B-TeZ IAC Aflatoksin 3ml kullanarak Temizleme Süreci talimatı

Transkript

1 Immunoafinite Kromatografisi ile Aflatoksinler içeren Gıda ve Yem Örneklerinin Hammadde Özütlerinin Temizlenmesi ve Piridinyum perbromid kullanılarak Postcolumn türetilmesi ile sonraki HPLC Analizi Prensip: Gıda ve yem toplam Aflatoksin belirlenme talimatı immünoafinite kolon (IAC) ve HPLC ile miktar özüt zenginleştirme adımına odaklanır. Kabul edilen laboratuar ekstraksiyon yöntemleri korunabilir. Organik çözücü toleransı, analitin elüsyon süreci ve kolon çalışma aralığının belirgin kriterleri izlenirse IAC kolonunun tüm performansı verilir. Gıda ve yemlerde aflatoksin (AFG2,AFG1, AFB2 ve AFB1) çoğu ön işlem yöntemlerinin belirlenmesi sorunlu matrisler uygulanması halinde müdahale edici maddelerden dolayı düşük duyarlılık gösterir. Aflatoksinlerin içerik belirleme yöntemi onun elüatı konsantre etme potansiyeli ve HPLC kolonuyla saflaştırmanın ek adımı ile immünoafinite kolonunun (IAC) yüksek seçiciliğini (IAC) birleştirir. Lütfen bu talimatın IAC kolon ile kullanılmaya odaklı olduğuna dikkat edin Hammadde ekstraksiyon adımı için bir literatür yöntemi verilir.verilen cihaz (örneğin HPLC sistemi) diğer olasılıklar arasında örnek olarak hizmet verebilir. Ekstraksiyon (Verilen literatür metodu): 100 ml metanol / su (60/40 v /v) toplamından 25g örnek elde edildiğini varsayın. Organik çözücü oranının PBS ile özütü seyreltilmesi farklı ise zenginleştirme aşamasında uygun şekilde ayarlanmalıdır. Öte yandan, örnek miktarının oranı ve ekstraksiyon çözücüsünün hacmi değişirse, gram eşdeğer hesaplanması düzeltilmelidir. Sorunlu bir matrisin bir örneği olarak yer fıstığı yemeği için, Roch et al.1 edebiyat yöntemi uygulanabilir. Zenginleştirme Adımı IAC: 4ml özüt (yukarıya bakın, 1g aflatoksin örnek miktarı içerir) 16ml 50mM PBS (ph=7.4) ile seyreltilir ve sonra B-Tez IAC Aflatoksin 3ml kolonun üst kısmında bir haznede uygulanır. Kolonun tam performansını korumak için, lütfen kolonun üst kısmında çözelti içindeki seyreltme tamponu oranının küçük olmamasına dikkat edin.12% metanol oranı, bu örnek zenginleşmesinde sonuçlanan, kolon performansını etkilemez. Dikkat: PBS seyreltilmiş özütün organik çözücüsünün oranı, kolonda uygulanan, % 20 metanol ve %10 asetonitrili geçmemelidir. Organik çözücü oranı bu sınırların üzerinde yer alıyorsa, kurtarma oranları azalır. Ek PBS ile özütü seyrelterek seyreltilmiş özüt hacminin artışı, diğer taraftan, hemen hemen hiç kolon performansı sonuçları yoktur. Örnekler aynı anda hazırlanabilir ise, çeşitli 12 J.T. Baker örnekleri değeri kanıtlamıştır. Afinite jel içinden akış oranı 1-3 ml/dk 'dır. Sorunlu matris durumunda akış oranı altında 2ml/dk altında olmalıdır. Dikkat! ne jel ne de jel ve kolonun döner vidalı çıkışı arasında hiçbir büyük hava kabarcığının olmadığının farkında olun, sürekli akışı ya da gerekli madde değişimini engeller. Uygulama ve beklenen içeriklere bağlı olarak, daha büyük ya da daha küçük özüt alikotları uygulanabilir. Bu gibi durumlarda örnek hesaplama (aşağıya bakınız) adapte edilmelidir. Yıkama: Tam örnek jelden geçtikten sonra 10 mm PBS/metanol (90/10 v / v) ün 5 ml ile yıkanır. Jelde kalan sıvılar kolonun üstünden veya alttan alçak basınç uygulanarak kaldırılır. Elüsyon: 1/4

2 B-Tez IAC Aflatoksin 3 ml kolonun üstünde örnek haznesi kaldırılır ve uygun bir şişe afinite kolonu altına yerleştirilir. Bağlı toksinler elüsyon çözücüsü olarak toplam 2ml metanol kullanılarak elüe edilir. Elüsyon süreci analitlerin tam olarak yayılmasını sağlamak için iki adımda gerçekleştirilir. İlk olarak, 1 ml elüsyon çözücüsünden bir hacim uygulanır. Hacim kolondan geçtikten sonra yarım dakika bekletilir elüsyon çözücüsünün 1ml ikinci kısmı kolondan elue edilmeden önce. Elüsyon sürecinin akış oranı 1ml/dk çok geçmemelidir. Kalan çözücü çözeltileri hafif bir uygulama ya da aşırı basınç ile elüe edilmelidir -.Tüm metanolik parçalar kolon eluat vermek için bütünleşmiştir. Kolon elüat doğrudan veya içerikler düşük olduğunda, HPLC içine enjekte edilebilir (<2ng/g, hammadde içeriği ile ilgili), bu buharlaşma ile konsantre edilebilir (ör. sürekli azot akımı altında 50 C de VLM buharlaştırıcı ). Dikkat: Eğer buharlaşma ile konsantrasyon izlerseniz, koruyucu olarak 100µl asetik asit/su (50/50 v/v) ekleyin. Analit kaybını önlemek için, küçük hacimli kalıntıda konsantrasyonu durdurun, ör µl. Kalıntı daha sonra HPLC çözücü içinde tekrar çözünür (ör. 0.4ml) ve son olarak bir alikot sistem içine enjekte edilir. IAC Kolon Özellikleri: A) Çalışma Aralığı ve B-TeZ IAC Aflatoksin 3ml Kolon Kurtarma Oranları: Kolonun çalışma aralığı: Kolonun sıfır kontaminasyonu: Çalışma aralığında Garantili Kurtarma Oranları (*) Aflatoksin toplam: Aflatoksin B 1 (AFB 1 ): Aflatoksin B 2 (AFB 2 ): Aflatoksin G 1 (AFG 1 ): Aflatoksin G 2 (AFG 2 ): ng Aflatoksin toplam IAC başına <0.04ng (LOD of HPLC-FLD metod) >90% ± 5% >95% ± 5% >90%% ± 5% >95%% ± 5% >90% ± 5% Kurtarma oranları tam IAC ayırma prosedürüyle sınırlıdır (hammadde ekstraksiyon işleminin kurtarma oranlarını içermez), IAC Zenginleştirme Adımı için, % 20 metanol ve %10 asetonitrilin altında seyreltilmiş özütün organik çözücü içeriği, Yıkama ve Elüsyon Adımı için bu talimatta tarif edildiği şekilde olduğu anlamına gelir B) B-TeZ IAC Aflatoksin 3ml Kolon Çapraz Reaktiviteler (**) : (**) Aflatoksin B 1 (AFB 1 ): 100n% Aflatoksin B 2 (AFB 2 ): 86% Aflatoksin G 1 (AFG 1 ): 101% Aflatoksin G 2 (AFG 2 ): 82% Recovery rate of AFB, AFG, AFG, divided by recovery rate of AFB if a total of 1.8µg Aflatoxin 2/4

3 toplam ( B 1, B 2, G 1, G 2, = 4:1:4:1 molar oranı ile) kolon başına analiz edilir. Lütfen bu miktarın kolonun kapasite sınırına yakın olduğuna dikkat edin, kolonun bağlanma yerlerinin sınırlı olduğu. Bu sebepten AFG 1 ve AFG 2 çapraz reaktiviteleri verilen çalışma aralığında aflatoksin konsantrasyonlarında çok daha yüksektir, antikor bağlanma yerlerinin fazla olduğu yerlerde (yukarıdaki A tablosuna bakın). C) B-TeZ IAC Aflatoksin 3ml Kolonun Kapasitesi (***) : (***) Maksimum Kolon Kapasitesi: 1.8µg Aflatoksin toplam Aşırı aflatoksin, ör. 4µg, 2 ml PBS küçük bir hacmi 5 dakika için IAC ile inkübe edilir; daha sonra IAC 2ml, PBS ile yıkandı ve bağlı olmayan bölümü analiz edilir. Eklenen analitin farklılığı ve bağlı olmayan analit maksimum kolon kapasitesine eşittir. D) B-TeZ IAC Aflatoksin 3ml Kolon Raf Ömrü: Raf ömrü: 2-8 C de 2 yıl oda sıcaklığında (20-25 C) 1 yıl 3/4

4 AnalitikMetod: HPLC: Shimadzu; Kolon: Trentec Reprosil-Pur RP C ODS3 5µm; 125x3,0mm koruma kolonu ile; Mobil Faz A: metanol / deiyonize su (85/15 v/v); Mobil Faz B: metanol / asetonitril / deiyonize su (18/18/64 v/v/v); Meyil: 0.01 dk B 100 %; 16 dk B 100 %; 17 dk B 0 %; 19 dk B 0 %; 20 dk B 100 %; Akış Oranı: 0.5ml/min; Analiz Süresi: 30dk; Enjektör Hacmi: 100µl Post Kolon Türevlendirme: 32 ppm dioksan / deiyonize su içinde piridinyum hidrobromür perbromid (0.1/99.9, v/v); Akış Oranı: 0.5ml/dk; reaksiyon kapiller (T-cihaz tarafından kolon ve dedektörün sonu arasına koyun): ): PEEK- kapiller, 1/16 x 0.25 mm ID; uzunluk: 40 cm Floresan-Bulma: λ EX [nm]: 362nm; λ EM [nm]: 440nm. Sıcaklık: Makine ve seyrelticiler oda sıcaklığındadır.seyrelticiler helyum gazı ile gazı giderilir. HPLC Metod Özellikleri Aflatoksin B 1 2 Ölçüm aralığı enjeksiyon başına 10pg Aflatoksin B1 den 500pg ye doğrusaldır (R =0.999) verilen HPLC metodunda. Tespit alt sınır (LOD) enjeksiyon başına 2pg AFB 1 dir (seslere sinyal (S/N) oran = 3). Hammadde kontaminasyon dengesi ve HPLC ölçüm aralığı: Belirtilen seyreltme adımları (zenginleştirme adımı, elüat konsantrasyon adımı) izlenirse, ng/g hammaddede aflatoksin B1 içerikleri HPLC yöntemi ölçüm aralığı içinde kalır. İçerikler yüksek ise, 2 den 200ng/g a, IAC kolon elüat HPLC elüent ile uygun şekilde seyreltilmelidir veya, alternatif olarak, enjektör hacmi ayarlanmalıdır. Sadece hammadde içerikleri 200ng /g toplam aflatoksin IAC kolon çalışma aralığı üzerinde kalırsa, bu talimatın kolonu başına 1g eşdeğer indirilmelidir.bu nedenle, IAC zenginleştirme adım ve sonraki HPLC analizi daha küçük bir özüt hacmi ile tekrarlanmalıdır, ör. 4 ml özüt yerine 2 ml özüt hacmi, ya da daha az olduğu durumlarda, 10 ml PBS ile seyreltilir ve IAC kolonuna uygulanır. Artık Aflatoksin G 1, Aflatoksin B 2 ; Aflatoksin G 2 : Duyarlılıklar [AREA Zirve / pg] aflatoksinler AFG 1, AFB 2 ve AFG 2, AFB 1 ile ilgili sırasıyla 37%; 136% ve 67% AFG 1 : Ölçüm aralığı enjeksiyon başına 25pg Aflatoksin G1 den 500pg a 1 doğrusaldır (R 2 =0.999). Tespit LOD enjeksiyon başına 6pg AFG1 dir. (sese sinyal (S/N) oran = 3). AFB 2 : Ölçüm aralığı enjeksiyon başına 2.5pg Aflatoksin B2 den 125pg a 2 doğrusaldır (R 2 =0.999). LOD enjeksiyon başına is 1pg AFB 2 dir. (sese sinyal (S/N) oran = 3). AFG 2 : : Ölçüm aralığı enjeksiyon başına 2.5pg Aflatoksin G2 den 2 125pg a doğrusaldır (R 2 =0.999). LOD enjeksiyon başına 2pg AFG 2 dir. (sese sinyal (S/N) oran = 3). Artık aflatoksinler (AFG1, AFB2 ve AFG2) çoğunlukla yaygın olarak oluştuğu ve böylece anahtar aflatoksin B1 ile eş zamanlı olarak analiz edildiği için, Hammadde içeriklerinin farklı seviyeleri ve belirtilen HPLC ölçüm aralıkları aflatoksin B1 için belirtildiği gibi aynı şekilde dengelenir. AFB 1 içeriğinin Örnek Hesaplaması : (AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 içeriğinin hesaplanması benzerdir) A) HPLC enjeksiyon başına Örnek Gramm Eşdeğerlerinin Hesaplanması: 25g Örnek 4ml Özüt 0.1ml 0.25g x x enjektör = Örnek 100ml Ekstraksiyon 0.4ml hacmi Eşdeğerleri Çözücü 4/4

5 B) ng/g da incelenen hammaddenin Aflatoksin B1 kontaminasyonunun hesaplanması: # ng enjekte edilen AFB = ng/g AFB 1 ör. yer fıstığı yemek Örnek Eşdeğerleri [g] Tampon, Kimyasallar Cihaz ve Literatür: Fosfat Tamponlu Tuzlu ph 7.4 (= 50mM PBS) 1.24g KH 2 PO g K 2 HPO g NaCl Kimyasallar: asetonitril, HPLC grade metanol, HPLC grade asetik asit, 100% ultrapure deiyonize su dipotasyum hidrojenfosfat, >98% potasyum dihidrojenfosfat, >98% sodyum klorür Buharlaşma: nitrojen gazı 5.0 [Hava Likit M ] (IAC-elüatın buharlaşması için) Postkolon Türevlendirme: piridin hidrobromür perbromid, >95%. dioksan, 99.5% Cihaz: HPLC; Shimadzu; pump: LC-6A (2 parça); otomatik örnekleyici: SIL 6B; floresan dedektör: RF- 10AXL; veri işleme: CLASS LC10 1L deiyonize su içinde çözün. Gerekirse 1N NaOH veya 1N HCI ile ph 7.4 (± 0.3)'e ayarlayın Consumerables: B-TeZ IAC Aflatoksin 3ml [BTAF310005] Elüsyon Çözücü: metanol Koruyucu: asetik asit/su (50/50 v/v): 10ml asetik asit ve 10ml deiyonize su karıştırın Reaktif: 32 ppm pyridine hydrobromide perbromide dioksan / deiyonize su içinde (0.1/99.9, v/v): 1 ml dioksan içinde 32 mg piridin hidrobromür perbromid kısmen çözülür ve yağlı suspended sıvıyı 1L gazı alınmış deiyonize suya pipetleyin Buharlaştırıcı (tripod ile) [VLM EVA EC1-S] Vakum SPE Manifold (BAKER spe-24g Kolon İşlemci 24 örneğe kadar işleme ) [J.T. Baker 7208] BioTeZ Berlin-Buch GmbH 1 " Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile yer fıstığı yemeğinde aflatoksinlerin tespiti: aflatoksin B1 türevlendirmesinin iki yönteminin karşılaştırılması" G. Roch, G. Blunden, J. Haig, D.Coker and C. Gay B. J. Biomed Sci 1995, 52, /4