BENZO(A)PĠREN UYGULANAN SIÇANLARDA OVARYUM DOKUSUNDA MEYDANA GELEN DEĞĠġĠKLĠKLERE BĠR ANTĠOKSĠDAN OLARAK CURCUMĠN ĠN ROLÜ.

Transkript

1

2 BENZO(A)PĠREN UYGULANAN SIÇANLARDA OVARYUM DOKUSUNDA MEYDANA GELEN DEĞĠġĠKLĠKLERE BĠR ANTĠOKSĠDAN OLARAK CURCUMĠN ĠN ROLÜ Simge ÇELEBĠ YÜKSEK LĠSANS TEZĠ HĠSTOLOJĠ - EMBRĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI GAZĠ ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ TEMMUZ 2015

3

4 ETĠK BEYAN Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tez Yazım Kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalıģmasında; Tez içinde sunduğum verileri, bilgileri ve dokümanları akademik ve etik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, Tüm bilgi, belge, değerlendirme ve sonuçları bilimsel etik ve ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, Tez çalıģmasında yararlandığım eserlerin tümüne uygun atıfta bulunarak kaynak gösterdiğimi, Kullanılan verilerde herhangi bir değiģiklik yapmadığımı, Bu tezde sunduğum çalıģmanın özgün olduğunu, bildirir, aksi bir durumda aleyhime doğabilecek tüm hak kayıplarını kabullendiğimi beyan ederim. Simge ÇELEBĠ 06/07/2015

5 iv BENZO(A)PĠREN UYGULANAN SIÇANLARDA OVARYUM DOKUSUNDA MEYDANA GELEN DEĞĠġĠKLĠKLERE BĠR ANTĠOKSĠDAN OLARAK CURCUMĠN ĠN ROLÜ (Yüksek Lisans Tezi) Simge ÇELEBĠ GAZĠ ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ Temmuz 2015 ÖZET Polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH lar) kömür, petrol, gaz, odun ve sigara dumanı ve mangalda piģirilen etler gibi organik maddelerin tamamlanmamıģ yanma sürecinde Ģekillenen organik bileģiklerdir. Doğada 100 den fazla bulunan polisiklik aromatik hidrokarbonlardan biri Benzo(a)piren dir (B(a)P). ÇalıĢmamızda, BaP ın ovaryumda oluģturabileceği olası hasarlara bir antioksidan olarak Curcumin in olası koruyucu etkilerinin incelenmesi amaçlandı. Deneyde 36 adet Wistar albino cinsi diģi sıçan kullanıldı ve denekler 6 gruba ayrıldı. Benzo(a)piren (10mg/kg/gün) mısır yağında, Curcumin (100mg/kg/gün) ise DMSO içerisinde çözüldü. Kontrol grubuna herhangi bir uygulama yapılmazken, diğer gruplara sırası ile mısır yağı, BaP, DMSO, Curcumin ve Curcumin+BaP olmak üzere, tüm uygulamalar 6 hafta süresince her gün aynı saatte gavaj yolu ile yapıldı. Deneklerin vücut ağırlıkları her gün ölçülerek kaydedildi. Süre bitiminde yüksek doz anestezi altında feda edilen deneklerin ovaryum dokuları alındı. Bu dokuların ağırlıkları ölçülerek kaydedildi ve histolojik izleme yöntemlerinden geçirildi. Değerlendirme için alınan kesitlere Hematoksilen-Eozin boyası uygulandı. Ġmmünohistokimyasal yöntem için apopitoz sinyal moleküllerinden kaspaz-3 ve sitokrom c primer antikorları kullanıldı, dokular ıģık mikroskobunda resimleri çekilerek değerlendirildi. Sonuç olarak BaP uygulamasının ovaryumda belirgin olarak Graaf follikül üzerinde etkili olduğu ve bu folliküllerin sayısını istatistiksel olarak anlamlı ölçüde azalttığı saptandı. BaP uygulamasının özellikle zona pellusida, granüloza ve ağırlıklı olarak kumulus hücrelerinde yapısal bozukluklara neden olduğu, bu uygulama ile atretik folliküllerin sayısının arttığı da belirlendi. Koruma erekli uygulanan Curcumin in ovaryum yapısında bir miktar düzelmeye neden olsa da bazı stromal değiģimlerin düzelmesi adına yetersiz kaldığı, BaP uygulaması ile görülen ve ortadan kuvvetliye değiģen Kaspaz-3 ve Sitokrom-c tutulumlarını da sadece orta düzeyli bir immünreaktiviteye çekebildiği saptandı. Bu bulgular ıģığında, Curcumin uygulamasının BaP ın neden olduğu yapısal yozlaģmaları kısmen engellediği ancak tam bir koruma için yetersiz kaldığı kanısına varıldı. BilimKodu : AnahtarKelimeler : Benzo(a)Piren, Curcumin, Ovaryum SayfaAdedi : 106 DanıĢman : Prof. Dr. Deniz ERDOĞAN

6 v THE ROLE OF CURCUMIN AS AN ANTIOXIDAN ON OVARY TISSUE CHANGES OF BENZO (A) PYRENE APPLIED RATS (M. Sc. Thesis) Simge ÇELEBĠ GAZĠ UNIVERSITY INSTITUTE OF HEALTH SCIENCES July 2015 ABSTRACT Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are organic compunds that shaped on incomplete oxidation period of organic substances such as coal, petrol, gas, wood, cigarette smoke and barbecued meat. Benzo(a)Pyrene (BaP) is one of the polycyclic aromatic hydrocarbons and it has more than 100 varieties in the nature. We want to investigate, the protective effects of Curcumin as an antioxidanton on potential BaP damages on ovary. 36 female Wistar Albino rats were used and subjects were divided into 6 groups in test. Benzo (a) Pyrene (10mg/kg/days) was solved in maize oil but DMSO was used as a solvent for Curcumin (10mg/kg/days). Althougt we did not apply any chemicals to control group, other groups which are BaP, Curcumin, maize oil, BaP+Curcumin and DMSO, the chemicals were applied by gavage for 6 weeks. In daily basis experimental animals body weights were mesaured and saved. At the end of period the rats have been sacrificed under high dose anesthesia and their ovarian tissues were taken. Tissues weights were measured and saved and processed histological observation procedures. Cross sections taken for inspection hematoxyline-eosin dyes were applied. For immunohistochemical method apoptosis signal molecules caspase-3 and cytochrome c primary antibodies were used and cross sections images from light microscope were evaluated. As results of test BaP application have an impact on the number of follicles noticeably Graaf follicle on ovary in a statistically significant decrease was detected. We saw that, the application of BaP, coused structural defects in ovarian tissue especially in zona pellucida, granulose and cumulus cells. In addition BaP application also caused to increase the number of atretic follicules. Beside this, the Curcumin which was used as a protective effects on ovary, we saw that; althougt it coused part of recovery on ovarian tissue, it has not completely protect the changes of some stromal degeneration to normal histological appears and we saw that it changes the strong immunreactivity of caspase 3 and sitocrom c in BaP groups to only mild reaction. ScienceCode : KeyWords : Benzo(a)pyrene, Curcumin, Ovary PageNumber : 106 Advisor : Prof. Dr. Deniz ERDOGAN

7 vi TEġEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca bilgi ve deneyimleri ile bana yol gösteren, tezimin hazırlanması ve deney süresince benimle değerli bilgilerini paylaģan danıģmanım Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı BaĢkanımız Hocam Sayın Prof. Dr. Deniz ERDOĞAN baģta olmak üzere, değerli hocalarım, Sayın Prof. Dr. Celal ILGAZ a, Sayın Prof. Dr. Candan ÖZOĞUL a, Sayın Prof. Dr. Suna ÖMEROĞLU na, her zaman desteğini gördüğüm Sayın Prof. Dr. Çiğdem ELMAS a ve yol göstericim olan Sayın Prof. Dr. Gülnur Take KAPLANOĞLU na; Tezimin her aģamasında yanımda olan, yardım eden ve desteklerini esirgemeyen ArĢ. Gör. Gülce Naz SARAÇ a ve ArĢ. Gör. C Merve SEYMEN e, tez döneminin tüm zorluklarını beraber aģtığım, dönem arkadaģım Mehmet Fatih AĞAÇKANLI ya, Anabilim Dalımız personellerine ve tüm asistan arkadaģlarıma; Deney ve tez yazım sürecinde yanımda olan Gönül ÖZÜNLÜ ye, Pınar KARAġAR a, Sena BĠLGĠN e ve baģta Zülfikar TATAR olmak üzere değerli çalıģma arkadaģlarım Neosys Cerrahi Çözümler ailesine; Bana verdikleri sonsuz sevgi ve emeklerle buraya gelmemi sağlayan, eğitimim için her tür fedakarlığı yapan, kızı olmaktan gurur duyduğum babam Fethi ÇELEBĠ ye, bana mesleği sevdiren, her zaman güçlü olmayı öğreten ve onun yolunda yürümekten onur duyduğum annem Prof. Dr. Gülser ÇELEBĠ ye, sadece gülümsediğinde bile mutlu olduğum, her zaman yanımda olduğunu kalbimde hissettiğim canım ablam Mine YAZICIOĞLU na, hep sakin kalarak beni yatıģtıran eniģtem M. Eylem YAZICIOĞLU na ve tez yazarken benim resim yaptığımı sanan, benimle beraber oturup resim yapan yeğenim Can YAZICIOĞLU na sonsuz teģekkür ederim

8 vii ĠÇĠNDEKĠLER Sayfa ÖZET... ABSTRACT... TEġEKKÜR... ĠÇĠNDEKĠLER... ÇĠZELGELERĠN LĠSTESĠ... ġekġllerġn LĠSTESĠ... RESĠMLERĠN LĠSTESĠ... SĠMGELER VE KISALTMALAR... iv v vi vii x xi xii xv 1. GĠRĠġ GENEL BĠLGĠLER Ovaryumların GeliĢimi Oogenezis Ovaryumların Anatomisi Ovaryumların yapısı Ovaryumların damarları Ovaryumların lenf damarları Ovaryumların sinirleri Ovaryumların Histolojisi Ovaryum medullası Ovaryum korteksi Ovaryum follikülleri Ovulasyon Korpus luteum Ovaryumların Fizyolojisi... 17

9 viii Hipotalamus tan salgılanan GnRH Hipofiz bezi ön lobu hormonları (FSH ve LH) Ovaryum hormonları (östrojen ve progesteron) Polisiklik Aromatik Hidrokarbonlar (PAH) Benzo(a)piren (B(a)P) Antioksidanlar Serbest radikaller ve etkileri Antioksidanların sınıflandırılması Antioksidan savunma düzenekleri Curcumin Apoptozis Kaspaz Sitokrom C GEREÇ VE YÖNTEM Deney Hayvanları ve Gruplandırma Deneyin YapılıĢı IĢık Mikroskobik Yöntem Ġmmünohistokimyasal Yöntem Ġstatistiksel Yöntem BULGULAR IĢık Mikroskobik Bulgular Ġstatistiksel bulgular TARTIġMA SONUÇ KAYNAKLAR EKLER

10 Ek-1. Katılım Belgesi Ek-2. Etik Kurulu Onayı ÖZGEÇMĠġ ix

11 x ÇĠZELGELERĠN LĠSTESĠ Çizelge Sayfa Çizelge 4.1. Wistar albino cinsi sıçanların vücut ağırlığının ANOVA yöntemiyle istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge 4.2. Gruplar arasında ağırlık ortalamalarının Tukey ve Duncan yöntemleriyle istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge 4.3. Ġki Yönlü Varyans Analizi ile sağ ve sol ovaryum ağırlıklarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge 4.4. Ovaryum ağırlıklarının ANOVA yöntemiyle istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge 4.5. Gruplar arasında ovaryum ağırlık ortalamalarının Duncan yöntemiyle istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge 4.6. Kaspaz-3 tutulum ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge 4.7. Kaspaz-3 tutulumlarının Duncan yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge 4.8. Sitokrom c tutulum ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge 4.9. Sitokrom c tutulumlarının Duncan yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge Primordiyal Follikül ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge Primordiyal folliküllerin Duncan yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge Unilaminar Primer Follikül ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge Multilaminar Primer Follikül ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge Sekonder Follikül ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge Graaf Follikül ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge Graaf folliküllerin Duncan yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi... 81

12 xi ġekġllerġn LĠSTESĠ ġekil Sayfa ġekil 4.1. Gruplar arasında Wistar albino cinsi diģi sıçanların ağırlıklarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi ġekil 4.2. Gruplar arasında ovaryum ağırlıklarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi ġekil 4.3. Kaspaz-3 tutulumunun gruplar arasında istatistiksel olarak değerlendirilmesi ġekil 4.4. Sitokrom c tutulumunun gruplar arasında istatistiksel olarak değerlendirilmesi ġekil 4.5. Gruplar arasında Primordiyal folliküllerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi ġekil 4.6. Gruplar arasında Unilaminar primer folliküllerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi ġekil 4.7. Gruplar arasında Multilaminar primer folliküllerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi ġekil 4.8. Gruplar arasında sekonder folliküllerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi ġekil 4.9. Gruplar arasında graaf folliküllerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi... 81

13 xii RESĠMLERĠN LĠSTESĠ Resim Sayfa Resim 4.1. Kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda germinal epitel ( ), bağ dokusu ( ), kortekste yayılan primordiyal follikül ( ), granuloza hücre katmanı ( ),graaf follikül ( ),antrum ( ),kumulus ooforus ( ) belirgin yapılarıyla, oosit ( ), zona pellusida (*), teka interna ( ), teka eksterna ( ), ve yer yer kan damarı ( ) görülüyor (Hematoksilen Eozin x400) Resim 4.2. Kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda geliģen folliküller (>), stromada yaygın iri stromal hücreler ( ) ve kan damarı ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) Resim 4.3. Mısır yağı uygulanan gruba ait ovaryum dokusunun primordiyal follikül ( ) granuloza hücre katmanı ( ), hafif oluģmaya baģlayan antrum ( ) ve geliģen follikülleri (>) kontrol grubu ile eģdeģ olduğu görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) Resim 4.4. Mısır yağı uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda granuloza hücre katmanı ( ), teka interna ( ) ve teka eksterna ( ) ayırt ediliyor. (Hematoksilen Eozin x400) Resim 4.5. DMSO uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda kan damarı ( ), oosit ( ), zona pellusida (*),granuloza hücre katmanı ( ) ve geliģen folliküller (>) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) Resim 4.6. DMSO uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda oosit ( ), zona pellusida (*), granuloza hücre katmanı ( ),kan damarı ( ) ve antrum ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) Resim 4.7. Cucumin uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda germinal epitel ( ), atretik follikül ( ), antrum ( ), oosit ( ), zona pellusida (*), primordiyal follikül ( ), granuloza hücre katmanı ( ), sekonder follikül (>>) ve kan damarı ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) Resim 4.8. Cucumin uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda belirgin graaf follikül ( ), teka interna ( ), teka eksterna ( ), antrum ( ),granuloza hücre katmanı ( ), kan damarı ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) Resim 4.9. B(a)P uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda geliģen follikül (>), granuloza hücre katmanı ( ), korpus luteum (+) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) Resim B(a)P uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda granuloza hücre katmanı ( ), graaf follikül ( ), antrum ( ), kumulus ooforus ( ), oosit ( ), dalgalı bir hal almıģ zona pellusida (*), bağ dokusu arasındaki kollajen liflerde homojenizasyon ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400)... 56

14 xiii Resim Sayfa Resim B(a)P uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda granuloza hücre katmanı ( ), graaf follikül ( ), antrum ( ) ve teka katmanlarının teka eksterna ( ) yapısına dönüģtüğü görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) Resim B(a)P ve Curcumin in birlikte uygulandığı gruba ait ovaryum dokusunda germinal epitel ( ), granuloza hücre katmanı ( ), stromal hücreler ( ), sekonder follikül (>>), antrum ( ), yoğun olan teka externa ( ) ve oosit ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) Resim Kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda zayıf Kaspaz-3 tutulumuimmün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400) Resim Mısır yağı uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda zayıf Kaspaz-3 tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400) Resim DMSO uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda zayıf Kaspaz-3 tutulumu immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400) Resim Curcumin uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda zayıf Kaspaz-3 tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400) Resim B(a)P uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda oosite ( ) yakın zona pellusidada (*), sekonder follikülde (>>), primordiyal follikülde ( ), graaf follikülde ( ) orta dereceli ve korpus luteumda (+) Kaspaz-3 tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400) Resim B(a)P ve Curcumin in birlikte uygulandığı gruba ait ovaryum dokusunda teka interna ( ) ve granuloza hücre katmanında ( ) orta dereceli Kaspaz-3 tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) Resim Kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda Sitokrom c tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400). 65 Resim Mısır yağı uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda Sitokrom c tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400) Resim DMSO uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda Sitokrom c tutulumuimmün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400) Resim Curcumin uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda Sitokrom c tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400)... 68

15 xiv Resim Sayfa Resim B(a)P uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda Sitokrom c tutulumuimmün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400) Resim B(a)P ve Curcumin in beraber uygulandığı gruba ait ovaryum dokusunda granüloza hücrelerinde ortadan kuvvetliye doğru değiģen Sitokrom c tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)... 70

16 xv SĠMGELER VE KISALTMALAR Bu çalıģmada kullanılmıģ simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aģağıda sunulmuģtur. Simgeler Açıklamalar α Alfa β Beta cm 3 Santimetreküp g Gram o C M ml Santigrat Mol Mililitre µ Mikron nm Nanometre Kısaltmalar Açıklamalar a AMP APAF-1 BaP BPDE camp CYP DNA E 2 EGF EH ER FSH GBG Arteria Adenozin Monofosfat Apoptotoik Proteaz Aktive Eden Faktör-1 Benzo(a)piren Diol Epoksitleri Siklik Adenozin Monofosfat Citokrom P450 Deoksiribonükleik asit Östrojen Epidermal Büyüme Faktörü Epoksit Hikralaz Endoplazmik Retikulum Folikül Uyarıcı Hormon Steroid Bağlayıcı Globulin

17 xvi GnRH GSH GST hcg ICAD IGF-1 LH Lig MFO n NADPH NO OMI PAH PBS RNA ROT ROS ROM SOD SRY TBF US-EPA v Gonadtropin Salgılatıcı Hormon Glutatyon Glutatyon S Transferaz Ġnsan Koryonik Gonadotropin Hormon Deoksiribonükleaz Ġnhibitörü Ġnsülin Benzeri Büyüme Faktörü Lüteinize Edici Hormon Ligamentum Mikrozomal KarıĢık Fonksiyonlu Oksidaz Nervus Nikotinamid Adenin Dinükleotit Fosfat Nitrit Oksit Oosit OlgunlaĢmasını Baskılayan Madde Polisiklik Aromatik Hidrokarbon Phosphate Buffer Saline Ribonükleik Asit Reaktif Oksijen Türevleri Reaktif Oksijen Türevleri Reaktif Oksijen Metabolitleri Süperoksit Dismutaz Sex-determining Region Y Testis Belirleyici Faktör Amerika BirleĢik Devletleri Çevre Koruma Birimi Vena

18 1 1.GĠRĠġ Modern çağın yaģam biçimi ve kirlilikten kaynaklanan sorunlar, insan sağlığını önemli ölçüde tehdit edici düzeylere ulaģmıģtır. Yenilen, içilen, kullanılan ve günlük yaģamda etkin kalınan çoğu madde, insan sağlığına zararlıdır. Bunların baģında da kimyasallar gelmektedir. Teknolojik ve bilimsel geliģmeler, kısa bir süre önce zararsız kabul edilen birçok kimyasal maddenin, baģta kanser olmak üzere bazı ölümcül hastalıklara, geriye dönüģsüz hasarlara ya da genetik bozulmalara neden olduğunu ortaya koymuģtur. Söz konusu zararlı kimyasalların listesi her geçen gün biraz daha artmaktadır[1]. Polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH lar) kömür, petrol, gaz, odun ve sigara dumanı ve mangalda piģirilen etler gibi organik maddelerin tamamlanmamıģ yanma sürecinde Ģekillenen iki ya da daha fazla benzen halkası içeren hidrofobik özellikleri olan organik bileģiklerdir[2-3].doğal olarak, orman yangınları ya da volkanik patlamalarla oluģurlar. Ġnsan kökenli oluģumlarında ise endüstriyel kaynaklar (çöp yakma, çimento fabrikaları, petrol rafinerileri, kok kömürü ve asfalt üretimi, alüminyum, demir çelik üretimi), motorlu taģıtlar ve sigara rol oynamaktadır. Sigara ile ortaya çıkan PAH miktarı diğerlerine karģın daha azdır ancak insan sağlığı açısından en fazla tehdit oluģturan kaynaklar arasındadır [4]. Doğada 100 ün üzerinde PAH bileģiği bulunur. Amerika BirleĢik Devletleri Çevre Koruma Birimi (United States Environmental Protection Agency, US EPA) tarafından bunların 16 tanesi öncelikli kirleticiler arasında sayılmıģtır. Bunlar; molekül ağırlığı en düģük PAH olan Naftalin (Np), Asenaftelen, Asenaften (Ane), Floren (Flr), Fenantren (Phe), Antrasen, Floranten (Flu), Piren (Py), Benzo(a)antrasen (BaA), Krisen, Benzo(b)floranten (BbF), Benzo(k)floranten (BkF), Benzo(a)piren (BaP), Dibenzo(a,h)antrasen (DahA), Ġndeno(1,2,3-cd)piren(IcdP), Benzo(g,h,i)perilen dir [5]. Benzo(a)piren, 3,4-benzopyrene, kimyasal formülü C20H12, moleküler ağırlığı g/mol, kaynama noktası 495 o C, erime noktası 179 o C, yoğunluğu 1.24g/cm 3 olan, sarı renkli, kokusuz, mutajenik ve karsinojenik özellik gösteren bir polisiklik aromatik hidrokarbondur ve suda çözünmez.bap ilk olarak havaya salınır, sonra fotooksidasyon ile atmosferden yayılır, daha sonra toprakta ve suda kuru olarak çöker. BaP için belirlenen yarı ömürler; atmosferde 1-6 saat, suda 1-8 saat, sedimentlerde 5-10 yıl, toprakta aydan daha fazladır[6-7].

19 2 Deney hayvanı çalıģmalarında BaP a soluma yoluyla etkin kalmanın solunum sistemi tümörü, ağız yoluyla etkin kalmanın ise mide tümörü, lösemi ve akciğer tümörlerine neden olduğu belirtilmiģtir. Toksikolojik ve epidemiyolojik çalıģmalara göre gebeliğin organogenezis evresinde PAH lara etkin kalma, yavrulamayı ve yavrunun geliģimini baskılayıcı sonuçlara neden olabilir. BaP a ağız yoluyla etkin kalmanın yeniden gebe kalmayı azalttığı ve aynı Ģekilde döllenmede de azalmaya neden olduğu belirtilmiģtir. Aynı zamanda, BaP a ağız yoluyla etkin kalmanın hayvanlarda bir kerede doğan yavru sayısını azalttığı ve doğan yavruların vücut ağırlıklarında azalmaya neden olduğu bildirilmiģtir [8-9]. BaP metabolizmasının, bazı enzimleri uyarması sonucu süperoksit ve hidrojen peroksit gibi serbest radikaller oluģur ve bunlar, oksidatif olarak değiģik hücre tiplerinde mitogenezisi ve hücre çoğalmasını baģlatırlar. Ayrıca proteinler, lipitler, DNA ve antioksidan enzimlere hasar verirler [9-11]. Serbest radikaller son yörüngelerinde bir ya da daha fazla eģlenmemiģ elektron içeren molekül, iyon yada bileģiklerdir. Bunlar diğer moleküller ile etkileģime girerek bunlardan elektron alır ya da verirler. Tüm hücrelerde metabolik yetiler sonucu aerobik hücre metabolizmasının bir ürünü olarak serbest radikaller oluģur[12]. Serbest radikallerden korunmamızı, antioksidanlar olarak isimlendirilen mikro-besin maddeleri sağlayabilir. Antioksidanlar; kimyasal maddeler aracılığıyla ortaya çıkan serbest radikallerin oluģumunu azaltırlar. Diyetle alınan ya da endojen olarak vücutta bulunan antioksidanlar, tepkimeye girerek hücre hasarını engeller ve serbest radikallerin yol açtığı oksidatif stresi azaltır ya da yok ederler[13]. Günümüzde, geleneksel tedavi ereğiyle kullanılan, bitkisel kökenli bileģiklerden biri olan, antioksidan özelliği bulunduktan sonra güncelliği artan ve geçmiģte sonsuz yaģam kaynağı olarak isimlendirilen Curcumin in (turmeric) tarihi 5000 yıl öncesine dayanmaktadır. Kimyasal ismi 1,6-heptadien-3,5-dion-1,7-bis(4-hidroksi-3-metoksifenol)-(1E,6E) ya da diferuloilmetan (C21H20O6) olan Curcumin in beta konumuna bağlanmıģ 2 keton grubu içermesi antioksidan özelliğe sahip olmasını sağlamaktadır [14-16].

20 3 Curcumin suda çözünmez, hücre membranının hidrofobik yapılarında yerleģir ve yapısı nedeniyle hücrelere hızlıca girer. Lipofilik özellikleri nedeniyle hücre zarı, endoplazmik retikulum ve çekirdek zarı gibi yapılarda toplanır. Sistemik dolaģımda ya çok düģük düzeyde olur ya da hiç bulunmaz. Curcumin gıda sanayinde katkı maddesi, tatlandırıcı, koruyucu ve renklendirici ajan olarak hardal, margarin ve içeceklerde ayrıca portakal sarısı rengi ile gıda boyası olarak da kullanılmaktadır. Çok iyi bilinen ve sıklıkla kullanılan köri baharatının da esasıdır. Bu nedenle Curcumin in dıģarıdan besin maddeleriyle alınması gerekmektedir [17] Curcumin antioksidan özelliği ile serbest radikal oluģumunu doğrudan ya da XD/XO dönüģümünün baskılanması ile dolaylı olarak etkiler. Curcumi nin hasar oluģturucu hidroksil radikalleri ya da peroksinitrit üzerindeki etkisi henüz tam aydınlatılamamıģtır. Kronik inflamasyon ve sitokinler NO sentezini uyararak DNA hasarına ve kansere yol açan peroksinitrit ve nitrit oluģumuna yol açmaktadır. Yapılan pek çok çalıģmada Curcumin in NO sentezini baskıladığı gösterilmiģtir[16] Kaynak verilerinden yola çıkılarak bu çalıģmada; polisiklik aromatik hidrokarbonlardan benzo(a)pirene etkin kalmanın ovaryum dokusunda oluģturabileceği yapısal değiģiklikler ve bunlara Curcumin in koruyucu etkisinin incelenmesi amaçlandı. Bu erekle deney hayvanı organ, yaģ ve kuru ağırlıkları ovaryum follikül sayıları istatiksel olarak değerlendirildi. Yapısal değiģimler ıģık mikroskobunda incelendi. Ayrıca apoptotik değiģimlerin gözlemlenebilmesi için ovaryum dokularına kaspaz 3 ve sitokrom c antikorlarıyla immunohistokimyasal boyama yapıldı. Tüm veriler gruplar arasında karģılaģtırmalı olarak değerlendirildi.

21 4

22 5 2. GENEL BĠLGĠLER 2.1. Ovaryumların GeliĢimi Cinsiyetin farklanması, çok sayıda geni içeren karmaģık bir süreçtir. Kısa kolunda (Yp11) SRY geni taģıyan Y kromozomu cinsiyetin belirleyicisidir. Bu genin protein ürünü olan testis belirleyici faktör(tbf), geliģmemiģ üreme organlarının cinsiyetini belirleyen genleri harekete geçirir. Bu genin var olması durumunda fötüsun cinsiyeti erkek, yokluğunda ise kız olarak farklanır[18] Fötusun cinsiyeti, genetik olarak döllenme sırasında belirlenir. Buna karģın geliģimin 7.haftasına değin ilkel cins bezleri erkek ya da diģi yapısal özellikleri içermezler[18]. Gonadlar baģlangıçta kölom epitelinin çoğalması ve altındaki mezenģimin yoğunlaģmasıyla oluģmuģ, bir çift uzunlamasına düzenlenmiģ genital ya da gonadal kabartılar halinde belirir. GeliĢimin 6. haftasına değin genital kabartılar içinde germ (üreme) hücreleri görülmez [18-19]. Ġlkel (germ) cins hücreleri, primer ektodermden (epiblasttan) köken alırlar. GeliĢimin erken evrelerinde (2. haftada) ilkel cins hücreleri, vitellüs kesesinin allontoise yakın duvarındaki endoderm hücrelerinin arasında belirirler. Bu hücreler, ameboid hareketlerle, son bağırsağın mezenterinin dorsali boyunca ilerleyerek, 5. haftanın baģında ilkel gonadlara ulaģırlar. 6. haftada ise genital kabarıklığı iģgal ederler. Ġlkel cins hücrelerinin izledikleri bu yola germ çizgisi (hattı) denir. Bu hücreler genital kabartılara ulaģamadıklarında gonadlar geliģemez. Gonadların ovaryum ya da testise farklanmalarında ilkel germ hücrelerinin uyarıcı etkisi vardır[18-19]. Ġlkel germ hücrelerinin gonadlara ulaģmasından önce ve ulaģması sırasında, genital kabartının epiteli çoğalır ve altındaki mezenģime doğru uzanır. Burada ilkel cinsiyet kordonları olarak isimlendirilen düzensiz Ģekilli kordonları oluģtururlar. Erkek ve diģi embriyolarda kordonlar yüzey epiteliyle bağlantılıdır. Bu evrede erkek ve diģi gonadların birbirinden ayırt edilebilmesi olası değildir. Bu evredeki gonadlara farklanmamıģ gonad, evreye ise farklanmamıģ evre denir[18].

23 6 Y kromozomu içermeyen XX kromozomuna sahip diģi embriyolarda, ilkel cinsiyet kordonları düzensiz hücre kümelerine ayrılır. Ġlkel cins hücreleri içeren bu kümeler, daha çok ovaryumun medulla bölgesine yerleģirler. Bu hücre kümeleri daha sonra ortadan kalkarak yerlerini damarlı stromaya (ovaryum medullası) bırakırlar[18-19]. DiĢi gonadın yüzey epiteli çoğalmayı sürdürür. 7. haftada yüzey epitelinden köken alan hücre kordonları, alttaki mezenģim içine yüzeye yakın olacak Ģekilde gömülür. Bunlara, ikincil kordonlar (kortikal kordonlar) denir. 4.ayda bu kordonlar, bir ya da daha çok sayıda ilkel cins hücresini çevreleyen izole hücre toplulukları haline gelirler. Bu hücreler zamanla oogonyumlara dönüģürken, yüzey epitelinden aģağıya doğru göç eden ve üreme hücrelerini çevreleyen epitel hücrelerinden de folliküler hücreler farklanır[18-19] Oogenezis Doğum öncesi (prenatal) olgunlaģma Ġlkel cins hücreleri, diģi gonada ulaģtıklarında oogonyumlara farklanırlar. Oogonyumlar ardarda geçirdikleri mitoz bölünmeler sonucunda kümeler oluģturur ve 3. ayın sonunda yassı epitel hücreler ile çevrelenirler. Bir küme içinde yer alan oogonyumların tümü olasılıkla tek bir ilkel cins hücresinden geliģir. Oogonyumları çevreleyen yassı epitel hücreleri, ovaryumun yüzey epitelinden köken alır ve follikül hücreleri olarak isimlendirilirler[18-20]. Oogonyumların çoğu mitoz bölünmeyi sürdürürken, bir kısmı da 1. mayoz bölünmenin profaz aģamasına girer ve primer oositlere farklanırlar. 3. aydan baģlayarak oogonyumların sayısı hızla artar ve geliģimin 5. ayında ovaryum içindeki cins hücrelerinin sayısı ortalama 7 milyona ulaģır. Bu evreden sonra hücre ölümleri baģlar ve çok sayıda oogonyum ve primer oosit atretik hale gelir. 7. ayda yüzeye yakın yerleģmiģ birkaçı dıģında çoğunluğu dejenere olur. Dejenere olmamıģ primer oositlerin tümü, 1. mayoz bölünmeye girmiģ ve her biri ayrı ayrı tek katlı yassı follikül hücreleri ile çevrelenmiģtir. Ortada bir primer oosit ve çevresinde birbirlerine desmozom tipi bağlantılarla tutunmuģ tek katlı yassı epitel hücreleriyle sarılı bu yapıya primordiyal follikül denir. Primordiyal follikül çevre dokudan belirgin bir bazal lamina ile ayrılmıģtır[18-21].

24 7 Doğum sonrası (postnatal) olgunlaģma Doğumda, tüm primer oositler 1. mayoz bölünmenin profaz evresinin diploten aģamasındadır. Bu evrede, oositler çekirdek kromatinin seyrek ve düzensiz bir yapılaģma gösterdiği dinlenme evresindedir. Primer oositler puberteye değin dinlenme evresinde kalırlar ve 1. mayoz bölünmeyi tamamlamazlar. Bu evre süresince, oositin olgunlaģması, follikül hücrelerince salgılanan oosit olgunlaģmasını baskılayan madde (OMI-oocyte maturation inhibitor) tarafından baskılanır[18-21]. Doğumda ovaryumlardaki primer oositlerin sayısı ila arasında değiģmektedir. Puberteye değin bunların büyük çoğunluğu atretik hale gelir ve puberte baģlangıcında oosit sayısı e kadar düģer. Bunların da 500 den daha azı üreme döngüsü içinde ovulasyon ile atılır. Diğerleri, farklı geliģim evrelerinde dejenere olup, atretik folliküller haline gelir. Geç olgunlaģan oositlerin bir kısmı 40 yıl süresince 1. mayoz bölünmenin profaz evresinde bekler[18-19]. Pubertenin baģlamasıyla, her ovariyal döngüde 5-15 arasında değiģen sayıda primordiyal follikül olgunlaģmaya baģlar. 1. mayoz bölünmenin profaz evresinin diploten aģamasında dinlenme halinde olan primer oosit büyümeye baģlar; oositi çevreleyen yassı follikül hücreleri kübikleģir; bu durumdaki follikül, tek sıralı follikül hücre katmanı içeren primer follikül olarak isimlendirilir. Daha sonra follikül hücreleri çoğalarak çok sıralı bir epitel katmanı oluģturur, çoğalan bu hücrelere granüloza hücreleri, oluģturdukları katmana ise granüloza hücre katmanı denir. Follikül bu haliyle çok sıralı follikül hücre katmanı içeren primer follikül olarak isimlendirilir[18-21]. Granüloza hücrelerinin çoğalması primer oosit lerce salgılanan aktivin denilen sinyal molekülünce sağlanır. Primer follikül çevresinde, stromal hücre ve bağ dokusu yoğunlaģarak teka follikülü denilen bir kılıf oluģturur. Bu arada granüloza hücreleri ve oosit, glikoprotein yapıda bir madde salgılayarak oosit in çevresinde zona pellusida denilen bir katman Ģekillendirir. Zona pellusida, homojen, koyu boyanan ve asidofilik özellikte bir kattır. Follikül büyümeyi sürdürürken teka follikül hücreleri, içte salgı yapan hücrelerden oluģan teka interna ve dıģta fibroblast benzeri hücreler içeren bağ dokusundan yapılı, fibröz bir kapsül olan teka eksterna denilen iki belirgin katman Ģeklinde farklanır. Aynı süreçte oosit in çevresindeki follikül hücreleri eldiven parmağı biçimindeki küçük

25 8 sitoplazmik uzantılarını, zona pellusida ya geçirip oosit zarının mikrovilluslarıyla iç içe girerler[18-21]. Folliküllerin büyümesi, hipofiz bezinden salınan follilkül uyarıcı hormon (FSH), büyüme faktörleri, epidermal büyüme faktörü (EGF), insülin benzeri büyüme faktörü (IGF-1) ile kalsiyum iyonlarının etkisine bağlıdır. GeliĢim ilerledikçe ve follikül büyüdükçe granüloza hücreleri arasındaki boģluklarda sıvı (likör follikülü) birikmeye baģlar. Bu boģlukların birleģmesiyle daha büyük bir boģluk (antrum) oluģur. Bu durumdaki folliküle sekonder (veziküler) follikül denir. BaĢlangıçta ay Ģeklinde olan antrum zamanla geniģler. Oositi çevreleyen granüloza hücreleri antrumun bir yanında bozulmadan kalarak kum yığını görüntüsündeki kümülüs ooforusu (cumulus oophorus) oluģtururlar. Olgun bir sekonder follikül 25mm veya daha büyük çaptadır. Ovulasyona yakın evrede follikül giderek büyür ve Graaf (olgun) follikülü oluģur. Gonadotropin Salgılatıcı Hormon (GnRH) artıģı LH ve FSH düzeyini düzenler ve bu sayede follikül ovulasyona gider. Pubertede GnRH salınımının baģlaması hipofiz bezinden FSH ve LH salınımını uyarır. Hipofiz bezi hormonlarının etkisiyle ovaryumda gün süren ovaryal (menstrüyal) döngü olaylanır. Her döngüde FSH etkisiyle 5-15 adet follikül geliģmeye baģlasa da bunlardan sadece bir tanesi tam olgunluğa ulaģabilir. Diğerleri geliģimin farklı evrelerinde dejenere olup atretik hale gelirler. Hangi follikülün o ay büyüme evresine gireceği ve hangisinin baskın follikül olarak seçileceğini belirleyen faktörler ise bilinmemektedir[18-21]. Follikül olgunlaģması tamamlanırken primer oosit 1. mayoz bölünmeyi tamamlar ve büyüklükleri farklı, ancak her biri 23 çift yapılı (2nDNA) kromozom içeren 2 yavru hücre oluģturur. Bu hücrelerden biri sitoplazmanın büyük bir kısmını içeren sekonder oosit, diğeri ise çok az sitoplazma içeren 1. kutup cismidir. Kutup cismi, oositin hücre zarı ile zona pellusida arasındaki perivitellin aralıkta yer alır. I. mayoz bölünme ovulasyondan hemen önce tamamlanır. Bundan hemen sonra ise sekonder oosit DNA eģleģmesi olmaksızın II. mayoz bölünmeye girer. Oosit II de bölünme mekiği oluģur. Kromozomlar ovulasyondan 3 saat önce metefaz plağında dizildiklerinde ovulasyon gerçekleģir ve oosit II ovaryumdan dıģarıya atılır. II. mayoz bölünme ancak oosit II, bir spermiyumla döllendiğinde tamamlanır. Döllenme gerçekleģmez ise, ovulasyondan 24 saat sonra dejenere olur. Bu sırada I. kutup cisimi de ikinci kez bölünebilir (18-21].

26 9 Ovaryumda, oogonyumlardan oosit II oluģuncaya değin gerçekleģen değiģimlere oogenezis denir[18] Ovaryumların Anatomisi Ovaryumların yapısı Ovaryumlar, pelvis boģluğunda (cavitas pelvis) arka duvarda sağda ve solda fossa ovarica da yerleģik, bademe benzeyen bir çift organdır. GeliĢimin erken evrelerinde karın arka duvarında yerleģik ovaryumlar, geliģimin ikinci ayından baģlayarak testis gibi pelvis boģluğuna inmeye baģlarlar. Ovaryum bu iniģini gebeliğin 7. ayında tamamlar ve küçük pelvis duvarındaki fossa ovarica (Krause çukuru) denilen çukurlara yerleģmiģ olur. Fossa ovarica, a. iliaca externa ile a. iliaca interna arasında bulunur. Alt ve önden, lig. latum uteri nin tabanı; yukarıdan, a.iliaca externa ve arkadan, üreterler ile sınırlanır. Çukurun dibinde ve peritonun (peritoneum) altından a.-v. obturatoria ile n. obturatorius geçer. Doğum yapan kadınlarda ovaryumlar daha aģağıda bulunur[22]. Tuba uterina nın arka alt kısmında yerleģmiģ, lig. latum uteri içinde bulunan ve pembemsi gri renkte olan ovaryumların yüzü puberteye değin periton ile örtülü olup düz ve parlaktır. Puberteden sonra matlaģır[22]. Ovaryumun, facies lateralis ve facies medialis olarak iki yüzü, margo liber ve margo mesoovaricus olarak iki kenarı ve extremitas tubaria ve extremitas uterina olarak iki ucu vardır[22]. Ovaryumlardan her biri; 5-6 g ağırlığında, cm boyda, yaklaģık 1 cm endedir. Facies medialis:ovaryumun tuba uterina ile örtülü olan kısmıdır. Tuba uterinanın infundibulum parçasıyla ovaryumun arka kısmı komģudur. Facies medialis, pelvis boģluğuna bakar. Ġnce bağırsak (intestinum tenue) ve sigmoid kolonla (colon sigmoideum) komģulukları vardır[22-23]. Facies lateralis:ovaryumun pelvis duvarına bakan yüzüdür. Bu yüz Paryetal periton (peritoneum parietale) aracılığıyla facies lateralis, fossa ovarica ya yerleģmiģtir[22-23].

27 10 Margo mesovaricus:ön kenardır. Bu kenarda Farre-Waldeyer çizgisi bulunmaktadır. Bu çizgi ovaryumu lig. latum uteriye bağlayan, mesovarium denilen bir periton katlantısının tutunduğu çizgidir. Ayrıca bu kenar üzerinde mesovarium içinde yer alan damar ve sinirlerin, organa girip çıktığı yer olarak bilinen hilum ovarii bulunmaktadır[22-23]. Extremitas tubaria:ovaryumların tuba uterina nın infundibulum parçası ile komģu olan üst ucudur. Fimbriae tubae ve lig. suspensorium ovari ismi verilen, içinde ovaryuma ait ven, arter ve sinirlerin yer aldığı periton kıvrımı bulunur [22-23]. Extremitas uterina:üst uçtan daha dar olan alt uçtur. Ligamentum ovarii proprii denilen ve fibröz dokudan yapılmıģ olan bir bağ, ovaryumun alt ucundan uterusun dıģ köģesine tutunur[22-23] Ovaryumların damarları Ovaryumların arterleri Ovaryumun arterleri, abdominal aorttan çıkan a. ovaricalardır. Aorta abdominalis ten ayrılan a. ovarica, lig. ovarii suspensorium içerisinde ilerler. Daha sonra mesovarium a gelir ve a. uterina nın bir dalı olan ramus ovaricus ile anastomoz yapar. Ovaryuma arterler, hilum ovarii den girer; folliküllerin çevresinde kapiller ağları oluģturur. Damarların çapı döngü evrelerine göre farklılık göstermektedir. Damarlar folliküllerin geliģimi sırasında geniģler, ovulasyondan sonra ise daralırlar[22-23]. Ovaryumun venleri Ovaryumun venleri, arterleri izleyerek hilum ovarii den çıkarlar. Venler, plexus ovaricus denilen venöz bir ağ yaparlar. Bu ağdan ayrılan venlerin, bir bölümü plexus uterovaginalis e, diğerleri ise lig. ovarii suspensonum içerisindeki v. ovarica ya açılırlar. V. ovarica, a. ovarica larla birlikte uzanır. Sol tarafta v. ovarica v. renalis e, sağ tarafta v. ovarica ise v. cava inferior a açılırlar[22-23].

28 Ovaryumların lenf damarları Lenf damarları, lenf kapillerleri olarak baģlar. Kan damarlarıyla birlikte uzanırlar. Nodi lymphatici preaortici ve nodi lymphatici aortici lateralis lere açılırlar[22-23] Ovaryumların sinirleri Ovaryum un sinirleri, plexus hypogastricus inferior ve a. ovarica nın çevresindeki plexus ovaricus dan gelir. Parasempatikleri 10. kafa çifti n. vagus tan, sempatikleri ise n. splanchnicus minor ve bir kısım torakal medulla spinalis segmentlerinden gelmektedir[22-23] Ovaryumların Histolojisi Ovaryumların yüzeyleri tek katlı yassıdan kübiğe değiģen bir epitel ile örtülüdür. Bu epitel katmanı, embriyoda birkaç kez çoğalarak primer ve sekonder cinsiyet kordonlarını yapan peritonal mezotelden geldiği için germinal epitel (epitelyum germinale) ismini alır. Germinal epitel hücrelerinin peritona bakan yüzünde mikrovilluslar ve az sayıda kinosilyalar gözlenir. Epitelin altında tunika albuginea ismi verilen damardan yoksun, düzensiz sıkı bağ dokusundan bir katman bulunur [20-21,24-26]. Histolojik kesitlerde ovaryumlarda iki bölge ayırt edilir. Bunlar, dıģta korteks (cortex), içte medulla katmanlarıdır Ovaryum medullası Kan ve lenf damarları ile kalın sinir demetlerinden zengin, açık renk boyanan iç bölgedir. Elastik liflerden zengin, hilus yakınında birkaç düz kas hücresi içeren fibroelastik gevģek bağ dokusu yapısındadır. Ġnsan ovaryum medullasında menstrüasyon öncesi östrojen salgılayan küçük gruplar halinde epiteloit intersitisyel hücreler bulunur. YaĢamın ilk yıllarından baģlayarak ve ergenlik çağının erken evreleri süresince folliküler atreziye koģut olarak interstitial hücrelerin sayısı artar ve interstitial bezler oluģur. Ovaryum medullasındaki diğer epiteloit hücre grubu ise, küçük adacıklar halinde hilusta gözlenen, hilus hücreleridir. Bunlar, testis in Leydig hücrelerine (endocrinocytus interstitialis)

29 12 benzerler ve sitoplazmalarında yağ damlacıkları, lipofüskin pigmenti, Reinke kristallerini içerirler ve androjen salgılarlar[20-21,24-26] Ovaryum korteksi Ovaryumun medulla bölgesini sarar ve dıģ kısımda bulunur. Korteks, stroma ve stroma içinde yerleģmiģ olan değiģik geliģim evrelerindeki ovaryum folliküllerini kapsar. Stroma, kollajen ve elastik liflerden, retiküler lif ağlarından ve iğsi bağ dokusu hücrelerinden yapılıdır. Korteksin bu interstisyel bağ dokusu germinal epitel altında sıkıģarak tunika albugenia yı oluģturur[20-21,24-26]. Ovaryum folliküllerinin çevresinde stromada dağılmıģ olarak düz kas lifleri izlenir. Folliküller (folliculi ovari) ortada bir oosit ve bunun çevresinde tek ya da çok sıralı follikül (granüloza) hücreleriyle çevrili yuvarlak ya da oval yapılardır [20-21,24-26] Ovaryum follikülleri Yeni doğan bir çocuğun her iki ovaryumunda toplam adet follikül bulunur ve bunlar 40 mikron çapındadırlar. Menapozdan sonra bu folliküllerden çok az bir kısmı dejenere olmadan kalır. Puberteden baģlayarak her 28 günde bir ovaryumlardan bir oosit atılır. Bir kadının üreme süreci yıl kadardır ve bu sürede ortalama 450 oosit ovulasyonla atılır [20-21,24-26]. Ovaryumlarda histolojik olarak 3 tip follikül bulunur; 1. Primordiyal Follikül, 2. Büyüyen Follikül i. Primer Follikül ii. Sekonder (Antral) Follikül, 3. Olgun (Graaf) Follikül. Primordiyal follikül Ovaryum follikülleri, bir oosit ve onu çevreleyen follikül hücrelerinden oluģurlar.

30 13 Primordiyal folliküller, fötal yaģamın 3. ayında belirirler. Tunika albugineanın hemen altında korteks stroması içinde bulunurlar. Primordiyal folliküllerde primer oosit tek sıra yassı follikül hücreleriyle sarılmıģtır. Follikül hücreleri dıģtan belirgin bir bazal lamina üzerine oturmuģlardır. Bu aģamada follikül içindeki primer oosit yaklaģık 25 μm çapındadır. Hücrede çekirdek bir kenara daha yakın yerleģiktir ve belirgin çekirdekcik kapsar. Oosit sitoplazmasında Balbiani cisimcikleri izlenir. Balbiani cisimcikleri, Golgi kompleksi zar ve vezikülleri, endoplazmik retikulum (ER) tubulusları, birçok mitokondriyon ve lizozomların birikmesiyle oluģumlar[20-21]. Büyüyen folliküller Primer follikül Primordiyal follikül büyüyen follikül aģamasına geldiğinde follikül hücreleri, oosit ve stromada değiģiklikler olaylanır. Ġlk olarak oosit büyür ve bunu saran follikül hücreleri kübikleģir. Follikül hücreleri kübik yapıya farklılaģtığında bu folliküle tek sıralı follikül hücre katmanı içeren primer follikül (unilaminar) denir [20-21,24-26]. Follikül hücreleri daha sonra primer oositin salgıladığı bir sinyal molekülü olan aktivin etkisi ile mitoz bölünme ile çoğalarak, primer oositin çevresinde üst üste sıralanırlar. Bu yapıya çok sıralı follikül hücre katmanı içeren primer follikül (multilaminar) ismi verilir. Çok katlı hale gelen follikül hücrelerine granüloza hücreleri, bunların oluģturduğu kata da stratum granulozum denir. Stratum granulozum çok katlı bir epitel olarak kabul edilir ve dıģ sınırlayıcı membran denilen bir bazal membrana oturur [20-21]. Oosit büyüdükçe, yapısında belirgin değiģiklikler olur. Golgi kompleksi sayıca artar. Granüllü endoplazmik retikulum tubulusları geniģlerken serbest ribozomlar sayıca çoğalır. Mitokondriyonlar tüm sitoplazmaya dağılırlar. Oosit ile stratum granulozum birbirinden ayrılır. Arada, asidofilik, ıģık kırıcı ve homojen bir kat olan zona pellusida belirir. Zona pellusida ıģık mikroskobunda ilk olarak oositin etrafı kübik ya da silindirik follikül hücreleri ile çevrildiğinde ve oosit çapı μm ye ulaģtığında görülür. Jel kıvamında, glikozaminoglikan ve glikoprotein yönünden zengin bir yapıda olan zona pellusida büyümekte olan oosit ve çevresindeki follikül hücrelerince sentezlenir. Zona pellusida, ZP1, ZP2 ve ZP3 denilen 3 farklı glikoproteinden oluģur. Oosit ve stratum granulozumun

31 14 en iç katındaki hücrelerin apikal zarlarından mikrovilluslar ve sitoplazmik uzantılar zona pellusida içinde birbirlerine doğru uzanırlar. Oosit ve granüloza hücre katmanında bu değiģiklikler oluģurken, follikülün hemen bitiģiğindeki stroma da, teka follikülü (thecae folliculi) katını oluģturmak üzere farklılaģır. Bu katman daha sonra teka interna ve teka eksterna olarak iki alt kata ayrılır [20-21,24-26]. Sekonder (antral) follikül Sekonder ve daha sonraki folliküllerin geliģimi follikülleri uyaran hormon etkisinde olaylanır. Primer follikülün çapı 200 μm ye ulaģıp 6-10 sıra granüloza hücresi ile çevrelendiğinde granüloza hücrelerinin aralarında hücreler arası aralıkta follikül sıvısı (likör folliküli) birikmeye baģlar. Sıvıyı içeren küçük boģluklar birbirleriyle birleģip daha büyük bir boģluk olan antrumu (antrum folliculare) oluģtururlar. Bu hale gelen follikül sekonder (ikincil follikül) ya da antral follikül olarak isimlendirilir. Follikül sıvısı plazma bileģenleri ve follikül hücrelerince salgılanan maddeleri içerir. Bu sıvıda glikozaminoglikanlar, steroid-bağlayıcı proteinleri de kapsayan yüksek yoğunlukta steroidler bulunur [20-21,24-26]. Antrumun geliģmesiyle birlikte follikülü çevreleyen ovaryumun interstisyel bağ dokusu da oosit-granüloza kompleksinin salgıladığı büyüme faktörlerinin etkisiyle ileri farklanmaya baģlar ve teka katmanları belirginleģir [20-21,24-26]. Teka interna: Ġç tarafta bulunan, zengin bir kapiller ağ içeren, ve salgı yapan hücrelerden oluģan katmandır. Teka interna hücrelerinde çok sayıda LH reseptörü vardır. LH uyarımına yanıt olarak, östrojenin öncüsü olan androjenleri sentezler ve salgılarlar [24,26]. Teka eksterna: Bağ doku hücrelerinden yapılmıģ stromaya bakan dıģ katmandır. Düz kas hücreleri ve enine düzenimli kollajen lif demetlerinden oluģur. Teka katmanları arasında ve teka eksterna ile çevre stroma arasındaki sınır belirgin değildir. Bununla birlikte granüloza hücreleri ile teka katmanı arasında bulunan bazal lamina bu iki katı kesin Ģekilde ayırır [24,26]. Sekonder follikülün boyutu arttıkça granüloza hücre katmanı ile çevrili olan antrumun da geniģliği artar ve oosit antrumun bir tarafına doğru itilir. Granüloza hücre katmanı oositi

32 15 çevreleyen bölge dıģında her bölümde aynı kalınlıktadır. Oosit çevresinde ise granüloza hücrelerinin oluģturduğu tepe Ģeklindeki yapıya kümülüs ooforus (cumulus ooforus) ismi verilir [20-21,24-26]. Olgun (graaf) follikül Birkaç sekonder follikül olgun follikül oluģturmak için geliģmeyi sürdürür ve Graaf (tersiyer, preovulatuar) follikülünü oluģturur. Graaf follikülünde granüloza hücreleri çoğalır, antrum geniģler ve follikül sıvısı ile dolar. Ovulasyondan hemen önce follikülün çapı 2,5 cm ye ulaģır. Bunlar ovaryum yüzeyinde çıkıntı oluģtururlar. Graaf follikülü en dıģtan saran bazal membran kalın, homojen ve saydamdır. Buna camsı zar denir. Graaf folliküllü döngünün baģlangıcından baģalayarak günde oluģurlar [20-21,24-26]. Atretik folliküller Atretik folliküller ovaryumda fötal evreden baģlayarak menapozun birkaç yıl sonrasına değin ovaryumda oluģurlar. Genelde menstrüal döngü süresince her ovulasyonda bir oosit atılır. Tüm yaģam süresince, çok sayıda çeģitli evredeki folliküllerden yalnızca % 0,1 i olgunlaģıp ovulasyona uğrar. Bu nedenle ovaryum folliküllerinin büyük bölümü, follikül hücreleri ve oosit in ölümüyle geriler ve fagositoz yapan hücrelerce ortadan kaldırılırlar. Bu iģlev sırasında granüloza hücrelerinde mitoz bölünme durur, granüloza hücreleri bazal membrandan ayrılır ve yozlaģırlar [20-21] Ovulasyon Ovulasyon, puberteden menapoza değin her 28 günde bir olaylanır. Ovulasyon iki kanama arasındaki döngünün ortasında olaylanır. Ovulasyon, döngünün genelde 14. gününde gerçekleģir ve bir oosit atılır. Aynı anda birkaç oositin atıldığı da olur [20-21,24-26]. Menstrüal döngünün 14. gününde granüloza ve teka hücrelerinden salgınan östrojen hormonu etkisiyle kandaki östrojen hormon düzeyi artar. Bu da uterus endometriyumunun folliküler ya da proliferatif evreye girmesi, servikal mukusun spermiyumların uterusa girmesine olanak verecek kadar incelmesi ve hipofiz bezini LH (luteinize edici hormon)

33 16 salgılaması için uyarır. LH nin döngünün tam ortasında aniden yükselmesiyle olgunlaģmayı destekleyen etkenlerin yoğunluğu artar ve o zamana değin diploten evresinde kalmıģ olan primer oositin I. mayoz bölünmesini tamamlamasını ve follikülün tersiyer evreye girmesini sağlar. Aynı zamanda II. mayoz bölünme baģlar ancak oosit ovulasyondan yaklaģık 3 saat öncesine değin II. metafaz evresinde duraklar. Bu sırada ovaryumun yüzeyinde bir kabarıklık oluģur ve bu kabarıklığın tam tepesinde stigma olarak isimlendirilen damarsız bir bölge belirir. LH nin yükselmesi kollajenaz yetisini arttırır ve follikülün çevresindeki kollajen lifler sindirilir. LH düzeyindeki ani artıģın bir diğer etkisi prostaglandin miktarının artmasıdır. Prostaglandin, ovaryum duvarında kas kasılmalarına neden olur. Oosit bu kasılmalarla çevresindeki granüloza hücreleriyle birlikte dıģarı atılır ve ovaryum un dıģında gezinir. Fimbriya ovarikaların hareketi ile oosit tuba uterina lümenine alınır[24-26]. Graaf follikülünde ovulasyon sonrasında bir iç basınç düģmesi gerçekleģir. Teka katmanlarından kan sızması ile kısa bir süre için follikül içine kan toplanır. Bu yapıya korpus rubrum (kırmızı cisim) denir[24-26] Korpus luteum Ovulasyondan sonra yırtılmıģ ve boģalmıģ follikül duvarında, teka katmanı ile birlikte içeriye doğru katlantılar oluģur. Granüloza hücreleri ve teka interna hücreleri büyüyüp irileģirler ve sitoplazmalarında lutein pigmenti birikir. Lutein pigmenti sarı renkli olduğu için bu yapıya sarı cisim ya da korpus luteum denir. Korpus luteumun geliģmesi sırasında granüloza ve teka interna hücreleri lutein hücrelerine dönüģürler [20-21,24-26]. Korpus luteum progesteron ve östrojen hormonları salgılar. Progesteron, östrojenik hormonların da katkısıyla, uterus mukozasının embriyonun implante olabilmesine uygun duruma geldiği sekretuar ya da progestasyonel evreye girmesini sağlar [24-26]. Döllenme olmazsa, ovulasyonu izleyen 9. günde korpus luteum eriģebileceği en büyük boyuta ulaģır ve ovaryum un yüzeyinde sarımsı bir çıkıntı Ģeklinde izlenebilir. Bundan sonra progesteron hormon üretimi azaldığı için yozlaģır ve menstrüal kanama baģlar. Buna menstrüasyon korpus luteumu denir [20-21,24-26].

34 17 Döllenme olaylanırsa korpus luteum büyüyerek gebelik korpus luteumuna dönüģür. Burada salgılanan progesteron ovaryumlarda yeni follikül geliģimini engeller. Gebelik korpus luteumu gebeliğin yaklaģık 4. ayına değin trofoblastlarca salgılanan insan koryonik gonadotropin hormonu (hcg) ile iģlevini sürdürür. Daha sonra bu görevi plasenta üstlenir[24-26]. Menstruasyon ve gebelik korpus luteum ları iģlevleri sonlanınca dejenerasyona uğrarlar. Yerlerini kollajen liflerden zengin bağ dokusundan yapılı, beyaz renkli bir yapı olan korpus albikans a (beyaz cisim) bırakırlar. Bu ovaryum içerisinde zamanla absorbe edilerek ortadan kaldırılır[21-22] Ovaryumların Fizyolojisi DiĢide erkek üreme sisteminden ayrıcalıklı olarak düzenli döngüsel değiģiklikler oluģur. Bu değiģiklikler, döllenme ve gebelik için belirli aralıklarla yapılan hazırlıklar olarak kabul edilebilir. DiĢi genital hormon sistemi, 3 ayrı hormon grubundan oluģmaktadır: 1. Hipotalamik serbestleģtirici hormon ya da gonadotropin serbestleģtirici hormon (GnRH). 2. Hipofiz bezi ön lobu hormonları olan Follikül Uyaran Hormon (FSH) ve LuteinleĢtirici Hormon (LH). Bu hormonların her ikisi de hipotalamusta sentezlenen GnRHserbestleĢtirici hormon etkisiyle salgılanırlar. 3. Ovaryum hormonları: Östrojen ve progesteron hormonlarıdır. Bunlar hipofiz bezi ön lobundan salınan FSH ve LH ye yanıt olarak ovaryumlardan salgılanırlar. Kadında aylık menstrüal döngü sürecinde, bu hormonların salınımları değiģiklik gösterir. Döngünün farklı evrelerinde bunların salgılanma hızları da farklıdır [27] Hipotalamus tan salgılanan GnRH Hipofiz bezi ön lobu hormonlarının çoğunluğu, hipotalamustan salgılanan serbestleģtirici hormonlarca denetlenir. Bunlar hipofiz bezi ön lobuna, hipotalamik-hipofizier portal sistem yoluyla ulaģırlar. Gonadotropinlerin uyarılmasında, serbestleģtirici hormon olan GnRH önemlidir. Hipotalamustan GnRH salgılanması sürekli değildir. Salgılanma 1-3

35 18 saatte bir olur ve birkaç dakika sürer. GnRH salınım sıklığını östrojenler arttırır, progesteron ve testosteron azaltır. GnRH sürekli salgılandığında hipofiz bezi ön lobunda baskılayıcı etki gösterir, FSH ve LH salgısı sıfıra değin düģer. Buna koģut olarak, GnRH nin sürekli salgılanmaması hormonun iģlevselliğinde önem taģır [27-28]. GnRH nin salgılanması hipotalamusun orta-alt bölgesinde arkuat çekirdeklerde sinirsel uyarı sonucu gerçekleģir. Bu nedenle, arkuat çekirdekler diģilerde cinsel erklerin çoğunu denetlemektedir. Bunun yanında ön hipotalamusun preoptik bölgesinde yerleģik nöronların orta düzeyde GnRH salgıladığı da belirlenmiģtir[27-28] Hipofiz bezi ön lobu hormonları (FSH ve LH) Menstrüal döngü sürecinde ovaryumlardaki değiģikliklerin tümü hipofiz bezi ön lobundan salgılanan gonadotropik hormonlar, FSH ve LH a bağlıdır [27-28]. Gonadotropik hormonlarla uyarılmayan ovaryumlar inaktiftir. Ovaryumlar fötal yaģam süresince plasentadan salınan, bir diğer gonadotropik hormon olan koryonik gonadotropinle (hcg) uyarılıp iģlev görürler. Ancak doğumdan birkaç hafta sonra bu uyarı ortadan kalkar ve ovaryumlar puberte öncesine değin inaktif durumda kalırlar[27-28]. FSH ve LH molekül ağırlıkları yaklaģık 30 bin olan küçük glikoprotein yapıdaki hormonlardır. Bunlar, ovaryumlardaki hedef hücreleri hücre zarlarında yerleģik özgül reseptörlere bağlanarak uyarırlar. Aktive olan reseptörler, bu hücrelerin salgı, büyüme ve çoğalma hızını arttırır. Bu uyarıcı etkilerin tümü hücre sitoplazmasındaki ikincil haberci siklik AMP (camp) sisteminin uyarılması sonucu gerçekleģir. camp, protein kinaz oluģumunu sağlar, daha sonra da çeģitli fosforilasyonlarda, anahtar enzim görevi yaparak pek çok hücre içi iģlevi hızlandırır [27-28]. Ovulasyon öncesinde, folliküllerden biri daha fazla büyümeye baģlar. Bu follikül bol miktarda östrojen hormonu salgılar ve östrojen, follikül üzerinde pozitif geribildirim etki yapar. FSH ve östrojenlerin birleģimi granüloza hücrelerinde FSH ve LH reseptör sayısının artmasına neden olur. Ayrıca teka interna hücrelerinde daha az bir pozitif geribildirim etki yaratır. Bu etkiler birlikte, hızlı geliģen follikülün sıvı ve hormon salgısının, patlamalar Ģeklinde hızla yükselmesine neden olur. Ayrıca follikülden salgılanan büyük miktarlardaki

36 19 östrojen, hipofiz bezi ön lobundan daha fazla FSH salgılanmasını baskılamak için, hipotalamusu etkiler. Bu yolla kendi pozitif geri bildirim uyarısıyla, geride kalan az geliģmiģ folliküllerin, daha da geliģmesini engeller[27-28]. Ovulasyonda LH un önemi ve yükseliģi LH, follikül büyümesinin son evresinde ve ovulasyon anında gerekli bir hormondur. Bu hormon olmadığında, çok büyük miktarlarda FSH olsa bile, follikül ovulasyon evresine değin geliģemez. Ovulasyondan yaklaģık 2 gün önce, hipofiz bezi ön lobunun LH salgısı yükselir. Bu artıģ ovulasyondan yaklaģık 16 saat önce, 6 ila 10 kat artar. FSH da aynı süreç içinde 2-3 kat yükselir. Böylece iki hormon aynı anda, birlikte etki ederek ovulasyon öncesi son birkaç günde, follikülün hızla büyümesini sağlar. LH ayrıca granüloza ve teka hücreleri üzerine de etki ederek, bu hücreleri daha çok progesteron ve daha az östrojen salgılayan hücrelere dönüģtürür. Bu nedenle, ovulasyondan yaklaģık bir gün önce, östrojen salgısı azalır ve küçük miktarda progesteron salgılanmaya baģlar. Follikülün büyümesi, eģ zamanlı olarak stigmanın dejenerasyonu, follikülün yırtılmasına ve oositin dıģarı atılmasına neden olur[27-28]. Oositin atılmasını izleyen ilk birkaç saat içinde, geride kalan granüloza ve teka interna hücreleri lütein hücrelerine dönüģür. Bu sürece luteinizasyon, oluģan yapıya da korpus luteum denir. Korpus luteumda granüloza hücreleri büyük miktarlarda progesteron ve östrojen hormonları salgılarlar. Teka hücreleri ise androstenedion ve testosteron gibi belirli androjenleri sentezlerler. Ancak bunların çoğu granüloza hücrelerinde kadın hormonlarına dönüģür. Granüloza ve teka interna hücrelerinin lutein hücrelerine dönüģümü, baģlıca hipofiz bezi ön lobundan salgılanan LH ye bağlıdır. Granüloza hücrelerinin luteinizasyonu, oositin ovaryumdan atılmasına koģut olaylanır. Luteinizasyonu, ovulasyonun sonuna değin denetleyen bir diğer etken, follikül sıvısında bulunan, luteinizasyonu baskılayıcı faktördür. Bu nedenle ovulasyon olaylanıncaya değin follikülde korpus luteum geliģmez. Ovulasyondan yaklaģık 12 gün sonra ise follikül, korpus albigansa dönüģür ve birkaç hafta içerisinde yerini bağ dokusuna bırakır[27-28]. Ovulasyonda salgılanan LH öncelikle granüloza ve teka hücrelerinde luteinizasyona neden olur. OluĢan lutein hücreler çoğalma, geniģleme, salgı ve yozlaģma sırasına göre programlanırlar. Hipofiz bezi ön lobunda LH artık salgılanmasa bile, bu süreç devam eder.

37 20 4 ila 8 gün sonra sonlanır. Diğer yandan, LH nin etkisiyle korpus luteumun büyümesi artar ve salgısı çoğalır. Gebelik gerçekleģtiğinde LH ile hemen hemen aynı özelliklere sahip diğer bir hormon olan koryonik gonadotropin (hcg) plasenta dan salgılanır. Bu hormon korpus luteum a etki ederek yaģamını uzatır ve genelde gebeliğin ilk 2-4 aylık süresinde devamını sağlar[27-28]. Menstrüal döngünün luteal evresinde, korpus luteumdan salgılanan özellikle östrojen ve östrojene oranla daha az progesteron hormonları, hipofiz bezi ön lobu üzerinde önemli geri bildirim etkisi yaratarak, FSH ve LH nin düģük dozda salgılanmasını sürdürür. Luteal hücreler küçük miktarlarda da olsa inhibin hormonu salgılarlar. Bu hormon özellikle hipofiz bezi ön lobundan FSH salgılanmasını baskılar. FSH ve LH nin kanda düģük düzeylere inmesi ve bu hormonların üretilmemeleri halinde korpus luteumun tümü dejenere olur. Bu olaya korpus luteumun gerilemesi (involasyon) denir. Korpus luteumdan östrojen, progesteron ve inhibin hormonları salgılanmadığı anda hipofiz bezi ön lobu üzerinde baskılayıcı geri bildirim (feedback) etkisi ortadan kalkar ve bez yine bir miktar FSH ve birkaç gün sonra da daha yavaģ artıģlarla LH salgılamaya baģlar. FSH ve LH yeni bir menstrüal döngüde yeni folliküllerin büyümesini baģlatır. Ancak, bu folliküller yeterince geliģme gösteremezler, çünkü östrojen ve progesteron yokluğu uterusta menstruasyonu olaylatır[27-28] Ovaryum hormonları (östrojen ve progesteron) Ovaryum hormonlarından olan östrojenlerin en önemlisi östradiol hormonu, progestinlerin en önemlisi de progesterondur. Östrojenler vücutta baģlıca ikincil kadın cinsiyet özelliklerini veren özgün hücrelerin çoğalma ve büyümesini sağlarlar. Diğer yandan progestinlerin tümü uterusun gebeliğe, meme bezlerinin de laktasyona hazırlıklarını yürütürler[27-28].

38 21 Östrojenler Östrojenlerin yapısı Kadın plazmasında önemli oranlarda 3 tip östrojen görülür. Bunlar 17β östradiol, östron ve östriyoldür. Bunlar A halkalarında 10. karbona bağlı açısal bir metil grubu ya da bir 4-3- keto yapısı içermeyen 18 karbonlu steroidlerdir[27-28]. Ovaryum lardan salınan en önemli östrojen 17β östradioldür. 17β östradiolün östrojenik gücü östrona karģın 12 kat, östriyole göre 80 kat daha fazladır. Bu nedenle östradiolün en önemli östrojen olduğu, buna karģın östronun östrojenik etkisinin düģük düzeyde olduğu söylenebilir. DolaĢımdaki östradiol ün %2 si serbesttir. Kalanı ise, %60 ı albümin e, %38 i testosteron u da bağlayan gonadal steroid bağlayıcı globulin (GBG) olarak proteinlere bağlıdır[27-28]. Östron ise çoğunlukla, böbreküstü bezi korteksi ve ovaryum teka interna hücrelerinden salgılanan androjenlerin periferik dokulardaki dönüģümlerinden kaynaklanır. Östron dolaģımda 17β östradiol ile denge halindedir. Östron daha sonra östriyole dönüģür. Bu dönüģümün büyük bir kısmının karaciğerde gerçekleģtiği düģünülmektedir[27-28]. Östriyol zayıf bir östrojen dir ve özellikle karaciğerde, östradiol ve östron un oksidasyon ürünü olarak ortaya çıkar[27-28]. Östrojenler ovaryum larda teka interna, granüloza hücreleri ve korpus luteumlardan salgılanırlar. Biyosentetik yolla androjenlerden oluģurlar. DolaĢımdaki androstenedion un aromatizasyonu ile sentezlenirler. Aromataz androstenedion un östrona, testosteron un ise östradiol e dönüģümünü katalizler. Teka interna hücrelerinde çok sayıda LH reseptörü vardır ve LH, camp üzerinden etki göstererek kolesterol ün androstenedion a dönüģümünü arttırır. Androstenadion un bir kısmı östradiol e dönüģür ve östradiol dolaģıma geçer. Teka interna hücreleri aynı zamanda granüloza hücrelerine de androstenedion sağlar. Androjen sağlanınca, granüloza hücreleri östradiol sentezler. Granüloza hücrelerinde ise çok sayıda FSH reseptörü vardır. FSH, camp üzerinden etki göstererek aromataz yetisini arttırıp bu hücrelerin östradiol salgısını güçlendirir. OlgunlaĢan granüloza hücreleri LH reseptörleri de kazanır ve LH östradiol yapımını uyarır.

39 22 Ovaryumun stromal dokusu da androjen ve östrojen sentezleyebilir. Ancak bu sentez menopoz öncesindeki normal kadınlarda önemsiz miktarlarda gerçekleģir[27-28]. Menstrüal döngü sırasında plazma östradiol düzeyinde gözlenen değiģikliklerin tümü ovaryum kökenlidir. Salgının 2 tepe değeri olup biri ovulasyondan hemen önce, diğeri luteal evrenin ortasındadır. Östradiol ün salgılanma hızı erken folliküler evrede 36 μg/gün (133 μmol/gün), ovulasyondan hemen önce 380 μg/gün, luteal evrenin ortasında 250 μg/gün dür. Menopozdan sonra östrojen salgısının düzeyi düģer [27-28] Östrojenlerin yıkımı karaciğerde gerçekleģir. Karaciğer östrojenleri, glukuronid ve sülfatlar halinde bağlar. Bağlı ürünlerin beģte biri safra ile geri kalanın çoğu idrarla atılır. Bunun yanında, karaciğer kuvvetli ösrojenler, östradiol ve östronu tümüyle etkisiz-östrojen olan östriyol e dönüģtürür[27-28]. Östrojenlerin işlevi Östrojen ler çocukluk evresinde çok az miktarlarda salgılanırlar; pubertede ise salgılanan miktar hipofiz gonadotropik hormonların etkisi altında 20 kat ya da daha yüksek oranda artıģ gösterir. Bu sırada kadının genital organları çocuk görüntüsünden eriģkin görüntüsüne dönüģür. Puberte sonrası, birkaç yıl içinde uterusun boyutları iki ya da üç kat artar. Östrojenler endometriyal stromada belirgin hücre çoğalmasına ve endometriyal bezlerde büyümeye yol açarak, daha sonraki günlerde implante olacak blastosistin beslenmesine yardımcı olurlar. Ayrıca, östrojenler vajina epitelini kübik Ģekilden, çok sıralı epitel haline dönüģtürerek, puberte öncesine karģın dıģ etkilere ve enfeksiyonlara daha dayanıklı hale getirir[27-28]. Östrojenler uterus endometriyumuna yaptıkları etkinin benzerini, tuba uterinalardaki mukoza katmanlarına da yaparlar. Salgı oluģturan hücrelerin çoğalmasında ve daha da önemlisi, lümene uzanan silyalı epitel hücrelerinin sayısında artıģ sağlarlar. Memede stromal dokuyu geliģtirir, kanal sistemlerinin geliģmesini ve yağ birikmesini uyarırlar. Meme baģlarının (areola) pigmentasyonuyla yükümlüdürler. Meme bezlerinde lobul ve alveollerin geliģimi, tek baģına östrojen etkisiyle gerçekleģmez. Bu yapıların geliģiminin tamamlanması ve iģlevsel özelliklerini kazanabilmesi için progesteron ve prolaktin hormonlarının desteği de gerekmektedir[27-28].

40 23 Östrojenler osteoblastik erki arttırırlar. Bu nedenle, pubertede kadınların üreme evresine girmesiyle birlikte birkaç yıl, büyüme son derece hızlıdır. Bunun yanında, uzun kemiklerin epifizlerinin erken birleģmesine yol açar. Bu etki erkekte testosteronun etkisine eģdeģdir; ancak kadında çok daha kuvvetlidir[27-28]. Östrojenler vücutta metabolik hızı zayıf olarak arttırırlar. Bu artıģ, erkek seks hormonu testosteronun etkisine karģın 1/3 oranda daha düģüktür. Bunun yanında deri altı yağ dokusunu arttırıcı etkisi de bulunmaktadır. Östrojenler yağın göğüs, derialtı ve kalçalarda birikmesine yol açar[27-28]. Östrojenler puberte sonrasında pubis ve aksillar bölgede kılların çoğalmasını sağlarlar. Bu olayın baģlıca yükümlüsü, puberte sonrasında kadın böbreküstü bezinden fazla miktarda östrojen salgılanmasıdır. Bununla birlikte, kıl büyümesi östrojenlerden çok androjenlere bağlıdır. Derinin yumuģak ve genelde düzgün olmasını sağlarlar ayrıca normale karģın daha çok damarlanmasına neden olurlar. Bu durum derinin daha sıcak olmasına ve erkeğe karģın kanlanmanın daha çok olmasına etki eder. Puberte sonrasında, böbreküstü bezi androjenlerinin artması, aksiller ter bezlerinin daha fazla salgı yapmasına ve akneye yol açar[27-28]. Östrojenler, aldosteron ve diğer adrenokortikal hormonlar gibi, böbrek tübüllerinde sodyum ve suyun geri emilimine neden olur. Ayrıca östrojen ler salgılandıktan sonra, hedef hücrelere ulaģmadan birkaç dakikalık süre içinde dolaģımda kalırlar. Hücrelere girdikten sonra saniyede sitoplazmada bir reseptör proteinle birleģirler ve çekirdeğe geçerler. Bu da kromozomal DNA nın özgül bölümüyle etkileģerek, transkripsiyon iģlemini baģlatır[27-28]. Progestinler Progestinler içinde en önemli hormon 21 karbonlu progesterondur. DüĢük düzeylerde bulunan bir diğer progestin, 17α- hidroksiprogesterondur. Bu hormon progesteronla birlikte salgılanır ve aynı etkiye sahiptir. Bu nedenle progesteron tek önemli progestin olarak kabul edilmektedir[27-28].

41 24 Progesteron hormon yapısı Gebe olmayan normal bir kadında, progesteron ovaryal döngünün ikinci yarısında korpus luteumdan salgılanır. Döngünün ilk yarısında plazmada bulunan düģük düzeydeki progesteron, eģit olarak ovaryumlar ve böbreküstü bezi korteksinden salgılanır. Gebelik sırasında özellikle gebeliğin 4. ayından sonra plasentadan progesteron salgılanır. Progesteron steroid hormonları salgılayan tüm dokulardaki steroid biyosentezinin bir ara üründür. DüĢük düzeylerdeki progesteron testis ve böbreküstü bezi korteksinden de dolaģıma katılır. Ovaryum folliküllerinden östrojenler ile birlikte 17α-hidroksiprogesteron da salgılanır ve 17β-östradiolün salgısına eģdeģdir. DolaĢımdaki progesteron un yaklaģık %2 si serbesttir, %80 i albumine, %18 i ise kortikosteroid-bağlayıcı globuline bağlıdır. Yarı ömrü kısa olan progesteron karaciğerde pregnanediole dönüģtürüldükten sonra glukuronik asit ile birleģtirilip idrarla atılır [27-28]. Progesteron hormonunun işlevi Progesteron un en önemli iģlevi kadın menstrüal döngüsünün ikinci yarısında uterus endometriyumunda salgılama ile ilgili değiģimleri baģlatarak, uterus u blastosistin implantasyonuna hazırlamaktır. Ayrıca uterus kasılmalarının Ģiddetini ve frekansını azaltarak implante blastosistin atılmasını engeller [27-28]. Progesteron, tuba uterina mukozasında salgılama ile ilgili değiģimleri baģlatır. Salgı, döllenmeden sonra tuba uterinada ilerleyen zigotun implantasyondan önce beslenmesi için gereklidir [27-28]. Progesteron alveol hücrelerinin çoğalmasıyla memelerdeki lobül ve alveollerin geliģimini hızlandırır. Böylece memeler büyüyerek salgı oluģturan bir yapı kazanırlar [27-28]. Yüksek düzeylerdeki progesteron östrojenler, testosteron ve adrenokortikal hormonlar gibi böbrek distal tubuluslerinden sodyum, klor ve suyun geri emilimini arttırır [27-28] Polisiklik Aromatik Hidrokarbonlar (PAH) Polisiklik aromatik hidrokarbonlar iki ya da daha fazla benzen halkası içeren hidrofobik özellikleri olan organik bileģiklerdir.[2-3] Doğal olarak, orman yangınları ya da volkanik

42 25 patlamalarla oluģurlar. Ġnsan kökenli oluģumlarında ise endüstriyel kaynaklar (çöp yakma, çimento fabrikaları, petrol rafinerileri, kok kömürü ve asfalt üretimi, alüminyum, demir çelik üretimi), motorlu taģıtlar ve sigara rol oynamaktadır. Isınma ve enerji erekli kullanılan kömür, odun gibi katı yakıtlar ve fosil yakıtlar da PAH oluģumuna neden olmaktadır. Sigara ile ortaya çıkan PAH miktarı diğerlerine karģın daha azdır ancak insan sağlığı açısından en fazla tehdit oluģturan kaynaklar arasındadır.[4] Hidrofobik yapıları nedeniyle PAH ların sudaki çözünürlükleri azdır. PAH lar yüksek oranda lipofilik özelliğe sahiptir. Yapısında dörtten az benzen halkası bulunduran PAH lar hafif PAH, dört ve daha fazla halka içeren PAH lar ise ağır PAH olarak tanımlanır. Hafif PAH ların sudaki çözünürlükleri daha fazla ve buhar basınçları daha yüksektir. PAH ların molekül ağırlıkları arttıkça sudaki çözünürlükleri azalır, toksik ve kanserojenik özellikleri artar[29-31]. PAH lar toprakta, suda, havada ve gıda örneklerinde bulunurlar. PAH ların mutajenik, toksik ve kanserojenik etkileri olduğu bilinmektedir. Et ya da diğer yiyecekleri ızgarada yanacak Ģekilde yüksek sıcaklıklarda piģirmek, yiyeceklerdeki PAH miktarının artmasına neden olur [29,32]. Doğada 100 ün üzerinde PAH bileģiği bulunur. Ancak Amerika BirleĢik Devletleri Çevre Koruma Birimi (United States Environmental Protection Agency, US EPA) tarafından bunların 16 tanesi öncelikli kirleticiler arasında sayılmıģtır. Bunlar; Naftalin (Np), Asenaftelen, Asenaften (Ane), Floren (Flr), Fenantren (Phe), Antrasen, Floranten (Flu), Piren (Py), Benzo(a)antrasen (BaA), Krisen, Benzo(b)floranten (BbF), Benzo(k)floranten (BkF), Benzo(a)piren (BaP), Dibenzo(a,h)antrasen (DahA), Ġndeno(1,2,3-cd)piren(IcdP), Benzo(g,h,i)perilen dir [5]. Yanmanın tam olarak gerçekleģmemesi sonucunda oluģan PAH lar genelde tek bir bileģik olarak değil yanma ürününün kompleks bir karıģımı olarak ortaya çıkarlar. AraĢtırma erekli saf bir bileģik olarak da üretilebilirler. Saf bileģik halinde PAH lar renksiz, beyaz, açık sarı yeģil renkli, katı halde ve hafif hoģ bir kokudadır. AraĢtırma için üretilen PAH lar dıģında bu bileģiklerin çoğunluğunun bir kullanım alanı bulunmaz. Birkaç PAH bileģiği sağlık alanında ve pestisit, boya ya da plastik üretiminde kullanılmaktadır[33,34].

43 Benzo(a)piren (B(a)P) Benzo(a)piren in yapısı 3,4-benzopirene, kimyasal formülü C20H12, moleküler ağırlığı g/mol, kaynama noktası 495 o C, erime noktası 179 o C, yoğunluğu 1.24g/cm 3 olan, sarı renkli, kokusuz, mutajenik ve karsinojenik özellik gösteren bir polisiklik aromatik hidrokarbondur. Benzo(a)piren pratik olarak suda çözünmez [6-7]. Endüstriyel olarak aluminyum, grafit, kömür, benzin ve asfalt üretimi sırasında ortaya çıkarak atmosferde ve endüstriyel çevrede kirliliğe yol açarlar. Ġnsanların BaP a etkin kalması, özellikle bu maddeyle bulaģık gıda ve suların alınması ya da kirli havada ve sigara dumanında bulunan partiküllerin solunması yoluyla olmaktadır [35-36]. BaP ilk olarak havaya salınır, sonra fotooksidasyon ile atmosferden yayılır, daha sonra toprakta ve suda kuru olarak çöker. BaP için tahmin edilen yarı ömürler; atmosferde 1-6 saat, suda 1-8 saat, sedimentlerde 5-10 yıl, toprakta aydan daha fazladır[7]. Deney hayvanı çalıģmalarında BaP a soluma yoluyla etkin kalmanın solunum sistemi tümörü, ağız yoluyla etkin kalmanın ise mide tümörü, lösemi ve akciğer tümörlerine neden olduğu belirtilmiģtir. Toksikolojik ve epidemiyolojik çalıģmalara göre gebeliğin organogenezis evresinde PAH lara etkin kalma, yavrulamayı ve yavrunun geliģimini baskılayıcı sonuçlara neden olabilir. BaP a ağız yoluyla etkin kalmanın yeniden gebe kalmayı azalttığını ve aynı Ģekilde döllenmede de azalmaya neden olduğu belirtilmiģtir. Aynı zamanda, BaP a ağızdan etkin kalmanın hayvanlarda bir kerede doğan yavru sayısını azalttığı ve doğan yavruların vücut ağırlıklarında azalmaya neden olduğu bildirilmiģtir[8-9]. Benzo(a)piren in metabolitik erki Benzo(a)piren, biyolojik etkilerini oluģturmadan önce, reaktif maddeleri oluģturmak için metabolik olarak bir aktivasyon geçirir. BaP ın kanserojenik ve mutajenik etkisi; hücresel makromoleküllere bağlanan mikrozomal karıģık iģlevli oksidazlarca (MFO) oluģturulur. BaP, MFO grubunda yer alan sitokrom p-450 enzimlerince metabolik aktivasyona uğrar ve

44 27 son olarak, benzo(a)piren7,8 diol-9,10-epoksit olarak isimlendirilen karsinojen Ģekline dönüģür [37-39]. Ġlk aģama sitokrom P450 enzimlerince katalizlenir ve bunda (+/-)-benzo(a)piren-7,8-oksit oluģur. Ġkinci aģama ise epoksithidroksilaz enzimlerince katalizlenir ve ilk oluģan ürün (+/- )-benzo(a)piren-7,8 dihidrodiole dönüģür. Son olarak sitokrom P450 enzimlerince katalizlenen tepkime sonucunda 7,8-diol-9,10-epoksit in dört izomerinden biri oluģur. OluĢan izomerlerin en önemlisi (7R,8S)-dihidroksi-(9S,10R)-epoksi-7,8,9,10- tetrahidrobenzo(a)pirendir (BPDE). BPDE, BaP ın oldukça reaktif bir metabolitidir, pro ve ökaryotik hücrelerde mutasyon ve sitotoksik etkilere neden olur [7,37-39]. BaP epoksitleri, DNA ile çok kolay nükleofilik yer değiģtirme tepkimeleri verirler. DNA üzerindeki nükleofilik kısımlar epoksit halkasını açarak tepkime verir ve BPDE ile kovalent bağ oluģturarak DNA nın alkillenmesine yol açarlar. DNA nın bu yoldan değiģimi, kanserin baģlamasına neden olur[40]. BaP metabolizmasının, bazı enzimleri uyarması sonucu süperoksit ve hidrojen peroksit gibi serbest radikaller oluģur. OluĢan serbest radikaller, oksidatif olarak değiģik hücre tiplerinde mitogenezisi ve hücre çoğalmasını baģlatırlar. Ayrıca proteinler, lipitler, DNA ve antioksidan enzimlere hasar verirler. BaP ın etkileri; aktivasyon ve detoksifikasyon metabolizmalarıyla azaltılıp, artırılabilir ya da ortadan kaldırılabilir Antioksidanlar Hücresel yaģamın sürekliliği karmaģık biyokimyasal tepkimelerin denge içinde yürümesine bağlıdır. Bu dengeyi bozacak yönde oluģan iç ya da dıģ kökenli etkenler hücre hasarına yol açarlar. Hücrede gerçekleģen radikal tepkimeleri, hücre homeostazının bir parçasıdır. Sağlıklı hücreler homeostatik olarak antioksidanların kullanılmasıyla serbest radikalleri ortadan kaldırırlar[41] Serbest radikaller ve etkileri Son yörüngelerinde bir ya da daha fazla eģlenmemiģ elektron içeren molekül, iyon yada bileģikler baģka moleküller ile etkileģime girerek bundan elektron alır ya da verirler.

45 28 Diğerleriyle kolaylıkla elektron alıģveriģine girebilen bu moleküllere serbest radikaller denir. Serbest radikallerin yarı ömürleri çok kısa olsa da yüksek derecede reaktiftir [12]. Serbest radikaller kimyasal olarak 3 Ģekilde oluģabilir: 1. Radikal olmayan bir molekülden tek bir elektron yitimi, X e- + X + 2. Radikal olmayan bir molekülün tek bir elektron kazanımı, X + e- X - 3. Homolitik yarılma. Normal bir molekülün kovalent bağının homolitik yarılması sonucu eģleģmiģ elektronlardan her birinin ayrı parçada kalması. X:Y X + Y Tüm hücrelerde metabolik yetiler sonucu aerobik hücre metabolizmasının bir ürünü olarak serbest radikaller oluģur. Canlı sistemindeki protein, lipid, DNA, karbonhidrat ve nükleotid koenzimler gibi yapılarla kolayca tepkimeye girerek hücre yapı ve iģlevlerine hasar verebilmektedir [42]. Serbest radikaller, canlı metabolizmasının doğal bir ürünü olarak ortaya çıkabildiği gibi çevre kirliliği, radyasyon, pestisitler, kontamine su, ısı, ağır egzersiz, inflamasyon, ateģli hastalıklar, hava kirliliği, sigara dumanı, kemoterapatik ajanlar gibi vücut dıģından gelen pek çok faktörün etkisi ile de oluģabilir [42-44]. Hücreleri hasara uğratabilen serbest radikal türleri; 1. Oksijen merkezli ajanlar, moleküler oksijen, süperoksit radikali, hidroksil radikali, alkoksil radikali, peroksil radikali. 2. Oksijen merkezli olmayan ajanlar; karbon merkezli olanlar (Lipid radikalleri, alkoksil radikalleri), kükürt merkezli olanlar (Thiyl), hidrojen merkezli olanlar (Hidrojen atomu), demir merkezli olanlar (Perferin radikali).

46 29 3. Reaktif oksijen metabolitleri (ROM); ozon, hidrojen peroksit, lipid peroksit, hipokloriz asit (HOCl), koraminler[45]. Hücrelerde iç ve dıģ kökenlere bağlı olarak da serbest radikaller oluģabilir. Ekzojen kökenli etmenler; iyonize ve iyonize olmayan radyasyon, antineoplastik ajanlar (nitrofurantoin, cisplatin, adriyamisin), hava kirleticileri, sigara dumanı, zehirli gazlar, doğal zararlı gazlar (ozon, oksijen), bazı ilaçlar, kanserojen maddeler, alkol, anestezikler, patojenik bakteri, virüsler ve pestisitler en önemli dıģ serbest radikal üretim kaynaklarıdır[46-47]. Endojen kökenli etmenler; metabolik olayların ilerleyebilmesi için metabolizmada, bazı biyokimyasal olayların çeģitli aģamalarında serbest radikaller üretilir. Bunlardan baģlıcaları, mitokondriyonlarda elektron taģınımı sırasında, endoplazmik retikulum ve çekirdek zarı elektron taģıma sistemleri sırasında, redoks döngüsünde, araģidonik asit metabolizması, fagositoz, otooksidasyon ve oksidan enzimlerin tepkimelerinde serbest radikaller açığa çıkar[46-47] Antioksidanların sınıflandırılması Antioksidanlar belirli özelliklerine göre sınıflandırılabilirler: Kökenlerine göre Endojen antioksidanlar: vücudun kendisinin serbest radikallere karģı ürettiği doğal bileģiklerdir. Süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz, bilirubin, ürik asit, sistein, histidin, albümin, hemoglobin, transferrin gibi bileģikler bu grupta yer alırlar[47-48]. Ekzojen antioksidanlar; vitamin, ilaç ve besin gibi dıģarıdan alınan bileģiklerdir. Ksantin oksidaz, NADPH ve NOS baskılayıcıları, lokal anestezikler, rekombinant süperoksit dismutaz, barbitüratlar bu grupta yer alırlar [47-48].

47 30 Çözünürlüklerine göre Suda çözünenler: Glutatyon, C vitamini, ürik asit gibi. Yağda çözünenler: A vitamini, E vitamini, ubikinonlar gibi [47-48]. YerleĢimlerine göre Hücre içinde bulunanlar; katalaz, peroksidaz, ferritin gibi. Plazma ve diğer hücre dıģı sıvılarda bulunanlar; transferrin, laktoferrin, seroloptazmin, haemopeksin, albumin gibi [47-48]. Yapılarına göre Enzimatik antioksidanlar Enzimatik olan antioksidanlar; sitokrom oksidaz, glutatyon redüktaz, SOD, katalaz, glutatyon peroksidaz, glutatyon-s-transferaz, hidroperoksidaz bu grupta bulunurlar [47-48,50]. Enzimatik olmayan antioksidanlar Enzimatik olmayan antioksidanlar; askorbik asit, seruloplazmin, retinoidler, glutatyon, askorbik asit, E vitamini, A vitamini, keratinoidler, ubikinonlar, flavanoidler, melatonin, ürik asit, albümin bu grupta yer alırlar [47-48,50] Antioksidan savunma düzenekleri Zincir kırıcı antioksidanlar, peroksit radikalleri ile doğrudan tepkimeye girerler ve zincir uzunluğunu gereken biçimde kısa tutarak peroksidasyonu engellerler. Antioksidan savunma sistemleri, serbest oksijen radikallerine karģı etkilerini 3 yolla gösterirler:

48 31 1. Radikal tepkimelerinin sona erdirilmesi: Bu antioksidanlar çeģitli radikalleri ortadan kaldırarak zincir tepkimelerinin ilerlemesine engel olurlar. Bunlar; A, C, E vitaminleri, ürik asit, bilirubin, ubikinon, selenyum vb. 2. Radikal oluģumunun sınırlandırılması: Serbest radikal öncüllerininin aktivasyonunu engelleyerek radikal üretimini önlerler. Metal iyonlarını bağlayan hücre dıģı antioksidanlardır. Bunlar; transferin, albümin, seruloplazmin, haptoglobin, hemopeksin vb. 3. OluĢan radikallerin detoksifikasyonu: Memeli hücrelerinde radikal detoksifikasyonunda SAD, katalaz, GSH peroksidaz görev alır. Glutatyon lu sistemin tamamlanması için GSH redüktaz ve Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz da devreye girmektedir [47-49] Curcumin Curcumin in tarihçesi Curcumin, Zingiberaceae (Zencefilgiller) ailesine ait Curcuma longa bitkisinin yumrularından elde edilir. Curcuma longa, tropik iklimlerde ve Hint yarımadasında doğal olarak yetiģmektedir. Kısa saplı uzun yaģamlı bir bitkidir. Boyları 100 cm e değin uzayabilmektedir. Eğri, oval ya da dikdörtgen Ģeklinde yapraklar ve güzel canlı beyaz çiçekler içerir. Bu bitkinin köklerinden elde edilen turmerik Hindistan'da yüzyıllardır yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, Çin ve diğer Asya ülkelerinde inflamasyon ve burkulmaların tedavisinde etkilidir. Turmeriğin aktif maddesi olan curcumin (difuruloylmetan) gıda sanayinde katkı maddesi, tatlandırıcı, koruyucu ve renklendirici ajan olarak hardal, margarin ve içeceklerde ayrıca portakal sarısı rengi ile gıda boyası olarak da kullanılmaktadır. Çok iyi bilinen ve sıklıkla kullanılan köri baharatının da esas yapısıdır[51]. Günümüzde, geleneksel tedavi ereğiyle kullanılan, bitkisel kökenli bileģiklerden biri olan, antioksidan özelliği bulunduktan sonra güncelliği artan ve geçmiģte sonsuz yaģam kaynağı olarak adlandırılan curcumin in (Turmeric) tarihi 5000 yıl öncesine dayanmaktadır. Ġlk olarak Marco Polo nun 1280 yılında Hindistan ve Çin e yaptığı geziler sırasında yazdığı notlarda adı geçen Turmeric, Avrupa ya 13. yy. da Arap gezginlerce getirilen ve curcumin içeren bir baharattır. Curcuma longa bitkisinin, kök ve saplarının kurutulup toz haline

49 32 dönüģtürülmesiyle elde edilir. Hindistan da Haldi olarak isimlendirilir ve curcumin bileģiğinin esas kaynaklarındandır[52]. Curcuma ya atıfta bulunarak ilk kaydedilen bilimsel araģtırma 1748 yılında, tumeric ile ilgili ilk farmakolojik inceleme ise bundan 67 yıl sonra yayınlanmıģtır. Romatizma, vücut ağrıları, deri hastalıkları, yaralar, bağırsak kurtları, ishal, aralıklı ateģ, karaciğer bozuklukları, huysuzluk, üriner deģarjı, dispepsi, kabızlık, leukoderma, amenore ve kolik yangı gibi hastalıkların bir çeģitlilik tedavisi için geleneksel bir ilaç olarak, yaygın olarak kullanılmaktadır[51,53]. Ġlk olarak Vogel ve Pellatier tarafından 1815 yılında C 21 H 2 OO 6 olarak formüle edilen curcumin, daha sonra 1910 yılında, Lampe ve arkadaģlarınca diferuloylmethane olarak isimlendirilmeye baģlamıģ ve Lampe ve Milobedzska tarafından 1913 yılında bileģik, ilk kez üretilmiģtir[53,54]. Curcumin in moleküler özellikleri Kimyasal ismi 1,6-heptadien-3,5-dion-1,7-bis(4-hidroksi-3-metoksifenol)-(1E,6E) ya da diferuloilmetan (C21H20O6) olan curcumin, etanol, keton, asetik asit ve kloroformda çözünür. Suda çözünmez. Moleküler ağırlığı 368,37 g/mol ve erime noktası 183 C dır.spektrofotometrik olarak metanolde 430 nm de, asetonda nm de emilim gösterir [55]. Curcumin in metabolizması Curcumin suda çözünmez, hücre membranının hidrofobik yapılarında yerleģir ve yapısı nedeniyle hücrelere hızlıca girer. Hücre zarından hızlı bir Ģekilde ilerleyip sitozole geçer. Lipofilik özellikleri nedeniyle hücre zarı, endoplazmik retikulum ve çekirdek zarı gibi membranöz yapıların içinde toplanır. Curcumin, sistemik dolaģımda ya çok düģük düzeyde olur ya da hiç bulunmaz [55-56]. Curcumin bağırsaklardan emilimi sırasında renksiz ve daha az polar olan tetrahidrocurcumin metabolitine dönüģür. Tetrahidrocurcumin bağırsaklardan emilerek tüm dokulara dağılır. Tetrahidrocurcumin karaciğerde glukuronik asitle etkileģerek safra yolu

50 33 ile atılır. Ağızdan alınan curcumin in büyük bir kısmı gaytayla, geri kalanı ise idrarla atılır[55-56]. Curcumin in antioksidan özelliği Curcumin in yapısındaki fenolik ve metoksi gruplarının serbest radikallerle tepkimeye girmesiyle fenoksil radikali oluģmaktadır. Ayrıca Curcumin'in birincil metaboliti tetrahidrocurcumin, antioksidan β diketo etki ile birlikte 2 karbonil arasındaki aktif metilen karbonundaki C-C bağını yıkarak antioksidan etki yapar. Bu antioksidan etkileriyle serbest radikal oluģumunu doğrudan ya da XD/XO dönüģümünün baskılanması ile dolaylı olarak etkiler. Curcumin in diğer hasar veren hidroksil radikalleri ya da peroksinitrit üzerindeki etkisi henüz tam aydınlatılamamıģtır. Kronik inflamasyon ve sitokinler NO sentezini uyararak DNA hasarına ve kansere yol açan peroksinitrit ve nitrit oluģumuna yol açmaktadır. Yapılan pek çok çalıģmada curcuminin NO sentezini baskıladığı gösterilmiģtir. Curcumin in hücresel oksidatif stres baskılamasının esası henüz tam olarak bilinmemektedir. Ancak Glutatyon redüktaz ya da diğer bazı antioksidatif enzimler ile oksijen radikallerini etkisizleģtirme iģini yüksek glikoz değerlerinde yaptığı söylenebilmektedir. Vaskuler inflamasyon ve kalp-damar hastalıkları, diabetiklerde morbidite ve mortalite için önemli bir etkendir[57-59] Apoptozis Çok hücreli organizmalarda, her hücre doğar, çoğalır, farklılaģır ve ölür. Doku homeostazisi; apoptozis ve proliferasyon dengesinin düzenli bir Ģekilde sürdürülmesine bağlıdır. Bu dengenin bozulması birçok önemli hastalığın ortaya çıkmasında rol alır. Apoptozis, hücrelerin kendi kendilerini yok ettikleri, genlerle düzenlenen, RNA ya, protein sentezine ve enerjiye gereksinim duyan, evrimsel olarak korunmuģ programlı hücre ölümüdür[60-61]. Apoptozisin belirgin yapısal özellikleri; membran tomurcuklanması, hücre küçülmesi ve kromatin yoğunlaģmasıdır. Kromatinin nükleozomlar arasındaki DNA bölgelerinden kesilmeleri sonucu ortaya çıkan DNA parçaları elektroforez yöntemi ile DNA merdiven görüntüsü nü oluģturur[62].

51 34 Hücrelerin genetik olarak belleklerinde var olan intihar programı çeģitli sinyallerle, patofizyolojik koģullarla ve oksidatif stres gibi uyaranlarla baģlamaktadır[60-62]. Ovaryumda apoptozisi düzenleyen çok sayıda özelleģmiģ molekül, hormon, büyüme faktörleri ve sitokinler bulunmaktadır. Sistem follikül için ölüm kararı verdiğinde apoptotik ölümün yürütülebilmesi için çok sayıda alt reaksiyon oluģur. Apoptotik iģlem iki genel mekanizma ile olaylanır; ölüm moleküllerinin hücre yüzey reseptörlerine bağlanmasıyla yürütülen ölüm reseptör aracılı yol olarak isimlendirilen Fas yolu ve hücre içinde gerçekleģen sinyallerle yürütülen mitokondriyon aracılı yol olarak isimlendirilen Bax yolu[63-64] Kaspaz 3 Kaspazlar hücrede iki önemli biyolojik yolda görev almaktadırlar; enflamatuar sinyal yolu ve hücre ölüm yolu (Fas yolu). Kaspaz ailesinin 7 üyesi (kaspaz 2, 3 ve 6-10) apoptotik ölüm yolunda iģlev görürken, diğer üçü (kaspaz 1, 4 ve 5 ) proinflamatuar sitokinleri aktifleģtirerek savunma sisteminde görev alır. Ġki yol birbirinden farklı olsa da sitokin aktivatörü kaspazlar ve apoptotik kaspazlar büyük benzerlikler gösterirler. Bu sınıflandırmaların dıģında kalan kaspaz-14 keratinositlerde üretilir ve epidermal farklılaģma sürecinde aktif olarak çalıģır [65-66]. Kaspaz olarak isimlendirilen sistin proteazlar protein grubunun aktifleģtirilmeleri ile hücre ölümü gerçekleģtirilir. Kaspaz ailesi apoptozisin baģlatılması, yürütülmesi ve sonlandırılmasında son derece önemli rol oynayan hücre içi proteazlardır[67]. Kaspazlar esas olarak iki alt gruba ayrılırlar; uzun öncül-bölgeli kaspazlar (kaspaz-1, -2, - 4, -5, -8, -9, -10, -11, -12, -13) ve kısa öncül-bölgeli kaspazlar (kaspaz-3, -6, -7, -14). Uzun öncül-bölgeli kaspazlar genelde hücre ölümünün baģlatılmasında daha erken görev alırlar ve öncül-kaspasların etkin kaspazlara dönüģümünü sağlarlar. Bu nedenle apoptozisi baģlatıcı kaspazlar olarak isimlendirilirler. Kısa öncül-bölgeli kaspazlar ise apoptozisin baģlamasından bir süre sonra iģlev görürler. Poli (ADP) riboz polimerazlar (PARP), kaspaz aktive eden DNAse baskılayıcısı (ICAD), jelsolin ve lamin gibi özel ölüm yapılarını parçalarlar. Bu nedenle bu kaspazlara yardımcı ya da etkili kaspazlar denir[68].

52 35 Kaspaz-3 apoptozisin anahtar moleküllerinden biridir. 17 kda ve 12 kda ağırlığında 2 alt birimi vardır. Kaspaz-3'ün üçboyutlu yapısı genel olarak kaspaz-1'le benzerlik gösterir. Ancak S4 alt bölgesi ölçü ve kimyasal bileģimlerine göre kaspaz-1'den çok farklıdır. kaspaz-3 tam ya da kısmen olarak birçok anahtar proteinlerin proteolitik yarıklanmasından sorumludur[69-70]. Fas-substrat reseptörünün uyarılmasıyla prokaspaz-8 ve prokaspaz-10 aktif hale geçer. Kaspaz-8 hücre içinde aktif Ģekle geçtikten sonra 2 farklı apoptotik sinyal yolu izleyebilir. Ġlk sinyal yolunda kaspaz-8 doğrudan kaspaz-3 ve kaspaz-7 gibi effektör kaspazları aktive ederek apoptozisin oluģmasını sağlayabilir. Daha sonra aktifleģen Kaspaz-3, deoksiribonükleaz inhibitörünü (ICAD) inaktif hale geçirir, böylece ICAD ın bağlandığı kaspazla aktifleģen deoksiribonükleazlar (CAD) serbest Ģekle geçer ve buna bağlı olarak da kromatin yoğunlaģması ve oligonükleozomal DNA parçalanması oluģmaktadır [71]. Ovaryum da kaspaz-3, sağlıklı korpus luteum ların luteal ve teka hücrelerinden ve atretik folliküllerin granüloza hücrelerinden salgılanır. Bu salınım gonadotropinlerce düzenlenir. Ayrıca kaspaz-3 salınımının sağlıklı folliküllerin granüloza hücrelerinde etkin olmayan Ģekilde (prokaspaz-3) bulunduğu bilinmektedir [72] Sitokrom C Sitoplazma içinde yine prokaspazların etkin kaspazlara dönüģümü, mitokondriyon kanal proteini olan Bcl-2 ailesinden Bax ın aktivasyonuna etki eder. Aktive olan Bax, sitokrom c nin mitokondriyondan sitoplazmaya salınımına neden olur. Bu olay diğer apoptotik proteazları aktive eder. Sitokrom c, Apoptotik Proteaz Aktive Eden Faktör-1 (APAF-1) e bağlanır. APAF-1 kaspaz-9 a bağlanarak 3 ü birlikte apoptozom u oluģturur. OluĢan apoptozom hücrenin proteolitik yıkımına neden olacak kaspazları uyarır. Aktive olan kaspazlar ise yine aynı düzenekle DNA da parçalanmalara ve kromatinde kırılmalara neden olarak hücreyi ölüme götürür. Ayrıca ilaç, radyasyon gibi dıģ etkenler nedeniyle de DNA hasarı ve hücre ölümü gerçekleģir. p53 doğrudan sitoplazma içinde apoptotik iģlemi baģlatarak mitokondriyon üzerinden Bax yolunu kullanıp DNA parçalanmasına neden olur[73-74].

53 36 Bcl-2, Bax ın mitokondriyal membrana tutunmasını engelleyerek, sitoplazmaya olan sitokrom c salınımını baskılar ve apoptozis engellenir. Olayın bu Ģekilde gerçekleģmediği durumlarda ise, Bax mitokondriyal membrana tutunarak sitoplazmaya olan sitokrom c salınmasını aktive eder ve apoptozis olusur. Hücre sitoplazmasında immünohistokimyasal olarak Bax proteininin gösterilmesi o hücrede apoptozisin olaylandığını ortaya koyar[73-74].

54 37 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Deney Hayvanları ve Gruplandırma ÇalıĢmada, Gazi Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları YetiĢtirme Deneysel AraĢtırma Merkezi (GÜDAM) nden sağlanan, gr ağırlığında 36 adet Wistar albino cinsi sıçan kullanıldı. Denekler, deney süresince Gazi Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları YetiĢtirme Deneysel AraĢtırma Merkezi (GÜDAM) nde ısısı ortalama 22 ± 2, ıģık 12 saat aydınlık 12 saat karanlık döngüsünde olacak Ģekilde bakıma alındı. Denekler 6 gruba ayrıldı; 1. Grup: Kontrol grubu (n=6) 2. Grup: Mısır yağı uygulanan sham kontrol grubu (1ml/kg/gün) (n=6) 3. Grup: DMSO uygulanan sham kontrol grubu (1ml/kg/gün) (n=6) 4. Grup: BaP uygulanan grup (10ml/kg/gün) (n=6) 5. Grup: Curcumin uygulanan grup (100ml/kg/gün) (n=6) 6. Grup: Curcumin + BaP uygulanan grup (100ml/kg/gün + 10ml/kg/gün) (n=6) 3.2. Deneyin YapılıĢı Curcumin in hazırlanması 15 ml DMSO içerisinde çözdürülen 0,6 gram curcumin, 100ml/kg/gün dozunda olacak Ģekilde deneklere gavaj yolu ile uygulandı. BaP hazırlanması 15 ml mısır yağı içerisinde çözdürülen 0,06 gram BaP, 10ml/kg/gün dozunda olacak Ģekilde deneklere gavaj yolu ile verildi. Deney süresince deneklerin vücut ağırlıkları her gün ölçülerek belirlendi.

55 38 6 Haftalık süre sonunda yüksek doz anestezi altında ötenazileri gerçekleģtirilen deneklerden ovaryum dokuları alındı. Alınan doku örnekleri ıģık mikroskobik inceleme için %10 luk nötral formalin tespit solüsyonu içine konuldular. Dokular alıģılagelmiģ histolojik izleme yönteminden geçirilerek parafin bloklar hazırlandı. Dokulardan alınan kesitlere Hematoksilen-Eozin boyası ve immünohistokimyasal yöntem uygulandı IĢık Mikroskobik Yöntem Alınan ovaryum doku örnekleri %10 luk nötral formaldehit tespit solüsyonundaki tespit iģleminden sonra kasetlere konularak akar su altında 24 saat süresince yıkandı. Suyun uzaklaģtırılması için dokular sırasıyla %70 lik, %80 lik, %90 lık, %100 lük artan derecelerde etil alkol serilerinden geçirildiler. Daha sonra dokular parlatılması ereğiyle ksilolden geçirilip parafine gömüldüler. Parafin bloklardan elde edilen 4 mikron kalınlığındaki kesitler Hematoksilen-Eozin boyası ile boyandı. Kesitler Leica DCM 4000 (Germany) bilgisayar destekli görüntüleme sisteminde, Leica Q Vin 3 programında değerlendirildi ve resimleri çekildi. Hematoksilen eozin boyama yöntemi Boya solüsyonlarının hazırlanması Hematoksilen-Eozin boyamada Harris in hematoksilen ve eozin boya solüsyonları kullanıldı. 1- Harris in hematoksilen solüsyonu Hematoksilen 1 gr 96 C Alkol 10 ml Potasyum alum (alüminyum potasyum sülfat) 20 gr Distile su 200 ml Merküri oksit 0.5 gr Glasiyal asetik asit 8 ml

56 39 2- Eozin solüsyonu Eozin 1 gr Distile su 100 ml 1 küçük kristal timol Boyama yöntemi Deney gruplarından alınan 4 mikron kalınlığındaki kesitler 70 C etüvde 30 dakika bekletildikten sonra, 2 kez 15 er dakika ksilole alınarak parafinden arındırılmaları sağlandı. Lamlar sırasıyla %100 lük, %96 lık, %80 lik, %70 lik, %50 lik azalan etil alkol serilerinden geçirilerek havada kurutuldu. 10 dakika süreyle akar su altında yıkandıktan sonra, Harris Hematoksilen de dakika boyandı ve lamlar akar su altında 10 dakika yıkandı. %70 alkol ve 2-3 damla glasiyel asedik asit damlatılarak hazırlanan karıģıma batırılıp tekrar 10 dakika akar suya tutuldular. Bu iģlemi izleyerek 5-10 dakika Eozin solüsyonunda boyanan lamlar 10 dakika süreyle akar su altında yıkandı ve artan dereceli etil alkol serilerinden geçirilerek (%50, %70, %80, %96, %100) 2 kez 15 er dakika ksilole alındı ve entellan ile kapatıldı Ġmmünohistokimyasal Yöntem Deney gruplarından alınan kesitler 37º C deki etüvde 12 saat tutulduktan sonra deparafinizasyonu kolaylaģtırmak ereğiyle etüv ısısı 57º C ye çıkarılarak 1 saat daha bekletildi. Camlar deparafinizasyonu tamamlamak için 2 kez 15 er dakika ksilolde bırakıldıktan sonra sırasıyla %100 lük, %96 lık ve %80 lik alkol serilerinden 10 ar dakika geçirilerek sudan, 2 kez 5 er dakika distile sudan geçirilerek alkolden arındırıldı. Kesitler daha sonra doku içerisinde formaldehitin kapattığı reseptör bölgelerinin açığa çıkarılmasını sağlamak ereğiyle mikrodalga fırında 1 M sitrat tamponuna (ph: 6,0) (Cat: AP , Lot: 9003LT13610, Lab Vision, Fremont, USA) etkin bırakıldı. Oda ısısında 20 dakika soğutulduktan sonra 15 dakika süreyle hidrojen peroksit (Cat: TA-060- HP, Lot: HP23484, Lab Vision, Fremont, USA) uygulandı ve endojen peroksidaz aktivitesi bloke edildi. Daha sonra, camlar 3 kez 3 er dakika PBS (Phosphate Buffer Saline) (ph: 7.4) ile yıkandıktan sonra özgün olmayan bağlanmaların engellenmesi ereğiyle 5 dakika

57 40 Ultra V Block (Cat: TA-125-UD, Lot: UD20396, Lab Vision, Fremont, USA) uygulandı. Bloklama aģamasının ardından kesitler yıkanmadan Kaspaz-3 (Cat: MS-1197-P1, Lot: 1197P13026G) ve Sitokrom-c (Cat: MS-1192-P, Lot: 1192P1202BE) primer antikorlarına etkin bırakılarak 60 dakika bekletildi. Camlar 60 dakikanın sonunda 3 kez 3 er dakika PBS ile yıkandıktan sonra 20 dakika biyotinli sekonder antikor (Cat: TA-125-BN, Lot: MBN110810, Lab Vision, Fremont, USA) uygulanarak primer antikora bağlanması sağlandı. Yeniden PBS ile yıkandıktan sonra dokular enzimin biyotine bağlanması için 20 dakika streptavidin peroksidaz enzim kompleksine (Cat: T P-125-HL, Lot: PHL120327, Lab Vision, Fremont, USA) etkin bırakıldı. Camlar yeniden PBS ile yıkandıktan sonra kromojen olan AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) (Cat:TA-060-SA, Lot: ASA130816, Lab Vision, Fremont, USA) uygulanarak gözle görülebilen immün tepkimenin açığa çıkması sağlandı. Zemin boyamasında Mayer in Hematoksileni (Cat: TA-125-MH, Lot: AMH70809, Lab Vision, Fremont, USA) kullanıldı ve camlar Ultramount (Cat: TA-125-UG, Lot: VM13518, Lab Vision, Fremont, USA) ile kapatıldı. Kesitler Leica DM 4000 (Germany) bilgisayar destekli görüntüleme sisteminde, Leica Q Vin 3 programında değerlendirildi ve resimleri çekildi Ġstatistiksel Yöntem Ġstatistiksel değerlendirme yapabilmek erkiyle tüm kontrol ve deney gruplarının vücut ağırlıkları, deney baģlangıcından sonuna dek her gün ölçüldü, deney bitiminde ise ovaryum dokusu kuru ağırlıkları ölçülerek kaydedildi. Verilerin analizi Windows için SPSS 18.0 paket programında yapıldı. Gruplar arasındaki vücut ağırlığı ve ovaryum kuru ağırlıklarının verileri karģılaģtırılarak, sürekli ölçümlü değiģkenlerin dağılımının normale uygun olup olmadığı Shapiro Wilk s testi ile araģtırıldı. Tanımlayıcı istatistikler ortanca değer ve çeyrek ayrılıģlar ( %25-%75) olarak gösterildi. Her denekten Hematoksilen Eozin ile boyanan kesitlerden follikül sayımı yapıldı. Gruplar arasında follikül sayısı ortanca değerleri yönünden farkın önemliliği için Kruskal- Wallis testi ile değerlendirildi. Normallik testinin sonuçlarına göre parametrik (ANOVA, Çoklu karģılaģtırma olarak: Bonferroni) ya da parametrik olmayan (Kruskal-Wallis Varyans Analizi, Çoklu karģılaģtırma olarak: Bonferroni DüzeltilmiĢ Mann-Whitney/U) testleri uygulandı. Anlamlılık düzeyi p<0,05 kabul edildi.

58 41 Dokuda Kaspaz-3 ve Sitokrom-c pozitif hücreler saptandı ve hücreler 1 merkez, 5 perifer bölgede olmak üzere toplam 6 bölge için tüm grup ve tüm hayvanlarda incelenerek, istatistik uygulaması için veriler oluģturuldu. 0=Hiç Yok, 1=Zayıf, 2=Azdan Ortaya, 3=Orta, 4=Ortadan Yoğuna, 5=Yoğun sayısal kod olarak kabul edildi.

59 42

60 43 4. BULGULAR 4.1. IĢık Mikroskobik Bulgular Hematoksilen eozin boyama bulguları Kontrol grubuna ait ovaryum dokusu hematoksilen-eozin boyamalarında germinal epitel altındaki bağ dokusu ve dıģ kortekste yayılan primordiyal folliküller ayırt ediliyordu. Küçük büyültmede korpus luteum kesitler dikkat çekiciydi. Graaf follikülünde granüloza hücre katmanı, antrum, kumulus ooforus belirgin yapıları ile ayırt ediliyordu. Oosit, zona pellusidası ile belirgindi. Follikül çevresinde teka interna ve teka eksterna katmanları ayırt ediliyordu. Teka interna katmanında salgı yapıcı hücrelerin çokluğu, yer yer kapiller damarlar izlenirken, teka eksterna katmanı bağ dokusu yapısı ile ilgi çekiyordu. GeliĢen folliküllerde yapı normaldi. Stromada yaygın olarak iri stromal hücreler ve kan damarları dikkat çekiciydi (Resim4.1, 4.2). Mısır yağı uygulanan grupta ovaryum yapısının kontrol grubu ile benzer olduğu ilgi çekerken, primordiyal, geliģen ve çok katmanlı granüloza hücreleri içeren, antrumun hafif oluģmaya baģladığı folliküllerde de yapı aynıydı. Graaf follikülünde de granüloza hücre katmanı ve teka katmanları ayırt ediliyordu (Resim4.3, 4.4). DMSO uygulanan grupta da ovaryum yapısı kontrol ve mısır yağı uygulanan gruplarla aynıydı (Resim4.5,4. 6). Curcumin uygulanan grupta ovaryum yapısı; primordiyal, sekonder ve Graaf follikülleri ile belirgin olarak izleniyordu. Bazı folliküllerin atreziye gidiģi de dikkat çekiciydi (Resim4.7, 4.8). B(a)P uygulamasının primordiyal ve geliģen folliküllerden çok Graaf folliküllerinde etkili olabileceği ve özellikle zona pellusida, granüloza ve ağırlıklı olarak kumulus hücrelerinde yapısal bozukluklara neden olabileceğinin göstergeleri ilgi çekiciydi. Zona pellusidanın dalgalı bir hal aldığı ve kumulus hücrelerinin bir grubunun yoğun çekirdekleri ile antrum boģluğu içine döküldüğü ayırt ediliyordu. Bağ dokusundaki arasındaki kollagen liflerde homojenizasyon oluģtuğu izleniyordu. Bazı folliküllerde teka inerna ve teka eksterna

61 44 katmanlarında belirgin bir yozlaģma izlenmezken, bazılarında tüm teka katmanlarının teka eksterna yapısına dönüģtüğü ilgi çekiyordu. Korpus lüteum da ise belirgin bir değiģiklik gözlenmiyordu. Atretik folliküllerin fazlalığı dikkat çekiciydi (Resim4.9, 4.10, 4.11). B(a)P ve Curcumin in birlikle uygulan grupta, yalnızca B(a)P uygulanan gruba karģın yapının biraz daha düzeldiği ancak stromal değiģimlerin hala aynı düzeyde olduğu ayırt edildi. Teka eksternanın ise hala yoğun olduğu belirgindi (Resim4.12). Kaspaz-3 bulguları Kontrol, mısır yağı, DMSO ve Curcumin uygulanan gruplarda Kaspaz-3 tutulumunun oldukça zayıf ve aynı düzeyde olduğu dikkati çekerken (Resim4.13, 4.14, 4.15, 4.16), B(a)P uygulanan grupta sekonder follikülde, Graaf follikülde ve korpus luteumda kaspaz-3 tutulumunun yer yer ortadan kuvvetliye değiģtiği ayırt ediliyordu. Aynı Ģekilde primordiyal follikülde bazı granüloza hücrelerinde de orta dereceli bir tutulum dikkat çekiciydi. Yine diğer gruplardan ayrıcalıklı olarak oosit sitoplazması ve zona pellusida da tepkime belirgindi. Kaspaz-3 tutulumunun genelde oosite yakın granüloza hücre katmanında olduğu ilgi çekiciydi. Yine bazı stromal hücrelerde de tepkime gözlemleniyordu. Teka eksterna katmanında belirgin bir tutulum saptanmadı (Resim4.17). B(a)P ve Curcumin in birlikte uygulandığı grupta tutulumun daha çok granüloza hücre düzeyinde olduğu yer yer de bazı stromal hücrelerde tutulumun varlığı belirgindi. Tek eksterna katmanında tutulum gözlenmezken, teka interna katmanındaki bazı hücrelerde orta dereceli immün reaktivite dikkat çekiyordu. Ancak bu tutulumun B(a)P uygulanan gruptaki tutuluma karģın daha az olduğu belirgindi (Resim4.18). Sitokrom c bulguları Sitokrom c immün reaktivitesinin kontrol, mısır yağı, DMSO ve Curcumin uygulanan gruplarda aynı boyanmayı verdiği gözlemlendi (Resim4.19, 4.20, 4.21, 4.22). B(a)P uygulanan grupta sitokrom c tutulumunun sekonder ve tersiyer folliküllerde granüloza hücre düzeyinde olduğu, zona pellusida da hiç tutulumun olmadığı, oosit zarında belirgin immün reaktivitenin kontrol gruplarına karģın daha yoğun olduğu dikkat çekiciydi (Resim4.23).

62 45 B(a)P ve Curcumin in birlikte uygulandığı grupta bazı granüloza hücrelerinde ortadan kuvvetliye doğru değiģen tutulum belirlenirken, bazılarında, özellikle Graaf folliküllerinde çoğu granüloza hücrelerinin boyanmadıkları izleniyordu. Oosite yakın granüloza hücrelerinde tutulum olduğu belirlendi (Resim4.24) Ġstatistiksel bulgular 6 hafta süresince yapılan çalıģmada deney gruplarının, uygulanan madde özelinde incelenen parametrelere göre farklılık içerip içermediği SPSS 19.0 da analiz yapılmıģ ve yorumlanmıģtır. Vücut ağırlığı bakımından Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) yapılmıģ ve gruplar arasında anlamlı bir farklılığı olduğu görülmüģtür (p=0,00<0,005) (Çizelge 4.1). Bu farklılığa neden olan grupların belirlenmesi için Tukey ve Duncan çoklu karģılaģtırma test istatistiklerinden yararlanılmıģtır (Çizelge 4.2). Uygulanan maddelerin kontrol grubu dıģındaki tüm gruplarda vücut ağırlığını azalttığı görülmüģtür (ġekil 4.1). Gruplar ve sağ-sol ovaryumlar arası ağırlıklarda fark olup olmadığı Ġki Yönlü Varyans Analizi ile analiz edilmiģtir. (Çizelge 4.3) Yapılan Ġki Yönlü Varyans Analizi sonrasında ovaryumların farklı olmasının (sağ ve sol ovaryum) ağırlıklarında bir değiģime neden olmadığı belirlenmiģtir (p=0,34>0,05). Gruplar arası farklılık incelendiğinde ovaryum ağırlıklarının gruplar arasında herhangi bir fark yaratmadığı yapılan Duncan Test istatistiğinde belirlenmiģtir (p=917>0,05) (Çizelge ). Gruplar arası ağırlık değiģimi de istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (ġekil 4.2). Kaspaz-3 tutulumunun istatistiksel olarak değerlendirilebilmesi ereğiyle Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) kullanılmıģtır (p=0,204>0,05) (Çizelge 4.6). Yapılan ANOVA testi gereği gruplar arasında farklılıklar olduğu gözlenmiģtir (p=0,000<=0,05). Bu farklılığın hangi gruptan kaynakladığını belirlemek üzere Duncan testi uygulanmıģtır (Çizelge 4.7). Gruplar arası farkın B(a)P ve B(a)P+Curcumin kaynaklı olduğu belirlenmiģtir. Curmumin in tek baģına bir farklılık göstermediği, B(a)P ile birleģmesi sonucu farklılık gösterdiği buna ek olarak B(a)P ın tek baģına uygulandığı grupta farklılık olduğu belirlenmiģtir (ġekil 4.3).

63 46 Sitokrom c tutulumunun istatistiksel olarak değerlendirilebilmesi ereğiyle Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) kullanılmıģtır (p=0,239>0,05) (Çizelge 4.8). Yapılan ANOVA testinde gruplar arasında farklılıkların oluģtuğu gözlenmiģtir. (p=0,000<=0,05) Bu farklılığın hangi gruptan kaynakladığını belirlemek erkiyle Duncan testi uygulanmıģtır (Çizelge 4.9). Gruplar arası farkın B(a)P ve B(a)P+Curcumin kaynaklı olduğu belirlenmiģtir. Curmumin in tek baģına bir farklılık göstermediği B(a)P ile birleģmesi sonucu farklılık gösterdiği buna ek olarak B(a)P tek baģına da farklılık gösterdiği gözlemlenmiģtir (ġekil 4.4). Folliküler düzeyde analiz yapmak erkiyle; primordiyal follikül, unilaminar primer follikül, multilaminar primer follikül, sekonder follikül ve Graaf follikülleri sayılmıģ istatistiksel olarak değerlendirilmiģtir. Gruplar arasında farklılıkların ölçülmesi ereğiyle Tek yönlü Varyans Analizi (ANOVA) uygulanmıģtır. Yapılan analiz sonucu primordiyal follikül düzeyinde gruplar arası farklılık olduğu belirlenmiģtir ve farklılık düzeyinin hangi gruplardan kaynaklandığının belirlenmesi için Duncan testi uygulanmıģtır (Çizelge ). Duncan testine göre gruplar arası farklılık gösteren grupların B(a)P ve B(a)P+Curcumin olduğu belirlenmiģtir (ġekil 4.5). ANOVA analizi sonrasında gruplar arası Unilaminar Primer follkül, Multilaminar Primer follikül ve sekonder follikül sayısında farklılık olmadığı gözlemlenmiģtir (Çizelge 4.12, 4.13, 4.14) (ġekil 4.6, 4.7, 4.8). Graaf Follikülü için uygulanan ANOVA analizinde ise gruplar arasında istatistiksel fark belirlenmiģtir. (p=0,005) (Çizelge 4.15) ve farklılık düzeyinin hangi gruplardan kaynaklandığının belirlenmesi için Duncan testi uygulanmıģtır (Çizelge 4.16). Yapılan Duncan test istatistiğine göre Graaf Follkül sayısının B(a)P ve B(a)P+Curcimin gruplarında farklılık gösterdiği belirlenmiģtir (ġekil 4.9).

64 Resim 4.1. Kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda germinal epitel ( ), bağ dokusu ( ), kortekste yayılan primordiyal follikül ( ), granuloza hücre katmanı ( ),graaf follikül ( ),antrum ( ),kumulus ooforus ( ) belirgin yapılarıyla, oosit ( ), zona pellusida (*), teka interna ( ), teka eksterna ( ), ve yer yer kan damarı ( ) görülüyor (Hematoksilen Eozin x400) 47

65 48 Resim 4.2. Kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda geliģen folliküller (>), stromada yaygın iri stromal hücreler ( ) ve kan damarı ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400)

66 Resim 4.3. Mısır yağı uygulanan gruba ait ovaryum dokusunun primordiyal follikül ( ) granuloza hücre katmanı ( ), hafif oluģmaya baģlayan antrum ( ) ve geliģen follikülleri (>) kontrol grubu ile eģdeģ olduğu görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) 49

67 50 Resim 4.4. Mısır yağı uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda granuloza hücre katmanı ( ), teka interna ( ) ve teka eksterna ( ) ayırt ediliyor. (Hematoksilen Eozin x400)

68 Resim 4.5. DMSO uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda kan damarı ( ), oosit ( ), zona pellusida (*),granuloza hücre katmanı ( ) ve geliģen folliküller (>) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) 51

69 52 Resim 4.6. DMSO uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda oosit ( ), zona pellusida (*), granuloza hücre katmanı ( ),kan damarı ( ) ve antrum ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400)

70 Resim 4.7. Cucumin uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda germinal epitel ( ), atretik follikül ( ), antrum ( ), oosit ( ), zona pellusida (*), primordiyal follikül ( ), granuloza hücre katmanı ( ), sekonder follikül (>>) ve kan damarı ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) 53

71 54 Resim 4.8. Cucumin uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda belirgin graaf follikül ( ), teka interna ( ), teka eksterna ( ), antrum ( ),granuloza hücre katmanı ( ), kan damarı ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400)

72 Resim 4.9. B(a)P uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda geliģen follikül (>), granuloza hücre katmanı ( ), korpus luteum (+) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) 55

73 56 Resim B(a)P uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda granuloza hücre katmanı ( ), graaf follikül ( ), antrum ( ), kumulus ooforus ( ), oosit ( ), dalgalı bir hal almıģ zona pellusida (*), bağ dokusu arasındaki kollajen liflerde homojenizasyon ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400)

74 Resim B(a)P uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda granuloza hücre katmanı ( ), graaf follikül ( ), antrum ( ) ve teka katmanlarının teka eksterna ( ) yapısına dönüģtüğü görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400) 57

75 58 Resim B(a)P ve Curcumin in birlikte uygulandığı gruba ait ovaryum dokusunda germinal epitel ( ), granuloza hücre katmanı ( ), stromal hücreler ( ), sekonder follikül (>>), antrum ( ), yoğun olan teka externa ( ) ve oosit ( ) görülüyor. (Hematoksilen Eozin x400)

76 Resim Kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda zayıf Kaspaz-3 tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) 59

77 60 Resim Mısır yağı uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda zayıf Kaspaz-3 tutulumuimmün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)

78 Resim DMSO uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda zayıf Kaspaz-3 tutulumu immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) 61

79 62 Resim Curcumin uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda zayıf Kaspaz-3 tutulumuimmün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)

80 Resim B(a)P uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda oosite ( ) yakın zona pellusidada (*), sekonder follikülde (>>), primordiyal follikülde ( ), graaf follikülde ( ) orta dereceli ve korpus luteumda (+) Kaspaz-3 tutulumuimmün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) 63

81 64 Resim B(a)P ve Curcumin in birlikte uygulandığı gruba ait ovaryum dokusunda teka interna ( ) ve granuloza hücre katmanında ( ) orta dereceli Kaspaz-3 tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400)

82 Resim Kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda Sitokrom c tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) 65

83 66 Resim Mısır yağı uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda Sitokrom c tutulumuimmün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)

84 Resim DMSO uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda Sitokrom c tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) 67

85 68 Resim Curcumin uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda Sitokrom c tutulumuimmün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400)

86 Resim B(a)P uygulanan gruba ait ovaryum dokusunda Sitokrom c tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz-Hematoksilen x400) 69

87 70 Resim B(a)P ve Curcumin in beraber uygulandığı gruba ait ovaryum dokusunda granüloza hücrelerinde ortadan kuvvetliye doğru değiģen Sitokrom c tutulumu- immün reaktivite gösteren hücreler ( ) (Ġmmünperoksidaz- Hematoksilen x400)

88 71 Çizelge 4.1. Wistar albino cinsi sıçanların vücut ağırlığının ANOVA yöntemiyle istatistiksel olarak değerlendirilmesi ANOVA D.Ağırlık Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups , ,796 9,476,000 Within Groups , ,275 Total , Çizelge 4.2. Gruplar arasında ağırlık ortalamalarının Tukey ve Duncan yöntemleriyle istatistiksel olarak değerlendirilmesi D.Ağırlık Subset for alpha = 0.05 Grup N 1 2 Tukey HSD a Curcumin ,9964 BAP+Curcumin ,8944 DMSO ,5484 Mısıryağı ,5278 BAP ,4028 Kontrol ,9468 Sig.,225 1,000 Duncan a Curcumin ,9964 BAP+Curcumin ,8944 DMSO ,5484 Mısıryağı ,5278 BAP 252 Kontrol ,9468 Sig.,056 1,000

89 72 Ağırlık , , , , , ,9498 Ağırlık ġekil 4.1. Gruplar arasında Wistar albino cinsi diģi sıçanların ağırlıklarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge 4.3. Ġki Yönlü Varyans Analizi ile sağ ve sol ovaryum ağırlıklarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Dependent Variable: Ovaryum Ağırlık Type III Sum of Source Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model,035 a 11,003,291,985 Intercept,728 1,728 66,422,000 Ovarvum,008 1,008,732,396 Grup2,016 5,003,290,917 Ovarvum * Grup2,011 5,002,205,959 Error,658 60,011 Total 1, Corrected Total,

90 73 Çizelge 4.4. Ovaryum ağırlıklarının ANOVA yöntemiyle istatistiksel olarak değerlendirilmesi ANOVA VAR00002 Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups,005 5,001,327,893 Within Groups,100 30,003 Total, Çizelge 4.5. Gruplar arasında ovaryum ağırlık ortalamalarının Duncan yöntemiyle istatistiksel olarak değerlendirilmesi O.Ağırlık Duncan Subset Grup2 N 1 Kontrol 12,0758 BAP 12,0933 Mısıryağı 12,0992 BAP+Curcumin 12,1017 DMSO 12,1083 Curcumin 12,1250 Sig.,323

91 74 Ağırlık 0,14 0,125 0,12 0,1 0,08 0,0758 0,0933 0,0992 0,1017 0,1083 0,06 0,04 Ağırlık 0,02 0 ġekil 4.2. Gruplar arasında ovaryum ağırlıklarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge 4.6. Kaspaz-3 tutulum ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi ANOVA Kaspaz-3 Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 318, , ,475,000 Within Groups 122, ,581 Total 440,

92 75 Çizelge 4.7. Kaspaz-3 tutulumlarının Duncan yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Kaspaz Duncan Subset for alpha = 0.05 Grup N Mısıryağı 36 1,0000 DMSO 36 1,0000 Kontrol 36 1,0000 Curcumin 36 1,0000 BAP+Curcumin 36 3,0000 BAP 36 4,0000 Sig. 1,000 1,000 1,000 ġekil 4.3. Kaspaz-3 tutulumunun gruplar arasında istatistiksel olarak değerlendirilmesi

93 76 Çizelge 4.8. Sitokrom c tutulum ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi ANOVA Sitokrom Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 311, ,219 81,226,000 Within Groups 160, ,766 Total 471, Çizelge 4.9. Sitokrom c tutulumlarının Duncan yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Sitokrom c Duncan Subset for alpha = 0.05 Grup N Mısıryağı 36,9722 DMSO 36 1,0000 Kontrol 36 1,0000 Curcumin 36 1,0000 BAP+Curcumin 36 3,0000 BAP 36 3,9444 Sig.,904 1,000 1,000

94 77 ġekil 4.4. Sitokrom c tutulumunun gruplar arasında istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge Primordiyal Follikül ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi ANOVA Primordial_Follikül Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 34, ,894 2,827,033 Within Groups 73, ,439 Total 107,639 35

95 78 Çizelge Primordiyal folliküllerin Duncan yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi Primordiyal_Follikül Duncan Subset for alpha = 0.05 Grup N 1 2 BAP 6 11,5000 BAP+Curcumin 6 12, ,5000 Kontrol 6 13,6667 Mısıryağı 6 14,0000 DMSO 6 14,0000 Curcumin 6 14,1667 Sig.,276,108 ġekil 4.5. Gruplar arasında Primordiyal folliküllerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi

96 79 Çizelge Unilaminar Primer Follikül ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi ANOVA UNILAMINAR PRĠMER FOLLĠKÜL Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 11, ,311,897,496 Within Groups 77, ,578 Total 88, ġekil 4.6. Gruplar arasında Unilaminar primer folliküllerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge Multilaminar Primer Follikül ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi ANOVA MULTILAMINARPRĠMERFOLLĠKÜL Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 5, ,067,575,719 Within Groups 55, ,856 Total 61,000 35

97 80 ġekil 4.7. Gruplar arasında Multilaminar primer folliküllerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi Çizelge Sekonder Follikül ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi ANOVA SEKONDER FOLLĠKÜL Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 23, ,644 1,883,127 Within Groups 74, ,467 Total 97, ġekil 4.8. Gruplar arasında sekonder folliküllerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi

98 81 Çizelge Graaf Follikül ortalamalarının ANOVA yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi ANOVA GRAAFFOLLĠKÜL Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 24, ,983 4,172,005 Within Groups 35, ,194 Total 60, Çizelge Graaf folliküllerin Duncan yöntemi ile istatistiksel olarak değerlendirilmesi GRAAF FOLLĠKÜL Duncan Subset for alpha = 0.05 Grup N 1 2 BAP 6,8333 BAP+Curcumin 6 1,0000 Kontrol 6 2,5000 Mısıryağı 6 2,6667 DMSO 6 2,6667 Curcumin 6 2,8333 Sig.,793,635 ġekil 4.9. Gruplar arasında graaf folliküllerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi

99 82

100 83 5. TARTIġMA Polisiklik aromatik hidrokarbonlar doğal olarak, orman yangınları ya da volkanik patlamalarla, insan kökenli olarak da endüstriyel kaynaklar (çöp yakma, çimento fabrikaları), petrol rafinerileri, kok kömürü ve asfalt üretimi, alüminyum, demir çelik üretimi, motorlu taģıtlardan yanmanın tam olarak gerçekleģmemesi sonucunda ortaya çıkarlar. Isınma ve enerji erekli kullanılan kömür, odun gibi katı yakıtlar, fosil yakıtlar ve sigara dumanı da PAH oluģumuna neden olmaktadır [4]. Doğada 100 ün üzerinde PAH bileģiği bulunur. Çok sayıda oluģları nedeni ile kantitatif olarak güç saptanırlar. Bu nedenle en kuvvetli karsinojen olarak bilinen benzo(a)pirenin belirlenmesine gidilmiģtir. Yapılan çalıģmalarda piģmiģ ette 4ng/g ve özellikle kömür ateģinde uzun süre beklemiģ çok piģmiģ ette 62 ng/g benzo(a)piren bulunduğu saptanmıģtır [5,75]. Benzo(a)piren insanlarda karaciğer, akciğer, mide ve deride sitotoksisite ve genotoksisiteye neden olmaktadır. Birçok çalıģmada da BaP ın ve benzeri bazı toksik kimyasalların, organ ağırlıklarında ve epitel boyunda değiģimlere, ovaryum folliküllerinin sayısında azalmaya ve infertiliteye neden olduğu, curcumin gibi antioksidanların da bu etkileri ortadan kaldırdıkları bildirilmiģtir[76-77]. Yapılan çalıģmalar B(a)P ın doğrudan karsinojen ve önkarsinojen olduğunu göstermiģtir. Benzo(a)piren in Benzo(a)pirendiol e dönüģümü ile karsinojenik etkileri görülür. Bu dönüģümde ilk olarak sitokrom CYP1A1 ve CYP1B1 gibi sitokrom P450 enzimlerinin metabolik aktivasyonu sonucu benzo(a)piren 7,8 epoksit oluģur ve epoksit hidrolaz (EH) tarafından metabolize edilir. Epoksit halkasının açılması sonucunda benzo(a)piren 7,8dihidrodiol ortaya çıkar. Sitokrom P450 enzimlerinin tepkimeleri sonucunda kanser oluģumunu tetikleyen benzo(a)piren 7,8dihidrodiol-9,10 epoksiti oluģturur. Bu molekül G lerin bulunduğu DNA bölgeleriyle bütünleģir ve guanin nükleobazlarının nükleofilik olan N2 bölgesiyle kovalent bağ yapar. AraĢtırmalar bu bağlanmanın DNA nın çifte sarmal yapısını bozduğunu ve kopyalanmasını etkileyerek mutasyonlara neden olduğunu ve bazı mutasyonların da kansere yol açtığını göstermiģtir[77, ].

101 84 Serviks kanseri HeLa hücrelerinde sitokrom P450 1A1 ifadelenmesinde BaP ın etkilerine bakılmıģ ve BaP ın HeLa hücrelerinin çoğalmasını uyarabileceği ve ayrıca HeLa hücrelerinde CYP1A1 in ifadelenmesini artırabileceği sonucuna varılmıģtır [78]. Kummer ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada, sıçan uterus dokusunda polisiklik aromatik hidrokarbonların östrojenik yetiye etkisine bakılmıģtır. ERα üzerinde doğrudan baskılayıcı etkisi olduğu ve uterus dokusunda CYP1A1, 1A2, 1B1 ifadelenmesini arttırdığı gözlemlenmiģtir. Yine aynı çalıģmada B(a)P a etkin bırakılan sıçan ovaryum dokusunda tümör baskılayıcı protein olan P53 ten ser-15 salgılanması ile P53 ün baskılandığı ve kanser oluģumuna neden olabileceği belirtilmiģtir.[79]. Einaudi ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada, B(a)P a etkin kalan farelerdeki oosit ve kumulus hücrelerindeki DNA hasarına bakılmıģtır. Benzo(a)piren diolepoksit in (BPDE) oosit ve kumulus hücrelerindeki DNA kırılımlarını arttırdığı gözlemlenmiģtir. Ovulasyondan 4-6 gün önce B(a)P uygulanan deneklerin ovaryumlarında, erken ve geç preantral follikül oositlerinin B(a)P a daha duyarlı olduğu ve DNA hasarının daha fazla görüldüğü bildirilmiģtir. Buna karģın, primer ve primordiyal folliküllerin daha az etkilendiği belirlenmiģtir. Folliküllerin duyarlılığının olgunlaģma aģamasına bağlı olarak değiģebileceği sonucuna varılmıģtır[80]. Chen ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada ovaryum kanserinde ve DNA kırılımlarında dibenzo(a,l)piren etkisine bakılmıģtır. DNA bazlarında hasara ve Granuloza hücrelerinde tümör oluģumuna neden olduğu bildirilmiģtir[81]. Sadeu ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada, sigaranın etken maddesi olan BaP a etkin bırakılan farelerde follikülogenezis, oosit olgunlaģması ve steroidogenezis in vitro olarak incelenmiģtir. Kültüre alınan folliküller 13 gün süresince belirli dozlarda Bap a etkin bırakılmıģtır. Süre sonunda oositlerin mitotik bölünmeyi tamamlayamadığı ve 1. kutup cisimciğinin yerinin kaydığı görülmüģtür. E 2 (östrojen) düzeyinin 8. ve 12. günler arasında önemli ölçüde arttığı ancak progesteron düzeyinde kontrol grubu ile karģılaģtırıldığında önemli ölçüde bir değiģiklik olmadığı belirlenmiģtir. Anti Müllerian hormon salgılanmasının azaldığı ve preantral folliküllerin antral folliküle dönüģümünün geç gerçekleģtiği saptanmıģtır. B(a)P ın follikül sayısında azalmaya ve follikül geliģiminde gerilemeye neden olduğu sonucuna varılmıģtırbizim çalıģmamızda da Sadeu ve

102 85 arkadaģlarının çalıģmasına benzer olarak B(a)P ın follikül sayısında azalmaya ve follikül geliģiminde gerilemeye neden olduğu gözlenmiģtir[82]. Siddique ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada, sigaranın neden olduğu oksidatif stresin follikül hücrelerindeki etkilerine hücre kültüründe bakılmıģtır. 8-isoprostan (8-IsoP) ve 8- hidroksi-2-deoksi Guanozin (8-OH-dG) bu çalıģmadaki oksidatif DNA hasar belirteçleri olarak kullanılmıģtır. Hücre kültürüne alınan follikül hücrelerinde 8-IsoP ve 8-OH-dG nın arttığı ve follikül geliģiminin gerilediği belirlenmiģtir. DNA hasar belirteçlerinin granuloza hücrelerinde arttığı, bunun ovulasyon ve döllenme oranlarında azalmaya neden olabileceği bildirilmiģtir[83]. Neal ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada, sigara içen ve içmeyen kadınlarda follikül sıvısında biriken B(a)P ve diğer bazı PAH lara bakılmıģtır. Sigara içen ya da sigara dumanına etkin kalan kadınlarda birikimin daha fazla olduğu ve B(a)P ın follikül sıvısında birikiminin diğer PAH lara karģın daha yoğun olduğu gözlemlenmiģtir[84]. Neal ve arkadaģlarının yaptığı bir diğer çalıģmada ise, in vitro fertilizasyon (IVF) tedavisi gören, sigara içen ve içmeyen kadınlarda follikül geliģiminin baskılanması ve diğer bazı değerler incelenmiģtir. Yine aynı çalıģmada sıçan ovaryumundan alınan folliküller in vitro olarak değerlendirilmiģtir. Sigara içen ve içmeyen kadınlar karģılaģtırıldığında, embriyo kalitesinde belirgin farklılık olmamasına karģın; implantasyon ve gebe kalma oranının sigara içenlerde düģtüğü belirlenmiģtir. Ġn vitro olarak incelenen sıçan folliküllerinde, B(a)P dozunun artması ile birlikte follikül sayısının, çoğalmasının ve E 2 düzeyinin azaldığı saptanmıģtır [85]. Bizim çalıģmamızda embriyo kalitesi, gebe kalma oranı ya da implantasyon yüzdesi incelenmemiģtir. Ancak Neal ve arkadaģlarının çalıģmasına benzer Ģekilde follikül sayısı ve çoğalması araģtırılmıģ ve follikül saysının ve çoğalmasının azaldığı saptanmıģtır. Kee ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada PAH ların insan primordiyal germ hücrelerine olan etkileri araģtırılmıģtır. PAH uygulaması sonrasında primordiyal germ hücrelerinin çoğalmasının düģtüğü görülmüģtür[86].

103 86 Tuttle ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada sigaranın fare ovaryumlarına etkileri araģtırılmıģtır. Sigara içen ve içmeyen olarak iki grup oluģturulmuģtur. Sigara içenlerde sonuç olarak, vücut ağırlığında bir değiģiklik saptanmamıģtır ancak ovaryum büyüklüğünde sigara içen gruplarda küçülme olduğu gözlemlenmiģtir. Sigara içen ve kontrol grubu arasında follikül sayıları karģılaģtırıldığında; sigara içen gruplarda toplam follikül sayısında (primordiyal, primer, sekonder ve antral) önemli bir azalma olduğu, primordiyal folliküllerin diğer folliküllerden daha duyarlı olduğu ve sayılarının diğerlerine oranla daha fazla düģtüğü belirtilmiģtir[87]. Sigara dumanında etkin oranda bulunduğu bilenen B(a)P kullandığımız çalıģmamızda Tuttle ve arkadaģlarını destekleyici olarak vücut ağırlığında anlamlı bir değiģiklik olmadığı, toplam follikül sayısında azalmaya neden olduğu, ayrıcalıklı olarak belirgin Ģekilde Graaf folliküllerinde yapısal değiģimlere neden olduğu gözlemlenmiģtir. B(a)P detoksifikasyonu GSH (glutatyon) ve GST (glutatyon s-transferaz) tarafından gerçekleģtirilir. Sinh ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada B(a)P ile uyarılmıģ ön mide kanserinde 14 gün süresince diģi farelere Curcumin uygulanmıģ ve koruyuculuğu incelenmiģtir. Karaciğer ve ön mide GSH, EH( Epoksit Hidralaz) ve GST izoenzim düzeylerinde anlamlı artıģlar belirlenmiģtir. Curcumin in farelerde B(a)P tarafından uyarılan ön mide kanserinde, karaciğerde metabolizma yolunu uyarıcı ve baskılayıcı etki ile baskılayabileceği sonucuna varılmıģtır [88]. Deshpande ve arkadaģlarının B(a)P tarafından uyarılan ön mide kanseri üzerine yaptıkları bir çalıģmada Curcumin in kanser geliģimini baskıladığı belirtilmiģtir [89]. Gao ve arkadaģlarının diģi farelerde intraperitoneal ve ağız yoluyla B(a)P uygulayarak yaptıkları çalıģmada serumda oksidatif stres ve servikste mitokondriyonların yapısı incelenmiģtir. B(a)P uygulanan gruplarda lipit peroksidaz düzeyleri, süperoksit anyon, hidrojen peroksit ve hidroksil radikal düzeylerinde artıģlar belirlenmiģtir. Servikal dokuda apoptozis ve nekroz saptanmıģtır. Mitokondriyonlarda ise çeģitli yapısal bozukluklar gözlemlenmiģtir [90]. Rekhadevi ve arkadaģlarının ovaryum hücrelerinin subselüler yapılarını incelediği çalıģmada; insan ovaryum hücrelerine B(a)P uygulanmıģtır. Nükleer, sitozolik,

104 87 mitokondriyal ve mikrozomal yapılara bakılmıģ ve B(a)P metabolizmasının mikrozomal ve mitokondriyal erklerde daha fazla olduğu görülmüģtür. Ayrıca B(a)P metabolizmasının uygulanan doz ile doğru orantılı olarak arttığı gözlemlenmiģtir [91]. Gebelikte B(a)P a etkin kalınması fetal ölüm oranında artıģa neden olmaktadır. Eksensefali ve torasik anomalilere, T lendosit geliģiminde bozulmaya ve antikorlarda azalmaya neden olmaktadır. Ayrıca gebelikte B(a)P a etkin kalma sonrasında dokularda BaP-DNA kimyasal katkı oluģumu ve DNA da kırılımlar tetiklenmektedir [92]. MacKenzie ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada 0, 10, 40 ve 160 mg/kg dozlarında farelere uygulanan B(a)P ın gebeliğin 7-16 günlerinde ağız yoluyla alınmasının fetal geliģim üzerindeki etkileri araģtırılmıģtır. Doğum öncesi mg/kg B(a)P a etkin kalan farelerde %97 oranında sterilite gözlenmiģtir. B(a)P dozu arttıkça doğurganlığın belirgin Ģekilde bozulduğu, ovaryum dokusunun hipoplazi gösterdiği, gonadlarda ve üreme organlarında yapısal anomalilerin izlendiği belirtilmiģtir[93]. Shum ve arkadaģlarınca yapılan bir çalıģmada farelerde gebeliğin 7. Ve 10. günlerinde vücut ağırlığı ile orantılı dozlarda B(a)P uygulanmıģtır. B(a)P a etkin kalma sonucunda uterus dokusunda toksisite ve terotojenik etkiler görüldüğü bildirilmiģtir [94]. Curcumin, Zingiberaceae (Zencefilgiller) ailesine ait Curcuma longa bitkisinin yumrularından elde edilir. Curcuma longa, tropik iklimlerde ve Hint yarımadasında doğal olarak yetiģmektedir. Kısa saplı uzun yaģamlı bir bitkidir. Romatizma, vücut ağrıları, deri hastalıkları, yaralar, bağırsak kurtları, ishal, aralıklı ateģ, karaciğer bozuklukları, huysuzluk, üriner deģarjı, dispepsi, kabızlık, leukoderma, amenore ve kolik yangı gibi hastalıkların bir çeģitlilik tedavisi için geleneksel bir ilaç olarak, yaygın olarak kullanılmaktadır. Curcumin in antiinflamatuar, antioksidan, antikanserojenik, antimutajenik, antikoagülan, antidiyabetik, antiviral ve sinir koruyucu olarak çok geniģ bir etki alanı bulunmaktadır[51, 95]. Zhu ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada, Curcumin ve Vitamin E nin akciğer epitel hücrelerinde B(a)P ın etkilerine karģı koruyu olup olmadığı araģtırılmıģtır. B(a)P a etkin bırakılan insan akciğer epitel hücreleri uyarıldığında sitotoksisite, DNA hasarı, ROS üretimi, faz 1 enzimleri (CYP 1A1-1B1, sitokrom p450), hücre döngüsünde durma,

105 88 p53 de azalma görülmüģtür. Curcumin ve Vitamin E nin birlikte kullanımı sonucunda geri döndürücü etkisinin görülmediği ancak daha sonraki etkiler için koruyucu olarak iģlev yapabilecekleri bildirilmiģtir [96]. Sehgal ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada ise Curcumin ve Piperine (Karabiber çekirdeğinde bulunan bir bileģen) antioksidanları kullanılarak fare akciğer ve karaciğerinde B(a)P ın toksik etkilerine bakılmıģtır. Curcumin in ve Curcumin ve Piperin in birlikte uygulandığı grupta CYP1A1, CYP1B1 ve sitokrom P450 ifadelenmesini azalttığı ve dolayısıyla karsinojen etkisi azalttığı bildirilmiģtir [97]. Kavaklı ve arkadaģlarının medulla spinalis yaralanmasında Curcuminin antioksidan etkisini araģtırmak için yaptığı çalıģmada yaralanma, ağırlık düģürme modeliyle gerçekleģtirilmiģtir. Deneklerde SOD ve malondialdehir (MDA) düzeylerine bakılmıģtır. Curcumin uygulanan grupta SOD düzeyinin kontrol grubuna karģın daha yüksek olduğu ve MDA düzeyinin de kontrol grubundan daha düģük olduğu gözlemlenmiģtir. Curcumin in antioksidan özelliği ile medulla spinalisi oksidatif hasara karģı koruduğu belirtilmiģtir [95]. Belviranlı ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada yaģlı diģi sıçanların kalp dokusunda Curcumin in oksidatif stres ve antioksidan savunma sistemi üzerindeki etkilerini araģtırmıģlardır. Curcumin uygulamasının GSH düzeylerini önemli ölçüde arttırdığı, MDA düzeylerini azalttığını gözlemlemiģlerdir [98]. Malhotra ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada fare akciğerinde Curcumin ve Resveratrol un B(a)P ile oluģturulan akciğer kanseri üzerindeki etkinliğine bakılmıģtır. Kontrol grubu ile karģılaģtırıldığında B(a)P uygulanan gruptaki vücut ağırlıklarının azaldığı, Curcumin ve Rasveratrol ile birlikte B(a)P uygulanan gruplardaki farelerin vücut ağırlıklarının ise kontrol grubuna yakın olduğu bildirilmiģtir. B(a)P uygulaması yapılan fare akciğerlerinde SOD ve GSH düzeylerinin azaldığı, epitel kalınlığının kontrol grubu ile karģilastırıldığında arttığı, çekirdek büyüklüğünün arttığı, mitotik erkin azaldığı, organellerde çeģitli yapısal bozukluklar gözlemlenmiģtir. B(a)P uygulanan gruplarda, Curcumin ve Resveratrol un ayrı ayrı veya birlikte deneklere verilmesi sonucunda B(a)P ın olumsuz etkilerinin geri döndürüldüğü belirlenmiģtir [99].

106 89 Malhotra ve arkadaģlarının yaptığı bir diğer çalıģmada ise B(a)P ile oluģturulan akciğer kanserinde modüle mitotik yıkım ve apoptozis ile Curcumin ve Resveratrol un enkinliğini araģtırmıģlardır. B(a)P uygulaması yapılan fare akciğerinde mikroçekirdek oluģumu ve bcl- 2 protein ifadelenmesinde önemli bir artıģ gözlemlemiģlerdir. Apoptotik hücre sayısında ve bax protein ifadelenmesinde önemli ölçüde azalma izlenmiģtir. Curcumin ve Resveratrol un birlikte uygulandığı gruplarda mikroçekirdek oluģumunda ve bcl-2 expresyonunda anlamlı bir azalma, ayrıca apoptotik hücre sayısının yanı sıra bax protein ifadelenmesinde gözle görünür bir artıģın olduğu bildirilmiģtir [100]. AktaĢ ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada iyonize radyasyon uygulanan farelerdeki ovaryum folliküllerinde Curcumin in antiapoptotik ve çoğalma erki araģtırılmıģtır. Farelere 3-10 saat radyasyon ve 3-10 saat radyasyon ile birlikte Curcumin tedavisi uygulanmıģtır. Radyasyona etkin kalma süresinin artmasıyla etkinin doğru orantılı olarak yükseldiği bulunmuģtur. 3 saatlik radyasyon uygulanması sonucu hem follikül duvarında hem de antrumda apoptotik hücreler olduğu ve erken atreziye giden follikül hücre sayısının kontrollere karģın arttığı görülmüģtür. 12 saatlik radyasyon uygulamasını izleyerek atrezik özellik gösteren follikül hücrelerinin önemli ölçüde çoğaldığı belirlenmiģtir. Atreziye giden follikül hücreleri ile birlikte granuloza hücreleri de azalmıģtır. Curcumin ile tedavi edilen gruplarda follikül sayısında artıģ, atreziye giden follikül sayısında azalma olduğu ve Curcumin in radyasyonun oluģturduğu hasarı belirli ölüçüde tedavi edebileceği sonucuna varılmıģtır[101]. Radyasyonun oksidatif strese neden olduğu bilinmektedir. Antioksidan olarak Curcumin in kullanıldığı çalıģmamızda B(a)P ın neden olduğu oksidatif stres etkilerinin ve apoptotik hücrelerin nispeten azaldığı görülmüģtür. Chen ve arkadaģları embriyonik geliģimde Curcumin in sitotoksik etkilerini araģtırmıģlardır. ÇalıĢmada fare embriyolarını blastosist evresinde curcumin ile inkübe etmiģlerdir. En yüksek doz uygulanan blastosistlerde kontrol grubuna karģın hücre sayısında azalma ve ROS(reaktif oksijen türevleri) üretimi ile iliģkilendirilen bir artıģ, fetal ağırlıkta ve implantasyon oranlarında da azalma gözlemlenmiģtir. Normal embriyonik geliģim için Curcumin in potansiyel bir risk oluģturduğu düģünülmüģtür[102].

107 90 Chen ve arkadaģlarının yaptığı bir diğer çalıģmada Curcumin in oosit olgunlaģması, döllenme ve embriyonik geliģim üzerindeki etkileri incelenmiģtir. Deneklere µm Curcumin uıygulanmıģtır. Curcumin in oosit geliģimini baskıladığı, implantasyonda, blastosist sayısında ve embriyonik geliģimde azalmaya neden olduğunu saptamıģlardır[103]. Zhang ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada Curcuminin endometriyozis üzerine baskılayıcı etkisi araģtırılmıģtır. Sonuçta Curcumin in endometriyozisli heterotropik endometriyumda mikrodamar, VEGF (Vasküler endotel büyüme faktörü) protein çoğalma miktarını azalttığı belirlenmiģ ve endometriyozis tedavisinde kullanılabileceği belirtilmiģtir[104]. Sak ve arkadaģlarının yaptığı çalıģmada sıçan ovaryumdaki iskemik reperfüzyon hasarında Curcumin in etkisine bakılmıģtır. Ġskemik reperfüzyon yapılan ovaryumda biriken oksidanların oksidatif strese neden olduğu gözlemlenmiģtir. Bu oksidatif stresin antral folliküllerde hasara, follikül sayısında azalmaya, hücresel dejenerasyona ve apopitotik hücrelerin çoğalmasına neden olduğu bildirilmiģtir. Ġskemik reperfüzyon uygulanan gruplarda oksidanların ve oksidatif stresin yoğun olduğu ve antioksidan düzeyinin düģtüğü izlenmiģtir. Curcumin ile tedavi edilen gruplarda oksidan ve oksidatif stres yoğunluğunun ve folliküllerde oluģan hasarın azaldığı ve dolayısıyla Curcumin in antioksidan etki yarattığı bildirilmiģtir[105]. Bizim çalıģmamızda oksidatif stresi arttıran B(a)P kullanılmıģtır. Sak ve arkadaģlarının çalıģmasına benzer bir Ģekilde, B(a)P ın follikül sayısında azalmaya, hücresel dejenerasyona ve apopitotik hücrelerde çoğalmaya neden olduğu izlenmiģtir. Antioksidan olarak kullanılan Curcumin in bu hasarı belli oranda azalttığı düģünülmüģtür. McKenna ve arkadaģları yemek borusu kanser hattına Curcumin in etkisini araģtırmıģlardır. Curcumin ile tedavi sonrasında 24 saat içinde kanser hattında canlılığın azaldığı izlenmiģtir. Curcumin in apoptozis uyarımına bağımlı olmayan bir düzenek ile hücre ölümüne neden olabileceği ve yemek borusu kanserinin tedavisi ve korunmasında anti-kanser olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıģtır[106]. Bizim çalıģmamızda da tüm bulgular ıģığında, sonuç olarak B(a)P ın ovaryum dokusunda yapısal bozukluklara, follikül geliģinde gerilemeye, follikül sayısında azalmaya neden

108 91 olduğu apopitozisi tetiklediği gözlemlenmiģtir. Antioksidan olarak kullanılan Curcumin in bu yapısal değiģimleri kısmen engelleyebileceği ancak tam koruma için yetersiz kaldığı düģünülmüģtür.

109 92

110 93 6. SONUÇ Çevresel kirliliğin önemli etmenlerinden biri olan B(a)P ın ovaryumda oluģturabileceği hasarda antioksidan olarak yeğlenen Curcumin in olası koruyucu etkilerini incelediğimiz çalıģmamızda; Curcumin çözücüsü olan DMSO nun, B(a)P çözücüsü olan mısır yağı nın ve tek baģına Curcumin in uygulandığı deney gruplarında tüm ovaryum yapısının kontrol grubu ile eģdeģ yapı sergilediği belirlenirken, B(a)P uygulamasının ovaryumda belirgin olarak Graaf follikül üzerinde etkili olduğu ve bu folliküllerin sayısını istatistiksel olarak anlamlı ölçüde azalttığı saptandı. B(a)P uygulamasının özellikle zona pellusida, granüloza ve ağırlıklı olarak kumulus hücrelerinde yapısal bozukluklara neden olduğu, bu uygulama ile atretik folliküllerin sayısının arttığı ve teka interna yapısının bozulduğu belirlendi. Koruma erekli uygulanan Curcumin in ovaryum yapısında bir miktar düzelmeye neden olsa da stromal değiģimlerin düzelmesi adına yetersiz kaldığı, B(a)P uygulaması ile oluģan Graaf follikül sayısındaki azalmayı dengeleyemediği, B(a)P uygulaması ile görülen ve ortadan kuvvetliye değiģen kaspaz-3 ve sitokrom-c tutulumlarını da sadece orta düzeyli bir immünreaktiviteye çekebildiği tespit edildi. Bu bulgular ıģığında, Curcumin uygulamasının B(a)P ın neden olduğu yapısal dejenerasyonları kısmen engellediği ancak tam bir koruma için yetersiz kaldığı kanısına varıldı.

111 94

112 95 KAYNAKLAR 1. Ġnternet: Kanserojenik, mutajenik ve teratojenik kimyasallar, URL: 2FIOLTP%2F2282%2Funite19.pdf&date= ,Son EriĢim Tarihi: Ġnternet: Guidance for environmental background analysis. %2Frelated%2Fdocuments%2FFinal_BG_Sediment_Guidance.pdf+&date= , Son EriĢim Tarihi: Ġnternet: 1. public health statement. URL: rofiles%2ftp69-c1.pdf&date= ,son EriĢim Tarihi: Vardar, N., Tasdemir, Y., Odabasi, M., and Noll, K. E. (2004). Characterization of atmospheric concentrations and partitioning of PAHs in the Chicago atmosphere. Science of the Total Environment, 327(1), Martorell, I., Perelló, G., Martí-Cid, R., Castell, V., Juan M. Llobet, J.M. and Domingo, J.L. (2010). Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in foods and estimated PAH intake by the population of Catalonia, Spain: temporal trend. Environment International, 36, Martinez, E., Gros, M., Lacorte, S. and Barcelo, D. (2004). Simplified procedures for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in water, sediments and mussels. Journal of Chromatography A, 1047, Faust, R. A. (1994). Toxicology Summary for Benzo[a]pyrene, Prepared for: Oak Ridge Reservation Environmental Restoration Program. 8. Ġnternet:PAHs case study. URL: %2Frdonlyres%2F16C681B8-61FC-4890-A8F8- DCB1E2CFB8AE%2F0%2FPAHsCaseStudy9164.pdf&date= , Son EriĢim Tarihi: Sullivan, P. D. (1985). Free radicals of benzo(a)pyrene and derivates. EnvironmentHealth perspective. 64, Lee, B. M., Lee, S. K., Kim, H. S. (1998). Inhibition of oxidative DNA damage, 8- OhdG, and carbonyl contents in smokers treated with antioxidants (vitamin E, vitamin C, _-carotene and red ginseng). Cancer Letters, 132, Klaunig, J. E., Kamendulis, L. M. (2004). The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 44, AkkuĢ, Ġ. (1995). Serbest radikaller ve fizyopatolojik etkileri. Konya: Mimoza yayınları, 1-47.

113 Koca, N., Karadeniz, F. (2003). Serbest radikal oluģum mekanizmaları ve vücuttaki antioksidan savunma sistemleri.gıda Mühendisliği Dergisi,6, Pandya, U., Saini, M. K., Jin, G. F., Awasthi, S., Godley, B. F., Awasthi, Y. C. (2000). Dietary curcumin prevents ocular toxicity of naphthalene in rats. Toxicology Letters,1, Aggarwal, B.B., Kuma,r A. and Bharti, A.C. (2003). Anticancer potential of curcumin: Preclinical and clinical studies. Anticancer Research,23, Jayaprakasha, G. K., Rao, L. J. M., Sakariah, K. (2005).Chemistry and biological activities of Curcuma longa. Trends in Food Science & Technology,16, Maheshwari, R. K., Singh, A. K., Gaddipati, J., Srimal, R. C. (2006). Multiple biological activities of curcumin: a short review. Life Sciences,78, Sadler, T. W. (2011). Medikal embriyoloji (11. Baskı). Ankara: Palme Yayıncılık Moore, K. L., Persaud, T.V. N. (2002). İnsan embriyolojisi (6. Baskı). (çev. M. Yıldırım, Ġ. Okar, H.Dalçık), Gardner, L. P., Hiatt, J. L. (2001). Color textbook of histology.philadelphia: Saunders, Ross, M. H., Kaye, G. I., Pawlina, W. (2003). Histology a text and atlas.philadelphia: Lippincott Williams&Wilkins, Arıncı, K., Elhan, A. (2001). Anatomi.Ankara: GüneĢ Kitabevi, Strandring, S. (2004). Gray s anatomy.edinburgh: Churchill Livingstone, Erdoğan, D., Hatipoğlu, M. T., Görgün, M., Ilgaz, C. (2007). Özel histoloji. Ankara: Hatipoğlu Publishers, Junqueira, L.C., Carneiro, J. (2006). Temel histoloji, konu anlatımı ve atlas. (çev. Y. Aytekin, S. Solakoğlu), Ankara: Nobel Tıp Kitapevleri, Kierszenbaum, A. L. (2006). Histoloji ve hücre biyolojisi(çev. R. Demir). Ankara: Palme Yayıncılık, Guyton, A. C., Hall, J. E. (2006). Text book of medical physiology.philadelphia: Saunders, Ganong, W. F. (2002). Tıbbi fizyoloji (20.baskı).(Çev: TFBD). Ġstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri, Danyi, S., Bose, F., Brasseur, C., Schneider, Y.J.,Larondelle, Y. and Pussemier, L. (2009). Analysis of EU priority polycyclic aromatic hydrocarbons in food supplements using high performance liquid chromatography coupled to an ultraviolet, diode array or fluorescence detector. Analytica Chimica Acta, 633,

114 Wenzl, T., Simon, R., Anklam, E. and Kleiner, J. (2006). Analytical methods for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in food and the environment needed for new food legislation in the European Union. Trends in Analytical Chemistry, 25, Ferrarese, E., Andreottola, G. and Oprea, I.A. (2008). Remediation of PAH contaminated sediments by chemical oxidation. Journal of Hazardous Materials, 152, Wang, X.Y., Li, Q.B., Luo, Y.M., Ding, Q., Xi, L.M., Ma, J.M., Li, Y., Liu, Y.P. and Cheng, C.L. (2010). Characteristics and sources of atmospheric polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in Shanghai, China. Environmental Monitoring and Assessment, 165, Douben, P.E. (Ed.). (2003). PAHs: An ecotoxicological perspective.john Wiley & Sons. 34. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). (1995). Toxicological profile for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). Atlanta (GA): Department of Health and Human Services, Public Health Service, USA. 35. Philips, D. H. (1999). Polysiclic aromatic hydrocarbons in the diet. Mutation Research, 443, Das, U. N. (2002). Effect of anti-oxidants, free radical quenchers and siklo oxigenase inhibitor on benzo(a)pyrene-induced suppression of human lymphocyte mitogenesis in vitro. Medical Science Monitor, 8(6), Ramesh, A. and Knuckles, M.E. (2006). Dose-dependent benzo(a)pyrene [B(a)P]- DNA adduct levels and persistence in F-344 rats following subchronic dietary exposure to B(a)P, Cancer Letters, 240(2), Kim, H. S., Kwack, S. J. and Lee, B. M. (2000). Lipid peroxidation, antioxidant enzymes, and benzo [a] pyrene-quinones in the blood of rats treated with benzo [a] pyrene. Chemico-biological interactions, 127(2), Naylor, S., Gan, L. S., Day, B. W., Pastorelli, R., Skipper, P. L. and Tannenbaum, S. R. (1990). Benzo [a] pyrene diol epoxide adduct formation in mouse and human hemoglobin: physicochemical basis for dosimetry. Chemical Research in Toxicology, 3(2), Lee, C. M., Chen, S. Y., Lee, Y. C. G., Huang, C. Y. F. and Chen, Y. M. A. (2006). Benzo [a] pyrene and glycine N-methyltransferse interactions: gene expression profiles of the liver detoxification pathway. Toxicology and Applied Pharmacology, 214(2), Gómez-Mendikute, A., Etxeberria, A., Olabarrieta, I. and Cajaraville, M. P. (2002). Oxygen radicals production and actin filament disruption in bivalve haemocytes treated with benzo (a) pyrene. Marine Environmental Research, 54(3), Sözmen, E.Y.(2002). Yaşlanma Biyokimyası.Ankara: Palme yayıncılık,

115 Aksoy, Y. (2002). The role of glutathione in antioxidant mechanism. Türkiye Klinikleri Tıp Bilimleri Dergisi, 22, Özgöçmen, S. (2007). Romatizmal hastalıklarda oksidatif stresin rolü. Türkiye Fiziksel Tıp ve Rehabilitasyon Dergisi, 53(2), Cheeseman, K. H., Slater, T. F. (1993). An introduction to free radical biochemistry. British Medical Bulletin, 49(3), Halliwel, B., Gutteridge, J. M. C. (1998).Free radicals in biology and medicine. Free Radical Research,28, Jensen, S. J. K. (2003).Oxidative stress and free radicals. Journal of Molecular Structure (Theochem), : Bilge, M. (2010). Hemodiyaliz hastalarında serbest radikallerin organizmaya ve antioksidan savunma sistemleri üzerine etkisi. Yüksek Lisans Tezi, Dumlupınar ÜniversitesiSağlık BilimleriEnstitüsü, Kütahya. 49. Delibas, N., Özcankaya, R. (1995). Serbest radikaller. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 2(3), Burtis, A. C., Ashwoood, E. R. (1999). Tietz textbook of clinical chemistry(third edition). Philadelphia: WB Saunder Company. 51. Pandya, U., Saini, M. K., Jin, G. F., Awasthi, S., Godley, B. F. and Awasthi, Y. C. (2000). Dietary curcumin prevents ocular toxicity of naphthalene in rats. Toxicology Letters, 115(3), Aggarwal, B. B., Kumar, A. and Bharti, A. C. (2003). Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research, 23(1A), Vogel, H.A., Pelletier, J. (1815). Curcumin-biological and medicinal properties. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2, Maheshwari, R. K., Singh, A. K., Gaddipati, J. and Srimal, R. C. (2006). Multiple biological activities of curcumin: a short review. Life Sciences, 78(18), Jayaprakasha, G. K., Rao, L. J. M. and Sakariah, K. K. (2005). Chemistry and biological activities of C. longa. Trends in Food Science & Technology, 16(12), Rao, M. N. A. (1997). Nitric oxide scavenging by curcuminoids. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 49(1), Hong, J., Bose, M., Ju, J., Ryu, J.H., Chen, X., Sang, S., Lee, M.J. and Yang, C.S. (2004). Modulation of arachidonic acid metabolism by curcumin and related betadiketone derivatives: effects on cytosolic phospholipase A(2), cyclooxygenases and 5- lipoxygenase. Carcinogenesis, 25(9), Zhang, F., Altorki, N. K., Mestre, J. R., Subbaramaiah, K. and Dannenberg, A. J. (1999). Curcumin inhibits cyclooxygenase-2 transcription in bile acid-and phorbol ester-treated human gastrointestinal epithelial cells. Carcinogenesis, 20(3),

116 Brouet, I., Ohshima, H. (1995). Curcumin, an anti-tumor promoter and antiinflammatory agent, inhibits induction of nitric oxide synthase in activated macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications, 206(2), Nicholson, P. W., Ali,A., et al. (1995). Identification and inhibition of the ICE/CED- 3 protease necessary for mammalian apoptosis. 376, Rotondal, J., Nicholsonz, D. W., Fazilz, K. M., Gallant, M., Gareau, Y., Labelle, M., Ruel, R., Peterson, E. P. Rasper,D. M. and Vaillancourt, J. P. (1996). The three dimensional structure of apopain/cpp32, a key mediator of. Nature Structural Biology, 3(7), Droge, W.(2002). Free radicals in the physidogical control of cell function. Physiological Reviews,82, Markstrom, E., Svensson, E., Shao, R., Svanberg, B., & Billig, H. (2002). Survival factors regulating ovarian apoptosis--dependence on follicle differentiation. Reproduction, 123(1), Tilly, J. L. (1996). Apoptosis and ovarian function. Reviews of Reproduction, 1, Günay, M., Tamer, K. and Cicioğlu, Ġ. (2006). Spor fizyolojisi ve performans ölçümü.ankara: Gazi Kitabevi. 66. Schlesinger, M. L., Ashburner, M. and Tissieres, A. (1982). Heat shock: From bacteric to man. New York; Cold Spring Harbor Laboratory Pres, 13, Lavrik, I. N., Golks, A. and Krammer, P. H. (2005). Caspases: pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation, 115(10), Peluffo, M. C., Busman, L., Stouffer, R. L., Tesone, M. (2006). Expression of caspase-2,-3,-8 and -9 proteins and enzyme activity in the corpus luteum of the rat at different stages during the natural estrous cycle. Reproduction. 132, Rotondal, J., Nicholsonz, D. W., Fazilz, K. M., Gallant, M., Gareau, Y., Labelle, M., Ruel, R., Peterson, E. P. Rasper, D. M. and Vaillancourt, J. P. (1996). The three dimensional structure of apopain/cpp32, a key mediator of. Nature Structural Biology, 3(7), Otsu, K., Sato, K., et al. (2005). An abortive apoptotic athway ınduced by singlet oxygen is due to the suppression of caspase activation. Biochemical Journal,389, Feranil, J. B., Isobe, N. and Nakao, T. (2005). Apoptosis in the Antral Follicles of Swamp Buffalo and Cattle Ovary: TUNEL and Caspase 3 Histochemistry. Reproduction in Domestic Animals, 40(2), Amsterdam, A., Sasson, R., Keren-Tal, I., Aharoni, D., Dantes, A., Rimon, E., Land, A., Cohen, T., Dor, Y. and Hirsh, L. (2003). Alternative pathways of ovarian apoptosis: death for life. Biochemical Pharmacology, 66(8),

117 Hussein, M. R. (2005). Apoptosis in the ovary: molecular mechanisms. Human Reproduction Update. 11, Terzi, G., Çelik, T. H. (2006). Polisiklik aromatik hidrokarbonların bazı gıdalarda bulunuģu ve insan sağlığı üzerine etkileri. Gıda Dergisi, 31(6). 75. Gao, M., Li, Y., Sun, Y., Shah, W., Yang, S., Wang, Y.and Long, J. (2011). Benzo [a] pyrene exposure increases toxic biomarkers and morphological disorders in mouse cervix. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 109(5), Lim, J., Lawson, G. W., Nakamura, B. N., Ortiz, L., Hur, J. A., Kavanagh, T. J. and Luderer, U. (2013). Glutathione-deficient mice have increased sensitivity to transplacental benzo [a] pyrene-induced premature ovarian failure and ovarian tumorigenesis. Cancer Research, 73(2), Shi, Y. R., Geng, J., Wang, H. and Zhang, Y. (2010). Effects of benzo (a) pyrene on expression of cytochrome P450 1A1 in HeLa cells of uterine cervix cancer. Journal of Shanghai Jiaotong University (Medical Science), 30(12), Kummer, V., Mašková, J., Zralý, Z., Neča, J., Šimečková, P., Vondráček, J.and Machala, M. (2008). Estrogenic activity of environmental polycyclic aromatic hydrocarbons in uterus of immature Wistar rats. Toxicology Letters, 180(3), Einaudi, L., Courbiere, B., Tassistro, V., Prevot, C., Sari-Minodier, I., Orsiere, T. and Perrin, J. (2013). In vivo exposure to benzo (a) pyrene induces significant DNA damage in mouse oocytes and cumulus cells. Human Reproduction, det Chen, K. M., Zhang, S. M., Aliaga, C., Sun, Y. W., Cooper, T., Gowdahalli, K., Zhu, J., Amin, S. and El-Bayoumy, K. (2012). Induction of ovarian cancer and DNA adducts by Dibenzo [a, l] pyrene in the mouse. Chemical Research in Toxicology, 25(2), Sadeu, J. C., Foster, W. G. (2011). Effect of in vitro exposure to benzo [a] pyrene, a component of cigarette smoke, on folliculogenesis, steroidogenesis and oocyte nuclear maturation. Reproductive Toxicology, 31(4), Siddique, S., Sadeu, J. C., Foster, W. G., Feng, Y. L. and Zhu, J. (2014). In vitro exposure to cigarette smoke induces oxidative stress in follicular cells of F1 hybrid mice. Journal of Applied Toxicology, 34(2), Neal, M. S., Zhu, J. and Foster, W. G. (2008). Quantification of benzo [a] pyrene and other PAHs in the serum and follicular fluid of smokers versus non-smokers. Reproductive Toxicology, 25(1), Neal, M. S., Zhu, J., Holloway, A. C. and Foster, W. G. (2007). Follicle growth is inhibited by benzo-[a]-pyrene, at concentrations representative of human exposure, in an isolated rat follicle culture assay. Human Reproduction, 22(4), Kee, K., Flores, M., Cedars, M. I. and Pera, R. A. R. (2010). Human primordial germ cell formation is diminished by exposure to environmental toxicants acting through the AHR signaling pathway. Toxicological Sciences, 117(1),

118 Tuttle, A. M., Stämpfli, M. and Foster, W. G. (2009). Cigarette smoke causes follicle loss in mice ovaries at concentrations representative of human exposure. Human Reproduction, 24(6), Singh, S. V., Hu, X., Srivastava, S. K., Singh, M., Xia, H., Orchard, J. L. and Zaren, H. A. (1998). Mechanism of inhibition of benzo [a] pyrene-induced forestomach cancer in mice by dietary curcumin. Carcinogenesis, 19(8), Deshpande, S. S., Ingle, A. D. and Maru, G. B. (1997). Inhibitory effects of curcumin-free aqueous turmeric extract on benzo [a] pyrene-induced forestomach papillomas in mice. Cancer Letters, 118(1), Gao, M., Li, Y., Sun, Y., Long, J., Kong, Y., Yang, S. and Wang, Y. (2011). A common carcinogen benzo [a] pyrene causes p53 overexpression in mouse cervix via DNA damage. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 724(1), Rekhadevi, P. V., Diggs, D. L., Huderson, A. C., Harris, K. L., Archibong, A. E. and Ramesh, A. (2014). Metabolism of the environmental toxicant benzo (a) pyrene by subcellular fractions of human ovary. Human & Experimental Toxicology, 33(2), Kristensen, P., Eilertsen, E., Einarsdóttir, E., Haugen, A., Skaug, V. and Ovrebø, S. (1995). Fertility in mice after prenatal exposure to benzo [a] pyrene and inorganic lead. Environmental Health Perspectives, 103(6), Mackenzıe, K. M., Angevine, D. M. (1981). Infertility in mice exposed in utero to benzo (a) pyrene. Biology of Reproduction, 24(1), Shum, S., Jensen, N. M. and Nebert, D. W. (1979). The murine Ah locus: in utero toxicity and teratogenesis associated with genetic differences in benzo [a] pyrene metabolism. Teratology, 20(3), Kavakli, H. S., Koca, C. and Alici, O. (2011). Antioxidant effects of curcumin in spinal cord injury in rats. Ulusal Travma ve Acil Cerrahi Dergisi, 17(1), Zhu, W., Cromie, M. M., Cai, Q., Lv, T., Singh, K. and Gao, W. (2014). Curcumin and vitamin E protect against adverse effects of benzo [a] pyrene in lung epithelial cells. PloS One, 9(3), e Sehgal, A., Kumar, M., Jain, M. and Dhawan, D. K. (2013). Modulatory effects of curcumin in conjunction with piperine on benzo (a) pyrene-mediated DNA adducts and biotransformation enzymes. Nutrition and Cancer, 65(6), Belviranlı, M., Okudan, N.and Atalık, K. E. N. (2012). YaĢlı sıçanlarda kurkumin takviyesinin kalp dokusunun oksidan/antioksidan durumu üzerine etkileri. Genel Tip Dergisi, 22(2). 98. Malhotra, A., Nair, P.and Dhawan, D. K. (2010). Modulatory effects of curcumin and resveratrol on lung carcinogenesis in mice. Phytotherapy Research, 24(9),

119 Malhotra, A., Nair, P. and Dhawan, D. K. (2012). Curcumin and resveratrol in combination modulates benzo (a) pyrene-induced genotoxicity during lung carcinogenesis. Human &Experimental Toxicology, 31(12), Aktas, C., Kanter, M.and Kocak, Z. (2012). Antiapoptotic and proliferative activity of curcumin on ovarian follicles in mice exposed to whole body ionizing radiation. Toxicology and İndustrial Health, 28(9), Chen, C. C., Hsieh, M. S., Hsuuw, Y. D., Huang, F. J.and Chan, W. H. (2010). Hazardous effects of curcumin on mouse embryonic development through a mitochondria-dependent apoptotic signaling pathway. International Journal of Molecular Sciences, 11(8), Chen, C. C., Chan, W. H. (2012). Injurious effects of curcumin on maturation of mouse oocytes, fertilization and fetal development via apoptosis. International Journal of Molecular Sciences, 13(4), Zhang, Y., Cao, H., Hu, Y. Y., Wang, H. Zhang, C. J. (2011). Inhibitory effect of curcumin on angiogenesis in ectopic endometrium of rats with experimental endometriosis. International Journal of Molecular Medicine, 27(1), Sak, M. E., Soydinc, H. E., Sak, S., Evsen, M. S., Alabalik, U., Akdemir, F.and Gul, T. (2013). The protective effect of curcumin on ischemia-reperfusion injury in rat ovary. International Journal of Surgery, 11(9), McKenna, S. L., O'Sullivan-Coyne, G., O'Sullivan, G. C., O'Donovan, T. R. and Piwocka, K., (2009). Curcumin induces apoptosis-independent death in oesophageal cancer cells. British Journal of Cancer, 101(9), Naegeli, H., Geacintov, N.E. (2005). Carcinogenic effects polycyclic aromatic hydrocarbons. In A. Luch. Mechanisms of repair of polycyclic aromatic hydrocarbonınduced DNA damage. (pp ), USA: Imperial College Pres Jiang, H., Gelhaus, S. L., Mangal, D., Harvey, R. G., Blair, I. A. and Penning, T. M. (2007). Metabolism of benzo [a] pyrene in human bronchoalveolar H358 cells using liquid chromatography mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology, 20(9), Shou, M. F. J. H. V., Gonzalez, F. J. and Gelboin, H. V. (1996). Stereoselective epoxidation and hydration at the K-region of polycyclic aromatic hydrocarbons by cdna-expressed cytochromes P450 1A1, 1A2, and epoxide hydrolase.biochemistry, 35(49), Fang, C., Zhang, Q. Y. (2010). The role of small-intestinal P450 enzymes in protection against systemic exposure of orally administered benzo [a] pyrene.journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 334(1),

120 EKLER 103

121 Ek-1. Katılım Belgesi 104

122 Ek-2. Etik Kurulu Onayı 105

123 106 ÖZGEÇMĠġ KiĢiselBilgiler Soyadı,adı Uyruğu Doğumtarihiveyeri Medenihali : Çelebi, Simge : T.C. : 1990/ ANKARA :Bekar Telefon : simge_celebi@hotmail.com Eğitim Derece EğitimBirimi Mezuniyettarihi Yüksek Lisans Lisans G.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitisü/ Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı Ankara Üniversitesi/ Fen Fakültesi/ Biyoloji Bölümü Devam Ediyor 2011 Lise Gazi Üniversitesi Vakfı Özel Fen Lisesi 2007 ĠĢDeneyimi Yıl Yer Görev 2015 Neosys Cerrahi Çözümler Ürün Müdürü YabancıDil Ġngilizce

124 GAZİ GELECEKTİR...