü hücre ayrımını yapabilmek için, sadece ölü hücreleri boyayabilen propidium iyodür gibi bir boya ve tüm hücreleri boyayan Hoechst gibi diğer bir boya kullanılabilir. Bu yöntemle hücrelerin canlı ya da ölü oldukları anlaşılabilir ancak ölüm nedeninin apoptozis ya da nekroz olduğunun ayrımı hematoksilen-eozin boyamada olduğu gibi çekirdek yapısına bakılarak yapılır [95]. Elektronmikroskop yöntemi: Yapısal değişimler en doğru bu yöntemle gözlenebilir. Sitoplazmik küçülme, kromatin yoğunlaşması ve çekirdek parçalanmasının yanında mitokondriyonların yapısı, hücre ve çekirdek zarının bütünlüğünün bozulup bozulmadığı gibi ayrıntıların incelenmesine de olanak sağlar [95, 105]. Faz kontrast mikroskop yöntemi: Bu yöntem, kültür ortamındaki hücrelerin incelenmesinde kullanılır. Ortam içinde yüzen ölü hücreler, apoptotik hücreler üzerinde gelişen cepçikler ve sitoplazmik vakuoller incelenerek apoptozis değerlendirilebilir [95]. Anneksin-V yöntemi: Anneksin-V, hücrenin dış yüzeyine transloke olan fosfatidil serine bağlanabilen bir proteindir ve fluorescein isothiocyanate (FITC) gibi floresan bir madde ile işaretlenerek apoptotik hücrelerin görüntülenmesini sağlayabilir. FITC-Anneksin-V kompleksinin fosfatidil serine bağlanma oranı flow sitometri ile ölçülebilir. Anneksin-V nekrotik hücrelerin yüzeyine de bağlanabildiğinden, propidium iyodür gibi vital olmayan bir boya da eklenir. Böylece, canlı hücreler, erken ve geç apoptotik hücreler ya da nekrotik

55 38 hücreler birbirinden ayırt edilebilir [95, 105]. TUNEL yöntemi: Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) enzimi kullanılarak apoptozis sonucu oluşan DNA kırıkları tanınabilir. TdT ve nonizotopik işaretli nükletidler (genellikle biyotinli dutp) ile yapılan işaretlemenin ardından floresan ya da enzimatik görüntüleme ile apoptotik hücreler belirlenir. Bu yöntem, TdT-dUTP nick-end-labelling sözcüklerinin kısaltılması olan TUNEL yöntemi ismiyle anılmaktadır [95, 104]. M30 yöntemi: Bu yöntemde kaspazların etkisiyle sitokeratin 18 in kırılması sonucu ortaya çıkan yeni antijenik bölgenin immunohistokimyasal yöntemle boyanması ilkesine göre apoptotik hücreler belirlenir. Sitokeratin 18, tek katlı bez epitel hücrelerinde bulunan tip 1 ara filament proteinidir. Bu nedenle M30 yöntemi sadece sitokeratin 18 eksprese eden epitelyal kökenli dokularda kullanılabilir [95]. Kaspaz-3 yöntemi: Apoptotik hücrelerde oluşan aktif kaspaz-3 immunohistokimyasal işaretlemeyle belirlenebilir. Bu yöntemin kullanılabilmesi için, dokuda kaspaz-3 ifadelendiğinin bilinmesi ya da çalışmada kullanılan apoptozise neden olan ajanın kaspaz- 3 ü kırıp kırmadığının bilinmesi gerekmektedir [95]. Agaroz jel elektroforezi: Apoptotik hücrelerdeki endonükleaz erki sonucu DNA tipik olarak baz çifti ve katları biçiminde parçalara ayrılır. Bu parçalanma şekli agaroz jel elektroforezinde merdiven biçiminde bir görüntü verir [95]. Western blot yöntemi: Bu yöntemle, antikorlar kullanılarak apoptozise özgü bazı proteinlerin (örn; bcl-2) eksprese edilip edilmedikleri ya da kırılıp kırılmadıkları (örn; kaspaz-3) saptanabilir [95, 106]. Flow sitometri yöntemi: Flow sitometri yönteminde, floresan bir maddeyle işaretlenmiş bir antikor kullanılarak apoptoziste ifadelendiği bilinen herhangi bir yüzey proteini saptanabilir ve böylece apoptotik hücreler belirlenebilir [95, 105] Apoptozis ve kanser Kanser gelişiminin temelinde hücrenin canlılığının sürekliliği, büyümenin denetimi ve farklılaşma gibi biyolojik süreçleri etkileyen mutasyonların aşamalı olarak bir araya

56 39 gelmesi yer almaktadır [107]. Çok hücreli organizmaların gelişim süreci ve doku sürekliliği için, hücre çoğalması ve ölümü arasında homeostatik dengenin düzenlenmesi oldukça önemlidir. Aşırı hücre artışı apoptozis ile dengelenir. Apoptozisi denetleyen genlerin ifadelenmesinde ya da işlevlerinde ortaya çıkan değişiklikler bu dengeyi bozar ve neoplastik hücre çoğalmasına katkı sağlar [108]. Kanserin gelişim sürecinde tümör hücrelerinde birçok yeni fenotipik özellikler ortaya çıkar. Bu özellikler sayesinde tümör hücreleri hızlı ve sınırsız bir şekilde çoğalabilir ve çevre dokulara yayılabilirler. Bu hücreler aynı zamanda mikroçevreden bağımsız olarak yaşamını sürdürebilir ve metastaz yapabilirler. Apoptozisin düzenlenmesinde görev alan proto-onkogenler ve tümör baskılayıcı genlerde oluşan seri mutasyonlar, malign fenotipin oluşumuna katkıda bulunurlar [107, 109]. Kaspaz genlerinde ortaya çıkan mutasyonlar ile çeşitli kanser türleri arasında ilişki bulunmaktadır. Kolon kanseri, mide-bağırsak sistem kanserleri ve endometrium tümörlerinde kaspaz-5 geninde çerçeve kayması mutasyonları, meme kanserinde ise kaspaz-3 geninde homozigot delesyonlar gözlenmiştir. Apoptozias baskılayıcı proteinlerde oluşan mutasyonların da çeşitli kanser türleri ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Meme kanserinde survivin proteininin aşırı ifadelendiği belirlenmiştir [108, 110]. Bcl-2 ailesi, anti-apoptotik ve pro-apoptotik üyelerden oluşan ve apoptozisi düzenlemede en önemli role sahip olan onkoprotein grubudur. Bu proteinlerin miktarında oluşan değişikliklerin kanser ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Non-Hodgkin lenfoma, prostat kanseri, meme kanseri ve küçük hücreli akciğer kanserinde apoptozis baskılayıcısı olan Bcl-2 nin aşırı ifadelendiği gözlenmiştir. Mide-bağırsak tümörleri ve diğer bazı kanser türlerinde ise apoptozisi indükleyen Bax geninde işlev yitimi mutasyonları olduğu bildirilmiştir [71, 108, 111]. p53, apoptoziste önemli bir denetim noktası proteini olarak görev yapar. DNA hasarı onarılmadığında apoptozisi ilerleten Bax, Noxa ve Puma proteinlerini aktifleştirerek, Bcl-2 ve Bcl-XL yi baskılayarak hücrenin apoptozise uğramasına neden olur. p53 ayrıca APAF- 1 ve kaspaz-9 ile ölüm sinyallerini alan DR5, Fas, TNF-α reseptör proteinlerinin de ekspresyonlarını arttırarak apoptozise katılır. p53 ün kendisinde ya da transkripsiyonlarını denetlediği apoptozisle ilişkili proteinlerde oluşan mutasyonların bazı kanser türleri ile ilişkili olduğu belirlenmiştir [108, 111].

57 Ovaryum Kanseri Epidemiyoloji ve dağılım Ovaryum kanseri, görülme sıklığı açısından akciğer, meme, kolon-rektum ve pankreas kanserlerinden sonra beşinci sırada yer alır. Kadınlarda görülen genital kanserler arasında ikinci sırada olup, en yüksek ölüm oranına sahiptir [4]. Bir kadının yaşamı boyunca ovaryum kanserine yakalanma olasılığı yaklaşık %1,37 olmakla birlikte, ovaryum kanseri nedeniyle ölme riski yaklaşık %1 dir [6]. Ülkemizde, Sağlık Bakanlığı nca yayınlanan Sağlık İstatistikleri Yıllığı 2012 de, ovaryum kanserinin kadınlarda görülen tüm kanser türleri arasında sekizinci sırada yer aldığı, genital sisteme ait kanserler arasında uterus korpusundan sonra ikinci sırada bulunduğu, dağılımının ise 7,5/ olduğu bildirilmiştir [2]. Ovaryum kanserinin dağılımı yaşla birlikte artmaktadır. Kanser tanısı konulan hastaların yaklaşık yarısı 63 ve üzeri yaştadır [6] Etiyoloji ve risk faktörleri Ovaryum kanserinin etiyolojisinin hala çok iyi bilinmiyor olması, bu hastalığa karşı etkili bir koruma yönteminin geliştirilmesini engellemektedir [112]. Ovaryum kanserlerinin büyük bir kısmının yüzey epitelinden ya da ovulasyondan sonra oluşan inklüzyon kistlerinden salınan kemokin ya da hormonlara uzun süre etkin kalınması sonucu oluştuğu düşünülmektedir. Ovaryum kanserlerinin bir kısmının da tuba uterina tümörlerinin ovaryuma yaptıkları metastazdan kaynaklandığı bilinmektedir. Epitelyal ovaryum kanserlerinin %90 ında genetik bir bileşen görülmezken, %10 unda BRCA genlerinden köken alan genetik yatkınlık ya da DNA onarım genlerinde mutasyonlar bulunmaktadır [113]. Epitelyal ovaryum kanserlerinde ayrıca hücre döngüsü ve hücre çoğalmasını düzenleyen genler ile hücre iskeleti ve ilaç dirençliliği ile ilişkili genlerde çeşitli hatalar bulunmaktadır [114]. Ovaryum kanseri riskini arttıran en önemli faktörler yaş, doğum sayısı ve aile öyküsüdür. Ovaryum kanserlerinin %90 ı sporadiktir ve herhangi bir risk faktörü olmadan ortaya çıkar [115].

58 41 40 yaşından küçük kadınlarda ovaryum kanseri görülme oranı oldukça düşük olup kanser genellikle menopozdan sonra ortaya çıkar [6]. Doğum sayısı, genetik olmayan en önemli risk faktörüdür. Gebelik sayısının artmasıyla ovaryum kanseri riski azalır. Her bir gebeliğin, ovaryum kanserine yakalanma riskini yaklaşık olarak %10 azalttığı tahmin edilmektedir. Erken menarş ya da geç menopoz yaşayan kadınlarda ve ilk gebeliği 35 yaşından sonra olan ya da hiç gebelik yaşamayan kadınlarda kansere yakalanma riski daha yüksektir [6, 116]. Epitelyal ovaryum kanserinde en önemli risk faktörü aile öyküsüdür. Ailesinde meme ve/veya ovaryum kanseri olan kadınlarda ovaryum kanseri görülme olasılığı daha fazladır. Ailesinde meme veya ovaryum kanseri hastası olanlarda risk %4-5 iken, ailede bu kanserlerin ikisinin birden bulunması yakalanma olasılığı %7 ye çıkarmaktadır. Çalışmalarda ailesel yatkınlıktan sorumlu, yüksek penetrasyon erkine sahip birkaç mutant gen bulunmuştur. Bu genler, tüm meme ve ovaryum kanserlerinin %5-10 undan sorumludur. Ailesel meme ve ovaryum kanserleriyle ilişkilendirilmiş en önemli genler BRCA-1, BRCA-2, p53 ve PTEN/MMAC1 dir [6, 12, 116]. Ovaryum kanseri, çoklu genetik değişikliklerin görüldüğü bir türdür [117]. Ovaryum kanserlerinin %90 ı sporadik gelişmektedir. Tirozin kinaz erkinin artması, protoonkogenlerin (Her2/neu, K-ras, Akt2, cmyc) aktive olması, tümör baskılayıcı genlerde (BRCA1, p53, p16, p22) mutasyonlar oluşması ve proteolitik enzimlerin aktivitesinin artması gibi moleküler değişiklikler sonucu malign değişim ortaya çıkar. Hastalarda somatik mutasyon görülme sıklığı, germline mutasyon görülme sıklığından daha fazladır [12]. Ailesel ovaryum kanseri sendromunun, kalıtsal meme-ovaryum kanseri, kalıtsal sitespesifik ovaryum kanseri ve Lynch II sendromu olmak üzere 3 tipi bulunmaktadır [118]. Kalıtsal meme-ovaryum kanseri sendromu, tüm kalıtsal sendromların %65-75 ini oluşturur ve genellikle birinci ve ikinci derece akrabalarında kanser öyküsü olan kadınlarda görülür. Çoğunlukla genç hastalarda görülen bu sendromda BRCA1 ve BRCA2 genlerinde mutasyon izlenir [ ]. Site-spesifik ovaryum kanserleri, kalıtsal ovaryum kanserlerinin %10-15 ini oluşturur ve BRCA1 genindeki mutasyonlar ile ilişkilidir [120]. Lynch II ya da kalıtsal polipozis olmayan kolorektal kanser, kolon kanseri ağırlıklı olup,

59 42 endometriyum, meme, mide, pankreas, karaciğer-safra sistemi, mesane ve ovaryum kanserlerinin de beraberinde görülmesi ile özelleşmiştir. Lynch II sendromu, kalıtsal ovaryum kanserlerinin %10-15 ini oluşturur ve DNA yanlış eşleşme onarım enzimleri mutasyonları (MLH1, MSH2, PMS1, PMS2 ve GTBP) ile ilişkilidir [119, 120]. Ovulasyon sayısı fazla olan kadınlarda ovaryum kanseri olasılığının arttığına yönelik bir varsayım bulunmaktadır [121]. Ovulasyon sırasında ovaryumun yüzey epiteli hasar görür ve bu hasar onarım düzenekleri ile giderilmeye çalışılır. Her ovulasyon sonrasında oluşan inflamasyon ve sitokin salınımı, genetik hasar ve malign değişimlere neden olabilir. Bu varsayıma göre çoklu gebelik, emzirme süresinin artması ve oral kontraseptif kullanımı kanser riskini azaltmaktadır. Ancak polikistik ovaryum sendromu bulunan kadınlarda ovulasyon sayısı az olmasına karşın ovaryum kanseri riskinin yaklaşık 2,5 kat fazla olması bu varsayımla uyuşmamaktadır [8]. Ovaryum kanseri gelişimi ile ilgili ikinci varsayım, retrograd menstruasyon varsayımıdır. Buna göre, menstruasyon sırasında tuba uterinalar aracılığı ile uterustan ve alt genital kanallardan ovaryumlara karsinojenler taşınır. Tubal ligasyon ve histerektomi uygulanan hastalarda ovaryum kanserine yakalanma riskinin sırasıyla 2/3 ve 1/3 oranında azalması bu varsayımı desteklemektedir. Bu uygulamalar, onkojenik faktörlerin alt genital bölgeden ovaryuma çıkışlarını engellemektedir [6, 122]. Ovaryum kanserinin gelişimi ile ilgili bir diğer varsayım ise gonadotropin varsayımıdır. Ovaryum yüzey epitelinin altındaki stromaya yaptığı invaginasyonlar sonucu inklüzyon kistleri oluşur. Gonadotropin varasyımına göre, gonadotropinlerin (LH ve FSH) etkisiyle salgılanan östrojen ve öncülleri, inklüzyon kistlerindeki hücrelerin hızla bölünmesine ve malign bir şekle dönüşmesine neden olmaktadır [8, 123]. Gebelik ve oral kontraseptif kullanımının ovaryum kanseri riskini azaltmasının nedeninin de hipofiz bezinden gonadotropin salgılanmasını baskılanması olduğu düşünülmektedir. FSH düzeyini arttırarak ovulasyonun gerçekleşmesini sağlayan fertilite ilaçları ise ovaryum kanseri riskini arttırmaktadır [113, 122, 123]. Ayrıca, emzirmenin de serum LH ve östradiol düzeyini düşürdüğü ve böylece ovaryum kanseri riskini azalttığı bilinmektedir [122].

60 Ovaryum tümörlerinin histolojik sınıflandırması Ovaryum kanseri basit bir hastalık olmayıp histolojik görünüşlerine göre sınıflandırılan 15 ten fazla farklı tümör tipinden oluşmaktadır [9]. Alt tipe özgü risk faktörleri (çevresel ve genetik), moleküler olaylar, prognostik belirteçler ve terapötik hedefler tanımlandıkça histolojik tip daha önemli bir hal almaktadır [124]. Böylece, bir tümörün özgün bir histolojik tip olarak tanımlanması ile genetik, prognostik ve tedaviye vereceği olası yanıt gibi bilgiler elde edilmiş olur. Özellikle, mevcut kemoterapi ilaçlarına direnç gösteren berrak hücreli karsinoma ve müsinöz karsinoma gibi alt tipler nedeniyle histolojik tipe özgü kliniksel girişimlere duyulan gereksinim giderek artmaktadır [125]. Ovaryum, farklı embriyolojik kökenli dokuların bir araya gelmesi ile oluşan ve neoplaziye yatklınlığı olan bir organdır. Ovaryum kanseri, ovaryumda bulunan üç ana hücre tipinin (germ, stromal ve epitelyal hücreler) hızla çoğalması ve bölünmesi ile ortaya çıkar [7, 8]. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 2002 yılında [9], kölom epiteli, germ hücreleri ve mezenşim (stroma ve seks kordonları) dokudan köken almalarına ve yapısal özelliklerine göre ovaryum tümörlerini histolojik olarak sınıflandırmıştır (Çizelge 2.1).

61 44 Çizelge 2.1. Ovaryum tümörlerinin histolojik sınıflandırması OVARYUM TÜMÖRLERİNİN HİSTOLOJİK SINIFLANDIRMASI Yüzey Epitelyal-Stromal Tümörler Seröz Tümörler Müsinöz Tümörler Endometrioid Tümörler Berrak Hücreli Tümörler Transisyonel Hücreli Tümörler Yassı (squamöz) Hücreli Tümörler Mikst Epitelyal Tümörler İndiferansiye ve Klasifiye Edilemeyen Tümörler Seks Kordonu-Stromal Tümörler Granüloza-Stromal Hücreli Tümörler Sertoli-Stromal Hücreli Tümörler Klasifiye Edilemeyen ya da Mikst Tipte Seks Kordonu-Stromal Tümörler Steroid Hücreli Tümörler Germ Hücreli Tümörler Primitif Germ Hücreli Tümörler Bifazik ya da Trifazik Teratom Monodermal Teratom ve Dermoid Kist ile İlişkili Somatik Tip Tümörler Germ Hücreli-Seks Kordonu Stromal Tümörler Rete Ovarii Tümörleri Adenokarsinom Adenom Kistadenom Kistadenofibrom Ovaryumun Diğer Tümörleri Küçük hücreli karsinom, hiperkalsemik tip Küçük hücreli karsinom, pulmoner tip Büyük hücreli nöroendokrin karsinom Hepatoid karsinom Primer ovarian mezotelyoma Wilms tümörü Gestasyonel koryokarsinom Mol hidatiform Adenoid kistik karsinom Bazal hücreli karsinom Ovarian wolfian tümör Paraganglioma Miksom Ovaryuma spesifik olmayan yumuşak doku tümörleri Diğer Tümör Benzeri Olgular Gebelik luteoması Stromal hipertekozis Stromal hiperplazi Fibromatozis Masif ovaryum ödemi Diğer Lenfoid ve Hematopoetik Tümörler Malign Lenfoma Lösemi Plazmositom Sekonder Tümörler

62 45 Ovaryumun yüzey epitelyal-stromal tümörleri Ovaryum kanserlerinin %85-90 ı epitel dokudan kaynaklanmaktadır. Ovaryumların yüzey epiteli, embriyolojik olarak kölom (mezotel) epitelinden köken alır. Yüzey epitelinin bilinen bir işlevi olmadığı için, oluşan fizyolojik değişiklikler ve küçük anomalilerin saptanması güçtür. Epitelyal ovaryum tümörlerinin benign-malign olarak ayrımı her zaman yapılamaz. Bu nedenle sınıflandırmaya klinik ve histopatolojik ayrımların gözlendiği üçüncü bir grup olan sınır (borderline) tümörler eklenmiştir [123, 124, 126]. Epitelyal ovaryum tümörleri, tuba uterina epiteli, endometrium, endoserviks, kolon epiteli ya da ürogenital kanalın epitel özelliklerini taşıyabilirler ve histolojik olarak 8 alt tipi bulunmaktadır (Çizelge 2.2). Çizelge 2.2. Yüzey epitelyal-stromal ovaryum tümörlerinin sınıflandırması YÜZEY EPİTELYAL-STROMAL TÜMÖRLER Seröz Tümörler Malign Borderline Benign Adenokarsinom Yüzey papiller adenokarsinomu Adenokarsinofibrom (malign adenofibrom) Papiller kistik tümör Yüzey papiller tümörü Adenofibrom, kistadenofibrom Kistadenom Papiller kistadenom Yüzey papillomu Adenofibrom ve kistadenofibrom Müsinöz Tümörler Malign Borderline Benign Adenokarsinom Adenokarsinofibrom (malign adenofibrom) İntestinal tip Endoservikal benzeri Kistadenom Adenofibrom ve kistadenofibrom Müsinöz kistik tümör ve mural nodüller Müsinöz kistik tümör ve psödomiksoma peritonei

63 46 Çizelge 2.2. (devam) Yüzey epitelyal-stromal ovaryum tümörlerinin sınıflandırması Endometrioid Tümörler Malign Borderline Benign Adenokarsinom-NOS Adenokarsinofibrom ( malign adenofibrom) Malign müllerian mikst tümör (karsinosarkom) Adenosarkom Endometrial stromal sarkom (düşük grade) İndifferansiye ovaryum sarkomu Kistik tümör Adenofibrom, kistadenofibrom Berrak Hücreli Tümörler Kistadenom Adenofibrom, kistadenofibrom Malign Borderline Benign Adenokarsinom Adenokarsinofibrom (malign adenofibrom) Kistik tümör Adenofibrom, kistadenofibrom Kistadenom Adenofibrom, kistadenofibrom Malign Tranzisyonel Hücreli Tümörler Borderline Benign Transisyonel hücreli karsinom (non-brenner tip) Malign Brenner tümörü Brenner tümörü Prolifere tip Brenner tümörü Metaplastik tip Yassı (skuamöz) Hücreli Tümörler Skuamöz hücreli karsinom Epidermoid kist Mikst Epitelyal Tümörler Malign Borderline Benign İndifferansiye karsinom Adenokarsinom-NOS İndiferansiye ve Klasifiye Edilemeyen Tümörler

64 47 Seröz tümörler Seröz tümörler, en sık görülen ovaryum kanseri tipidir. Ovaryum kanserlerinin yaklaşık %80-85 ini oluştururlar [127]. Daha çok yaşlarda görülür ve hastaların %40-60 ında çift taraflıdır. Seröz tümörlerin %50 sinden fazlasının çapı 15 cm yi aşar. Kesitlerde solid, yer yer kanamalı alanlar, nekroz, kist duvarında invazyon ve çevre dokulara adezyon gözlenir. Kist boşluğuna doğru uzantılar yapan papiller yapılar içerir. Hücreler mikroskobik olarak tuba uterina epiteline benzerler. Olguların %80 inde tümörlerde psammoma cisimcikleri ismi verilen düzensiz lamelli yapıda kalsifikasyonlar bulunur. Primer tümörde bulunup metastatik tümörde bulunmayan psammoma cisimcikleri iyi prognozla ilişkilidir [9, 124, 126]. Müsinöz Tümörler Müsinöz tümörler ovaryum kanserlerinin yaklaşık %3 ünü oluştururlar [126]. Seröz tümörlere benzer yaş dağılımı gösterirler. Tümörlerin epitel hücrelerinin bir kısmı ya da tümü intrasitoplazmik müsin içerirler. Bu hücreler endoserviks, mide pilor bölgesi ya da bağırsak epitel hücrelerine benzetilirler. Müsinöz karsinomalar genellikle büyük, düz yüzeyli, sulu ya da viskoz mukoid materyal içeren multi ya da uniloküler kistik yapılardır. Hastaların yalnızca %5 inde iki taraflıdır. Çapları ortalama cm olup daha büyük boyutlara da ulaşabilirler. Müsinöz tümörlerin çoğu bağırsak tipi hücreler içerdiğinden mide-bağırsak sistem tümörlerinden ayırmak için yalnızca histolojik incelemeler yeterli olmayabilir [9]. Endometrioid tümörler Endometrioid tümörler ovaryum kanserlerinin %10-20 sini oluşturarak seröz tümörlerden sonra ikinci sırada yer alırlar. Hastaların %30-50 sinde çift taraflıdır. Endometriyumunun epitel ve stromal tümörlerine benzerler. Çok katlı, müsin içermeyen epitel ile örtülü, yuvarlak, oval ya da tübüler bezler içerirler [9]. Olguların %20-30 unda endometrioid ovaryum kanserine endometrial kanser eşlik eder. İki kanserin birlikte görülmesi, tanısal açıdan metastatik ya da eş zamanlı hastalığın ayrımını zorlaştırır. Ancak eş zamanlı endometrial kanser görülme olasılığı metastatik endometrioid ovaryum kanseri görülme olasılığından daha fazladır. Eş zamanlı uterus-ovaryum endometrioid kanserlerinde 5 yıllık

65 48 sağ kalım oranı %80 iken, metastaz durumunda bu oran %40 a düşer [128]. Berrak hücreli tümörler Tüm ovaryum kanserlerinin %5 ini oluştururlar [126]. Tümör çapları 15 cm kadardır. Hastaların %40 ında çift taraflıdır. Ağırlıklı olarak epitelyal hücreler ve bunlar yanında fibramatöz bileşenler içerirler. Epitel bir ya da daha fazla hücre tipinden oluşabilir. En yaygın görülen hücreler berrak ve çekirdeği sitoplazmanın üst sınırına yakın yerleşmiş iri başlı çivi şeklinde olan hücrelerdir. Ayrıca kübik, yassı ve oksifil hücreler de bulunabilir. Uzun berrak hücreler bol berrak ya da vakuollü sitoplazma, hiperkromatik düzensiz çekirdek ve değişik büyüklüklerde çekirdekçiklere sahiptir [9]. Oksifil varyant, tipik bir berrak hücreli tümör içinde gelişen eozinofilik tümör olarak karakterize edilir [126]. Bazı tümörlerin merkezi kısımlarında endometriozis ve endometrioid karsinoma bulunur. Bu ovaryum tümörleri, histolojik olarak uterus kanserine ya da utero dietilstilbestrol e etkin kalmış genç hastaların vajinalarındaki kanserlere benzer. Berrak hücreli epitelyal ovaryum tümörleri, hiperkalsemik ve endometriozis ile en sık birliktelik gösteren tümörlerdir [129]. Tranzisyonel hücreli tümörler Üriner kanalda görülen tümörlere benzeyen epitelyal tümörlerdir. Ovaryum tümörlerinin %1-2 sini oluştururlar. Genellikle, seröz adenokarsinom başta olmak üzere diğer epitelyal tümör tipleriyle karıştırılırlar [9, 126]. Bu tümörler en sık müsinöz tümörlerle olmak üzere diğer epitelyal ovaryum tümörleriyle birlikte görülürler ve bu durumda prognoz kötüdür [129]. Yassı (skuamöz) hücreli tümörler Germ hücre kökenli olmayan yassı epitel hücrelerinin oluşturduğu tümörlerdir yaş arası kadınlarda görülür ve bazı durumlarda endometriozis ile ilişkilidir. Endometrioid tümörlerden skuamöz farklılaşmanın yaygınlığı ile ayırt edilirler. Bu tümörlerin çoğu dermoid kistlerden kaynaklanır ve germ hücreli tümörler grubuna dahil edilir [9].

66 49 Karışık epitelyal tümörler Yüzey epitelyal ovaryum tümörlerinin %0,5-4 ünü oluştururlar [9]. Tümörlerin mikst epitelyal sayılması için histolojik olarak farklı en az iki tümör tipini barındırması ve her bir tümör tipinin tümörün en az %10 unu kaplaması gereklidir [126]. En sık karşılaşılan tümör karışımı, seröz (silli) ve müsinöz epitel karışımıdır. Bu durumda müsinöz epitel hücreleri, yalnızca apikal ya da luminal bölgede değil hücrenin her tarafına dağılmış şekilde hücre içi müsin içerirler [9]. İndiferansiye ve klasifiye edilemeyen tümörler Histolojik olarak diğer tümör tiplerinden herhangi birine dahil edilebilmelerini sağlayacak ayırt edici mikroskobik özellikleri bulunmayan tümörlerdir. Ovaryum kanserlerinin %4-5 ini oluştururlar [9, 126] Ovaryum kanseri tedavisinde kemoterapi uygulamaları Ovaryum kanseri, tüm jinekolojik kanserler arasında kemoterapiye en iyi yanıt verendir. Kemoterapiye yanıt alınması hastaların tedavi olabilme potansiyellerini gösterirken, hastaların %75 inden fazlasında ilaca dirençli klonlar gelişir ve bu nedenle ölürler. Prognozu daha kötü olan hastaların bir kısmında ise kemoterapiye primer direnç görülür [14]. Epitelyal ovaryum kanseri tedavisinde etkili olan birçok sitotoksik ajan bulunmaktadır. Bunlar arasında platin bileşikleri (sisplatin, karboplatin), klasik alkilleyici ajanlar (isofosfamid, siklofosfamid), antrasiklinler (doksorubisin, epirubisin), hekzametilmelamin, 5-fluorourasil (5-FU), etoposid, metotreksat, mitomisin-c yer alır. Tamoksifen ve medroksiprogesteron asetat da düşük düzeyde aktivite gösterir li yıllarda paklitakselin bulunmasıyla ovaryum kanseri tedavisinde belirgin bir ilerleme gerçekleşmiştir [15]. Ovaryum kanserinde standart tedavi platin bazlıdır. Platin içermeyen tedavilere yanıt %40 iken, platin tabanlı tedavilerde yanıt yaklaşık %60-80 dir. Ayrıca diğer tedavilere yanıt alınamayan hastalarda platin bazlı tedaviye %30-40 oranında yanıt alınabilir. Karboplatin

67 50 ve sisplatin arasında etkinlikte fark yoktur ancak karboplatin genellikle sisplatinden daha iyi tolere edilebilir [130]. Önceleri tedavi olarak platin ile kombine ilaç olarak siklofosfamid kullanılırken, etkinliğinin daha fazla olduğunun bulunmasıyla siklofosfamidin yerini paklitaksel almıştır. Platin/paklitaksel ile platin/siklofosfamid tedavisi karşılaştırıldığında, paklitaksel grubunda klinik yanıt %59 iken siklofosfamid grubunda %48, tam klinik remisyonun paklitaksel grubunda %41 iken siklofosfamid grubunda %27 olduğu görülmüştür. Paklitaksel kullanılan hastalarda total sağkalım oranının da belirgin bir şekilde uzun olması nedeniyle ilk aşama tedavi olarak paklitaksel/platin uygulanmaya başlanmıştır [131]. Platin bazlı kemoterapi epitelyal ovaryum kanseri hastalarında sağkalım oranını arttırmaktadır. Ancak, primer yanıt yüksek olmasına (%70-80) karşın, hastaların %75 inde hastalık yineler. Platin bazlı birincil tedaviye alınan yanıt doğrultusunda belirlenen platin duyarlılığı ile ikincil tedaviye alınacak yanıt tahmin edilebilir. Genel olarak, tedavi sırasında ilerleme gösteren, stabil hastalığı olan ya da ilk 6 ay içinde yineleme gösteren hastalar platine dirençli olarak sınıflandırılırken, 12 aydan uzun bir sürede yineleme göstermeyen hastalar ise platine duyarlı olarak sınıflandırılırlar [16]. Matsuo ve ark. tarafından 2010 yılında yayınlanan derlemede, klinik testlerde en yaygın olarak kullanılan ilacın gemsitabin olduğu belirtilmiştir. Gemsitabin bazlı kombinasyon terapisine alınan yanıt, test edilen diğer birçok ilaçtan alınan ortalama yanıttan daha fazla bulunmuştur. Ayrıca gemsitabin tedavisinin hastaların, hastalıklarında ilerleme olmaksızın sağkalım oranlarını arttırdığı görülmüştür [132]. Kısmi platin duyarlılığı olan ve platin bazlı tedavinin bitiminden 6-12 ay sonra yinelenen kanserlerde trabektedin in etkili olduğu gözlenmiştir [17]. Son yıllarda yeni biyolojik ajanların bulunması, ovaryum kanserinde prognozun iyileştirmesine yönelik beklentileri arttırmıştır. Ovaryum kanseri biyolojisi hakkında sahip olunan bilgiler arttıkça, tedavide kullanılabilecek büyüme faktörü reseptörleri, çeşitli sinyal dönüşüm yolakları, hücre döngüsü düzenleyicileri ve anjiogenik düzenekler gibi moleküler hedefler tanımlanmıştır [17].

68 51 Primer tedavide ve platine duyarlı yineleyen ovaryum kanserlerinde bir VEGF baskılayıcısı olan bevacizumab etkinlik açısından onaylanmıştır [17, 133, 134]. Bevacizumab ın en büyük etkisi, kanserin ilerleme riskinin yüksek olduğu hastalarda gözlenmiş ve bu ilaç ovaryum kanserlerindeki asitleri azaltmıştır [135]. BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları bulunan ovaryum kanserlerinin tedavisinde Poli-ADPriboz-polimeraz baskılayıcıları (PARP inhibitörleri) umut vermektedir [17]. PARP baskılayıcılarından olan olaparib ve iniparib in platine duyarlı ovaryum kanserlerinde etkili olduğu görülmüştür [ ] Wnt Sinyal Yolağı Kanonikal Wnt/β-katenin yolağı, non-kanonikal planar hücre polarite yolağı ve nonkanonikal Wnt-Ca +2 yolağı olarak üç ana Wnt sinyal yolağı vardır. Bu yolaklar kanonikal ya da non-kanonikal olarak iki gruptan birine aittir. Bu iki grup arasındaki esas fark, β- katenin varlığı ya da yokluğudur. Kanonikal Wnt/β-katenin yolağı, β-katenine gereksinim duyarken non-kanonikal yolak bu proteinden bağımsız olarak çalışır [20] Wnt sinyal yolağının bileşenleri Non-kanonikal Wnt sinyal yolakları Wnt sinyal yolağında ligand olarak işlev yapan Wnt proteinleri, sisteinden zengin 19 glikoproteinden oluşurlar. Bu ligandlar, Wnt yolaklarının esas reseptörlerinden biri olan Frizzled (Fzd) transmembran reseptörüne bağlanırlar [139]. Wnt ligandı Fzd ye bağlandığında, üç farklı hücre içi sinyal yolağından biri aktive olabilir. Üç yolağın tümünde bir Wnt ligandı Fzd reseptörüne bağlanır ve Dishevelled (Dsh) proteininin serbest kalmasına neden olur. Planar hücre polarite non-kanonikal yolakta bu kompleks Dsh ile ilişkili morfogenezis aktivatörü Daam1 e bağlanır. Bu olaylar dizisi, hücre kutuplaşmasını denetleyen Rac ve RhoA GTPaz ların aktivasyonuna neden olur. Wnt-Ca +2 non-kanonikal yolakta ise Wnt/Fzd/Dsh kompleksi bir G proteinine (Ror 1/2) bağlanarak kalmodulinbağımlı kinaz II, protein kinaz C ve fosfataz kalsinörin uyarılmasına neden olur. Bu bağlanma, hücre içinde kalsiyumun artmasına ve daha sonra da artan kalsiyum nedeniyle diğer sinyal yolaklarının uyarılmasını sağlar [20].

69 52 Kanonikal (Wnt/β-katenin) sinyal yolağı Kanonikal Wnt/β-katenin yolağında Wnt ligandı olmadığında, reseptör bulunmadığında ya da bloke olduğunda yolak kapalı dır. Dikkopf (DKK1-4) ailesi, transmembran reseptörlerden birine (Fzd, LRP5/6) doğrudan bağlanarak Wnt nin bu reseptörlere bağlanmasına engeller. Wnt-inhibitör faktör (WIF-1) ve Fzd reseptörü salgı proteinleri ailesi (SFRP1-5), Wnt nin kendisine bağlanarak bu proteinin reseptörlere bağlanmasına engel olur. Wnt ligandı reseptörlere bağlanmazsa, Axin, adenomatöz polipozis koli (APC) ve GSK3β dan oluşan bir yıkım kompleksince β-katenin parçalanır. β-katenin, kazein kinaz 1 (CK1) ve GSK3β tarafından fosforile edilir ve ardından ubikitinasyonu ve 26S proteazom tarafından proteazomal degradasyonu gerçekleşir. Sitoplazmada β-katenin miktarı düşük olduğunda, TCF/LEF transkripsiyon faktörleri serbest kalır ve aktif haldeki hedef genleri bloke ederek transkripsiyonun engellenmesini sağlar [20]. Kanonikal Wnt yolağının uyarılması için Wnt ligandlarının Fzd ailesi reseptörler ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör ile ilişkili proteinler (LRP5 ve LRP6) i içeren hücre yüzey reseptörlerine bağlanması ve β-katenin kararlılığının gerçekleşmesi gerekmektedir. Wnt yolağı açık olduğunda sitozolik β-katenin stabilize olur. LRP6/LRP5, CK1 ve GSK3β tarafından fosforillenir. Dsh molekülleri plazma membranına gelerek Fzd ile etkileşime girerler. Axin in fosforile LRP6/LRP5 ve Dsh ile etkileşime girmesi sonucu yıkım kompleksi inaktive olur ve β-katenin degradasyonu baskılanır. β-katenin sitoplazmada birikir ve çekirdeğe girer. Çekirdekte TCF/LEF ailesine ait transkripsiyon faktörlerinden ayrılmasına neden olur ve transkripsiyon faktörlerine kendisi bağlanır. BCL9/LGS ve Pygopus (Pygo) gibi ko-aktivatörler ile etkileşime girerek hedef genlerin transkripsiyonunu sağlar [140]. TCF/LEF, BCL9/LGS ve Pygo çekirdekte β-katenin e bağlanarak bir transkripsiyonal aktivasyon kompleksi oluştururlar. β-katenin, çoğalma ve yaşam ile ilgili genlerin transkripsiyonunu sağlar. β-katenin in kanonikal yolağın transkripsiyon faktörlerine bağlanmasıyla aktive olan ana proteinler ve genler c-myc, Cyclin D1, Survivin, Axin2 ve matriks metalloproteinazlardır. Wnt yolağı tarafından düzenlendiği bilinen 100 ün üzerinde hedef gen bulunmaktadır ve bunların 23 ünün ovaryum kanserinde aşırı ifadelendiği gösterilmiştir [141].

70 Wnt sinyal yolağının düzenlenmesi Kanonikal Wnt/β-katenin yolağı kanser araştırmalarında en iyi tanımlanmış Wnt yolağıdır. Wnt/β-katenin yolağı gen mutasyonları, hücre dışı baskılayıcılar ve çekirdek içi transkripsiyon kofaktörleri olarak çeşitli aşamalarda düzenlenir. Bunların her biri farklı düzenekleri kapsar. Wnt ligandı olmadığında, bir yıkım kompleksi β-katenin düzeyini denetler. CK1 ve forforile olmamış GSK3β, β-katenin i fosforile eder ve proteini ubikitinasyon ve proteazomal degradasyon için hedefler. Protein kinazlar (A, B ve C), Akt/PI3K ve MAPK, GSK3β yı fosforile ederek GSK3β nın β-katenin i fosforilleme ve degradasyon için hedefleme özelliğini baskılar. Ovaryum kanserlerinin çoğu, gen amplifikasyonu nedeniyle aşırı aktive olan fosfoinositid 3-kinaz (PI3K) ın β-katenin fosforilasyonunu engelleyerek hücresel farklılaşma, bölünme ve canlılığın devam etmesine neden olmasıyla gerçekleşir [142, 143] Ovaryum kanserinde Wnt sinyal yolağındaki değişiklikler Membranöz faktörler Epitelyal ovaryum kanserinde Fzd reseptörünün iki alt tipi olan Fzd1 ve Fzd5 miktarı artar. Malign ovaryum tümör dokuları bu reseptörler için normal ovaryum dokularından daha fazla pozitif boyanırlar [144]. Epitelyal ovaryum tümörlerinin metastazla yayılması sırasında tümör hücrelerinin submezotelyal interstisyal kollajenlere adezyonu söz konusudur. Mezotel ve submezotelyal matrikse β-1 integrin-aracılı tutunma gerçekleştiğinde, diğer peritoneal organlarda metastatik tümör bölgelerinin oluşumu kolaylaşır. Kollajen-bağlayıcı β-1 integrinlerin işlevi sonucu LRP6, WNT5A, MMP9, PTGS2 (COX2), PLAUR, vimentin, SNAII nin mrna düzeyinde ifade artışı gösterilmiştir [145]. Bu veriler, ovaryum kanserinin metastazla yayılmasının LRP6 tarafından yönetildiği ve bu nedenle LRP6 yı hedef almanın ovaryum kanseri tedavisinde etkili bir yaklaşım olabileceğini göstermektedir [20]. Wnt yolağının karşıtı olarak görev yapan çok sayıda protein bulunmaktadır. Bu proteinler DKK1-4, WIF-1 ve SFRP1-5 i içerir. SFRP ler, Wnt ligandına ya da Fzd reseptörüne doğrudan bağlanarak Wnt nin Fzd ye bağlanmasına ve yolağın aktive olmasına engel olurlar. SFRP4 proteininin ifadesinin azalması, daha agresif bir ovaryum kanseri fenotipi

71 54 ile doğru orantılıdır ve SFRP4 düzeyi prognoz ile doğrudan ilişkilidir Bu proteinlerin ifadeleri kaybolduğunda tekrar ifadelenmeleri sağlanarak ya da ifadelenmeleri arttırılarak ovaryum kanserinde terapötik hedefler olarak kullanılabilirler [146]. Sitoplazmik ve çekirdek faktörleri Endometrioid ovaryum kanserlerinde genellikle β-katenin geninde (CTNNB1) bir mutasyon vardır. Seröz ve berrak hücreli ovaryum kanserlerinde ise CTNNB1 geninde mutasyon bildirilmemiş olmakla birlikte bu kanserlerde nüklear β-katenin varlığı gözlenmiştir [147]. Nüklear β-katenin ifadelenmesi ve ileri-dereceli seröz ovaryum kanseri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu belirlenmiştir [148]. β-katenin fosforilasyonunu baskılayan proto-onkogen FRAT1 in seröz ovaryum kanserlerinde aşırı ifadelendiği, sitoplazmik β-katenin miktarı ile doğru orantılı olduğu ve nüklear β-katenin artışına neden olduğu bulunmuştur [147]. β-katenin e bağlanan ko-aktivatörlerden biri olan Pygo, tümör hücre gelişimi için gerekli olan bir bileşendir ve bu proteinin ovaryum kanserinde yüksek düzeyde ifadelendiği saptanmıştır [149]. Bir diğer ko-aktivatör olan BCL9/LGS nun ifadesi, epitelyal ovaryum kanserlerinde yaygındır. Bu ko-aktivatörlerin aşırı ifadelenmesi, Wnt yolağının ovaryum kanserinde tümör oluşumunda önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir. Hücre içi etkileşimler Epitelyal-mezenşimal değişim e (EMT) uğrayan hücrelerde E-kaderin ifadesi azalır, vimentin ifadesi ise artar. Bunun sonucunda tümör hücrelerinin invazyonu ve metastazı gerçekleşir. Epitelyal ovaryum kanserleri aynı zamanda bir mezenşimal-epitelyal değişim (MET) geçirirler, çünkü normal ovaryum yüzey epiteli mezenşimal kökenlidir. Bu süreç epitelyal-mezenşimal esneklik olarak isimlendirilir. Her iki değişimin de metastaz oluşumu için eşit derecede önemli olduğu düşünülmektedir [20]. Metastatik epitelyal ovaryum kanseri hücreleri integrinler aracılığıyla periton boşluğunun intersitisyal kollajenlerine bağlanırlar. Bu sürecin en önemli bileşenleri olan hücre-matriks ve hücre-hücre adhezyonları, integrinler ve E-kaderinler aracılığıyla gerçekleştirilir. Epitelyal ovaryum kanserinde, diğer epitelyal hücre kökenli kanserlerdeki baskın EMT bileşeninden farklı olarak MET bileşeni baskındır. Bu nedenle ovaryum kanserinde malign

72 55 hale dönüşüm sürecinde E-kaderin ifadelenmesi artar. E-kaderin bazlı zonula adherens tipi bağlantılar, β-katenin tarafından stabilize edilir ve bağlantılardaki stabilite yitimi sitoplazmik ya da nüklear β-katenin artışına neden olabilir [145]. Hücre dışı faktörler Epitelyal ovaryum kanserinde Wnt yolağının membranöz ve hücre içi bileşenleri yanında hücre dışı uyaranların ifadesi de artar. Bu faktörler özellikle Wnt-1, Wnt-2b, Wnt-5a ve Wnt-11 i içerirler [144]. Ricken ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada RT-PCR kullanılarak beş ovaryum kanser hücre hattının RNA ları incelenmiş ve Wnt-2b, Wnt-5a ve Wnt-11 transkriptlerinin ifadeleri doğrulanmıştır [150]. Gen ifadesi Dört gen veri grubu, tarafından yapılan araştırmalarda normal ovaryum yüzey epiteli ve ovaryum kanseri arasında yalnızca dört yolağın farklı şekilde ifade edildiği belirlenmiştir. Bu yolaklardan biri Cytoskeleton remodeling/tgf-wnt yolağı dır [151]. Sitoiskeleti yeniden şekillendirici/tgf/wnt yolağı, TGF-β yolağı ve Wnt yolağının karşılıklı etkileşimince oluşturulan ve hücre iskeletinin yeniden şekillenmesinde (hücre-hücre adezyonu ve hücre-matriks adezyonu) görev alan ana yolaktır. Bu yolak, çeşitli kanser türlerinde metastaz ile ilişkilidir ve kanser hücrelerinin göçü ve invazyonunda oldukça önemlidir [152]. Ovaryum kanserinde kemorezistans ve yaşam uzunluğu ile ilişkili altı temel moleküler sinyal yolağı bulunmuştur. Bunlardan ikisi TGF-Wnt yolağı ve özellikle Wnt-2 tarafından aktive edilen Wnt yolağıdır [146] Wnt sinyal yolağının potansiyel terapötik hedefleri Wnt yolağının spesifik membranöz, hücre içi ve dışı bileşenlerinin tanımlanması tedavi için olası hedef arayışlarının ortaya çıkmasına neden olmuştur. Son zamanlarda Wnt yolağını hedef alan faz I kliniksel uygulamalara yeni küçük moleküller eklenmiştir. Porcuine (Porcn), Wnt ligandının salınımında önemli bir aşama olan Wnt ye yağ asidi eklenmesini sağlayan açiltransferaz enzimdir. Porcn olmadığında bu modifikasyon katalizlenmez ve Wnt proteini hücre içerisinde tutuklanmış şekilde kalır. LGK974, Porcn u baskılayan küçük bir moleküldür. β-kateninin serbestleşmesini bloke eden PRI-724 ve

73 56 koaktivatörü CBP ise çekirdekte Wnt sinyal yolağını hedef alan küçük moleküllü baskılayıcılardandır [20]. Diğer yolaklar da Wnt yolağı ile karşılıklı etkileşimlerde bulunabilir. Wnt yolağında Aksin, β-katenin yıkım kompleksine ait önemli bir proteindir. PARP lar, aksinin degrade olmasına neden olur. Böylece Aksin β-kateninin yıkımına katkı sağlayamaz duruma gelir. PARP baskılandığında ise Aksin kararlı hale gelir ve β-katenini degrade etmeyi sürdürür [153]. Ovaryum kanseri ile ilgili klinik araştırmalarda kullanılmakta olan çeşitli PARP baskılayıcıları vardır. Ayrıca PARP ın özgün bir tipi olan tankirazları hedef alan küçük bir molekül olan PARP baskılayıcısı XAV939 ile ilgili ön klinik çalışmalar yürütülmektedir [154]. Ovaryum kanserinde Fzd reseptör ifadesinin arttığı bildirilmiştir. Klinik araştırmalarda kullanılan ve özel olarak Fzd reseptörünü hedef alan iki ilaç bulunmaktadır. OMP-18R5, Fzd reseptörlerini hedef alan monoklonal bir antikordur ve Fzd reseptörlerinin Wnt ligandları ile ilişki kurmasını engeller. Bu ilaç meme, akciğer, pankreas ve kolon kanserlerinde standart kemoterapi ile kombinasyon halinde kullanılmaktadır. Diğer bir ilaç olan OMP-54F28 de Wnt ligandlarına bağlanarak onları alıkoyar [20]. Onkolojide son yıllarda yeni bir yaklaşım ortaya çıkmıştır. Repurposed ismi verilen bu yaklaşımda geçmişte başka ereklerle kullanılan ilaçların antikanser ilacı olarak etkilerinin araştırılması amaçlanmaktadır. FDA tarafından onaylanmış antihelmintik bir bileşik olan niklozamid, steroid özellikte olmayan anti-inflamatuvar ilaçlar (NSAIDS) ve antipsikotik ilaçlar olan lityum ve valporik asidin Wnt yolağı aracılığıyla işlev gördükleri gösterilmiştir. NSAIDS, TCF nin degradasyonuna neden olur ve Cox2 gibi Wnt hedef genlerini baskılar. Bunlar Wnt yolağını direkt olarak hedef almamalarına rağmen potansiyel bir anti-wnt ajanı olarak kullanılabilirler. Niklozamid, Wnt/β-katenin yolak aktivasyonunu inhibe eder [20]. Kolorektal kanserde niklozamidin Dsh protein ailesinin bir üyesi olan Dvl2 nin ifadesini azalttığı gösterilmiştir [28]. Yapılan son çalışmalar niklozamidin yalnızca Wnt/βkatenin yolağını değil aynı zamanda NF-B, Notch, ROS, mtorc1 ve Stat3 gibi kanser kök hücrelerinin devamlılığında görev alan sinyal yolaklarını da hedef aldığını göstermiştir [27, 155]. Niklozamidin Wnt yüzey reseptörü LRP6 nın degradasyonunu uyararak Wnt/βkatenin sinyalini baskıladığı rapor edilmiştir [25]. Ovaryum kanseri hastalarında LRP6 ifadesinin arttığı gözlenmiştir. Kemorezistans gösteren ve kanser kök hücresi tanımına

74 57 uyan ovaryum tümör hücrelerine klinik olarak onaylanmış 1200 den fazla ilaç uygulandığında, niklozamid in in vitro ve in vivo ortamda ovaryum kanser kök hücrelerini seçici olarak hedef alan en iyi ilaç olduğu belirlenmiştir [40] Niklozamid Helmint sınıfı organizmalar, insan vücudunda mide-bağırsak kanalı lümeninde, kan ve lenf damarları içinde ve bazı dokularda parazit olarak yerleşir ve genel olarak helmintiyazis denilen hastalıklara neden olurlar. Helmintiyazis ülkemizde en sık görülen hastalıklardan biridir. Bağırsak helmintiyazisine özellikle çocuklarda sık rastlanır. Bu tür helmintiyazislerin çoğu, ciddi komplikasyonlara neden olmadığından konakçı tarafından önemsenmez. Ancak bağırsak helmintiyazisi çocuklarda beslenme ve büyüme bozuklukları ile bilişsel işlev geriliğine neden olabilir. Bağırsak helminti olan nematodlar, insan feçesleri ile atılan yumurtaların su ve besinler yoluyla ağızdan alınmaları ile vücuda girerler. Bu hastalığa karşı kullanılan ilaçlar ya helminti öldürerek ya da felç edip bağırsak duvarından ayrılmasını sağlayarak etki gösterir. Bu ilaçların mide-bağırsak kanalından emilmemeleri ve sistemik etkilerinin bulunmaması gereklidir. İlacın emilmeyip bağırsak lümeninde kalması buradaki helmintler ile yüksek yoğunlukta etkileşime girmesini sağlar. Helmintin damarlar ve dokulara yerleşmesine ise sistemik helmintiyazis adı verilir. Bu durumda çeşitli komplikasyonlar oluşur ve klinik belirtiler ortaya çıkar. Sistemik helmintiyazis bağırsak helmintiyazisi kadar yaygın bir olgu değildir [156]. Helmintler zoolojik sınıflandırmada nematodlar, sestodlar ve trematodlar olarak alt gruplara ayrılırlar. Antihelmintik ilaçlar kısmen seçici etkileri nedeniyle bu alt gruplara uyan bir özgüllük gösterirler. Bu nedenle kullanıldıkları alt gruba göre sınıflandırılırlar [156]. Antihelmintik bir ilaç olan niklozamid (C13H8Cl2N2O4; ticari ismi Niclocide), insanlarda 1960 yılından beri çeşitli tenyaların tedavisinde ağız yoluyla kullanılan, FDA tarafından onaylı, klorosalisilamid türevi, suda çözünmeyen bir ilaçtır [22-24]. Taenia saginata ve Hymenolepis nana ya karşı en fazla yeğlenen iki ilaçtan biridir [156]. Bu ilaç, hedeflediği moleküler yolaklar bilinmeksizin, parazitik solucan ile enfekte olmuş hayvan modellerindeki etkinliğine dayanılarak geliştirilmiş ve etki yolu tam olarak tanımlanamamıştır. Niklozamidin antiparazitik etkisinin nedeninin, parazitin ph

75 58 homeostazını bozma erki olduğuna inanılmaktadır [23, 157]. Ayrıca, tenyaların mitokondriyonlarında oksidatif fosforilasyonu baskıladığı düşünülmektedir [25]. Niklozamid, mide-bağırsak kanalındaki hücreler tarafından hidrolitik olarak parçalanabilmektedir [158]. Mide-bağırsak kanalından emilim oranı yaklaşık %33 tür. Hayvanlarda yapılan çalışmalar, niklozamidin mutajenik, onkojenik ya da embriyo-toksik aktiviteye ve kümülatif etkilere sahip olmadığını göstermiştir [26, 159]. Sıçanlardaki oral LD50 değeri >5000 mg/kg olan niklozamid, çok düşük bir toksisiteye (iyi tolere edilebilir) sahip olmasının yanında güvenli, ucuz ve kolay ulaşılabilir bir ilaçtır [26, 27, 160]. Niklozamidin in-vitro ortamda normal hücrelere karşı belirgin bir toksisitesi gözlenmemiş ve niklozamid uygulanmış farelerde bir yan etki belirlenmemiştir [28]. Son yıllarda, meme, prostat, kolon, ovaryum, akciğer, kan kanseri gibi çeşitli kanserlerde yürütülen in-vivo ve in-vitro yapılan çalışmalarda, niklozamidin farklı yolaklara etki ederek tümör hücrelerinin çoğalmasını baskıladığı, apoptozisi uyardığı, kanser kök hücrelerinin gelişimini baskıladığı ve kanser hücrelerinin yayılma ve metastazını engellediği görülmüştür.

76 59 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Çalışmada Kullanılan Hücreler Çalışmamızda ilk kez 1982 yılında Hamilton T. C. ve arkadaşlarınca 60 yaşındaki beyaz kadından alınmış, epitel kökenli ovaryum adenokarsinomu olan OVCAR-3 hücre hattı kullanıldı. Doç. Dr. Ayşe Tansu KOPARAL (Anadolu Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı) tarafından ATCC (American Type Culture Collection) den satın alınan hücreler, çalışmamız için hediye edildi Hücre Kültürü OVCAR-3 hücreleri, önceden inaktifleştirilmiş %20 lik Fetal Sığır Serum (FBS), 1 mm Sodyum Pirüvat, %1 lik penisilin-streptomisin, %7,5 lik sodyum bikarbonat ve 0,01 mg/ml sığır insülini içeren RPMI-1640 besiyerinde, 75 cm 2 lik flasklarda %95 hava ve %5 CO2 ortamında, 37 o C deki Heraus marka CO2 inkübatöründe kültüre edildi Çalışmada Kullanılan İlaçların Dozlarının Hazırlanması Deneylerde kullanılan niklozamid in (Sigma, N ) 0,1 M lık ve 5-FU nun (Fluka, 03738) 1 M lık esas stok solüsyonları, DMSO (dimetil sülfoksit) içinde çözünerek hazırlandı. Diğer dozlar, esas stok solüsyonun kültür besiyeri içinde seyreltilmesiyle ve DMSO oranı % 0,1 i geçmeyecek şekilde hazırlanarak +4 o C de saklandı. Ön çalışmalarda OVCAR-3 hücreleri için ilaçların çok sayıda dilüsyonları denendi ve sitotoksisite deneylerinde kullanılmak üzere bunlar arasından uygun dozlar belirlendi. Niklozamid in 0,2 μm, 0,5 μm, 1 μm, 2 μm, 4 μm, 8 μm ve 5-FU nun 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 40 μm dozları in vitro sitotoksisite deneylerinde kullanıldı MTT İçin Hücrelerin Hazırlanması Uygun koşullarda çoğalmaya bırakılan hücreler flask yüzeyini %70 oranında kapladıklarında Tripsin-EDTA ile muamele edilerek flask tabanından kaldırıldı. Tripan mavisi boyası ile boyanan hücreler, Thoma lamı yardımıyla 3 kez sayıldı ve ortalamaları

77 60 alındı. Hücreler RPMI-1640 besiyerinde süspansiyon haline getirildikten sonra, 96 kuyucuklu hücre kültürü plakalarına her kuyucukta 5x10 3 hücre olacak şekilde 0,2 ml hücre süspansiyonu aktarıldı. Flask yüzeyine yapışmaları ve yeni ortama alışmaları için hücreler 37 o C de 48 saat inkübe edildi. İnkübasyon süresi sonunda hücrelerin üzerindeki besiyerleri uzaklaştırıldı, test maddelerinin belirlenen dozlarını içeren taze besiyerleri eklenerek 24, 48 ve 72 saat 37 o C de CO2 inkübatöründe inkübe edildi In Vitro Sitotoksisite Testi (MTT Yöntemi) Bu yöntem Mosmann ın [161] yöntemine uygun olarak modifiye edilerek uygulandı. Belirtilen dozlardaki ilaçlar ile 24, 48 ve 72 saat muamele edilen hücrelerden inkübasyon süresi sonunda besiyerleri uzaklaştırıldı ve 5 mg/ml MTT içeren taze besiyeri eklendi. Hücreler MTT varlığında 3 saat süresince % 95 hava ve % 5 CO2 ortamında, 37 o C de karanlıkta inkübe edildi. Bu süre sonunda hücrelerden MTT içeren besiyeri uzaklaştırıldı ve canlı hücrelerin oluştduğu formazan kristallerinin çözünmesi için her kuyucuğa 0,1 ml DMSO eklendi. Çözünmeyi kolaylaştırmak için kültür plakası 15 dk 300 rpm de çalkandı. Çözünen formazan kristallerinin oluşturduğu renk şiddetinin optik dansitesi (OD), Bio- Tek, ELx808-IU marka ELISA cihazında 570 nm dalga boyunda ölçüldü. OD değerlerinin artışı, canlı hücrelerin sayısı ile doğru orantılı olarak değerlendirildi. İlaç ile muamele edilmeyen hücrelerin canlılık oranı % 100 olarak kabul edilerek deney hücrelerinin canlılık oranları yüzde olarak ifade edildi. Deney setlerinde hücreler her ilaç dozu için 4 paralel halinde ekildi ve deneyler birbirinden bağımsız olarak 3 kez yinelendi TUNEL ve İmmunositokimyasal Yöntemler İçin Hücrelerin Hazırlanması Uygun koşullarda çoğalmaya bırakılan hücreler flask yüzeyini %70 oranında kapladıklarında Tripsin-EDTA ile muamele edilerek flask tabanından kaldırıldı. Tripan mavisi boyası ile boyanan hücreler, Thoma lamı yardımıyla 3 kez sayıldı ve ortalamaları alındı. Hücreler %20 FBS içeren RPMI-1640 besiyerinde süspansiyon haline getirildi. 24 kuyucuklu kültür plakalarına yerleştirilmiş yuvarlak lameller üzerine her kuyucuğa toplam hacim 0,5 ml olacak şekilde 5x10 4 hücre ekildi. Hücreler lamellerin yüzeyine yapışmaları ve yeni ortama alışmaları için 48 saat süresince 37 o C de CO2 inkübatöründe inkübe edildi. İnkübasyon süresi sonunda besiyerleri uzaklaştırıldı, test maddelerinin MTT testi

78 61 sonucunda belirlenen dozlarını (niklozamid için 1 µm ve 2 µm; 5-FU için 10 µm ve 20 µm) içeren taze besiyerleri eklenerek 48 saat inkübe edildi. Süre sonunda besiyeri uzaklaştırılıp hücreler 2x5 dk PBS (fosfat buffer saline) ile yıkandı. Hücreler, PBS içinde hazırlanmış %1 lik paraformaldehit (ph:7,4) solüsyonu ile oda sıcaklığında 10 dk bekletilerek fikse edildi. Fiksasyon solüsyonu hücre yüzeyinden uzaklaştırıldıktan sonra hücreler 2x5 dk PBS ile yıkandı. %1 Triton X-100 içeren PBS solüsyonu eklendi ve plakalar 5 dk +4 o C de inkübe edilerek permeabilizasyon işlemi gerçekleştirildi. Permeabilizasyon solüsyonu hücre yüzeyinden uzaklaştırıldıktan sonra PBS ile 2x5 dk yıkama yapıldı TUNEL Yöntemi DNA parçalanması ve apoptotik hücre ölümünün belirlenmesi için in situ apoptozis saptama kiti kullanıldı (Millipore Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, Lot: Temecula, CA 92590). Yuvarlak lameller üzerinde çoğaltılarak fikse edilmiş hücrelerdeki endojen peroksidaz ı baskılamak için PBS içinde hazırlanmış %3 lük hidrojen peroksit (H2O2) eklendi ve hücreler 5 dk oda sıcaklığında inkübe edildi. H2O2 solüsyonu uzaklaştırıldıktan sonra hücreler 2x5 dk PBS ile yıkandı. Eşitleme tamponu ile 10 sn oda sıcaklığında inkübasyon yapıldı. Tampon uzaklaştırılıp, hücrelere TdT enzimi uygulandı ve nemli ortamda 37 o C ye ayarlanmış etüvde 1 saat bekletildi. Hücreler, durdurma/yıkama tamponunda oda sıcaklığında 10 dk bırakılıp 3x1 dk PBS ile yıkandıktan sonra antidioxigenin konjugatı ile 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. 4x2 dk PBS ile yıkama işleminin ardından peroksidaz substratı olan diaminobenzidin (DAB) eklenerek hücrelerin boyanması sağlandı. Optimum boyanma zamanını belirlemek için mikroskop altında renk oluşumu gözlendi. 3x1 dk dh2o (distile su) ile yıkama işlemi yapıldıktan sonra %0,5 lik Metil yeşili uygulanarak zemin boyaması yapıldı. Boyanan lameller %100 lük n-butanol ile yıkandı. Ksilen ile dehidrasyon yapıldı ve ardından entellan kullanılarak lameller lamlar üzerine kapatıldı. Hazırlanan preparatlar Leica DM 4000 (Germany) bilgisayar destekli görüntüleme sisteminde, Leica Q Vin 3 programında incelenerek apoptozise giden hücreler saptandı. 1 merkez 5 perifer bölge olarak toplam 6 farklı bölgeden gelişigüzel olarak seçilen 100 apoptotik hücre sayılarak, istatistiksel değerlendirme için veriler oluşturuldu.

79 β-katenin İçin İmmunositokimyasal Yöntem Yuvarlak lameller üzerinde çoğaltılarak tespit edilmiş hücrelerdeki endojen peroksidaz aktivitesini baskılamak için PBS içinde hazırlanmış %3 lük H2O2 eklendi ve hücreler 5 dk oda sıcaklığında tutuldu. 2x5 dk PBS ile yıkanan lamellere 5 dk Ultra V Block uygulanarak özgün olmayan bağlanmaların engellenmesi sağlandı. Bu işlemden sonra yıkama yapılmadan β-katenin primer antikor aşamasına geçildi. Bu erekle PBS ile 1/200 oranında dilüe edilen β-katenin rabbit poliklonal primer antikoru (Life Technologies; ) uygulanan hücreler 1 gece +4 o C de bekletildi. Süre sonunda hücreler 3x3 dk PBS ile yıkandı ve 20 dk biyotinli sekonder antikor uygulanarak (İnvitrogen, ) primer antikora bağlanması sağlandı. 3x3 dk PBS ile yıkamanın ardından hücreler 20 dakika streptavidin peroksidaz enzim kompleksine (İnvitrogen, ) etkin bırakıldı, böylece enzimin biyotine bağlanması sağlandı. Lameller yeniden 3x3 dk PBS ile yıkandıktan sonra DAB uygulanarak (İnvitrogen, ) gözle görülebilen immün tepkimenin açığa çıkması sağlandı. Zemin boyamasında Harris in Hematoksileni (İnvitrogen, ) kullanıldı. Boyanan lameller %100 lük n-butanol ile yıkandı. Ksilen ile dehidrasyon yapıldı ve ardından entellan kullanılarak lameller lamlar üzerine kapatıldı. Hazırlanan preparatlar Leica DM 4000 (Germany) bilgisayar destekli görüntüleme sisteminde, Leica Q Vin 3 programında değerlendirildi ve resimleri çekildi. Uygulanan immün boyama göz önünde bulundurularak yapılan değerlendirmeler sonucunda β-katenin pozitif hücreler saptandı ve hücreler 1 merkez, 5 perifer toplam 6 bölge için tüm preparatlarda incelenerek, immünreaktivite açısından istatistik uygulaması için veriler oluşturuldu. 0=Hiç Yok, 1=Zayıf, 2=Azdan Ortaya, 3=Orta, 4=Ortadan Yoğuna, 5=Yoğun sayısal veriler olarak kabul edildi İstatistiksel Analiz MTT deneylerinin sonuçlarının istatistiksel değerlendirmesinde SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) programı kullanıldı ve elde edilen verilerin tek yönlü ANOVA ile post-hoc olarak scheffe ve tamhane testi uygulanarak anlamlıkları belirlendi. Anlamlılık değeri olarak p<0.001 kabul edildi.

80 63 TUNEL yöntemi uygulandıktan sonra elde edilen verilerin değerlendirilmesinde, SPSS versiyon 17.0 yazılımı kullanıldı. Her bir gruptaki TUNEL-pozitif hücre sayısının diğer gruplardakilerden istatistiksel olarak anlamlı şekilde farklı olup olmadığını görmek amacıyla oranlar arasındaki farkın anlamlılığı için z testi yapıldı. Bu testte her bir gruptaki pozitif hücre sayısının o gruptaki toplam hücre sayısına oranı kullanılarak ikili grup karşılaştırmaları yapıldı ve aradaki fark p <0.05 düzeyinde test edildi. β-katenin tutulumunu belirlemek için yapılan immunositokimyasal yöntem ile elde edilen verilerin değerlendirilmesinde SPSS versiyon 17.0 yazılımı kullanıldı. Öncelikle gruplar arasında anlamlı farklar olup olmadığı, Kruskal Wallis H testi ile analiz edildi. Gruplar arasında p < düzeyinde anlamlı bir fark görüldüğünden, gruplar arasındaki farkların hangi ikili gruplar arasında olduğunu görmek için p<0.05 düzeyinde Mann Whitney U testleri yapıldı.

81 64

82 65 4. BULGULAR 4.1. MTT Bulguları OVCAR-3 hücreleri üzerine niklozamid in mitokondri aracılı sitotoksik etkisi 24, 48 ve 72 saatlik bekleme süreleri sonunda MTT yöntemi ile araştırıldı. Niklozamid in hücre canlılığı üzerine etkisinin ilk 24 saatte oldukça zayıf olduğu görüldü. 48 saat sonunda 0,2 μm ve 0,5 μm dozlarda anlamlı bir etki gözlenmezken, 1 μm, 2 μm, 4 μm ve 8 μm dozlarda hücre canlılığının anlamlı olarak azaldığı izlendi. 72 saatlik inkübasyon süresi sonunda ise 1 μm lık dozdan itibaren canlı hücre sayısının dramatik bir şekilde azaldığı gözlemlendi. Bu nedenle hücrelerin 48 saatte kontrole oranla canlılıklarını yarı yarıya yitirdikleri 2 μm lık doz IC50 değeri olarak belirlendi (Şekil 4.1). 5-FU nun OVCAR-3 hücreleri üzerine sitotoksik etkisini belirlemek ereğiyle, hücreler 24, 48 ve 72 saat süresince artan dozlarda ilaca etkin bırakılarak MTT yöntemi uygulandı. 24 saatlik inkübasyon süresi sonunda 5-FU nun hücre canlılığı üzerine anlamlı bir etkisinin olmadığı görüldü. 48 saat sonunda yapılan incelemede, 1 μm dozda anlamlı bir etki gözlenmezken, 2 μm lık dozdan itibaren 5-FU nun canlı hücre sayısını anlamlı olarak azalttığı saptandı. 72 saatlik ilaç uygulamasının kullanılan tüm dozlarda etkili olduğu izlendi. 48 saatlik uygulamada hücrelerin yarısını öldüren 2 μm lık 5-FU dozu IC50 değeri olarak belirlendi (Şekil 4.2) TUNEL Bulguları Kontrol OVCAR-3 hücre hattına ait TUNEL boyamalarında genelde az sayıda hücrenin pozitif reaktivite gösterdiği dikkati çekti (Resim 4.1). TUNEL pozitif boyanma göstermeyen hücreler, iri çekirdekleri, belirgin 2 ya da 3 çekirdekçiği ile normal yapıda gözlendi (Resim 4.2). DMSO uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait küçük büyültmeli incelemelerde hücre hattı genelinde TUNEL pozitif hücrelerin kontrol grubuna benzer şekilde az sayıda olduğu gözlendi (Resim 4.3). Büyük büyültmeli incelemelerde DMSO uygulanan hücrelerin sitolojik özellikleri kontrol hücre hattı ile eşdeşti. Hücrelerde sitoplazma belirgin iken, iri

83 66 yuvarlak çekirdeklerde yer yer 2, yer yer ise 3 çekirdekçik belirgin olarak izlendi (Resim 4.4). 10 μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında yapılan küçük büyültmeli incelemelerde kontrol ve DMSO kontrol gruplarına karşın TUNEL pozitif hücre sayısının belirgin olarak arttığı en dikkat çekici bulguydu. Hücrelerin bir grubunda yoğun TUNEL pozitif reaksiyon izlenirken, bir grup hücrenin çekirdeğinde tepkimenin daha az belirgin olduğu gözlendi. Bu bulgu, hücrelerde DNA kırıklarının daha yeni oluşmaya başladığının göstergesi olarak değerlendirildi (Resim 4.5). Büyük büyültmeli incelemelerde TUNEL pozitif hücrelerde, sitoplazmada yapısal bir bozukluk olmadığı, çekirdek ve çekirdekçiklerin belirginliği dikkati çekti (Resim 4.6). 20 μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında yapılan küçük büyültmeli incelemelerde hücre hattı genelinde tutulumun pozitif olduğu belirlendi (Resim 4.7). Büyük büyültmeli incelemelerde hücrelerin bir grubunda ileri apoptozisin bir göstergesi olarak çekirdek zarında ondülasyon ve çekirdekçik dağılımı ile kromatin yapısının bozulduğu belirlenirken, bir grup hücrede çekirdekçik yapısı halen normaldi. Ancak bu hücrelerde çekirdekçik sayısının genelde 1 e indiği görüldü (Resim 4.8). 1 μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında yapılan sitolojik değerlendirmede, TUNEL pozitif hücrelerin sayıca az oldukları, hücre hattı genelinin negatif hücrelerden oluştuğu belirlendi (Resim 4.9). Büyük büyültmeli incelemelerde TUNEL pozitif reaksiyon gösteren hücrelerin bir grubunda çekirdekte ondülasyonun başladığı ve çekirdekçik yapısının ayırt edilmediği dikkati çekerken, bir grup TUNEL pozitif hücrede ise çekirdek ve çekirdekçik organizasyonunun halen korunduğu izlendi. TUNEL negatif hücreler ise normal sitolojik yapılarıyla ayırt edildi (Resim 4.10). 2 μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında, 1µM lık niklozamid uygulanan gruba karşın TUNEL pozitif hücrelerin arttığı belirlendi. Bu grupta diğer gruplardan ayrıcalıklı olarak TUNEL pozitif hücrelerde çekirdeklerin yer yer apoptotik cisimcikleri oluşturmak üzere parçalandığı, bir grup hücrede ise çekirdeklerde lobülasyon oluştuğu dikkati çekti (Resim 4.11). Büyük büyültmeli incelemelerde lobülasyon göstermeye başlayan çekirdekler ve normal çekirdek morfolojisine sahip TUNEL pozitif hücreler belirgin olarak izlendi (Resim 4.12).

84 β-katenin İmmunositokimya Bulguları Kontrol OVCAR-3 hücre hattına ait β-katenin immün boyamalarında tüm hücrelerin hücre zarlarında belirgin tutulum ayırt edildi (Resim 4.13). Büyük büyültmeli incelemelerde tüm OVCAR-3 hücrelerinde hücre zarında kuvvetli β-katenin tutulumu izlenirken, yer yer sitoplazmada da tutulumun varlığı gözlendi. Bu bulgu β-katenin bağımlı Wnt yolağının göstergesi olarak kabul edildi (Resim 4.14). DMSO uygulanan OVCAR-3 hücre hattında yapılan boyamalarda kontrol grubuna benzer şekilde; tüm OVCAR-3 hücrelerinde hücre zarında kuvvetli β-katenin tutulumu izlenirken (Resim 4.15), büyük büyütmeli incelemelerde bir grup hücrede sitoplazmada da orta derecede immün reaksiyon belirlendi (Resim 4.16). 10 ve 20 μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında küçük (Resim 4.17 ve 4.19) ve büyük büyültmeli incelemelerde (Resim 4.18 ve 4.20) tutulum kontrol grubuna eşdeşti. Hücre zarında kuvvetli, sitoplazmada orta dereceli β-katenin tutulumu ayırt edildi. 1 μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumu değerlendirildiğinde hücre hattı genelinde tutulumun kuvvetli membranöz, orta dereceli sitoplazmik olduğu izlenirken, bir grup OVCAR-3 hücrelerinde zayıf membranöz ve zayıf sitoplazmik tutulum belirlendi (Resim 4.21 ve 4.22). 2 μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin tutulumunun dramatik biçimde azaldığı, çoğu hücrede zar ve sitoplazmada negatif reaksiyonun varlığı izlenirken az sayıda hücrede zar düzeyinde zayıf immunreaktivite belirlendi (Resim 4.23). Büyük büyültmeli incelemelerde zar ve sitoplazma düzeyinde tutulum göstermeyen OVCAR-3 hücreleri ve zayıf sitoplazmik tutulum gösteren hücreler saptandı (Resim 4.24).

85 68 Resim 4.1. Kontrol OVCAR-3 hücre hattına ait resimde tutulum gösteren hücreler ( ) ve tutulum göstermeyen hücreler ( ) görülüyor (TUNEL x400)

86 Resim 4.2. Kontrol OVCAR-3 hücre hattına ait resimde tutulum gösteren hücreler ( ), tutulum göstermeyen hücreler ( ), çekirdek ( ) ve çekirdekçik ( ), sitoplazma ( ) izleniyor (TUNEL x1000) 69

87 70 Resim 4.3. DMSO uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait resimde tutulum gösteren hücreler ( ) ve tutulum göstermeyen hücreler ( ) görülüyor (TUNEL x400)

88 Resim 4.4. DMSO uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait resimde tutulum gösteren hücreler ( ), tutulum göstermeyen hücreler ( ), çekirdek ( ), çekirdekçik ( ) ve sitoplazma ( ) izleniyor (TUNEL x1000) 71

89 72 Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait resimde tutulum gösteren hücreler ( ), tutulum göstermeyen hücreler ( ) ve az pozitif tepkime gösteren hücreler ( ) görülüyor (TUNEL x400)

90 73 Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait resimde tutulum gösteren hücreler ( ), tutulum göstermeyen hücreler ( ),az pozitif tepkime gösteren hücreler ( ), çekirdek ( ), çekirdekçik ( ) ve sitoplazma ( ) izleniyor (TUNEL x1000)

91 74 Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait resimde tutulum gösteren hücreler ( ) görülüyor (TUNEL x400)

92 Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait resimde çekirdekçik ( ), çekirdek zarında ondülasyon ( ) ve kromatin yapısı bozulan çekirdek (+) ve sitoplazma ( ) izleniyor (TUNEL x1000) 75

93 76 Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait resimde tutulum gösteren hücreler ( ) ve tutulum göstermeyen hücreler ( ) görülüyor (TUNEL x400)

94 Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait resimde tutulum gösteren hücreler ( ), tutulum göstermeyen hücreler ( ), az pozitif tepkime gösteren hücreler ( ), çekirdek ( ), çekirdek zarında ondülasyon ( ), çekirdekçik ( ) ve sitoplazma ( ) izleniyor (TUNEL x1000) 77

95 78 Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait resimde tutulum gösteren hücreler ( ) ve apoptotik cisimcikler halini almış çekirdek parçaları ( ) görülüyor (TUNEL x400)

96 Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattına ait resimde çekirdekçik ( ), çekirdek ( ) ve lobülasyon göstermeye başlayan çekirdekler ( ) ve sitoplazma ( ) izleniyor (TUNEL x1000) 79

97 80 Resim Kontrol OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ) ve sitoplazmada tutulum gösteren hücreler ( ) görülüyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)

98 Resim Kontrol OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ) izleniyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) 81

99 82 Resim DMSO uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ) ve sitoplazmada tutulum gösteren hücreler ( ) görülüyor (İmmünperoksidaz- Hematoksilen x400)

100 Resim DMSO uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ) ile sitoplazmalarında da tutulum gösteren hücreler ( ) ayırdediliyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) 83

101 84 Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ) ve sitoplazmada tutulum gösteren hücreler ( ) görülüyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)

102 Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ) ve sitoplazmada tutulum gösteren hücreler ( ) izleniyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) 85

103 86 Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ) ve sitoplazmada tutulum gösteren hücreler ( ) görülüyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)

104 Resim μm 5-FU uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ) ve sitoplazmada tutulum gösteren hücreler ( ) izleniyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) 87

105 88 Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ) ve sitoplazmada tutulum gösteren hücreler ( ) görülüyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)

106 Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ) ve sitoplazmada tutulum gösteren hücreler ( ) izleniyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) 89

107 90 Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde hücre zarlarında belirgin tutulum gösteren hücreler ( ), sitoplazmada tutulum gösteren hücreler ( ) ve tutulum göstermeyen hücreler ( ) görülüyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)

108 Resim μm niklozamid uygulanan OVCAR-3 hücre hattında β-katenin immün boyamasına ait resimde tutulum göstermeyen hücreler ( ), sitoplazmada tutulum gösteren hücreler ( ) izleniyor (İmmünperoksidaz-Hematoksilen x1000) 91

109 92 Şekil 4.1. Niklozamid in OVCAR-3 hücreleri üzerine sitotoksik etkisinin MTT yöntemi ile değerlendirilmesi, (*) işareti kontrole göre anlamlı farklılıkları göstermektedir (p 0.001)

110 Şekil FU nun OVCAR-3 hücreleri üzerine sitotoksik etkisinin MTT yöntemi ile değerlendirilmesi, (*) işareti kontrole göre anlamlı farklılıkları göstermektedir (p 0.001) 93

111 Topam hücre sayısı 94 TUNEL-Pozitif Hücre Sayısı Kontrol DMSO 10 μm 5-FU 20 μm 5-FU 1 μm Niklozamid 2 μm Niklozamid Toplam Hücre Sayısı TUNEL-Pozitif Hücre Sayısı Şekil 4.3. Gruplar arasında TUNEL-pozitif hücrelerin karşılaştırılması Çizelge 4.1. Gruplar arasında TUNEL-pozitif hücrelerin istatistiksel olarak karşılaştırılması Gruplar z p Anlamlılık Kontrol & DMSO 0,3858 0,700 p > 0.05 Kontrol & 10μM 5-FU 6,6395 0,000 p < Kontrol & 20μM 5-FU 10,3491 0,000 p < Kontrol & 1μM Niklozamid 4,2809 0,000 p < Kontrol & 2μM Niklozamid 7,1634 0,000 p < DMSO & 10μM 5-FU 6,9587 0,000 p < DMSO & 20μM 5-FU 10,6199 0,000 p < DMSO & 1μM Niklozamid 4,6291 0,000 p < DMSO & 2μM Niklozamid 7,476 0,000 p < μM 5-FU & 20μM 5-FU 4,5028 0,000 p < μM 5-FU & 1μM Niklozamid 2,5538 0,011 p < μM 5-FU & 2μM Niklozamid 0,593 0,553 p > μM 5-FU & 1μM Niklozamid 6,7937 0,000 p < μM 5-FU & 2μM Niklozamid 3,9588 0,000 p < μM Niklozamid & 2μM Niklozamid 3,1339 0,002 p < 0.05

112 Ortalama yoğunluk ,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 β-katenin İmmunreaktivitesi KONTROL DMSO 10 μm 5-FU 20 μm 5-FU 1 μm Niklozamid 2 μm Niklozamid 1.ALAN ALAN ALAN ALAN ALAN ALAN Şekil 4.4. İmmunreaktivite gösteren hücrelerdeki β-katenin tutulumu yoğunluğu 6 5,5 5 4,5 β-katenin İmmunreaktivitesi 4 3,5 * 3 2,5 2 1,5 * 1 0,5 0 KONTROL DMSO 10 μm 5-FU 20 μm 5-FU 1 μm Niklozamid 2 μm Niklozamid Şekil 4.5. Gruplar arasında β-katenin immunreaktivitesinin karşılaştırılması (p < 0.001)

113 96 Çizelge 4.2. β-katenin tutulumu gösteren OVCAR-3 hücrelerinin ortalama ve standart sapma değerleri Grup Kontrol DMSO 10 μm 5-FU 20 μm 5-FU 1 μm Niklozamid 2 μm Niklozamid 4,5 ± 4,5 ± 4,0 ± 4,0 ± 2,5 ± 1,0 ± x Ss 0,84 0,84 0,89 0,89 1,05 0,63

114 97 5. TARTIŞMA Niklozamid, insanların yaklaşık 50 yıldır kullanmakta olduğu, antihelmintik ilaçlar sınıfında, özellikle bağırsak kurtlarına karşı etkili bir tenyasittir. Mitokondriyonda oksidatif fosforilasyonu baskılayarak ve ATP aktivitesini uyararak tenyaların ölmesini sağlar. Niklozamid insanlarda iyi tolere edilebilir özellikte bir ilaçtır. Yetişkinlerde 2 gr lık tek bir oral doz ya da 7 gün süresince 2gr/gün kullanılarak çeşitli bağırsak paraziti enfeksiyonlarının tedavisinde etki gösterir [162, 163]. İlaç geliştirme, oldukça maliyetli ve uzun bir süreçtir. Farmakokinetik özellikleri, güvenilirlikleri bilindiği ve insanlarda kullanımları önceden onaylanmış olduğundan, eski ya da başarısız ilaçlar için yeni kullanım alanlarının bulunması, yeni ilaç bulmaktan hem daha hızlı hem de daha ekonomiktir [164]. Son 6 yıl içerisinde yapılan yüksek-verimlilikte görüntüleme çalışmalarıyla niklozamid in potansiyel bir anti-kanser ajanı olduğu saptanmıştır. Birbirinden bağımsız araştırmalarda niklozamid in kanser hücrelerinde Wnt/β-katenin, mtorc1, STAT3, NFκB ve Notch sinyal yolaklarını baskıladığı, mitokondriyonları hedef alarak hücre döngüsünün duraksamasını sağladığı, hücre çoğalmasını engellediği ve apoptozisi uyardığı belirlenmiştir. Niklozmid in in vitro ve in vivo ortamda anti-kanser aktivitelerinin gösterildiği çok sayıda çalışma yapılmıştır [165]. Biz de yapmış olduğumuz kaynak taramaları ışığında, OVCAR-3 hücre hattı üzerinde gerek apoptotik gerekse çoğalmayı engelleyici özelliklerini araştırabilmek ereği ile antikanser ajan olduğu tanımlanan niklozamid uygulaması gerçekleştirdik. Wang ve arkadaşları (2009), hücre-temelli lusiferaz haberci deneyi yardımıyla eritrolösemi hücrelerinde (K562) endojen CBF1-bağımlı Notch sinyal yolağını düzenleyen ilaçları görüntülemişlerdir. Niklozamid CBF1-bağımlı haberci genini doz ve zamana bağımlı bir şekilde baskılamıştır. RT-PCR analizleri, bu ilacın K562 hücrelerinde endojen Notch sinyalini düzenlediklerini, Notch1 reseptörleri ve Notch hedef genlerinin mrna ifadelenme düzeylerini etkilediklerini göstermiştir. Benzidin boyaması sonucunda K562 hücrelerinde niklozamid in eritrosit farklılaşmasını arttırdığı saptanmıştır. Flow sitometri ile 24 saat süresince 1,25 μm niklozamid uygulamasından sonra S fazındaki hücre sayısının arttığı belirlenmiştir [166].

115 98 Balgi ve arkadaşları 2009 yılında yaptıkları çalışmada hücre temelli bir deney kullanarak 3584 farmakolojik olarak aktif kimyasal ve onaylı ilacı değerlendirmiş, niklozamid in otofagozom içeriğini arttırma yeteneğinin yüksek olduğunu belirlemişlerdir. MTT, Flow sitometri, SDS-PAGE ve Western Blot deneyleri sonucunda niklozamid in besinden zengin koşullarda, MCF-7 meme kanseri hücrelerinde 1 μm dozda otofajiyi uyardığı, mtorc1 (rapamisin kompleksinin memelilerdeki hedefi 1) sinyallerini belirgin bir şekilde azalttığı, 3 μm dozda ise sinyalleri tümüyle baskıladığı bulunmuştur. Uygulamadan 5 dakika gibi kısa bir süre sonra mtorc1 sinyallerinde kısmi bir baskılanma gerçekleşirken 2 saat sonunda tam bir baskılanma oluştuğu görülmüştür [167]. Akut miyeloid lösemi kök hücrelerine niklozamid in etkisinin araştırıldığı çalışmada, hastalardan alınan primer hücreler ve lösemi hücre hatlarında niklozamid in NFκB aktivitesini doz ve zamana bağımlı bir şekilde baskıladığı gösterilmiştir. NFκB transkripsiyonu ve DNA ya bağlanması niklozamid ile belirgin biçimde engellenmiştir. Oldukça düşük (nm) dozlardaki niklozamid, primer blast hücrelerinde ve hücre hatlarında canlı klonojenik hücre sayısını azaltmıştır. Niklozamid, akut miyeloid lösemi ksenograftlarında ve farklı hücre hatlarında kematörapötik ajanlarla sinerjistik etki göstererek hücre çoğalmasını baskılamıştır. Ayrıca primer hücrelerde ve progenitör/kök hücrelerde ROS üretimine neden olarak apoptozisi uyarmış ve mitokondriyal hasara neden olmuştur [27]. Wang ve arkadaşları (2013) tarafından yapılan çalışmada meme kanseri hücrelerinde (MCF7 ve MDA-MB-231) flow sitometri yardımıyla yan popülasyon sferleri analiz edilerek, bu hücreler farelere verilmiş ve deneklerde tümör oluşturulmuştur. Yüksek verimlilikte ilaç görüntüleme testi ile tümörsfer oluşumunu baskılayan moleküller incelendiğinde, 3 μm niklozamid in MCF7 SPS hücrelerinde sferoid alanını %60 oranında azalttığı belirlenmiştir. 72 saat süresince niklozamid uygulanan MCF7 yan popülasyon hücreleri ile gerçekleştirilen flow sitometri analizlerinde niklozamid in bu hücrelerde apoptozise neden olduğu gözlenmiştir. Hayvan ksenograftlarına intraperitoneal enjeksiyon ile 8 hafta süresince 10 mg/kg/gün niklozamid uygulaması sonucu tümör gelişiminde baskılanma ve tümör büyüklüğünde azalma oluşmuştur. Meme kanseri kök hücrelerinde Wnt, Notch ve Hedgehog sinyal yolaklarına ait hedef genlerin mrna ları RT-PCR ile incelendiğinde niklozamid in bu yolakları belirgin bir şekilde baskıladığı bulunmuştur [168].

116 99 Yeni STAT3 baskılayıcılarını tanımlamak ereğiyle yaptıkları çalışmada Ren ve arkadaşları (2010), lusiferaz haberci testini kullanılarak 1500 ilaç türevini değerlendirilmişlerdir. Test edilen ilaçlar arasından niklozamid in en güçlü STAT3 baskılayıcısı olduğunu bulmuşlardır. 5 μm niklozamid ile 24 saat inkübe edilen HeLa epitelyal karsinoma hücrelerinde STAT3 ün transkripsiyonel aktivitesi belirgin biçimde baskılanmıştır. EMSA analizleri, Du145 prostat kanseri hücrelerinde niklozamid uygulamasının STAT3 aktivasyonunu engellediğini göstermiştir. Western blot analizi sonucunda niklozamid in STAT3 proteininin transkripsiyonunu baskıladığı saptanmıştır. Niklozamid in antiproliferasyon aktivitesi incelendiğinde, ilacın 0,7 μm dozda hücre çoğalmasını, 1 μm dozda ise koloni oluşumunu baskıladığı gözlenmiştir. Yapılan flow sitometrik analizler, niklozamid in Du145 kanser hücrelerinin G0/G1 fazında durdurulmasına ve apoptozise neden olduğunu göstermiştir [33]. Multiple miyeloma tedavisinde kullanılmak için 100 adet patentli ilacın görüntülendiği, Khanim ve arkadaşları tarafından 2011 yılında yapılan çalışmada, niklozamid in Multiple miyeloma hücre hatları ve kemik iliği örneklerinde 1 μm dozda güçlü bir anti-proliferatif etkiye sahip olduğu bulunmuştur. Flow sitometri ile niklozamid uygulamasının Multiple miyeloma hücrelerinde apoptozisi uyardığı, Western blot analizleri ile de otofajiyi desteklediği görülmüştür. 18 saat süresince 1 μm niklozamid uygulamasının hücre içi serbest hafif zincir protein düzeyini anlamlı şekilde azalttığı gözlenmiştir. Niklozamid hücrelerde mitokondriyal membran potansiyeli yitimine ve oksidatif fosforilasyonun bozulmasına neden olmuştur. İlacın hücrelerde doz ve zamana bağımlı bir şekilde mitokondriyal süperoksit üretimine neden olarak sitotoksisiteye yol açtığı belirlenmiştir. Western blot analizleri niklozamid in aynı zamanda STAT3 ve NFκB aktivitesini baskılama yoluyla da hücre ölümünü uyardığı ortaya koymuştur [30]. Ovaryum kanseri hücrelerine niklozamid in sitotoksik etkileri incelediğimiz çalışmamızda niklozamid in en uygun dozunun belirlenebilmesi ereği ile MTT testi kullanıldı. Artan dozlarda uygulanan niklozamid in doz ve zamana bağlı olarak sitotoksik etki gösterdiği belirlendi. Niklozamid 48 saatlik inkübasyon süresi sonunda 2 µm gibi düşük bir dozda hücre çoğalmasını anlamlı bir şekilde baskıladığı, bu ilacın OVCAR-3 hücreleri üzerinde kuvvetli bir sitotoksik etkiye sahip olduğu belirlendi.

117 yılında yayınladıkları çalışmada Wieland ve arkadaşları, 160 adet sentetik ve doğal toksik maddeyi inceleyerek niklozamid in bunlar arasında insan glioblastoma hücrelerine karşı oldukça etkili olduğunu belirlemişlerdir. Glioblastoma hastalarından alınan 21 adet insan primer glioblastoma dokusundan izole edilen hücrelerde niklozamid in IC50 değerinin 300 nmol/l ile 1,2 nmol/ml arasında değiştiği, test edilen 5 insan glioblastoma hücre hattında ise bu değerin 2,4-4,2 kat daha yüksek olduğu bulunmuştur. Çalışmada niklozamid in hücre döngüsü ve göç yeteneği üzerine baskılayıcı aktivitesini belirlemek için Flow sitometri kullanılmış ve tek doz ilaç uygulamasının primer glioblastoma hücrelerinde siklin D1 ifadelenmesini baskılayarak hücrelerin saat süresince geçici olarak G1 fazında tutuklanmalarına neden olduğu ve subtoksik dozlardaki niklozamid in hücrelerin göç etme yeteneklerini baskıladığı gözlenmiştir. Tek doz ilaç uygulamasından 5 gün sonra yapılan Western blot ve RT-PCR analizleri ile niklozamid in hücrelerde Notch, mtorc ve Wnt/β-katenin sinyal yolaklarını doza bağımlı bir şekilde baskıladığı gösterilmiştir. İmmunohistokimyasal yöntemle 1,5 μm niklozamid uygulamasından 2 gün sonra hücrelerde β-katenin pozitif hücre sayısında anlamlı bir azalma olduğu belirlenmiştir [24]. Sack ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada (2011) niklozamid in test edilen 1280 farmakolojik olarak aktif bileşik arasından kolon kanserinde metastazın engellenmesine yönelik en etkili bileşik olduğu belirlenmiştir. İnsan kolon kanseri hücrelerine 1 μm niklozamid uygulanarak, metastaz oluşumunda işlev gören önemli bir protein olan S100 kalsiyum bağlanma proteini A4 (S100A4) mrna ve protein ifadelenmesine etkisi kantitatif ters transkripsiyon PCR ve immunoblot deneyleri yardımıyla incelenmiştir. Niklozamid in in vitro ortamda insan kolon kanseri hücrelerinde S100A4 mrna ve protein ifadelenmesini azalttığı, bununla birlikte hücre göçü, yayılması, çoğalması ve koloni oluşumunu baskıladığı gözlenmiştir. Ayrıca yapılan in vivo incelemede, niklozamid uygulanan farelerde karaciğer metastazının kontrollere karşın anlamlı biçimde azaldığı ve yaşam süresinin uzadığı belirlenmiştir [37]. Ye ve arkadaşları 2014 te yayınladıkları çalışmada meme kanserine karşı niklozamid in etkisini in vitro ve in vivo olarak incelemişlerdir. MTT yöntemiyle niklozamid in fare (4T1) ve insan meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231) üzerine sitotoksik etkisi ölçülmüş ve ilacın kanser hücrelerinin çoğalmasını doz ve zamana bağımlı olarak baskıladığı belirlenmiştir. 4T1 hücrelerinde niklozamid uygulamasından sonra koloni oluşumu doza

118 101 bağlı şekilde azalmış ayrıca koloni boyutları küçülmüştür. Hoechst boyama ve Flow sitometri ile 4T1 hücrelerindeki apoptozis incelenmiş ve ilaç uygulamasından 24 saat sonra apoptozisin doza bağımlı olarak uyarıldığı görülmüştür. Western blot ile Bcl-2, Mcl-1, survivin ifadelerinin anlamlı bir şekilde azaldığı, kaspaz-3 ifadesinin ise arttığı saptanmıştır. Niklozamid uygulanan 4T1 ve MDA-MB-231 hücrelerinde gruplarda göç ve invazyon yapan hücre sayısında azalma olduğu belirlenmiştir. 4T1 hücreleri verilen farelerde 20 mg/kg/gün niklozamid uygulamasının akciğere metastaz yapan hücre sayısını düşürdüğü görülmüştür. Yapılan histolojik analizler niklozamid uygulanan hayvanlarda alan başına düşen mikrometastatik nodül sayısının diğer gruplara karşın anlamlı bir şekilde az olduğunu göstermiştir. IHC analizleri niklozamid uygulamasının Ki-67 pozitif hücre sayısını azalttığı ve kaspaz-3 pozitif hücre sayısını arttırdığını göstermiştir [169]. Çalışmamızda, MTT testi sonuçları doğrultusunda seçilen niklozamid dozlarının apoptozise etkisini saptayabilmek için TUNEL yöntemi kullanıldı. OVCAR-3 hücreleri 48 saat 1 μm niklozamid ile inkübe edildiklerinde az sayıda apoptotik hücre gözlenirken, 2 μm niklozamid uygulamasının bahsedilen diğer çalışmalarla tutarlı bir şekilde, kontrole göre TUNEL pozitif hücre sayısında anlamlı bir artışa neden olduğu belirlendi. 5-FU ile 48 saatlik inkübasyon sonucunda ise ilacın hem düşük (10 μm) hem yüksek dozda (20 μm) niklozamid den daha fazla hücreyi apoptozise götürdüğü tespit edildi. Lee ve arkadaşları (2014) tarafından yapılan çalışmada küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücre hattı H1299 un radyo-duyarlılığını arttıran 1040 bileşik incelenmiş ve radyasyon uygulamasından sonra uygulanan 2 μm niklozamid in hücre ölümünü arttırdığı belirlenmiştir. Radyo-duyarlılaştırma etkisinin nedeni araştırıldığında, ilacın kaspaz-3 ve PARP ayrılmasını arttırdığı saptanmıştır. FACS (floresan aktive hücre ayırma) analizleri ile de niklozamid in apoptotik hücre ölümünü arttırdığı doğrulanmıştır. İyonize radyasyondan (IR) 2 saat önce uygulanan niklozamid in apoptozisin tetiklenmesi yönünden tek başına IR ya da tek başına niklozamid e karşın 2 kat daha etkili olduğu saptanmıştır. Niklozamid H2O2 ile birlikte uygulandığında da apoptozisin yalnız uygulamaya kıyasla arttığı belirlenmiştir. Ayrıca IR ya da H2O2 varlığında niklozamid in c-jun u aktive etme yeteneğinde de bir artış olduğu izlenmiştir [39].

119 yılında You ve arkadaşlarının yayınladığı çalışmada radyo-dirençli akciğer kanserine karşı niklozamid in etkisi araştırılmıştır. İnsan akciğer kanseri (A549, H358, H157 ve H292) hücrelerine IR uygulanması sonucu immunofloresan boyama yöntemi ile JAK2 ve STAT3 ifadesinin doz ve zamana bağımlı olarak arttığı gözlenmiştir. Kanser hücreleri radyo-duyarlı hale getirildiğinde JAK2, STAT3, Bcl2 ve Bcl-XL düzeylerinin arttığı, 24 saat süresince 1 μm niklozamid uygulandıktan sonra bu proteinlerin ifadesinin baskılandığı belirlenmiştir. Radyo-dirençli hücrelere artan dozlarda (0,2-2 μm) niklozamid uygulandığında STAT3 aktivitesinin baskılandığı gözlenmiştir. Niklozamid in radyoduyarlı ve radyo-dirençli hücrelerde G0/G1 evresindeki hücre sayısını arttırdığı izlenmiştir. Fare ksenograftlarına 21 gün süresince 2 gy/hafta IR ve 30 mg/kg/gün niklozamid uygulamasından sonra yapılan Western blot analizlerinde niklozamid in radyo-duyarlı ve dirençli dokularda STAT3/Bcl2/Bcl-XL yolağını baskıladığı görülmüştür. Hematoksileneozin boyama yöntemi ile yapılan incelemelerde 21 gün süresince 30/mg/kg/gün niklozamid uygulamasının akciğer kanseri dokularına karşı toksik etki göstermediği gözlemlenmiştir [170]. Li ve arkadaşları (2013) küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde yaygın kullanılan bir ilaç olan erlotinib e karşı kazanılan direncin yok edilmesinde niklozamid in etkisini araştırmışlardır. Erlotinib e dirençli hale getirilmiş HC827 hücrelerine 48 süresince niklozamid (0,1-2 μm/l) uygulandığında, STAT3 sinyal yolağının baskılanmasıyla erlotinib direncinin ortadan kalktığı görülmüştür. Benzer şekilde fare ksenograftları ile yapılan in vivo çalışmada 32 gün süresince uygulanan 20 mg/kg/gün niklozamid, akciğer tümörlerindeki erlotinib direncini anlamlı olarak azaltmıştır. Kantitatif ters transkripsiyon PCR ve Western blot analizleri niklozamid in bu etkiyi STAT3 sinyal yolağını baskılayarak gerçekleştirdiğini ortaya koymuştur [34]. Li ve arkadaşlarının 2013 yılında yayınladıkları çalışmada, baş ve boyun kanserine karşı niklozamid in erlotinib ile birlikte etkisi incelenmiştir. İnsan baş ve boyun kanseri hücrelerine (Tu202 ve Tu686) 0,1 μm erlotinib uygulandığında EGFR baskılanırken STAT3 yolağının aktive olduğu gösterilmiştir. Hücrelerde STAT3 yolağı susturulduğunda, erlotinibin kanser hücrelerine karşı etkinliğinin arttığı izlenmiştir. Western blot analizleri artan dozlarda niklozamid uygulamasının erlotinib tarafından uyarılan STAT3 fosforilasyonunu baskıladığını ve doza bağımlı bir şekilde Bcl2/Bcl-XL ifadelenmesini azalttığını göstermiştir. Baş ve boyun kanseri hayvan ksenograftlarında 2 hafta süresince

120 mg/kg/gün erlotinib ve 20 mg/kg/gün niklozamid uygulamasının hayvanlarda herhangi bir yan etkiye neden olmadan sinerjistik etki göstererek tümör gelişimini baskıladığı ve bu iki ilacın tek bir ilaca karşın etkisinin daha fazla olduğu belirlenmiştir. İmmunohistokimyasal analizler ile tümör dokularındaki aktif kaspaz3 ifadelenmesi incelenmiş ve erlotinib ve niklozamid birlikte kullanıldığında aktif kaspaz3 pozitif hücrelerin arttığı ve apoptozisin uyarıldığı gözlenmiştir [171]. Liu ve arkadaşları tarafından 2014 yılında yayınlanan çalışmada niklozamid in kastrasyona dirençli prostat kanserine olan etkisi araştırılmıştır. HEK293 ve AR-V7 ifade ettiği bilinen CWR22Rv1 hücrelerinde 0,5 μm niklozamid in AR-V7 nin transkripsiyonel aktivitesini anlamlı olarak baskıladığı belirlenmiştir. Prostat kanseri hücrelerine (C4-2 ve CWR22Rv1) 48 saat süresince 0,5 μm niklozamid uygulandığında normal prostat epiteli hücrelerine karşın hücre çoğalmasının anlamlı bir şekilde engellendiği saptanmıştır. Kanser hücrelerinde niklozamid apoptozisi doza bağımlı olarak arttırmış ve koloni oluşturma yeteneğini azaltmıştır. Etkili bir anti-androjen olduğu bilinen enzalutamid e karşı dirençli hale getirilmiş C4-2B hücrelerine niklozamid uygulandığında da benzer sonuçlar alınarak hücre çoğalmasının ve koloni oluşturma yeteneğinin baskılandığı görülmüştür. Hücrelere niklozamid ve enzalutamid birlikte uygulandığında, bu iki ilacın sinerjistik etki göstererek tek bir ilaca karşın hücre gelişimini daha etkili bir biçimde baskıladığı belirlenmiştir. Fare ksenograftlarında da bu iki ilaç sinerjistik etki göstererek tümör boyutunun küçülmesine neden olmuştur. Niklozamid ksenograftlarda enzalutamid e karşı kazanılan direncin ortadan kalkmasını sağlamıştır. IHC analizlerinde niklozamid ve enzalutamid birlikte uygulandıklarında Ki67 (hücre çoğalması belirteci) pozitif hücre sayısının tek bir ilaca karşın daha fazla olduğu saptanmıştır [172]. Wnt sinyal yolağı, hücrelerin çoğalması, canlılıklarının sürdürülmesi, göç etmeleri, kutuplaşmalarının sağlanması, kaderlerinin belirlenmesi ve kök hücrelerin kendini yenilemeleri gibi birçok farklı işlevin gerçekleştirilmesinde görev alır. Wnt ligandlarının miktarında ortaya çıkan düzensizlikler ya da Wnt sinyal dönüşümü için gerekli olan proteinlerin aktivitelerinde oluşan değişiklikler embriyonik gelişim sırasında çeşitli anomalilerin oluşmasına neden olur. Yetişkinlerde ise bu yolağın bozulması kanser gibi hastalıklarla ilişkilidir [18].

121 104 Farklı kanser türlerinde Wnt sinyal yolağı mutasyonlarına oldukça sık rastlanmaktadır. Bu da Wnt/β-katenin sinyalinin kanser gelişimi sürecindeki önemini ortaya koymaktadır. Birçok kanser türünde APC geninde kalıtsal mutasyonların bulunduğu belirlenmiştir. Wnt yolağına ait TCF4, CTNNB1 ve WTX (X kromozomu üzerindeki Wilms tümör geni) gibi diğer genlerde ortaya çıkan mutasyonlar da Wnt/β-katenin yolağının aktivitesinin artmasına neden olmaktadır [173, 174]. Wnt sinyal yolağına ait moleküllerin ifadelenme düzeyleri, kanser hastaları için tanısal birer belirteç olarak hizmet edebilir. Yapılan çalışmalarda, meme ve kolon kanserinin gelişiminde nüklear β-katenin miktarında artış ve buna bağlı olarak Wnt/β-katenin yolağının aktivitesindeki artışın bu kanserlerdeki kötü ilerleyiş ile bağlantılı olduğu görülmüştür [ ]. Wnt3a, Wnt5a ve Wnt7a gibi Wnt ligandlarının bazı kanser türlerinde kanser gelişimini arttırırken diğerlerinde bu tip bir etkiye sahip olmadığı belirlenmiştir. Wnt7a, ovaryum kanseri hücrelerinde β-katenin-bağımlı transkripsiyonu aktive etmekte iken [178], transkripsiyon üzerine etkisi çok azdır [179]. Deri kanseri hücrelerinde Wnt3a melanosit farklılaşması ile ilişkili genlerin aktivitesini arttırmakta ve hücre çoğalması ile ilgili olanların ifadesini azaltmaktadır [180]. Prostat kanserinde ise Wnt3a hücre çoğalması için önemli olan genlerin ifadelenmesini arttırmaktadır [181]. Wnt5a, ovaryum kanserinde tümör gelişimini baskılayarak β-katenin-bağımlı transkripsiyonun negatif bir düzenleyicisi olarak davranabilmektedir [182]. Birçok farklı insan tümöründe Wnt reseptörü olan Fzd7 nin ifadesi artarak kanser hücrelerinin çoğalmasını ve kanserin ilerlemesini destekler [183]. Fzd7 geninin susturulması meme kanserinde TCF-bağımlı transkripsiyonu azaltmış ve ksenograft tümör gelişimini baskılamış [184] ve hepatoselüler kanser hücrelerinin gelişimini engellemiştir [185]. ROR1 ve ROR2 reseptörleri de kanser hücrelerinin çoğalması ve tümör oluşumuna katkıda bulunmaktadır. In vitro ve in vivo ortamda ROR1 ifadesinin baskılanmasıyla mide, akciğer ve meme kanserinde tümör gelişiminin azaldığı [ ], ROR2 ifadesinin engellenmesiyle leiomyoma (düz kas kanseri) ve renal hücre kanseri ksenograftlarında tümör gelişiminin baskılandığı saptanmıştır [189, 190].

122 105 Wnt yolağının aktivitesi aynı zamanda reseptörleri sayesinde belirli Wnt ligandları ile yer değiştirebilen SFRP ve WIF1 gibi çeşitli salgı proteinlerince de düzenlenebilir. Bazı meme kanseri hücrelerinde SFRP düzeyinin artması gelişimi baskılarken [191] diğer hücrelerde tümör gelişimi üzerine etki etmemesi [192] kanser hücrelerinin SFRP duyarlılıkları yönünden farklı göstermektedir. WIF1 glioblastoma, serviks ve prostat kanseri hücre hatlarında β-katenin-bağımlı transkripsiyonu düzenleyerek hücre çoğalmasını baskılar [193, 194]. WIF proteinleri ve diğer Wnt antagonistleri β-katenin sinyallerini düzenlemenin yanında diğer sinyal yolakları üzerine de etki ederler. SFRP ve WIF1 lerin miktarı değiştirilerek kanser hücrelerinin çoğalmasının engellenebileceği varsayılmaktar [18]. Wnt sinyal yolağı, gelişmekte olan embriyo ve yetişkinlerde çeşitli multipotent progenitör hücrenin sürekliliğinin ve farklılaşmasının sağlanmasında görev almaktadır. Wnt/β-katenin sinyallerinin tümör-başlatıcı hücreler olarak isimlendirilen kanser hücresi alt popülasyonlarının sürekliliğinin sağlanması yoluyla kanserin ilerlemesine katkıda bulunduğu gösterilmiştir [195]. Farelerde tümör oluşturma yeteneğine sahip lösemi kök hücrelerinde nüklear β-katenin miktarının ve Wnt/β-katenin aktivitesinin oldukça yüksek olduğu bulunmuştur [196]. Wnt sinyal yolağı tümörü başlatmanın yanında tümör gelişiminin sürmesinde de görev alır. Bazı hücrelerde Wnt nin uyarılmasıyla hücresel yaşlanmanın engellendiği belirlenmiştir. Örneğin, fibroblastlarda endojen Wnt2 nin azalması, yaşlanma belirteçlerinin artmasına neden olurken, Wnt3a nın uyarılması ya da Wnt yolağının negatif bir düzenleyicisi olan GSK3β baskılanması yaşlanmayı geciktirir [197]. Benzer şekilde fare meme hücrelerinde Wnt1, kontak-inhibisyon ile uyarılan yaşlanmayı engeller ve tek katmanlı hücrelerden üç boyutlu yapıların oluşmasını destekler [198]. Farklı kanser tiplerinde tümör hücrelerinin çoğu kemoterapötik ilaçlar ya da diğer toksinlere etkin bırakıldıklarında canlılıklarını sürdürebilmek için Wnt tarafından uyarılmaya gereksinim duyarlar [ ]. Wnt/β-katenin sinyalleri, kanser tipine özgü bir şekilde hücrelerin göç etme yeteneğini arttırarak ya da azaltarak tümörün metastazında da görev alabilir. Wnt1 ve Wnt3a, kemik iliği kanseri hücrelerinin göçünü uyarmış [203], LRP5 ise Wnt/β-katenin sinyaline negatif etki ederek prostat kanseri hücrelerinin yayılmasını ve göçünü engellemiştir [204]. Çeşitli kanser türlerinde SFRP1 ve DKK1 gibi Wnt/β-katenin antagonistleri hücre hareketini

123 106 azaltarak Wnt/β-katenin sinyal yolağı tarafından uyarılan yayılma yeteneğini baskılamıştır [ ]. Fzd1 in primer tiroid ve tiroid kanseri hücrelerinde hücre yayılmasını azalttığı [208], Wnt2 nin ise özofageal kanser hücrelerinin göçünü yavaşlattığı görülmüştür [209]. Wnt yolağının negatif düzenleyicileri olan TCF1 ve TCF4, fare modelinde akciğer kanseri hücrelerinin metastaz yapma yeteneğini baskılamıştır [210]. Benzer şekilde hepatoselüler kanser ksenograftlarında β-katenin geninin susturulmasıyla pulmoner ve abdominal metastik lezyonların sıklığı azalmıştır [211]. Gelişim sırasında β-katenin-bağımsız Wnt sinyal yolakları, yönlendirilmiş hücre göçünü düzenleyerek embriyonun morfogenezinde önemli rol oynarlar. Bu yolaklar kanser hücrelerinin göçü ve yayılımında da benzer işlev yaparlar. Deri kanserinde Wnt5a, β- katenin-bağımsız sinyaller aracılığıyla in vitro ortamda kanser hücrelerinin yayılım yeteneğini arttırmıştır [212]. Prostat ve meme kanseri hücre hatlarında ise Wnt5a hücre göçünü ve yayılımını baskılamıştır [213, 214]. Wnt5a reseptörü ROR2 susturulduğunda, fare deri kanseri hücrelerinde akciğer metastazının sıklığı ve şiddeti azalmış [215] ve in vitro ortamda sarkoma hücrelerinin yayılımı baskılanmıştır [190, 216]. Wnt tarafından aktive edilen lusiferaz habercilerinin kullanıldığı birçok çalışmada Wnt sinyal yolağını baskılayan yeni moleküller tanımlanmıştır. Örneğin, sentetik kimyasal kütüphanelerinin görüntülenmesiyle Porkupin in (Wnt ligandlarını değiştiren membran bağımlı bir asetiltransferaz) aktivitesini baskılayan bir ilaç olan IWP tanımlanmıştır [217]. Yine aynı yöntem kullanılarak iki küçük molekül (XAV939 ve pirivinyum) bulunmuştur. XAV939 tankiraz ı baskılayarak Aksin kararlılığını arttırır. Pirivinyum ise kazein kinaz ı aktive ederek β-katenin fosforilasyonunu arttırır [154, 218]. Mutasyonlar ve Wnt yolağı proteinlerinin farklı ifadelenmesi nedeniyle Wnt sinyalleri aktive ya da inaktive olduklarında farklı kanser türlerinde farklı yanıtlar oluşabilmektedir. Bu nedenle Wnt sinyal yolağı bileşenlerini özgül olarak hedef alan küçük moleküllerin tanımlanması tedavi açısından önemlidir. APC ve Aksin1 genlerindeki mutasyonlar nedeniyle Wnt/β-katenin yolağının aşırı ifadelenmesi, olası moleküler hedefleri sınırlamaktadır. Çünkü hedef moleküllere gerek kalmaksızın mutasyonlar aracılığıyla yolak aktivasyonu gerçekleşmektedir. Bu zorluğun üstesinden gelebilmek için araştırmacılar TCF7L2 ve β-katenin arasındaki etkileşimi bozan moleküller tanımlayarak β-katenin-bağımlı transkripsiyonu baskılamışlardır [ ].

124 107 Wnt reseptörlerini hedef alan antikorlar yardımıyla da kanser hücrelerinde hücre gelişimi baskılanabilir ve apoptozis uyarılabilir. Örneğin, normal dokular yerine kolon kanseri ve hepatoselüler kanser hücrelerini hedef alan Fzd7 ye özgü antikorlar bu erekle kullanılabilir [185, 223]. Benzer şekilde LRP yi hedef alan antikorlar tümör hücrelerinin gelişimini engelleyebilir [224]. Wnt ligand ve reseptörlerini hedef alan antikorlar yanında Wnt-düzenleyici peptidlerin kullanımını öneren çalışmalar da bulunmaktadır. SFRP1 ya da SFRP1-türevli peptidler yardımıyla farelerde HCT116 ksenograft tümör oluşumu geciktirilmiş ve tümör hücrelerinde mitoz bölünme oranı azaltılmıştır [225]. Ksenograft meme tümörlerine SFRP1 proteininin uygulanması sonucu tümör gelişimi baskılanmıştır [207]. Wnt sinyal yolağının uyarılması ya da baskılanması tümör oluşumunun veya kanser ilerlemesinin denetim altına alınması için tek başına yeterli olmayabilir. Wnt sinyal yolağı kanser hücrelerinin normal çoğalmasını düzenlemenin yanında onları toksik maddelere karşı daha duyarlı ya da duyarsız hale getirebilir. Bu nedenle Wnt yolağı kombinasyon tedavilerinde elverişli bir hedef olarak da kullanılabilir. Çeşitli kanser türlerinde Wnt/βkatenin sinyal yolağının baskılanmasıyla kanser hücrelerinin kemoterapötik ajanlara karşı duyarlılığı arttırılmıştır. Örneğin, WIF1 prostat kanseri hücre hattı olan PC3 hücrelerinde paklitaksel ve etoposid e karşı duyarlılığı çoğaltmıştır [226]. DKK1, U87MG glioblastoma hücrelerinin DNA ya hasar veren ve mikrotübülleri hedef alan ilaçlar gibi çeşitli toksinlere karşı olan duyarlılığını arttırmıştır [227]. Bazı Wnt lerin ifade düzeylerinin artması da hücreleri kemoterapötik ilaçlara duyarlı hale getirebilir. Örneğin, Wnt5a SKOV3 ovaryum kanseri hücrelerini çeşitli ilaçlara karşı duyarlılaştırır [228]. Deri kanseri hücreleri Wnt/βkatenin yolağının uyarılmasıyla BRAF-MAPK sinyali baskılayıcılarına duyarlı hale gelir [229]. Seröz ovaryum kanserinde Wnt sinyal yolağının negatif bir düzenleyicisi olduğu bilinen Dickkopf-1 (DKK1) in tümör ilerlemesi ve yayılımına etkisinin incelendiği çalışma Wang ve Zhang tarafından 2011 de yayınlanmıştır. PCR ve Western blot analizleri yapılarak, 32 tümör dokusunda DKK1 mrna ve protein ifadesinin normal ovaryum doku örneklerine karşın belirgin bir şekilde yüksek olduğu bulunmuştur. 178 hasta örneğinde yapılan immunohistokimya (IHC) incelemeleri, DKK1 düzeyinin kanser evresi ile doğru orantılı

125 108 olduğunu göstermiştir. Fare ksenograftlarında yapılan deneylerde de DKK1 in tümör hücrelerinin gelişimini ve yayılımını uyardığı görülmüştür [230]. Ford ve arkadaşları (2014) tarafından yapılan çalışmada epitelyal ovaryum kanserinde Wnt5a ifadelenmesi ve bu proteinin β-katenin-bağımlı ve bağımsız Wnt sinyal yolaklarındaki aktive edici ya da baskılayıcı rolünün araştırılması amaçlanmıştır. 623 hastadan alınan tümör örneğinde gerçekleştirilen RT-PCR, Western blot ve IHC deneyleriyle epitelyal ovaryum kanserinin tüm alt tiplerinde (seröz, endometrioid, berrak hücreli ve müsinöz) Wnt5a ifadesinin sınırda ve benign kontrollere karşın daha yüksek olduğu bulunmuştur. İnsan ovaryum yüzey epitel hücrelerine rekombinant Wnt5a uygulandığında hücre adezyonunun azaldığı ve epitelyal-mezenşimal değişimin (EMT) arttığı gözlenmiştir. Ayrıca β-katenin-bağımlı Wnt sinyal yolağına ait moleküllerin ifadesinin baskılandığı, β-katenin-bağımsız Wnt yolağına ait molekül ifadesinin arttığı belirlenmiştir. Ovaryum kanseri hücrelerinde Wnt5a susturulduğunda ise mezenşimalepitelyal değişim (MET) gerçekleştiği saptanmıştır [231] yılında yayınladıkları çalışmada Bodnar ve arkadaşları IHC yöntemiyle ileri dereceli epitelyal ovaryum kanserinde (AEOC) E-kaderin, β-katenin ve WNT-1 ifadelerini araştırmışlardır. Bu şekilde de AEOC de bu proteinlerin prognostik ve belirleyici rolünü saptamak istemişlerdir. Bu proteinlerin ifade düzeyleri ile ilerlemesiz sağkalım ve genel sağkalım arasındaki ilişkiyi değerlendirmişlerdir. 46 ovaryum kanseri hastasından alınan örnekte yaptıkları incelemelerde E-kaderin, β-katenin ve WNT-1 in tümör dokularında şiddetli tutulum gösterdiğini belirlemişlerdir. Çok değişkenli analizlerde güçlü membranöz β-katenin ifadesinin ilerlemesiz sağkalım için elverişli bir belirteç olmadığını, ancak tek değişkenli analizlerde prognostik bir etken olduğunu gözlemlemişlerdir. Ayrıca güçlü membranöz β-katenin ifadesinin platinyum-bazlı kemoterapiye karşı gelişen direnç ile ilişkili olduğunu saptamışlardır [232] yılında Schmid ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada gerçek zamanlı-polimeraz zincir tepkimesi (RT-PCR) kullanılarak seröz ovaryum kanserinde Wnt yolağı incelenmiştir. Seröz ovaryum kanseri hastalarından alınan primer dokularda yolağın hedef genlerinden biri olan Aksin2 nin ifadesinin tüm örneklerde arttığı belirlenmiştir. Yine Wnt sinyal yolağının aktivitesindeki artışa bağlı olarak fibroblast büyüme faktörü 9 (FGF9) ifadesinin

126 109 de normal ovaryum yüzey epiteline karşın 1000-kattan daha fazla arttığı gözlenmiştir [233]. Bizim çalışmamızda da ovaryum kanseri hücrelerinde sitozolik β-katenin düzeyinin yüksek olduğu ve OVCAR-3 hücrelerine çeşitli çalışmalarda Wnt sinyal yolağını baskıladığı gösterilmiş bir ilaç olan niklozamid uygulandığında, bu hücrelerdeki sitozolik β-katenin ifadelenmesinin azaldığı belirlendi yılında yayınladıkları çalışmada Osada ve arkadaşları, insan kolorektal kanserlerinde niklozamid in etkisini araştırmışlardır. Araştırmacılar hücre çoğalmasını değerlendirmek için MTT testini kullanmışlar ve 2 μm niklozamid dozunun hücre hatlarında (HT29, HCT116, CaCO2 ve MCF-10A) anti-proliferatif etkiye sahip olduğunu bulmuşlardır. Kanser hücrelerinin farelere deri altı enjeksiyonu sonrasında 6 hafta süresince ağızdan gavaj yoluyla niklozamid uygulanmış ve ilacın farelerde herhangi bir yan etkiye yol açmadığı görülmüştür. Niklozamid, deneklerde tümör gelişimini hızla baskılamıştır. Hızlı gelişen tümörlerde gelişimin baskılanması için gerekli niklozamid dozu 200 mg/kg iken yavaş gelişen tümörlerde 100 mg/kg olarak belirlenmiştir. Lusiferaz haberci testi ile niklozamid in tümör hücrelerinde Wnt/β-katenin sinyal aktivitesini doza bağımlı bir şekilde baskıladığı gözlenmiştir. Western blot ve IHC analizlerinde, 3 hafta süresince 20 ya da 100 mg/kg/gün niklozamide etkin kalan farelerden alınan kolorektal kanser dokularında Dvl2 ve β-katenin ifadelenmesinin kontrollere karşın anlamlı olarak azalttığı izlenmiştir [28]. Çalışmamızda çeşitli kanserlerin tedavisinde kullanılmakta olan 5-FU nun OVCAR-3 hücreleri üzerine sitotoksik etkisi MTT testi yardımıyla incelendiğinde, bu ilacın 48 saatlik inkübasyon sonunda IC50 değerinin 20 μm olduğu bulundu. Niklozamid in hücre çoğalmasını etkin bir şekilde baskıladığı 2 μm lık IC50 değeri ile karşılaştırıldığında, bu dozun oldukça yüksek olduğu, ovaryum kanseri hücreleri üzerinde niklozamid e göre daha zayıf sitotoksik etkiye sahip olduğu dikkati çekti. Lu ve arkadaşları 2011 yılında yayınladıkları çalışmalarında insan prostat (PC-3, Du145) ve meme kanseri (MDA-MB-231, T47D) hücrelerinde niklozamid in Wnt sinyal yolağı üzerine etkilerini incelemişlerdir. Test edilen tüm kanser hücrelerinde ilaç 1 μm dan daha düşük dozlardaki IC50 değeri ile hücre çoğalmasını baskılamıştır. 24 saat süresince 1,2 μm

127 110 niklozamid uygulaması kanser hücrelerinde apoptotik DNA kırıklarının oluşmasını uyarmıştır. Araştırmacılar GST-E-kaderin bağlanma testini kullanarak niklozamid in sitozolik serbest β-katenin ve total hücresel β-katenin birikimini engellediğini göstermişlerdir. Gerçek zamanlı PCR ve Western blot analizleri ile niklozamid in Wnt koreseptörü olan endojen LRP6 ifadelenmesini anlamlı bir biçimde azaltarak Wnt/β-katenin sinyal yolağını baskıladığı belirlenmiştir [25]. Londoño ve arkadaşlarınca 2014 te yayınlanan çalışmada, bazal-benzeri meme kanserine (BLBC) karşı niklozamid in etkileri incelenmiştir. Yapışkan ve yapışkan olmayan kanser hücreleri için ATPlite testi ile hücresel toksisite değerleri belirlenmiş ve yapışkan olmayan hücrelerin niklozamid e karşı yapışkan hücrelerden daha duyarlı oldukları saptanmıştır. Lusiferaz haberci testi ile niklozamid uygulamasının BLBC hücrelerinde β-katenin miktarını azalttığı gözlenmiştir. BLBC hastalarından izole edilen tümör hücrelerine 48 saat süresince 1-8 μm niklozamid uygulaması bu hücrelerde belirgin bir sitotoksisiteye neden olmuştur. 24 saat süresince TRA-8 (TRAIL ölüm reseptörü 5 e özgü monoklonal bir antikor) uygulamasından sonra 24 saat niklozamid uygulamasının tümörsfer sayısını tek bir madde uygulamasına karşın daha kuvvetli bir şekilde azalttığı belirlenmiştir. 24 saat 0,25 ng/ml TRA-8 ve 48 saat 0,25 μm niklozamid uygulaması sonucu Wnt/β-katenin baskılanmasının arttığı gözlenmiştir. BLBC fare modelinde TRA-8 ve niklozamid in birlikte uygulaması tek bir ilaca karşın tümör gelişimini daha fazla baskılamıştır. Yapılan IHC ve Western blot analizleri bu tedavinin deneklerde STAT3, sitozolik β-katenin ve nüklear β-katenin ifadelerini azalttığını, kaspaz-3 ifadesini ise arttırdığını göstermiştir [234]. Ono ve arkadaşları (2014) niklozamid in leimyoma (düz kas tümörü) üzerine etkisini araştırmışlardır. 38 leimyoma hastası kadından izole edilen hücrelerine 3 gün süresince artan dozlarda niklozamid uygulanarak MTS deneyi ile oluşan sitotoksisite değerlendirildiğinde, ilacın tümör hücrelerinin çoğalmasını doza bağımlı olarak baskıladığı belirlenmiştir. Niklozamid in Wnt/β-katenin sinyal yolağına etkisini araştırmak için lusiferaz haberci deneyi yapılmış ve uygulama sonucunda yolak aktivitesinin anlamlı bir şekilde engellendiği görülmüştür. İmmmunofloresan yöntemiyle kanser hücrelerinde niklozamid uygulamasının β-katenin pozitif hücre sayısını belirgin olarak azalttığı saptanmıştır [235].

128 111 Yo ve arkadaşlarının 2012 yılında yayınladıkları çalışmada, niklozamid in in vitro ortamda sisplatin e karşı dirençli insan ovaryum kanseri hücreleri (CP70sps) ve ovaryum kanseri hastalarından izole edilen ovaryum kanseri başlatıcı hücrelerin (OTIC) gelişimini baskılama açısından, test edilen 1258 biyoaktif bileşik arasından düşük dozlarda en etkili ilaç olduğu belirlenmiştir. CP70sps hücreleri verilmiş farelere 10 mg/kg/gün dozda niklozamid uygulaması yapıldığında, ilacın ovaryumdaki OTIC gelişimini baskıladığı ve periton boşluğundaki OTIC gelişimini de kısmen engellediği gözlenmiştir. Yapılan genetik analizler ile niklozamid uygulamasından sonra tümör başlatıcı hücrelerde 2928 genin ifadelenmesinde değişiklikler oluştuğu saptanmıştır. Niklozamid in hücrelerde ROS miktarında %20 lik artışa neden olduğu ve artan ROS un mitokondriyal apoptozisi arttırdığı görülmüştür [40]. Ovaryum kanserinde niklozamid in Wnt/β-katenin sinyal yolağı üzerine etkilerinin incelendiği Arend ve arkadaşları (2014) tarafından yapılan çalışmada, 34 ovaryum kanseri hastasının tümör asitlerinden izole edilen tümör hücreleri kullanılmıştır. 0,1-5 μm niklozamid uygulandıktan sonra ATP-lite testi ile hücre canlılığı ölçülmüş ve ilacın hastaların 32 sinde belirgin bir toksisiteye neden olduğu izlenmiştir. Western blot analizleri ile Wnt/ β-katenin yolağı proteinlerinin ve hedef genlerinin (LRP6, Aksin2, Siklin D1, survivin ve sitozolik β-katenin) ifadelenme düzeylerinin niklozamid uygulaması ile azaldığı belirlenmiştir. Yapılan Flow sitometri ve IHC analizleri, asitlerdeki aldehit dehidrogenaz (ALDH) ve LRP6 pozitif hücrelerin solid tümörlere karşın daha fazla olduğunu göstermiştir. 24 saat süresince 8 μm niklozamid uygulamasından sonra ise H skorlarının anlamlı bir şekilde azaldığı izlenmiştir [41]. King ve arkadaşları (2014) tarafından yapılan çalışmada ovaryum kanserinde Wnt7A/βkatenin sinyal yolağını baskılama açısından niklozamid in test edilen 1280 farmakolojik olarak aktif bileşik arasından en etkili ilaç olduğu bulunmuştur. Yapılan PCR analizlerinde niklozamid in Wnt7A düzeyini doza bağımlı bir şekilde azalttığı gözlenmiştir. Ovaryum kanseri hücre hatlarında (OVCAR3, OVCAR5, SKOV3, A2780) yürütülen lusiferaz haberci deneyi ile yolak aktivitesinin niklozamid tarafından baskılandığı belirlenmiştir. Niklozamid uygulaması SKOV3 hücrelerinin sayısını doza bağımlı bir şekilde azaltmıştır. Western blot analizlerinde 10 μm niklozamid in aktif kazpaz-3 ve PARP miktarını arttırdığı saptanmıştır. Ovaryum kanseri fare ksenograftlarında IHC ile Ki67 ifadelenmesi incelenmiş ve niklozamid uygulamasının tümör hücrelerinin çoğalmasını baskıladığı

129 112 belirlenmiştir. Ayrıca TUNEL yöntemiyle doku örneklerinde apoptotik hücre sayısında anlamlı bir artış olduğu gözlemlenmiştir [236]. Biz de OVCAR-3 hücre hattı üzerinde 1 μm ve 2 μm niklozamid uygulamalarının ardından yaptığımız β-katenin immünositokimya deneyleri sonucunda özellikle 2 μm niklozamid uygulamasının hücrelerdeki β-katenin pozitif hücre sayısında azalma meydana getirdiğini ve yer yer hiç pozitif immünreaktvite göstermeyen hücrelerin bulunduğunu tespit ettik. 5-FU nun ise sitoplazmik β-katenin tutulumunda anlamlı bir değişiklik oluşturmadığı ve Wnt sinyal yolağı üzerine herhangi bir etkisinin olmadığını gördük.

130 SONUÇ Yapılan sitotoksisite değerlendirmelerinde niklozamid in OVCAR-3 hücrelerinin çoğalması üzerine 2 μm gibi düşük bir dozda etkili olduğu belirlendi. IC50 değeri 20 μm olarak belirlenen, kanser tedavisinde rutin olarak kullanılan 5-FU ya karşın bu dozun oldukça düşük olduğu görüldü. Niklozamid in MTT ile belirlenen dozlarda OVCAR-3 hücrelerinde apoptozisi uyardığı ancak bu etkinin 5-FU kadar kuvvetli olmadığı tespit edildi. Niklozamid in, OVCAR-3 hücrelerindeki etkisinin, tümör hücrelerinin çoğalmasını indükleyen Wnt/β-katenin sinyal yolağını baskılamak ve bu sayede hücre çoğalmasını engellemek biçiminde olduğu, 5-FU nun antitümoral etkisinin ise bu yolak üzerinden gerçekleşmediği belirlendi. Sonuç olarak, elde ettiğimiz tüm veriler değerlendirildiğinde, niklozamid in, düşük dozlarda etkin olup, apoptozisi uyarma ve daha etkin olarak da β-katenin bağımlı Wnt sinyal yolağını baskılayarak hücre çoğalmasını azaltma özellikleri sayesinde ovaryum kanseri tedavisinde günümüzde sıklıkla kullanılan ajanlara alternatif bir ilaç olabileceği kanısına varıldı.

131 114

132 115 KAYNAKLAR 1. Futreal, P.A., Kasprzyk, A., Birney, E., Mullikin, J. C. Wooster, R. and Stratton M. (2001). Cancer and genomics. Nature, 6822, Başara, B. B., Güler, C. Yentürk, G. K., Birge, B., Pulgat, E.ve Ekinci, M. B. (2013). T.C. Sağlık Bakanlığı Sağlık İstatı stı klerı Yıllığı 2012, Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Sağlık Araştırmaları Genel Müdürlüğü, Sağlık Bakanlığı Yayın No:917, ISBN: Casciato, D. A. and Lowitz, B. B. (2004). Klinik Onkoloji El Kitabı, (Çev. O. Manavoğlu). Ankara: Palme Yayıncılık. Ankara: Palme Yayıncılık. (Eserin orijinali 2001 de yayımlandı) Siegel, R., Ma, J., Zou, Z. and Jemal, A. (2014). Cancer Statistics. A Cancer Journal of Clinicians, 64, Kuzey, G. M. (2007). Temel Patoloji, Over ve Fallopian Tüp Hastalıkları Patolojisi (Birinci Baskı). İstanbul: Güneş Kitabevi, American Cancer Society. Cancer Facts & Figures Atlanta, Ga: American Cancer Society, Kaku, T., Ogawa, S., Kawano, Y., Ohishi, Y., Kobayashi, H., Hirakawa, T. and Nakano, H. (2003). Histological classification of ovarian cancer. Medical Electron Microscopy, 36, Williams, T. I., Toups, K. L., Saggese, D. A., Kalli, K. R., Cliby, W. A and Muddiman, D. C. (2007). Epithelial ovarian cancer: disease etiology, treatment, detection and investigational gene, metabolite and protein biomarkers. Journal of Proteome Research, 6, Tavassoli, F. A. and Deville, P. (2003). World Health Organization classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital tract. Lyon, PA: IARC Press, Rosai, J. (2012). Rosai and Ackerman s Surgical Pathology, Female reproductive system (Onuncu baskı). Missouri: Elseiver, Runnebaum, I. B. and Stickeler, E. (2001). Epidemiological and molecular aspects of ovarian cancer risk. Journal of Cancer Research Clinical Oncology, 127(2), Tammela, J. and Odunsi, K. (2004). Gene expression and prognostic significance in ovarian cancer. Minerva Ginecologica, 56, Jeremy, R. C. (2007). Molecular pathogenesis and therapotic targets in epithelial ovarian cancer. Journal of Cellular Biochemistry, 102:

133 Beksaç, M. S. (2006). Jinekoloji Üreme Endokrinolojisi & İnfertilite Jinekolojik Onkoloji (İkinci Baskı). Ankara: Akademisyen Kitabevi Harries, M. and Gore, M. (2002a). Part II: chemotherapy for epithelial ovarian cancer- treatment of recurrent disease. The Lancet Oncology, 3, Smolle, E., Taucher, V., Pichler, M., Petru, E., Lax, S. and Haybaeck, J. (2013). Targeting Signaling Pathways in Epithelial Ovarian Cancer. Inernational Journal of Molecular Sciences, 14, Kim, A., Ueda, Y., Naka, T. and Enomoto, T. (2012). Therapeutic strategies in epithelial ovarian cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 13, Anastas, J. N. and Moon, R. T. (2013). WNT signalling pathways as therapeutic targets in cancer. Nature Reviews Cancer, 13(1), Dubeau L. (2008). The cell of origin of ovarian epithelial tumours. The Lancet Oncology, 9, Arend, R. C., Londoño-Joshi, A. I., Straughn Jr., J. M. and Buchsbaum, D. J. (2013). The Wnt/à-catenin pathway in ovarian cancer: A review. Gynecologic Oncology, 131, Takebe, N., Harris, P. J., Warren, R. Q. and Ivy, S. P. (2011). Targeting cancer stem cells by inhibiting Wnt, Notch, and Hedgehog pathways. Nature Reviews Clinical Oncology, 8, Garin, J., Despeignes, J. and Billerau, M. (1964). Present treatment of taeniasis with niclosamide. Lyon Medical, 212, Fairweather, I. and Boray, J. C. (1999). Fasciolicides: efficacy, actions, resistance and its management. The Veterinary Journal, 158, Wieland, A., Trageser, D., Gogolok, S., Reinartz., R., Höfer, H., Keller, M., Leinhaas, A., Schelle, R., Normann, S., Klaas, L., Waha, A., Koch, P., Fimmers, R., Pietsch, T., Yachnis, A. T., Pincus, D. W., Steindler, D. A., Brüstle, O., Simon, M., Glas, M. and Scheffler, B. (2013). Anticancer Effects of Niclosamide in Human Glioblastoma, Clinical Cancer Research, 19(15), Lu, W., Lin, C., Roberts, M. J., Waud, W. R., Piazza, G. A., and Li, Y. (2011). Niclosamide suppresses cancer cell growth by inducing Wnt co-receptor LRP6 degradation and inhibiting the Wnt/beta-catenin pathway. PloS one, 6(12), e Merschjohann, K. and Steverding, D. (2008). In vitro trypanocidal activity of the anti- helminthic drug niclosamide. Experimental Parasitology, 118, Jin, Y., Lu, Z., Ding, K., Li, J., Du, X., Chen, C., Sun, X., Wu, Y., Zhou, J. and Pan, J. (2010). Antineoplastic mechanisms of niclosamide in acute myelogenous leukemia stem cells: inactivation of the NF-kappaB pathway and generation of reactive oxygen

134 117 species. Cancer Research, 70(6), Osada, T., Chen, M., Yang, X. Y., Spasojevic, I., Vandeusen, J. B., Hsu, D., Clary, B. M., Clay, T. M., Chen, W., Morse, M. A. and Lyerly, H. K. (2011). Antihelminth compound niclosamide downregulates Wnt signaling and elicits antitumor responses in tumors with activating APC mutations. Cancer Research, 71(12), Karin, M. (2006). Nuclear factor-κb in cancer development and progression. Nature, 441, Khanim, F. L., Merrick, B. A. M. E., Giles, H. V., Jankute, M., Jackson, J. B., Giles, L. J., Birtwistle, J., Bunce, C. M. and Drayson, M. T. (2011). Redeployment-based drug screening identifies the anti-helminthic niclosamide as anti-myeloma therapy that also reduces free light chain production. Blood Cancer Journal, 1(10), e Bowman, T., Garcia, R., Turkson, J. and Jove, R. (2000). STATs in oncogenesis. Oncogene, 19, Bhardwaj, A., Sethi, G., Vadhan-Raj, S., Bueso-Ramos, C., Takada, Y., Gaur, U. Nair, A. S., Shishodia, S. and Aggarwal, B. B. (2007). Resveratrol inhibits proliferation, induces apoptosis, and overcomes chemoresistance through downregulation of STAT3 and nuclear factor-kappab-regulated antiapoptotic and cell survival gene products in human multiple myeloma cells. Blood, 109, Ren, X., Duan, L., He, Q., Zhang, Z., Zhou, Y., Wu, D. and Ding, K. (2010). Identification of niclosamide as a new small-molecule inhibitor of the STAT3 signaling pathway. ACS Medicinal Chemistry Letters, 1(9), Li, R., Hu, Z., Sun, S. Y., Chen, Z. G., Owonikoko, T. K., Sica, G. L., Ramalingam, S. S., Curran, W. J., Khuri, F. R. and Deng, X. (2013a). Niclosamide overcomes acquired resistance to erlotinib through suppression of STAT3 in non small cell lung cancer. Molecular Cancer Therapeutics, 12(10), Boye, K. and Maelandsmo, G. M. (2010). S100A4 and metastasis: a small actor playing many roles. American Journal of Pathology, 176(2), Helfman, D. M., Kim, E. J., Lukanidin, E. and Grigorian, M. (2005). The metastasis associated protein S100A4: role in tumour progression and metastasis. British Journal of Cancer, 92(11), Sack, U., Walther, W., Scudiero, D., Selby, M., Kobelt, D., Lemm, M., Fichtner, I., Schlag, P. M., Shoemaker, R. H. and Stein, U. (2011). Novel effect of antihelminthic Niclosamide on S100A4-mediated metastatic progression in colon cancer. Journal of National Cancer Institute, 103(13), Trachootham, D., Alexandre, J. and Huang, P. (2009). Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms: a radical therapeutic approach? Nature Reviews Drug Discovery, 8,

135 Lee, S. L., Son, A. R., Ahn, J., and Song, J. Y. (2014). Niclosamide enhances ROSmediated cell death through c-jun activation. Biomedicine & Pharmacotherapy, 68(5), Yo, Y. T., Lin, Y. W., Wang, Y. C., Balch, C., Huang, R. L., Chan, M. W., Sytwu, H. K., Chen, C. K., Chang, C. C., Nephew, K. P., Huang, T., Yu, M. H. and Lai, H. C. (2012). Growth Inhibition of Ovarian Tumor Initiating Cells by Niclosamide. Molecular Cancer Therapeutics, 11(8), Arend, R. C., Londoño-Joshi, A. I., Samant, R. S., Li, Y., Conner, M., Hidalgo, B., Alvarez, R. D., Landen, C. N., Straughn, J. M. and Buchsbaum, D. J. (2014). Inhibition of Wnt/β-catenin pathway by niclosamide: A therapeutic target for ovarian cancer. Gynecologic oncology, 134(1), Moore, K. L. and Persaud, T. V. N. (2008). Klinik Yönleriyle İnsan Embriyolojisi. (Çev. H. Dalçık ve M. Yıldırım). İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd. Şti. (Eserin orijinali 2007 de yayımlandı) Moore, K. L. and Persaud, T. V. N. (2009). Embriyoloji ve Doğum Defektlerinin Temelleri, Biz Doğmadan Önce (Çev. S. Müftüoğlu, P. Atilla ve F. Kaymaz). Ankara: Güneş Tıp Kitabevleri. (Eserin orijinali 2007 de yayımlandı) Sadler, T. W. (2011). Langman Medikal Embriyoloji (Çev. A. C. Başaklar). Ankara: Palme Yayıncılık. (Eserin orijinali 2010 da yayımlandı) Schoenwolf, G. C. (2008). Larsen s Human Embryology (Dördüncü Baskı). New York, Edinburg: Churchill Livingstone, Elsevier Publishing, Seçkin, İ., Ertürkoğlu, A. Ş., Taşyürekli, M., Arda, O., Alkan F. ve Oktar, H. (2008). Embriyoloji Ders Kitabı (Birinci Baskı). İstanbul: İstanbul Üniversitesi Basım ve Yayınevi, Carlson, B. M. (2009). Human Embryology and Developmental Biology (Dördüncü Baskı). Philadelphia, PA: Mosby/Elsevier, Kierszenbaum, A. L. (2006). Histoloji ve Hücre Biyolojisi, Patolojiye Giriş (Çev. R. Demir). Ankara: Palme Yayıncılık. (Eserin orijinali 2002 de yayımlandı) Ross, M. H. and Pawlina, W. (2014). Histoloji, Konu Anlatımı ve Atlas (Çev. B. Baykal). Ankara: Palme Yayıncılık. (Eserin orijinali 2011 de yayımlandı), Ozan, H. (2004). Premium Ozan Anatomi (Üçüncü Baskı). İstanbul: Klinisyen Tıp Kitabevleri, Yıldırım, M. (2006). İnsan Anatomisi 2. Cilt (Birinci Baskı). İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd. Şti., Fritsch, H. and Kuehnel, W. (2013). İnsan Anatomisi Renkli Atlası 2. Cilt, (Çev. C. Kopuz). İstanbul: İstanbul Tıp Kitabevi. (Eserin orijinali 2007 de yayımlandı)

136 Gökmen, F. G. (2003). Sistematik Anatomi (Birinci Baskı). İzmir: Güven Kitabevi, Arıncı, K. ve Elhan, A. (2001). Anatomi 1. Cilt (Üçüncü Baskı). Ankara: Güneş Kitabevi Lmt., Hatipoğlu, M. T. ve Hatipoğlu, H. G. (2006). Yüksekokullar Anatomi Ders Kitabı (Birinci Baskı). Ankara: Selvi Yayınevi, Cumhur, M., Yener, N. ve Tuncel, M. (2001). Temel Anatomi (Birinci Baskı). Ankara: ODTÜ Geliştirme Vakfı Yayıncılık ve İletişim A.Ş., Schünke, M., Schulte, E. and Schumacher, U. (2009). Prometheus Anatomi Atlası 2. Cilt, (Çev. M. Yıldırım). İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd. Şti. (Eserin orijinali 2006 da yayımlandı), Standring, S. (2004). Gray s Anatomy: The Anatomical Basic of Clinical Practice (Otuzdokuzuncu Baskı). Philadelphia, PA: Elsevier, Erdoğan, D., Hatiboğlu, M. T., Görgün, M. ve Ilgaz, C. (2007). Özel Histoloji (İkinci Baskı). Ankara: Hatiboğlu Yayınevi, Gartner, L. P and Hiatt, J. L. (2007). Color Textbook of Histology (Üçüncü Baskı). Philadelphia, PA: Sounders, Elsevier, Ovalle, W. K. and Nahirney, P. C. (2009). Netter Temel Histoloji, (Çev. S. Müftüoğlu, F. Kaymaz ve P. Atilla). Ankara: Güneş Tıp Kitabevleri. (Eserin orijinali 2007 de yayımlandı), Widmaier, E. P., Raff, H. and Strang, K. T. (2014). Vander İnsan Fizyolojisi, (Çev. T. Özgünen), Ankara: Güneş Tıp Kitabevleri. (Eserin orijinali 2013 te yayımlandı), Ganong, W. F. (2011). Ganong un Tıbbi Fizyolojisi. (Çev. H. Gökbel). İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd. Şti. (Eserin orijinali 2009 da yayımlandı), Guyton, A. C. and Hall, J. A. (2007). Tıbbi Fizyoloji (Çev. B. Çağlayan Yeğen, H. Çavuşoğlu, İ. Alican ve Z. Aydın). İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd. Şti. (Eserin orijinali 2005 te yayımlandı), Preston, R. R. and Wilson, T. E. (2014). Lippincott Görsel Anlatımlı Çalışma Kitapları Fizyoloji (Çev. Ü. İşoğlu-Alkaç). İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri (Eserin orijinali 2012 de yayımlandı), Noyan, A. (2005). Yaşamda ve Hekimlikte Fizyoloji (On Beşinci Baskı). Ankara: Meteksan Anonim Şirketi, Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C. A., Krieger, M., Scott, M. P., Bretscher, A., Ploegh, H. and Matsudaira, P. (2011). Moleküler Hücre Biyolojisi (Çev. H. Geçkil, M. Özmen ve Ö. Yeşilada) Ankara: Palme Yayıncılık. (Eserin orijinali 2007 de

137 120 yayınlandı) Boyle, P. and Levin, B. (2008). World Cancer Report 2008, Section 3 Mechanisms of Carcinogenesis. IARC Publications, Cabadak, H. (2008). Hücre Sı klusu ve Kanser. ADÜ Tıp Fakültesi Dergisi, 9(3), Weinberg, R. A. (2013). The Biology of Cancer-Chapter 2: The Nature of Cancer (İkinci Baskı). New York: Garland Science, Cooper, M.G. ve Hausman, E.R. (2006). Hücre Moleküler Yaklaşım. (Çev. M. Sakızlı ve N. Atabey). İzmir: İzmir Tıp Kitabevi (Eserin orijinali 2004 te yayımlandı), Tonini T, Rossi F and Claudio PP. (2003). Molecular basis of angiogenesis and cancer. Oncogene, 22, Konukoğlu, D. ve Turhan, M. S. (2005). Anjı yogenezı n Temel Moleküler Mekanı zmalari ve Tümör Anjı yogenezı. Cerrahpaşa Tıp Dergisi, 36, Güllü, İ. H. ve Akalın, İ. (2005). Metastaz biyolojisi. Üroonkolojı Bültenı, 4, Weber, F.G. (2008). Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters, 270, Fidler, I. J. (2003). The pathogenesis of cancer metastasis: the seed and soil hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer, 3, Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L. and Condeelis, J. (2012). Directed cell invasion and migration during metastasis. Current Opinion in Cell Biology, 24, Rabbani, S. A. and Mazar, A. P. (2001). The role of the plasminogen activation system in angiogenesis and metastasis. Surgical Oncology Clinics of North America, 10(2), Yokuş, B. ve Ülker, D.Ü. (2012). Kanser Biyokimyası. Dicle Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Dergisi, 1(2), Hanahan, D. and Weinberg, R. A. (2011). Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell, 144, Bütüner, B. D. ve Katrancı, G. (2006). Mutasyon, DNA Hasarı, Onarım Mekanizmaları ve Kanserle İlişkisi. Ankara Eczacılık Fakültesi Dergisi, 35(2), Ashe, P. C. and Berry, M.D. (2003). Apoptotic signaling cascades. Neuro- Psychopharmacology ve Biological Psychiatry, 27,

138 Karp, G. (2004). Cell and Molecular Biology, (Beşinci Baskı). California: John Wiley & Sons, Inc., Kevin, H. (2007). Biology of cancer. Cancer Biology and Imaging Medicine, 36, Çelfe, K. (2010). Kanser Genetiği. Klinik Gelişim, Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Walter, P. (2007). Molecular Biology of The Cell (Beşinci Baskı). New York: Garland Science, Kapuy, O., He, E., Avilés, S., Uhlmann, F., Tyson, J. J. and Novák, B. (2009). System-level feedbacks control cell cycle progression. FEBS Letters, 583, Jordan, C. T. (2007). The leukemic stem cell. Best Practice & Research Clinical Haematology, 20(1), Tuna, M. (2009). Solid tümörlerde ve lösemilerde kanser kök hücreleri. Türk Onkoloji Dergisi, 24(1), Wu, X. Z. (2008). Origin of cancer stem cells: the role of self- renewal and differentiation. Annals of Surgical Oncology, 15(2), Mak, T. (2003). The E. Donnall Thomas Lecture-apoptosis: "this death that makes life live". Biology of Blood Marrow Transplant, 9, Akşit, H. ve Bildik, A. (2008). Apoptozis. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 19(1), İnci, A., Yıldırım, A., Yavuz, A. ve Düzlü, Ö. (2009). Bazı Protozoon Enfeksiyonlarda Apoptozis. Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 6(2), Altunkaynak, B. Z. ve Özbek, E. (2008). Programlanmış Hücre Ölümü: Apoptoz Nedir? Tıp Araştırmaları Dergisi: 6 (2), Güleş, Ö. ve Eren, Ü. (2008). Apoptozun Belirlenmesinde Kullanılan Yöntemler Yüzüncü Yıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 2, Jacobson, M. D., Weil, M. and Raff MC. (1997). Programmed cell death in animal development. Cell, 88, Marshall, J. C., Malam, Z. and Jia, S. (2007). Modulating neutrophil apoptosis. Novartis Foundation Symposia, 280, Gültekin, N., Karaoğlu, K. ve Küçükateş, E. (2008). Hücrede apoptoz ve sağkalım mekanizmalarının keşfedilmesi ve yeni potansiyel tedavi stratejileri. Türk Kardiyoloji Derneği Arşivi, 36(2),

139 Kosova, F. ve Arı, Z. (2011). Prostat kanseri ve apoptozis ilişkisi. Klinik ve Deneysel Araştırmalar Dergisi, 2(1), Ozawa, H., Keone, R. W. and Marcilla, A. E. (2002). Thetapeutic stragies targetting caspase inhibition following spinal cord injury in rats. Experimental Neurology, 177, Norberg, E., Orrenius, S. and Zhivotovsky, B. (2010). Mitochondrial regulation of cell death: processing of apoptosis-inducing factor (AIF). Biochemical and Biophysical Research Communication, 396, Akbulut, G. (2005). Yaşlanma sürecinde mide mukozasında kaspaz-3 enzim aktivitesi ve melatoninin etkisi. Doktora tezi, Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Fizyoloji A.D., Ankara Ricci, J. E., Gottlieb, R. A. and Gren, D. R. (2003). Caspase-mediated loss of mitochondrial function and generation of reactive oxygen species during apoptosis. The Journal of Cell Biology, 160, Elmore, S. (2007). Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology, 35(4), Yasuhara, S., Zhu, Y., Matsui, T., Tipirneni, N., Yasuhara, Y., Kaneki, M. and Martyn, J. J. (2003). Comparison of comet assay, electron microscopy, and flow cytometry for detection of apoptosis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 51(7), Brentnall, M., Rodriguez-Menocal, L., De Guevara, R. L., Cepero, E., and Boise, L. H. (2013). Caspase-9, caspase-3 and caspase-7 have distinct roles during intrinsic apoptosis. BMC cell biology, 14(1), Doğan, A. L. ve Güç, D. (2004). Sinyal iletim mekanizmaları ve kanser. Hacettepe Tıp Dergisi, 35, Öztürk, M. (2005) Apoptoz ve kanser. IX. Tıbbi Biyoloji Kongresi Bildiri kitabı K02 Manisa, K Chang, H. Y. and Yang. X. (2000). Proteases for cell suicide: function and regulation of caspases. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(4), Chowdhury, I., Tharakan, B. and Bhat, G. K. (2008). Caspases-An update, Comparative Biochemistry and Physiology, 151, Lowe, S. W. (2000). Apoptosis in cancer. Carcinogenesis, 21(3), Atasu, T ve Sahmay, S. (2001). Jinekoloji (İkinci Baskı). İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi, Landen, C. N., Birrer, M. J. and Sood, A. K. (2008). Early events in the pathogenesis of epithelial ovarian cancer. Journal of Clinical Oncology, 26(6),

140 Farley, J. (2008). Genomic analysis of epithelial ovarian cancer. Cell Research, 18, Whittemore, A. S., Balise, R. R., Pharoah, P. D., Dicioccio, R. A., Oakley-Girvan, I., Ramus, S. J., Daly, M., Usinowicz, M. B., Garlinghouse-Jones, K., Ponder, B. A., Busy, S., Senie, R., Andrulis, I., John, E., Hopper, J. L. and Piver, M. S. (2004). Oral contraceptive use and ovarian cancer risk among carriers of BRCA1 or BRCA2 mutations. British Journal of Cancer, 91(11), Partridge, E. E. and Barnes, M. N. (1999). Epithelial ovarian cancer: prevention, diagnosis and treatment. A Cancer Journal of Clinicians, 49, Benedet, J. L., Hacker, N. F. and Ngan, H. Y. S. (2000). Staging classifications and clinical practice guidelines of gynaecologic cancers. International Journal of Gynecology Obstetrics, 70, Haberal, A. (2004). Meme ve Over Kanserlerinde Genetik Tarama: Yalnız Araştırma Amaçlı mı Yoksa Rutin Tarama mı Olmalıdır? TJD Uzmanlık Sonrası Eğitim Dergisi, 6, Abraham, J. and Allegra, C. J. (2001). Bethesda Handbook of Clinical Oncology Ovarian Cancer (Altıncı Baskı). Lippincott Williams & Wilkins, Çiçek, N., Akyürek, C., Çelik, Ç. ve Haberal, A. (2004). Kadın hastalıkları ve Doğum Bilgisi, Epitelyal Over Kanserleri (İkinci Baskı). İstanbul: Güneş Kitabevi, Purdie, D. M., Bain, C. J., Siskind, V., Webb, P. M. and Green, A. C. (2003). Ovulation And Risk Of Epithelial Ovarian Cancer, International Journal of Cancer, 104, Rock, J. A. and Jones, H. W. (2008). Ovarian cancer: Etiology, Screening and Surgery. The Linde's Operative Gynecology (Onuncu Baskı). Lippincott Williams & Wilkins, So, W. K., Cheng, J. C., Poon, S. L. and Peter, C. K. (2008). Leung Gonadotropinreleasing hormone and ovarian cancer: a functional and mechanistic overview. FEBS Journal, 275, Gilks, C. B. and Prat, J. (2009). Ovarian carcinoma pathology and genetics: recent advances. Human Pathology, 40, Fountain, J., Trimble, E. and Birrer, M. J. (2006). Summary and discussion of session recommendations. Gynecologic Oncology, 103, S23 S Soslow, R. A. (2008). Histologic Subtypes of Ovarian Carcinoma: An Overview. International Journal of Gynecological Pathology, 27, Seidman, J. D., Horkayne-Szakaly, I., Haiba, M., Boice, C. R., Kurman, R. J. and Ronett, B. M. (2004). The histologic type and stage distribution of ovarian

141 124 carcinomas of surface epithelial origin. International Journal of Gynecological Pathology, 23, Castro, I. M., Conell, P. P., Waggoner, S., Rotmensch, J. and Mundt, A. J. (2000). Synchronous ovarian and endometrial malignancies. American Journal of Clinical Oncology, 23, Ayhan, A. ve Başaran M. (2002). Jinekolojik Onkoloji, Epitelyal over kanserleri (Üçüncü Baskı). Ankara: Çağdaş Medikal Kitabevi, Harries, M. and Gore, M. (2002b). Part I: chemotherapy for epithelial ovarian cancer- treatment of recurrent disease. The Lancet Oncology, 3, Thigpen, J. T. (2000). Chemotherapy for advanced ovarian cancer: overview of randomized trials. Seminars in Oncology, 27, Matsuo, K., Lin, Y. G., Roman, L. D. and Sood, A. K. (2010). Overcoming Platinum Resistance in Ovarian Carcinoma. Expert Opinion on Investigational Drugs, 19, Perren, T. J., Swart, A.M., Pfisterer, J., Ledermann, J. A., Pujade-Lauraine, E., Kristensen, G., Carey, M. S., Beale, P., Cervantes, A. and Kurzeder, C. (2011). A phase 3 trial of bevacizumab in ovarian cancer. The New England Journal of Medicine, 365, Aghajanian, C., Blank, S.V., Goff, B.A., Judson, P.L., Teneriello, M.G., Husain, A., Sovak, M.A., Yi, J., Nycum, L.R. (2012). A randomized, double-blind, placebocontrolled phase III trial of chemotherapy with or without bevacizumab in patients with platinum-sensitive recurrent epithelial ovarian, primary peritoneal, or fallopian tube cancer. Journal of Clinical Oncology, 30, Chen, S. S., Michael, A. and Butler-Manuel, S.A. (2012). Advances in the treatment of ovarian cancer: A potential role of anti inflammatory phytochemicals. Discovery Medicine, 13, Tewari, K. S. (2012). American Society of Clinical Oncology 2012 Annual Meeting: highlights from the gynecologic oncology track. International Journal of Gynecological Cancer, 22, Gelmon, K.A., Tischkowitz, M., Mackay, H., Swenerton, K., Robidoux, A., Tonkin, K., Hirte, H., Huntsman, D., Clemons, M. and Gilks, B. (2011). Olaparib in patients with recurrent high-grade serous or poorly differentiated ovarian carcinoma or triplenegative breast cancer: A phase 2, multicentre, open-label, non-randomised study. The Lancet Oncology, 12, Sessa, C. (2011). Update on PARP1 inhibitors in ovarian cancer. Annals of Oncology, 22, viii72 viii Gonzalez-Sancho, J. M., Brennan, K. R., Castelo-Soccio, L. A. and Brown, A. M. (2004). Wnt proteins induce dishevelled phosphorylation via an LRP5/6-independent

142 125 mechanism, irrespective of their ability to stabilize beta-catenin. Molecular and Cellular Biology, 24, Kikuchi, A., Yamamoto, H. and Kishidai S. (2007). Multiplicity of the interactions of Wnt proteins and their receptors. Cell Signal, 19, Barbolina, M. V., Burkhalter, R. J. and Stack, M. S. (2011). Diverse mechanisms for activation of Wnt signalling in the ovarian tumour microenvironment. Biochemical Journal, 437, Bader, A. G., Kang, S., Zhao, L. and Vogt, P. K. (2005). Oncogenic PI3K deregulates transcription and translation. Nature Reviews Cancer, 5, Bast, Jr. R. C., Hennessy, B. and Mills, G. B. (2009). The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature Reviews Cancer, 9, Badiglian Filho, L., Oshima, C. T., De Oliveira Lima, F., De Oliveira Costa, H., De Sousa Damiao, R., Gomes, T. S. and Gonçalves, W. J. (2009). Canonical and noncanonical Wnt pathway: a comparison among normal ovary, benign ovarian tumor and ovarian cancer. Oncology Reports, 21, Burkhalter, R. J., Symowicz, J., Hudson, L. G., Gottardi, C. J. and Stack, M. S. (2011). Integrin regulation of beta-catenin signaling in ovarian carcinoma. The Journal of Biological Chemistry, 286, Jacob, F., Ukegjini, K., Nixdorf, S., Ford, C. E., Olivier, J., Caduff, R., Scurry, J. P., Guertler, R., Hornung, D., Mueller, R., Fink, D. A., Hacker, N. F. and Heinzelmann- Schwarz. V. A. (2012). Loss of secreted frizzled-related protein 4 correlates with an aggressive phenotype and predicts poor outcome in ovarian cancer patients. PLoS One, 7, e Wang, Y., Hewitt, S. M., Liu, S., Zhou, X., Zhu, H., Zhou, C., Zhang, G., Quan, L., Bai, J. and Xu, N. (2006). Tissue microarray analysis of human FRAT1 expression and its correlation with the subcellular localisation of beta-catenin in ovarian tumours. British Journal of Cancer, 94, Lee, C. M., Shvartsman, H., Deavers, M. T., Wang, S. C., Xia, W., Schmandt, R., Bodurka, D. C., Atkinson, E. N., Malpica, A., Gershenson, D. M., Hung, M. C. and Lu, K. H. (2003). Beta-catenin nuclear localization is associated with grade in ovarian serous carcinoma. Gynecologic Oncology, 88, Popadiuk, C. M., Xiong, J., Wells, M. G., Andrews, P. G., Dankwa, K., Hirasawa, K., Lake, B. B. and Kao, K. R. (2006). Antisense suppression of pygopus2 results in growth arrest of epithelial ovarian cancer. Clinical Cancer Research, 12, Ricken, A., Lochhead, P., Kontogiannea, M. and Farookhi, R. (2002). Wnt signaling in the ovary: identification and compartmentalized expression of wnt-2, wnt-2b, and frizzled-4 mrnas. Endocrinology, 143,

143 Al Sawah, E., Marchion, D., Xiong, Y., Ramirez-Diaz, I., Abbasi, F., Bou Zgheib, N. and Lancaster, J. (2013). A novel strategy to identify ovarian cancer molecular signaling pathways and drug repurposing candidates. Gynecologic Oncology, 130(1), e Flores, R. J., Li, Y., Yu, A., Shen, J., Rao, P. H., Lau, S. S. and Man, T. K. (2012). A systems biology approach reveals common metastatic pathways in osteosarcoma. BMC Systems Biology, 6(1), Bao, R., Christova, T., Song, S., Angers, S., Yan, X. and Attisano, L. (2012). Inhibition of tankyrases induces Axin stabilization and blocks Wnt signalling in breast cancer cells. PLoS One, 7, e Huang, S. M., Mishina, Y. M., Liu, S., Cheung, A., Stegmeier, F. and Michaud G. A. (2009). Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature, 461, Pan, J. X., Ding, K. and Wang, C. Y. (2012). Niclosamide, an old antihelminthic agent, demonstrates antitumor activity by blocking multiple signaling pathways of cancer stem cells. Chinese Journal of Cancer, 31, Kayaalp, S. O. (2012). Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji, 2. Cilt, (On Birinci Baskı) Ankara: Hacettepe- Taş Kitapçılık Ltd. Şti., Imming, P., Sinning, C., and Meyer, A. (2006). Drugs, their targets and the nature and number of drug targets. Nature Reviews Drug Discovery, 5, Espinosa-Aguirre, J. J., Reyes, R. E. and Cortinas de Nava, C. (1991). Mutagenic activity of 2-chloro-4-nitroaniline and 5-chlorosalicylic acid in Salmonella typhimurium: two possible metabolites of niclosamide. Mutation Research, 264(3), Craig, P. and Ito, A. (2007) Intestinal cestodes. Current Opinion in Infectious Diseases, 20, World Health Organization (WHO) (2002) WHO Specifications and Evaluations for Public Health Pesticides (niclosamide). Geneva: World Health Organization, Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays methods, Journal of Immunological Methods, 16, Andrews, P., Thyssen, J. and Lorke, D. (1982). The biology and toxicology of molluscicides Bayluscide. Pharmacology & Therapeutics, 19, Al-Hadiya, B. M. (2005). Niclosamide: comprehensive profile. Profiles Drug Substances, Excipients and Related Methodology, 32, Chong, C. R. and Sullivan, D. (2007). New uses for old drugs. Nature, 448,

144 Li, Y., Li, P. K., Roberts, M. J., Arend, R. C., Samant, R. S., and Buchsbaum, D. J. (2014). Multi-targeted therapy of cancer by niclosamide: A new application for an old drug. Cancer Letters, 349(1), Wang, A. M., Ku, H. H., Liang, Y. C., Chen, Y. C., Hwu, Y. M., and Yeh, T. S. (2009). The autonomous notch signal pathway is activated by baicalin and baicalein but is suppressed by niclosamide in K562 cells. Journal of Cellular Biochemistry, 106(4), Balgi, A. D., Fonseca, B. D., Donohue, E., Tsang, T. C., Lajoie, P., Proud, C. G., Nabi, I. R. and Roberge, M. (2009). Screen for chemical modulators of autophagy reveals novel therapeutic inhibitors of mtorc1 signaling. PLoS One, 4(9), e Wang, Y. C., Chao, T. K., Chang, C. C., Yo, Y. T., Yu, M. H., and Lai, H. C. (2013). Drug screening identifies niclosamide as an inhibitor of breast cancer stem-like cells. PloS One, 8(9), e Ye, T., Xiong, Y., Yan, Y., Xia, Y., Song, X., Liu, L., Li, D., Wang, N., Zhang, L., Zhu, Y., Zeng, J., Wei, Y. and Yu, L. (2014). The anthelmintic drug niclosamide induces apoptosis, impairs metastasis and reduces immunosuppressive cells in breast cancer model. PloS One, 9(1), e You, S., Li, R., Park, D., Xie, M., Sica, G. L., Cao, Y., Xiao, Z. Q. and Deng, X. (2014). Disruption of STAT3 by niclosamide reverses radioresistance of human lung cancer. Molecular Cancer Therapeutics, 13(3), Li, R., You, S., Hu, Z., Chen, Z. G., Sica, G. L., Khuri, F. R., Curran, W. J., Shin, D. M. and Deng, X. (2013b). Inhibition of STAT3 by niclosamide synergizes with erlotinib against head and neck cancer. PloS One, 8(9), e Liu, C., Lou, W., Zhu, Y., Nadiminty, N., Schwartz, C. T., Evans, C. P., and Gao, A. C. (2014). Niclosamide inhibits androgen receptor variants expression and overcomes enzalutamide resistance in castration-resistant prostate cancer. Clinical Cancer Research, 20(12), Cancer Genome Atlas Network. (2012). Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature, 487, Bass, A. J., Lawrence, M. S., Brace, L. E., Ramos, A. H., Drier, Y., Cibulskis, K., Meyerson, M. et. al., (2011). Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion. Nature Genetics, 43(10), Cheng, H., Liang, H., Qin, Y. and Liu, Y. (2011). Nuclear β-catenin overexpression in metastatic sentinel lymph node is associated with synchronous liver metastasis in colorectal cancer. Diagnostic Pathology, 6, Khramtsov, A. I., Khramtsova, G. F., Tretiakova, M., Huo, D., Olopade, O. I., and Goss, K. H. (2010). Wnt/β-catenin pathway activation is enriched in basal-like breast cancers and predicts poor outcome. The American Journal of Pathology, 176(6),

145 López-Knowles, E., Zardawi, S. J., McNeil, C. M., Millar, E. K., Crea, P., Musgrove, E. A., Sutherland, R. L. and O Toole, S. A. (2010).. Cytoplasmic localization of β- catenin is a marker of poor outcome in breast cancer patients. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, 19, Yoshioka, S., King, M., L., Ran, S., Okuda, H., MacLean, J. A., McAsey, M. E., Sugino, N., Brard, L., Watabe, K. and Hayashi, K. (2012). WNT7A regulates tumor growth and progression in ovarian cancer through the WNT/ β-catenin pathway. Molecular Cancer Research, 10, Ochoa-Hernández, A. B., Ramos-Solano, M., Meza-Canales, I. D., García-Castro, B., Rosales-Reynoso, M. A., Rosales-Aviña, J. A. and Aguilar-Lemarroy, A. (2012). Peripheral T-lymphocytes express WNT7A and its restoration in leukemia-derived lymphoblasts inhibits cell proliferation. BMC Cancer, 12(1), Chien, A. J., Moore, E. C., Lonsdorf, A. S., Kulikauskas, R. M., Rothberg, B. G., Berger, A. J., Major, M. B., Hwang, S. T., Rimm, D. L. and Moon, R. T. (2009). Activated Wnt/β-catenin signaling in melanoma is associated with decreased proliferation in patient tumors and a murine melanoma model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106, Guturi, K. K., Mandal, T., Chatterjee, A., Sarkar, M., Bhattacharya, S., Chatterjee, U. and Ghosh, M. K. (2012). Mechanism of β-catenin- mediated transcriptional regulation of epidermal growth factor receptor expression in glycogen synthase kinase 3β-inactivated prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry, 287, Bitler, B. G., Nicodemus, J. P., Li, H., Cai, Q., Wu, H., Hua, X., Li, T., Birrer, M. J., Godwin, A. K., Cairns, P. and Zhang, R. (2011). Wnt5a suppresses epithelial ovarian cancer by promoting cellular senescence. Cancer Research, 71, King, T. D., Zhang, W., Suto, M. J. and Li, Y. (2012). Frizzled7 as an emerging target for cancer therapy. Cellular Signalling, 24, Yang, L., Wu, X., Wang, Y., Zhang, K., Wu, J., Yuan, Y. C., Deng, X., Chen, L., Kim, C. C., Lau, S., Somlo, G. and Yen, Y. (2011). FZD7 has a critical role in cell proliferation in triple negative breast cancer. Oncogene, 30, Wei, W., Chua, M.-S., Grepper, S. and So, S. K. (2011). Soluble Frizzled-7 receptor inhibits Wnt signaling and sensitizes hepatocellular carcinoma cells towards doxorubicin. Molecular Cancer, 10, Yamaguchi, T., Yanagisawa, K., Sugiyama, R., Hosono, Y., Shimada, Y., Arima, C., Kato, S., Tomida, S., Suziki, M., Osada, H. and Takahashi, T. (2012). NKX2-1/TITF1/TTF-1-Induced ROR1 is required to sustain EGFR survival signaling in lung adenocarcinoma. Cancer Cell, 21, Zhang, S., Chen, L., Cui, B., Chuang, H. Y., Yu, J., Wang-Rodriguez, J., Tang, L., Chen, G., Basak, G. W. and Kipps, T. J. (2012). ROR1 is expressed in human breast cancer and associated with enhanced tumor-cell growth. PLoS One, 7, e31127.

146 Gentile, A., Lazzari, L., Benvenuti, S., Trusolino, L. and Comoglio, P. M. (2011). Ror1 is a pseudokinase that is crucial for Met-driven tumorigenesis. Cancer Research, 71, Wright, T. M., Brannon, A. R., Gordan, J. D., Mikels, A. J., Mitchell, C., Chen, S., Espinosa, I., van de Rijn, M., Pruthi, R., Wallen, E., Edwards, L., Nusse, R. and Rathmell, W. K. (2009). Ror2, a developmentally regulated kinase, promotes tumor growth potential in renal cell carcinoma. Oncogene, 28, Edris, B., Espinosa, I., Mühlenberg, T., Mikels, A., Lee, C. H., Steigen, S. E., Zhu, S., Montgomery, K. D., Lazar, A. J., Lev, D., Fletcher, J. A., Beck, A. H., West, R. B., Nusse, R. and van de Rijn, M. (2012). ROR2 is a novel prognostic biomarker and a potential therapeutic target in leiomyosarcoma and gastrointestinal stromal tumour. The Journal of Pathology, 227, Matsuda, Y., Schlange, T., Oakeley, E. J., Boulay, A. and Hynes, N. E. (2009). WNT signaling enhances breast cancer cell motility and blockade of the WNT pathway by sfrp1 suppresses MDA-MB-231 xenograft growth. Breast Cancer Research, 11, R DiMeo, T. A., Anderson, K., Phadke, P., Fan, C., Perou, C. M., Naber, S. and Kuperwasser, C. (2009). A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Cancer Research, 69, Yee, D. S., Tang, Y., Li, X., Liu, Z., Guo, Y., Ghaffar, S., McQueen, P., Atreya, D., Xie, J., Simoneau, A. R., Hoang, B. H. and Zi, X. (2010). The Wnt inhibitory factor 1 restoration in prostate cancer cells was associated with reduced tumor growth, decreased capacity of cell migration and invasion and a reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Cancer, 9, Lambiv, W. L., Vassalo, I., Delorenzi, M., Shay, T., Diserens, A. C., Misra, A., Feuerstein, B., Murat, A., Miglavacca, E., Hamou, M. F., Sciuscio, D., Burger, R., Domany, E., Stupp, R. and Hegi, M. E. (2011). The Wnt inhibitory factor 1 (WIF1) is targeted in glioblastoma and has a tumor suppressing function potentially by induction of senescence. Neuro-Oncology, 13, Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P. and Eaves, C. J. (2012). Cancer stem cells: an evolving concept. Nature Reviews Cancer, 12, Yeung, J., Esposito, M. T., Gandillet, A., Zeisig, B. B., Griessinger, E., Bonnet, D. and So, C. W. (2010). β-catenin mediates the establishment and drug resistance of MLL leukemic stem cells. Cancer Cell, 18, Ye, X., Zerlanko, B., Kennedy, A., Banumathy, G., Zhang, R. and Adams, P. D. (2007). Downregulation of Wnt signaling is a trigger for formation of facultative heterochromatin and onset of cell senescence in primary human cells. Molecular Cell, 27,

147 Zeng, Y. A. and Nusse, R. (2010). Wnt proteins are self-renewal factors for mammary stem cells and promote their long-term expansion in culture. Cell Stem Cell, 6, Zhang, H., Zhang, X., Wu, X., Li, W., Su, P., Cheng, H., Xiang, L., Gao, P. and Zhou, G. (2012). Interference of Frizzled 1 (FZD1) reverses multidrug resistance in breast cancer cells through the Wnt/β-catenin pathway. Cancer Letters, 323, Noda, T., Nagano, H., Tagemasa, I., Yoshioka, S., Murakami, M., Wada, H., Kobayashi, S., Marubashi, S., Takeda, Y., Dono, K., Umeshita, K., Matsuura, N., Matsubara, K., Doki, Y., Mori, M. and Monden, M. (2009). Activation of Wnt/βcatenin signalling pathway induces chemoresistance to interferon- α/5-fluorouracil combination therapy for hepatocellular carcinoma. British Journal of Cancer, 100, Bordonaro, M., Tewari, S., Cicco, C. E., Atamna, W. and Lazarova, D. L. (2011). A switch from canonical to noncanonical Wnt signaling mediates drug resistance in colon cancer cells. PLoS One, 6, e Hirata, H., Hinoda, Y., Nakajima, K., Kawamoto, K., Kikuno, N., Ueno, K., Yamamura, S., Zaman, M. S., Khatri, G., Chen, Y., Saini, S., Majid, S., Deng, G., Ishii, N. and Dahiya, R. (2011). Wnt antagonist DKK1 acts as a tumor suppressor gene that induces apoptosis and inhibits proliferation in human renal cell carcinoma. International Journal of Cancer, 128, Qiang, Y.W., Walsh, K., Yao, L., Kedei, N., Blumberg, P. M., Rubin, J. S., Shaughnessy, J. and Rudikoff, S. (2005). Wnts induce migration and invasion of myeloma plasma cells. Blood, 106, Zi, X., Guo, Y., Simoneau, A. R., Hope, C., Xie, J., Holcombe, R. F. and Hoang, B. H. (2005). Expression of Frzb/secreted Frizzled- related protein 3, a secreted Wnt antagonist, in human androgen-independent prostate cancer PC-3 cells suppresses tumor growth and cellular invasiveness. Cancer Research, 65, Kurayoshi, M., Que, N., Yamamoto, H., Kishida, M., Inoue, A., Asahara, T., Yasui, W. and Kikuchi, A. (2006). Expression of Wnt-5a is correlated with aggressiveness of gastric cancer by stimulating cell migration and invasion. Cancer Research, 66, Pukrop, T., Klemm, F., Hagemann, T., Gradl, D., Schulz, M., Siemes, S., Trümper, L. and Binder, C. (2006). Wnt 5a signaling is critical for macrophage- induced invasion of breast cancer cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103, Scheel, C., Eaton, E. N., Chaffer, C. L., Reinhardt, F., Kah, K. J., Bell, G., Guo, W., Rubin, J., Richardson, A. L. and Weinberg, R. A. (2011). Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast. Cell, 145,

148 Ulivieri, A., Lavra, L., Dominici, R., Giacomelli, L., Brunetti, E., Sciacca, L., Trovato, M., Barresi, G., Foukakis, T., Jia-Jing, L., Larsson, C., Bartolazzi, A. and Sciacchitano, S. (2008). Frizzled-1 is down-regulated in follicular thyroid tumours and modulates growth and invasiveness. The Journal of Pathology, 215, Fu, L., Zhang, C., Zhang, L. Y., Dong, S. S., Lu, L. H., Chen, J., Dai, Y., Kong, K. L., Kwong, D. L. and Guan, X. Y. (2011). Wnt2 secreted by tumour fibroblasts promotes tumour progression in oesophageal cancer by activation of the Wnt/βcatenin signalling pathway. Gut, 60, Nguyen, D. X., Chiang, A. C., Zhang, X. H., Kim, J. Y., Kris, M. G., Ladanyi, M., Gerald, W. L. and Massague, J. (2009). WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell, 138, Liu, L., Zhu, X. D., Wang, W. Q., Shen, Y., Qin, Y., Ren, Z. G., Sun, H. C. and Tang, Z. Y. (2010). Activation of β-catenin by hypoxia in hepatocellular carcinoma contributes to enhanced metastatic potential and poor prognosis. Clinical Cancer Research, 16, Weeraratna, A. T., Jiang, Y., Hostetter, G., Rosenblatt, K., Duray, P., Bittner, M. and Trent, J. M. (2002). Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell, 1, Syed Khaja, A. S., Helczynski, L., Edsjö, A., Ehrnström, R., Lindgren, A., Ulmert, D., Andersson, T. and Bjartell, A. (2011). Elevated level of Wnt5a protein in localized prostate cancer tissue is associated with better outcome. PLoS One, 6, e Hansen, C., Howlin, J., Tengholm, A., Dyackok, O., Vogel, W. F., Nairn, A. C., Greengard, P. and Andersson, T. (2009). Wnt-5a-induced phosphorylation of DARPP-32 inhibits breast cancer cell migration in a CREB-dependent manner. The Journal of Biological Chemistry, 284, O Connell, M. P., Fiori, J. L., Xu, M., Carter, A. D., Frank, B. P., Camilli, T. C., French, A. D., Dissanayake, S. K., Indig, F. E., Bernier, M., Taub, D. D., Hewitt, S. M. and Weeraratna, A. T. (2010). The orphan tyrosine kinase receptor, ROR2, mediates Wnt5A signaling in metastatic melanoma. Oncogene, 29, Enomoto, M., Hayakawa, S., Itsukushima, S., Ren, D. Y., Matsuo, M., Tamada, K., Oneyama, C., Okada, M., Takumi, T., Nishita, M. and Minami, Y. (2009). et al. Autonomous regulation of osteosarcoma cell invasiveness by Wnt5a/Ror2 signaling. Oncogene, 28, Chen, B., Dodge, M. E., Tang, W., Lu, J., Ma, Z., Fan, C. W., Wei, S., Hao, W., Kilgore, J., Williams, N., S., Roth, M. G., Amatruda, J. F., Chen, C. and Lum, L. (2009). Small molecule mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology, 5(2), Thorne, C. A., Hanson, A. J., Schneider, J., Tahinci, E., Orton, D., Cselenyi, C. S., Jernigan, K. K., Meyers, K. C., Hang, B. I., Waterson, A. G., Kim, K., Melancon, B.,

149 132 Ghidu, V. P., Sulikowski, G. A., LaFleur, B., Salic, A., Lee, L. A., Miller, M. and Lee, E. (2010). Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1α. Nature Chemical Biology, 6(11), Hallett, R. M., Kondratyev, M. K., Giacomelli, A. O., Nixon, A. M., Girgis-Gabardo, A., Ilieva, D. and Hassell, J. A. (2012). Small molecule antagonists of the Wnt/βcatenin signaling pathway target breast tumor- initiating cells in a Her2/Neu mouse model of breast cancer. PLoS One, 7, e Gonsalves, F. C., Klein, K., Carson, B. B., Katz, S., Ekas, L. A., Evans, S., Nagourney, R., Cardozo, T., Brown, A. M. and DasGupta, R. (2011). An RNAibased chemical genetic screen identifies three small-molecule inhibitors of the Wnt/wingless signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(15), Wang, W., Liu, H., Wang, S., Hao, X. and Li, L. A. (2011). diterpenoid derivative 15-oxospiramilactone inhibits Wnt/β-catenin signaling and colon cancer cell tumorigenesis. Cell Research, 21, Tian, W., Han, X., Yan, M., Xu, Y., Duggineni, S., Lin, N., Luo, G., Li, Y. M., Han, X., Huang, Z. and An, J. (2012). Structure-based discovery of a novel inhibitor targeting the β-catenin/tcf4 interaction. Biochemistry, 51(2), Pode-Shakked, N., Harari-Steinberg, O., Haberman-Ziv, Y., Rom-Gross, E., Bahar, S., Omer, D., Metsuyanim, S., Buzhor, E., Jacob-Hirsch, J., Goldstein, R. S., Mark- Danieli, M. and Dekel, B. (2011). Resistance or sensitivity of Wilms tumor to anti- FZD7 antibody highlights the Wnt pathway as a possible therapeutic target. Oncogene, 30, Ettenberg, S. A., Charlat, O., Daley, M. P., Liu, S., Vincent, K. J., Stuart, D. D., Schuller, A. G., Yuan, J., Ospina, B., Green, J. et al. (2010). Inhibition of tumorigenesis driven by different Wnt proteins requires blockade of distinct ligandbinding regions by LRP6 antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 107, Lavergne, E., Hendaoui, I., Coulouarn, C., Ribault, C., Leseur, J., Eliat, P. A., Mebarki, S., Corlu, A., Clement, B. and Musso, O. (2011). Blocking Wnt signaling by SFRP-like molecules inhibits in vivo cell proliferation and tumor growth in cells carrying active β-catenin. Oncogene, 30, Ohigashi, T., Mizuno, R., Nakashima, J., Marumo, K. and Murai, M. (2005). Inhibition of Wnt signaling downregulates Akt activity and induces chemosensitivity in PTEN- mutated prostate cancer cells. Prostate, 62, Shou, J., Ali-Osman, F., Multani, A. S., Pathak., S., Fedi, P. and Srivenugopal, K. S. (2002). Human Dkk-1, a gene encoding a Wnt antagonist, responds to DNA damage and its overexpression sensitizes brain tumor cells to apoptosis following alkylation damage of DNA. Oncogene, 21,

150 Peng, C., Zhang, X., Yu, H., Wu, D. and Zheng, J. (2011). Wnt5a as a predictor in poor clinical outcome of patients and a mediator in chemoresistance of ovarian cancer. International Journal of Gynecological Cancer, 21, Biechele, T. L., Kulikauskas, R. M., Toroni, R. A., Lucero, O. M., Swift, R. D., James, R. G., Robin, N. C., Dawson, D. W., Moon, R. T. and Chien, A. J. (2012). Wnt/β-catenin signaling and AXIN1 regulate apoptosis triggered by inhibition of the mutant kinase BRAFV600E in human melanoma. Science Signalling, 5, ra Wang, S. and Zhang, S. (2011). Dickkopf-1 is frequently overexpressed in ovarian serous carcinoma and involved in tumor invasion. Clinical & Experimental Metastasis, 28(6), Ford, C. E., Punnia-Moorthy, G., Henry, C. E., Llamosas, E., Nixdorf, S., Olivier, J., Caduff, R., Ward, R. L. and Heinzelmann-Schwarz, V. (2014). The non-canonical Wnt ligand, Wnt5a, is upregulated and associated with epithelial to mesenchymal transition in epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology, 134(2), Bodnar, L., Stanczak, A., Cierniak, S., Smoter, M., Cichowicz, M., Kozlowski, W., Szczylik, C., Wieczorek, M. and Lamparska-Przybysz, M. (2014). Wnt/β-catenin pathway as a potential prognostic and predictive marker in patients with advanced ovarian cancer. Journal of Ovarian Research, 7(1), Schmid, S., Bieber, M., Zhang, F., Zhang, M., He, B., Jablons, D. and Teng, N. N. (2011). Wnt and hedgehog gene pathway expression in serous ovarian cancer. International Journal of Gynecological Cancer, 21(6), Londoño-Joshi, A. I., Arend, R. C., Aristizabal, L., Lu, W., Samant, R. S., Metge, B. J., Hidalgo, B., Grizzle, W. E., Conner, M., Forero-Torres, A., LoBuglio, A. F., Li, Y. and Buchsbaum, D. J. (2014). Effect of niclosamide on basal-like breast cancers. Molecular Cancer Therapeutics, 13(4), Ono, M., Yin, P., Navarro, A., Moravek, M. B., Druschitz, S. A., Gottardi, C. J., and Bulun, S. E. (2014). Inhibition of canonical WNT signaling attenuates human leiomyoma cell growth. Fertility and Sterility, 101(5), King, M. L., Lindberg, M. E., Stodden, G.R., Okuda, H., Ebers, S. D., Johnson, A., Montag, A., Lengyel, E., MacLean, Ii. J. A. and Hayashi, K. (2014). WNT7A/βcatenin signaling induces FGF1 and influences sensitivity to niclosamide in ovarian cancer. Oncogene, doi: /onc

151 134

152 135 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Soyadı, adı : Çakır Gündoğdu, Ayşe Uyruğu : T.C. Doğum tarihi ve yeri : Muğla Medeni hali : Evli Telefon : Faks : ys_cakir@yahoo.com Eğitim Derece Eğitim Birimi Mezuniyet tarihi Yüksek Lisans Anadolu Üniversitesi 2012 Gazi Üniversitesi Devam ediyor Lisans Anadolu Üniversitesi 2010 Lise Dalaman Lisesi 2004 İş Deneyimi Yıl Yer Görev 2013 Gazi Üniversitesi Araştırma Görevlisi Yabancı Dil İngilizce Yayınlar Oztetik, E. and Cakir, A. (2014). New Food for an old mouth: new enzyme for an ancient archaea. Enzyme Microb Technol, 55,

153 GAZİ GELECEKTİR...