ÖZEL EGE LİSESİ GIDA GÜVENLİĞİ ANALİZLERİNDE NANOTEKNOLOJİNİN KULLANIMI

Transkript

1 ÖZEL EGE LİSESİ GIDA GÜVENLİĞİ ANALİZLERİNDE NANOTEKNOLOJİNİN KULLANIMI HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER: Naz DELİBAŞ Arda TAVUSBAY DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Merve AKPINAR İZMİR 2017

2

3 İÇİNDEKİLER Sayfa 1. GİRİŞ Gıda Güvenliği Gıda Patojenleri Gıda Patojenlerinin Saptanması Projenin Amacı YÖNTEM Kullanılan Kimyasallar ve Çözeltiler Proje Süresince Kullanılan Kimyasallar Proje Süresince Kullanılan Çözeltiler Kullanılan Cihazlar Polimeraz Zincir Reaksiyon PCR Kurulumu PCR Döngünün Gerçekleştirilmesi PCR Görüntüleme Agaroz Jel Hazırlanması, Örneklerin Jele Yüklenmesi ve Görüntüleme Agaroz Jel Hazırlanması Örneklerin Jele Yüklenmesi ve Görüntüleme BULGULAR Farklı DNA Miktarlarında ve Döngü Dayılarında Altın Nanopartikül Varlığının PCR Verimine Etkisine İlişkin Bulgular L. monocytogenes PrfA Proteinini Kodlayan Gen Fragmentini Çoğaltmak İçin Yapılan Denemeler E. coli O157:H7 EscA Proteinini Kodlayan Gen Fragmentini Çoğaltmak İçin Yapılan Denemeler Farklı DNA Miktarlarında ve Döngü Sayılarında Kuantum Dot Varlığının PCR Verimine Etkisine İlişkin Bulgular L. monocytogenes PrfA Proteinini Kodlayan Gen Fragmentini Çoğaltmak İçin Yapılan Denemeler E. coli O157:H7 EscA Proteinini Kodlayan Gen Fragmentini Çoğaltmak İçin Yapılan Denemeler Altın Nanopartikül ve Kuantum Dot Kullanımının Dubleks PCR Üzerindeki Etkisine İlişkin Bulgular Örnek Uygulama Çalışmalarına İlişkin Bulgular SONUÇLAR VE TARTIŞMA ÖNERİLER KAYNAKLAR... 21

4 1. Giriş 1.1 Gıda Güvenliği Gıda güvenliği; fiziksel, kimyasal ve mikrobiyolojik özellikleriyle gıdaların üretim, işleme, saklama, taşıma ve dağıtım aşamalarında besin değerini kaybetmeden tüketime uygun hale getirilmesi, bu aşamalarda gerekli kurallara uyulması, önlemlerin alınması olarak tanımlanmaktadır ve sağlıklı, sağlığa yararlı, sağlık durumunu korumuş gıda kavramlarını içermektedir (Erbelet, 2014; Erden, 2012). Gıda güvenliği sistemleri ise, gıda kaynaklı tehlikelerin azaltılması amacıyla çiftlikten sofraya gıda güvenliği (farm to table) yaklaşımını öne çıkarmaktadır (Erbelet, 2014; WHO, 2015; Yasmin ve ark., 2016). Gıda kaynaklı tehlikelerin önlenmesi için temel yaklaşım, ham maddeden başlayarak gıda tüketimine kadar gıda zincirindeki her bir aşamanın dikkatle incelenmesini ve kontrol basamaklarının uygulanmasını gerekli kılmaktadır (Erbelet, 2014). Günümüzde, ulusal ve uluslararası boyutta gıda güvenliğine yönelik çalışmalara olan ilgi artmaktadır (Pinu, 2016; Souii ve ark., 2016). Gıda güvenliği sadece tarımsal üretim bazında değil, aynı zamanda veterinerlik, ormancılık, balıkçılık, su, endüstri ve ekonomi gibi geniş alanları kapsayan küresel bir konudur (Erbelet, 2014). Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Organizasyonu (FAO), 2009 yılında yayınladığı raporda, 2050 yılında Dünya nüfusunun 9,3 milyara yaklaştığı (Şekil 1) göz önüne alındığında besin ihtiyacının nasıl sağlanacağı konusunu ele almış ve 2013 yılında da gıda güvenliğini sağlamaya yönelik hususları gözden geçirmiştir (Popp, 2013). MÖ Milyon Milyar Tarıma Başlanması Milyar Milyar 3.02 Milyar Milyar Şekil 1. Dünya popülasyonunun zamana bağlı değişimi (Popp, 2013). Dünya nüfusunun hızla artmasıyla birlikte, endüstriyel gıda üretimi yapan tesislerde gerekli hijyen kurallarına uyulmaması, gıda katkı maddelerinin ve tarım ilaçlarının yaygın kullanılması, toprak verimliliğinin azalmasıyla hormonlu ve genetiği değiştirilmiş gıdaların yaygınlaşması gibi başlıca etmenler gıda kalitesini düşürerek gıda güvenliğini tehdit etmekte, bunun sonucunda da gıda kaynaklı hastalıklara zemin oluşturmaktadır (Erden, 2012). Dolayısıyla, gıda güvenliği dünya çapındaki ana sorunlardan biri haline gelmiş ve son zamanlarda bu konulardaki çalışmalar hız kazanmıştır. Özellikle, uluslararası gıda ticareti göz önünde bulundurulduğunda, gıda güvenliğinin ana unsurları ele alınarak başta az gelişmiş ülkelerde olmak üzere yasal düzenlemelere gidilmiştir. Amerika ve Avrupa devletleri ise bu anlamda az gelişmiş ülkelere kıyasla birkaç adım daha öndedir. Avrupa Birliği (AB) ülkeleri gıda mevzuatlarının geliştirilmesine yönelik ilk adımları 1997 yıllarında atarken, konuya yönelik hassasiyetleri günden güne gelişmiş ve 2000 yıllarından itibaren AB de gıda güvenliğinin sağlanması adına denetim ve kontrol mekanizmaları oluşturulmuştur. Amerika - 1 -

5 Birleşik Devletlerinde ise Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), gıda kaynaklı hastalıkların ve ölümlerin azaltılması amacıyla 2015 yılında Gıda Güvenliği Kanunu nu düzenlemiştir (Erbelet, 2014; Erden, 2012). Türkiye de ise toplumun yaşam kalitesinin yükseltilmesi amacıyla gıda kalitesi ve gıda güvenliği sorunu 2023 Vizyon hedefleri arasında birinci sırada yer almaktadır. Bu raporda, toplumun yeterli ve dengeli beslenmesi, ürün kalitesinin güvence altına alınması, gıdalardan kaynaklanan sağlık risklerinin azaltılması ve tüketici haklarının korunması için gıda güvenliğinin zorunlu olduğu vurgulanarak Türkiye nin ekolojik avantajlarından kaynaklanan ürün çeşitliliği ve kalitesinin ekonomik anlamda değerlendirilmesi için; işleme, ambalajlama, muhafaza süreçleri ile gıda kalite ve kalite yönetim sistemlerinin geliştirilmesine ve yaygınlaştırılmasına duyulan ihtiyaca dikkat çekilmiştir (TÜBİTAK, 2004). Hızla artan dünya nüfusu, tüketicileri bol çeşitli ve uzun ömürlü gıdalara yönlendirmiştir. Son yıllarda, gıdalar, tarlalardan ya da fabrikalardan tüketiciye ulaşana kadar pek çok aşamadan geçmekte ve hatta uluslararası boyutta değerlendirilirse kilometrelerce yol kat etmektedir. Gıdaların bu küresel dağılımı göz önünde bulundurulduğunda, herhangi bir aşamada oluşabilecek gıda kaynaklı enfeksiyonlar tüm dünya popülasyonunu etkileyebilecektir. Ayrıca, uygun olmayan tarım uygulamaları, gıda zincirinin herhangi bir aşamasındaki kötü hijyen, gıda işleme ve hazırlama esnasında kontrol eksikliği, çeşitli kimyasalların yanlış kullanımı, kontamine ham madde, gıda ve su, uygun olmayan saklama koşulları gibi faktörler gıda güvenliğini tehdit etmektedir (Uçar ve ark., 2016). Gıda güvenliğini ve gıda kalitesini düşürerek gıda kontaminasyonuna neden olan etmenler fiziksel, kimyasal ve biyolojik faktörler olarak üç grupta sınıflandırılmaktadır (Duan ve ark., 2016; Uçar ve ark., 2016). Fiziksel faktörler; gıdaların tarladan sofraya gelişindeki herhangi bir aşamada alet, ekipman ve süreçte yer alan personelden kaynaklanabilir (Uçar ve ark., 2016). Kimyasal faktörler ise; ağır metal kirleticileri, pestisit gibi zirai ilaçları, bazı büyüme ve ürün geliştirici hormonları içerebilmektedir (Jiang ve ark., 2016). Gıdalarda istenmeyen virüsler, parazitler, mantarlar, bakteriler gibi mikroorganizmalar ise biyolojik faktörleri oluşturur (Zhao ve ark., 2014). Gıda güvenliğini ve kalitesini arttırmada bu faktörlerin negatif etkisini indirgemek büyük önem taşımaktadır. 1.2 Gıda Patojenleri Gıda kaynaklı patojenler, üretim, dağıtım ve tüketime kadar tüm aşamalarda gıda güvenliğini tehlikeye atmaktadır (Yasmin ve ark., 2016). Üretimden tüketime herhangi bir aşamada gıda kontaminasyonu; bakteri, virüs, parazit, mantar, kimyasal ajan ya da toksinlerden kaynaklanan çok çeşitli gıda kaynaklı hastalıklara neden olmaktadır. Ayrıca, gıda kaynaklı hastalıklar neticesinde toplumda farklı salgınlar, büyük iş gücü ve ekonomik kayıplar da görülebilir. Bu nedenle gıda patojenlerinin doğurduğu gıda kaynaklı hastalıklara paralel olarak gıda güvenliğinin azalması, toplumsal ve küresel ciddi bir sorundur. FDA, kontamine gıdaların neden olduğu 81 gıda kaynaklı hastalık olduğunu tanımlamıştır (Uçar ve ark., 2016). Her yıl yaklaşık 2 milyon ölüm güvenilir olmayan gıdaların tüketimi sonucu meydana gelmektedir ve bu ölümlere ishalden kansere kadar değişen 200 den fazla hastalık türünün neden olduğu görülmüştür (Yasmin ve ark., 2016). Herhangi bir gıda ya da su kaynağı bakteri, virüs, mantar ya da parazit gibi organizmalarla kontamine olduğunda, bu gıdaların tüketilmesi sonucu gıda kaynaklı hastalıklar meydana gelebilir. Gıda kaynaklı hastalıklara sebep olan başlıca bakteriyel patojenler; Listeria, Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Campylobacter ve Shigella her yıl milyonlarca insanın sağlığını etkilemektedir. Bu patojenlerin neden olduğu hastalıkların başında gıda zehirlenmeleri ve gıda alerjileri gelmektedir (Jiang ve ark., 2016; Pinu, 2016; Uçar ve ark., 2016; Yasmin ve ark., 2016). Ayrıca, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Streptococcus, Bacillus - 2 -

6 cereus gibi mikroorganizmalar da sıklıkla gıda zehirlenmelerine neden olmaktadırlar. Gıda zehirlenmelerine daha çok bakteriyel organizmalar sebep olsa da bazı parazit (Trichinella spiralis, Toxoplasma gondii) ve virüsler (Hepatitis A) de gıda kaynaklı hastalıklara sebep olmaktadır (Uçar ve ark., 2016). Sözü geçen patojenler meyve ve meyve suları, sebze, et ve et ürünleri, süt ve süt ürünleri, hazır gıdalar, deniz ürünleri gibi pek çok gıda ürünlerini kirletebilmektedir (Law ve ark., 2015; Uçar ve ark., 2016). Gıda kaynaklı hastalıklar dünya çapında oldukça yaygındır. Her yıl milyonlarca gıda kaynaklı hastalık vakalarıyla karşılaşılsa da, bunların tamamı istatistiksel olarak kayıt edilmemektedir. Bazı durumlarda gıda kaynaklı hastalıklar ölümle sonuçlanabilir. Gelişmekte olan ülkelerde çoğunluğu çocuklar olmak üzere her yıl yaklaşık 2 milyon insan kontamine gıda ve sulardan dolayı yaşamını yitirirken (Uçar ve ark., 2016; Yasmin ve ark., 2016), Birleşmiş Milletlerde ise Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezinden (CDC) 2011 yılında elde edilen verilere göre, her 6 kişiden biri gıda kaynaklı hastalığa maruz kalmış ve hastane vakasının 3000 i ölüm ile sonuçlanmıştır (Camargo ve ark., 2016; Law ve ark., 2015; Yasmin ve ark., 2016). Türkiye de ise 1999 ve 2000 yıllarında gıda kaynaklı hastalık vakalarının sayısı sırasıyla ve olarak saptanmıştır (Uçar ve ark., 2016). 1.3 Gıda Patojenlerinin Saptanması Gıda güvenliği yasaları ekonomik olarak gelişmiş ülkelerde çok iyi olmasına rağmen, gıda kaynaklı patojenlerin neden olduğu hastalıklar halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir. Gıdalardaki patojen kontaminasyonunun saptanmasındaki yetersizlik gıda endüstrisinde büyük ekonomik kayıplara yol açabildiği gibi insan sağlığına da ciddi zararlar verebilmektedir (Kim ve ark., 2014). Gıda kaynaklı patojenlerin saptanmasında kullanılan geleneksel yöntemler hücre kültivasyonuna dayanmaktadır. Bu yöntemler ile muhtemel sonuçlar için en az 3-4 güne, kesin sonuçlar için ise maksimum 7 güne gereksinim vardır (Kim ve ark., 2014; Law ve ark., 2015; Yasmin ve ark., 2016). Bu yöntemlerde agar yüzeyinde kültivasyon işleminin ardından biyokimyasal tanımlama işlemleri gerçekleştirilir. Ayrıca, patojen türüne bağlı olarak farklı kültür ortamları gerekmektedir. Patojen türünün değişmesi de analiz süresini etkileyen en önemli faktörlerdendir (Law ve ark., 2015). Bazı durumlarda bir haftayı aşan analiz süresine gereksinim duyulmaktadır. Dahası bu yöntemlerde, kültivasyon ortamının hazırlanması, aşılama, koloni sayımı gibi basamaklarda bulunmaktadır. Geleneksel yöntemler ekonomik olmasına karşın hassasiyetleri düşüktür. Bu nedenle, gıda patojenlerinin tayininde hızlı yeni yöntemler geliştirilmesi ve aynı zamanda ham madde ya da işlenmiş gıdalarda bulunan düşük sayıdaki patojenlerin saptanması büyük önem taşımaktadır. Gıda güvenliği açısından kontamine gıdalardaki tek bir patojen bile enfeksiyon riski oluşturmaktadır (Kim ve ark., 2014; Law ve ark., 2015; Pinu, 2016; Souii ve ark., 2016; Yasmin ve ark., 2016). Günümüzde, gıda patojenlerinin hızlı, yüksek hassasiyet ve ekonomik olarak tayin edilebilmesi için geliştirilmeye çalışılan yeni yöntemler nükleik asit, sensör ve immünolojik göstergelerin saptanması temellidir (Law ve ark., 2015). ELISA, antikor-antijen ilişkisine dayanan spesifik bir yöntem olup gıdalardaki patojenlerin saptanmasında oldukça sık kullanılmaktadır, fakat bu yöntemde gıda patojenleri hassas bir şekilde saptanmasına rağmen diğer yöntemlere kıyasla pahalı bir yöntemdir ve uzun zaman gerektirir (Kim ve ark., 2014; Uçar ve ark., 2016; Yasmin ve ark., 2016). ELISA yönteminin yanlış negatif sonuç verdiği, benzer yapıdaki antijenlerle çapraz reaktivitiye neden olup yanlış pozitif sonuç verebildiği bulgularda bulunmaktadır (Law ve ark., 2015). Bunların dışında farklı çalışma prensiplerine dayanan biyosensörler de gıda patojenlerinin saptanmasına yönelik yararlanılan metodlardan biridir. Bu yöntemlerde genel olarak biyoverici ve fiziksel bir dönüştürücü arasındaki etkileşimle hedef organizmadaki herhangi bir molekülün fiziksel özelliklerinin kaydedilmesi - 3 -

7 gerçekleşir. Sensör temelli yöntemler oldukça spesifik ve duyarlı olmasına rağmen ekonomik açıdan tercih edilebilirliği düşüktür. En büyük dezavantajı ELISA ve geleneksel yöntemlerde de olduğu gibi canlı ve ölü hücreler arasında ayrımın tam olarak yapılamamasıdır (Law ve ark., 2015; Souii ve ark., 2016). Bunun dışında, bazı sensör tipleriyle gerçekleştirilen analizlerde düşük miktarlardaki mikroorganizma miktarının saptanamadığı ve gıda matriksiyle etkileşime girdiği de gözlemlenmiştir. Nükleik asit temelli yöntemlerin başında ise polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gelmektedir. Hedef patojendeki toksin üreten spesifik genlerin saptanmasını esas alır. PCR yönteminde, spesifik hedef DNA diziliminin amplifikasyonu gerçekleştirilir ve ardından PCR amplifikasyon ürünleri elektroforetik olarak saptanır. Yapılan çalışmalara göre geleneksel PCR yöntemiyle L. monocytogenes, E. coli O157:H7, S. aureus, Salmonella spp., Brucella spp. ve Shigella spp. gibi gıda kirleticilerinin saptandığı görülmüştür (Law ve ark., 2015; Souii ve ark., 2016). Son zamanlarda, gıda kontrolü ve güvenliği açısından, nükleik asit temelli PCR yönteminin hem geleneksel kültivasyon yöntemleriyle hem de immunokimyasal yöntemlerle yarıştığı ve bu yöntemlerin yerini almaya başladığı görülmektedir. Dolayısıyla, gıda güvenliği açısından büyük risk oluşturan patojenlerin saptanmasında PCR yöntemi araştırmacıların odak noktası haline gelmeye başlamıştır. Diğer yöntemlerle kıyaslandığında PCR ın kontaminasyon riski düşüktür ve hızlı, ekonomik, spesifik, hassas bir yöntemdir (Souii ve ark., 2016). Geleneksel yöntemlerde, sensör ve ELISA uygulamalarında gıda kaynaklı hastalıklarda görülen semptomlara neden olan patojen bakterilerin metabolik ürünleri (enzimler, toksinler gibi) ya da endotoksinler gibi hücresel komponentlerin saptanmasında canlı hücrelere ihtiyaç duyulurken; nükleik asit temelli PCR tekniğinde hem canlı hem de ölü hücreler üzerinden analiz yapılabilmektedir (Souii ve ark., 2016). Geleneksel PCR ın bu avantajlarına rağmen, PCR teknolojisinin uygulanmasında karşılaşılan amplifikasyon sorunları bu tekniğin geliştirilmesini gerektirir (Lou ve Zhang, 2013; Pan ve ark., 2012; Souii ve ark., 2016). Gıda kaynaklı patojenlerin hassas, güvenilir ve hızlı bir şekilde tayin edilmesi için kullanılan yöntemlerin dezavantajlarını tanımlamak ve problemleri en aza indirgemek için yeni yöntemler geliştirilmesi büyük öneme sahiptir. Günümüzde, gıdalarda bulunan patojenlerin geleneksel, immünolojik ve moleküler yöntemlerle saptanması birkaç saat ile birkaç gün arasında sürmektedir. Bu nedenle, son yıllarda araştırmacılar bu patojenlerin daha etkili ve ekonomik bir şekilde saptanması için ilgilerini nanoteknoloji alanına çevirmektedirler ve nanoteknolojinin gıda güvenliği ile gıda kalitesi açısından umut verici bir teknoloji olacağını düşünmektedirler (Eleftheriadou ve ark., 2017). Özellikle, farklı sensör tipleri nanomalzemelerle modifiye edilerek yeni biyosensörlerin geliştirilmesi ve bunların gıda güvenliğini tehdit eden patojenlerin saptanmasında kullanımına yönelik çalışmalar hızla artmaktadır (Wang ve Duncan, 2017). Ancak, nanosensörlerin kullanımı özel ekipmanlar gerektirir ve maliyetlidir. Dahası uygulamasının gerçekleştirilmesi için laboratuvar deneyimine sahip yetişmiş eleman ihtiyacı söz konusudur. Nano-sensör gibi yöntemlerin uygulanması bu açıdan kısıtlamalara da sahiptir. ELISA ve nano-elisa gibi yöntemlerde antikor kullanıldığı için hem maliyet fazladır hem de yöntemin stabilitesi açısından sorunlar çıkabilmektedir (Souii ve ark., 2016). Kuantum dotlar, karbon nanomateryaller, metal oksit ve altın nanopartiküller gibi maddelerin büyük ölçüde PCR ı geliştirdiği ve amplifikasyon sorunlarını minimize ettiği öne sürülmüştür (Lou ve Zhang, 2013). Bu nanopartiküllerin PCR da kullanımı sonucu geliştirilen nanopcr yöntemiyle daha spesifik ve duyarlı sonuçlar elde edilmesi sebebiyle, bu yöntem ile gıda patojenlerinin saptanması üzerine yapılan çalışmalar son zamanlarda artış göstermektedir (Lou ve Zhang, 2013; Pan ve ark., 2012; Souii ve ark., 2016). Nano-PCR, bazı çalışmalarda virüs ve bakterilerin belirlenmesi için kullanılmıştır. Ördek tembusu (DTMUV) virüsünün belirlenmesi için nanopartikül olarak katı altın nanometal parçacıkları kullanılmış ve standart analizin 10 katı duyarlılıkta DTMUV DNA sı tespit - 4 -

8 edilmiştir (Wanzhe ve ark., 2016). Salmonella typhi nin PCR ile belirlenmesine yönelik olarak yapılan bir çalışmada altın, manyetik ve gümüş nanopartiküller kullanılmıştır (Rehman ve ark., 2015). Bu çalışmada kullanılan DNA miktarı 25 ng dır. Herpes virüsünün PCR ile belirlenmesine yönelik bir diğer çalışmada da altın nanopartiküllerden yararlanılmıştır (El- Husseini ve ark., 2016). Görüldüğü gibi nanopartiküllerin patojenik organizmaların PCR ile belirlenmesi mümkündür. Altın nanopartiküllerin ve kuantum dotların PCR verimini ve spesifikliğini arttırdığı bilinmektedir (Li ve ark., 2005; Kuang ve ark., 2011). Literatürde, insan sağlığı için en tehlikeli patojenlerden olan L. monocytogenes ve E. coli O157:H7 genomik DNA sının ayrı ayrı ve dubleks PCR ile belirlenmelerine ilişkin altın nanopartikül ve kuantum dot temelli bir yöntem mevcut değildir. PCR verimini arttırmak ve iki organizmaya ait genomik DNA nın birlikte belirlenmesini sağlamak amacı ile altın nanopartiküllerin ve kuantum dotların kullanımı ilk kez bu proje kapsamında incelenmiştir ve aynı zamanda iki nano-pcr bileşeninin etkileri de karşılaştırılmıştır. İlgili organizmaların varlığının belirlenmesi için DNA larının PCR ile çoğaltılması oldukça pratik ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Dahası, örneklere bulaşmış olan organizmalar ölmüş olsalar dahi DNA ları ortamda bulunacağı için bu yaklaşım ile canlı-ölü hücre ayrımı da yapılabilir. 1.4 Projenin Amacı Güvenli gıda tedarikini sağlamak ve gıda kaynaklı hastalıkların oluşumunu en aza indirgemek için gıda kaynaklı patojenlerin varlığını analiz etmek oldukça önemlidir. L. monocytogenes ve E. coli O157:H7 gıda kaynaklı patojenler içerisinde insan sağlığı açısından etkileri ölümcül olabilecek nitelikte olan iki organizmadır. Bu projenin amacı, bu organizmalara ait genomik DNA ların birlikte ve ayrı olarak, nano-pcr yaklaşımları ile daha duyarlı, hassas ve seçimli olarak belirlenmesidir. Ülkemizin 2023 hedeflerinden biri, gıda kalitesini arttırmak ve gıda güvenilirliğini sağlamaktır. Bunun yanında, ülkemizin dışa bağımlılığını azaltmaya yönelik tanı kitlerinin geliştirilmesi hedeflenmektedir. Gıda patojenlerinin moleküler olarak tayini için kullanılan kitler yurtdışından ithal edilmektedir. Projenin önemli diğer bir çıktısı, patojen organizmaların genomik DNA larının kite dönüştürülme potansiyeli olan ve daha hassas bir şekilde belirlenmesi için standart PCR yönteminin iyileştirilmesidir. Ayrıca, bu proje kapsamında aynı örnekte bulunan birden fazla gıda patojeninin aynı anda saptanması amacı ile multipleks-pcr yöntemi kullanılmaktadır. Multipleks PCR, gıda patojenlerinin daha hızlı bir şekilde tayinini sağlamasına rağmen, PCR koşullarının optimizasyonu ile ilgili sorunlar multipleks PCR ın etkinliğini düşürmektedir. Bu projede, aynı anda iki gıda patojeninin saptanması için kullanılacak dubleks PCR ın etkinliğinin arttırılması amaçlanmıştır. 2. Yöntem 2.1 Kullanılan Kimyasallar ve Çözeltiler Proje Süresince Kullanılan Kimyasallar NaCl (Sigma), KCl (Sigma), Na2HPO4 (Sigma), KH2PO4 (Sigma), dntp (Sigma), Taq polimeraz enzimi (Thermo Sciencetific), Agaroz (Sigma), Safe view (ABM), Tris Baz (Fluka), karboksil modifiye Kuantum dot, Lot: MKBV0066V (Sigma), Altın nanopartikül 10 nm (Sigma)

9 2.1.2 Projede Kullanılan Çözeltiler PBS tamponu: 0,137 M NaCl, M KCl, 0.01 M Na2HPO4 ve 0,002 M KH2PO4 içerecek şekilde hazırlanarak ph değeri 7,4 e ayarlanmıştır. UV-PCR kabini içeresinde steril filtreden (0,2 µm, Milex) geçirilen tampon +4ºC de saklanmıştır. TAE tamponu: 40 mm Tris (ph 7.6), 20 mm asetik asit, 1 mm EDTA içerecek şekilde hazırlanan tampnun ph sı 8,3 değerine ayarlanarak kullanılmıştır. Gıda kaynaklı hastalıklara sebep olan, sırasıyla L. monocytogenes ve E. coli O157:H7 tarafından PrfA ve EscA proteinlerini kodlayan primer dizileri Ege Üniversitesi öğretim üyesi Doç. Dr. Serap Evran dan temin edilmiştir. Primer Dizileri: 5 EscA (E. coli) CCGCTCGAGGTCAAAGTAATGTTCCTTTATGGC 3 EscA (E. coli) GGAGGAGGATCAGGAGGAGGATCATTGGACAGAATT 3 PrfA (L. monocytogenes) GATTCCATTCTTGCCGCCGCCATTTAATTTTC 5 PrfA (L. monocytogenes) AGACAAACAAGGCGGCGGCAACGCTCAAGCA 2.2 Kullanılan Cihazlar Heidolph vorteks, Selecta masaüstü santrifüj, (UVP) UV3 HEPA PCR Kabini, Applied Biosystems Thermal Cycle Cihazı, HOEFER Power Supply Agaroz Jel Yürütme Sistemi, UV star 365 nm Biometra Illuminator, Heidolph MR Hei-Standard Manyetik Karıştırıcı, Mettler Toledo ph-metre. 2.3 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) PCR Kurulumu Bütün PCR bileşenleri -20ºC derin dondurucudan çıkarılarak çözüldükten sonra, bütün bileşenler santrifüj ile kısa bir spin sonrasında kullanıma uygun hale getirilmiştir. Tampon konulmadan önce vortex ile karıştırılmıştır. Toplam hacmi çalışmaya göre farklı miktarlarda hazırlanan bir PCR karışımı için, ilk önce ilgili hacmi tamamlayacak miktarda steril saf su eklenmiştir. 20 mm MgCl2 içeren 10X reaksiyon tamponundan toplam hacmin onda biri kadar hacimde eklenerek her reaksiyonun son MgCl2 konsantrasyonu 2mM olacak şekilde ayarlanmıştır. 10 mm dntp karışımından son konsantrasyonları 1 µm olacak şekilde ileri ve geri yöndeki primerler de PCR tüpüne ilave edilmiştir. Pipetaj ile karıştırılan örnekler spinlenmiştir (6sn). Derin dondurucudan çıkarılan polimeraz enzimi çözüldükten sonra 2,5 U aktive içeren enzim reaksiyon karışımına eklenmiştir ve pipetajlama ile karışım homojen hale getirilmiştir. 10 µl lik hacimlere bölünen reaksiyon karışımına farklı miktarlarda kalıp DNA eklenmiştir (Şekil 2). Kalıp DNA ların seyrelmeleri ön denemeler ile belirlendikten sonra her bir farklı parametrenin denenmesi için Çizelge 1 deki reaksiyon karışımına benzer şekilde PCR örnekleri hazırlanmıştır. Çizelge 1 de 50 µl son hacme sahip bir PCR karışımının hazırlanmasında eklenen bileşenler görülmektedir. Hazırlanan reaksiyon karışımlarına - 6 -

10 çalışmaya göre kuantum dot veya altın nanopartikül eklenerek farklı kalıp DNA miktarları için PCR kurulumu gerçekleştirilmiştir. Şekil 2. PCR kurulum aşamalarının gösterilmesi. Çizelge 1. Polimeraz zincir reaksiyonlarını (PCR) gerçekleştirmek için hazırlanan reaksiyon karışımının 50 µl son hacim için kullanılan bileşenleri. 0, PCR Döngüsünün Gerçekleştirilmesi PCR reaksiyonunun istenilen denemeye göre Çizelge 1 de belirtildiği gibi kurulumu gerçekleştirildikten sonra karışımlar termal döngü cihazına yerleştirilmiştir. Çizelge 2 de yazılan koşullarda PCR çalıştırılmıştır. 2. Denaturasyon Tavlama 1. Uzama evreleri birbirinden bağımsız olarak 15, 20 ve 30 kez tekrar edilmiştir (Şekil 3). Ayrıca, PCR analizi tüm örnekler için birbirinden bağımsız olarak üç tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. Şekil 3. PCR döngüsünün gerçekleştirilmesi

11 Çizelge 2. PCR için gerçekleştirilen döngü sıcaklıkları ve süreleri PCR Görüntüleme Agaroz Jel Hazırlanması, Örneklerin Jele Yüklenmesi ve Görüntüleme Agaroz Jel Hazırlanması Agaroz (0,2 g) tartılarak Shott şişesine aktarılmıştır. 1X TAE tamponu (20 ml) eklenerek mikrodalga fırına koyulmuştur. Kaynayınca çıkarılan agaroz çözeltisi hafifçe çalkalanıp tekrar mikrodalga ile ısıtılmıştır. Tartılan agaroz tamamen çözünene kadar bu işleme devam edilmiştir. Trayın çatlamaması için, agaroz çözeltisi musluk altında yaklaşık 50ºC sıcaklığa kadar soğutulmuştur (Şekil 4). 0,8 µl Safe View DNA boyası eklenerek, örneklerin yükleneceği kuyucukların oluşturulması için tarak takılmıştır. Agaroz jel çözeltisi traya yavaşça döküldükten sonra, oluşan kabarcıklar pipet ucu ile giderilmiştir. Agaroz jelin tamamen polimerize olması için yaklaşık 30 dakika beklenmiştir (Şekil 5). Şekil 4. Agaroz jelin hazırlanması. Şekil 5. Hazırlanan agaroz jelin traya dökülmesi

12 Örneklerin Jele Yüklenmesi ve Görüntüleme Elektroforez tankı yeteri kadar TAE tamponu ile doldurulduktan sonra, jel tanka yerleştirilmiştir. Daha önce hazırlanan PCR örnekleri ve ThermoScientific SM1551 gen marker ı (10 µl) jel üzerinde oluşturulan kuyucuklara yüklendikten sonra, 100 V akımda 30 dk sistem çalıştırılıp jel üzerinde örneklerin yürütülmesi gerçekleştirilmiştir (Şekil 6). İşlem tamamlandığında sistem kapatılarak traydan alınan jel üzerinde örneklerin dağılımı UV ışığı altında incelenmiştir (Şekil 7). PCR sonuçlarının değerlendirilmesinde kullanılan Thermo Scientific SM 1551 kodlu gen marker ına (Marker; M) ait bilgiler, Şekil 8 de verilmektedir. Şekil 6. Örneklerin sisteme yüklenmesi ve jel üstünde yürütülmesinin gerçekleştirilmesi. Şekil 7. Örneklerin UV ışığı altında görüntülenmesi. Şekil 8. PCR sonuçlarının değerlendirilmesinde kullanılan Thermo Scientific SM 1551 kodlu Gen Markeri

13 3. Bulgular 3.1 Farklı DNA Miktarlarında ve Döngü Dayılarında Altın Nanopartikül Varlığının PCR Verimine Etkisine İlişkin Bulgular L. monocytogenes PrfA Proteinini Kodlayan Gen Fragmentini Çoğaltmak İçin Yapılan Denemeler L. monocytogenes in PrfA proteinini kodlayan gen fragmentini çoğaltacak primer dizileri kullanılarak, L. monocytogenes genomik DNA sının (L g DNA) farklı konsantrasyonlarının PCR verimine etkisi farklı döngü sayılarına (15 ve 30 döngü) bağımlı olarak araştırılmıştır. Şekil 9. L g DNA kalıp olarak kullanıldığı ve döngü sayısının etkisinin incelendiği PCR çalışmasına ait agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 1: L g DNA sından 0,055 ng, 15 döngü, 2: L g DNA sından 5,5 ng, 15 döngü, 3: L g DNA sından 5,5 ng, 30 döngü, 4: L g DNA sından 0,055 ng, 30 döngü. Agaroz jeldeki görüntülere göre, 711 bp civarında olması beklenen gen fragmentinin varlığı üzerinden PCR sonucu değerlendirildiğinde, Şekil 9 da görüldüğü üzere L g DNA sından hem 5,5 ng hem de 0,055 ng kullanıldığında standart PCR koşulları olan 30 döngüde 711 bp civarında bant gözlemlenmiştir. 5,5 ng L g DNA kullanıldığında bant daha parlak ve keskindir. PCR ın 15 döngü ile çalıştırıldığı koşullarda ise, her iki DNA miktarları için agaroz jelde bant gözlemlenmemiştir. L g DNA sının saptanmasının PCR ile daha verimli saptanabilmesi amacıyla, 0,6 nm altın nanopartikül (AuNP) içeren reaksiyon koşullarında 0,055 ng ve 5,5 ng L g DNA sı içeren karışımlar ile 15 ve 20 döngü sayıları denenerek PCR çalıştırılmıştır. Bu çalışma ile 711 bp civarındaki bant gözlemlenerek AuNP kullanımının döngü sayısı ve DNA kalıp miktarındaki değişimler ile PCR verimine etkisi belirlenmiştir (Şekil 10). Şekil 10. 0,6 nm AuNP varlığında L g DNA kalıp miktarının ve döngü sayısının PCR üzerine etkisinin incelenmesine ait agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 1: L g DNA sından 5,5 ng, 20 döngü, 2: L g DNA sından 5,5 ng, 15 döngü, 3: L g DNA sından 0,055 ng, 20 döngü, 4: L g DNA sından 0,055 ng, 15 döngü, 5: L g DNA sından 5,5 ng, 30 döngü (kontrol)

14 Şekil 10 da 0,6 nm AuNP varlığında L g DNA kalıp miktarının ve döngü sayısının PCR üzerine etkisinin incelenmesine ait agaroz jel elektroforezi görüntüleri incelendiğinde, döngü sayısının 15 ve 20 olduğu koşullarda gen fragmenti için 711 bp civarındaki bant gözlemlenmiştir. Diğer yandan, 0,6 nm AuNP varlığında 0,055 ng genomik DNA kullanılan reaksiyonlarda ise 15 ve 20 döngü sayısı ile gerçekleştirilen PCR koşullarında bant gözlemlenmemiştir. 0,055 ng L g DNA kullanılarak 0,6 nm AuNP varlığında 30 döngü ile çalıştırılan PCR sonrasında da belirgin bir bant gözlemlenmiştir, Şekil 9 da AuNP yokluğunda elde edilen sonuçlarla kıyaslandığında daha belirgin bir bant elde edilmiştir. PCR ile L g DNA sının daha etkili bir şekilde saptanmasına yönelik yapılan bir diğer çalışmada, 0,6 nm AuNP varlığında ve yokluğunda farklı L g DNA miktarlarının 30 döngü ile çalışılan PCR reaksiyonuna etkisi araştırılmıştır (Şekil 11). Şekil 11. 0,6 nm AuNP varlığında ve yokluğunda farklı L g DNA miktarlarının PCR üzerine etkisi. 1: L g DNA sından 5,5 ng/aunp+, 2: L g DNA sından 5,5 ng/aunp-, 3: L g DNA sından 0,55ng/AuNP+, 4: L g DNA sından 0,55 ng/aunp-, 5: L g DNA sından 0,22 ng/aunp+, 6: L g DNA sından 0,22 ng/aunp-, 7: L g DNA sından 0,11 ng/aunp+, 8: L g DNA sından 0,11 ng/aunp-, (tüm PCR çalışmalarında döngü sayısı 30 dur). Şekil 11'de görüldüğü gibi AuNP kullanımı ile, ortamda 0.11 ng genomik DNA bulunması durumunda dahi agaroz jelde PCR ürünü görüntülenebildi. Ayrıca, AuNP varlığında belirlenen tüm bantların AuNP yokluğunda elde edilen bant görünümleriyle karşılaştırıldıklarında daha belirgin olduğu da Şekil 11 de görülmektedir. Başka bir deyişle; altın, nano-pcr'ın daha hassas bir tayin sağladığını göstermektedir. PCR ile L g DNA sının daha etkili bir şekilde saptanmasına yönelik yapılan bir diğer çalışmada, 0,6 nm AuNP varlığında ve yokluğunda farklı L g DNA miktarlarının 20 döngü ile çalışılan PCR reaksiyonuna etkisi araştırılmıştır (Şekil 12). Şekil 12. 0,6 nm AuNP varlığında ve yokluğunda farklı L g DNA miktarlarının PCR üzerine etkisi. 1: L g DNA sından 5,5 ng/aunp+, 2: L g DNA sından 5,5 ng/aunp-, 3: L g DNA sından 0,55ng/AuNP+, 4: L g DNA sından 0,55 ng/aunp-, 5: L g DNA sından 0,22 ng/aunp+, 6: L g DNA sından 0,22 ng/aunp-, 7: L g DNA sından 0,11 ng/aunp+, 8: L g DNA sından 0,11 ng/aunp-, (tüm PCR çalışmalarında döngü sayısı 20 dir)

15 Projenin bu aşamasında, AuNP varlığında kurulan nano-pcr a döngü sayısının etkisi değişen L g DNA miktarları ile birlikte incelenmiştir. Döngü sayısı 30'dan 20'ye düşürüldüğünde, 5.5 ng genomik DNA için tekrarlanabilir sonuçlar elde edilememiştir (Şekil 12; 1. ve 2. kuyucuklar). Diğer DNA konsantrasyonları için de PCR ürünleri elde edilememiştir. Dolayısıyla, 20 döngü sonucunda, 30 döngüdeki kadar hassas sonuçların elde edilemediği belirlenmiştir E. coli O157:H7 EscA Proteinini Kodlayan Gen Fragmentini Çoğaltmak İçin Yapılan Denemeler Projenin bu aşamasında, E. coli O157:H7 kökenli EscA proteinini kodlayan gen fragmentinin (E g DNA) çoğaltılması için farklı E. coli O157:H7 genomik DNA sı konsantrasyonlarında ve döngülerde 0,6 nm AuNP varlığının PCR verimine etkisi incelenmiştir. Şekil 13. E g DNA sından 132, ng kullanılan ve 30 döngü ile gerçekleştirilen PCR çalışmasında elde edilen 378 bp lik EscA proteinini kodlayan gen fragmentinin agaroz jel elektroforezi görüntüsü. E g DNA sından 132, ng kullanıldığında 30 döngü ile gerçekleştirilen PCR reaksiyonu sonucu, EscA proteinini kodlayan gen fragmentinin 378 bp civarındaki agaroz jel görüntüsü Şekil 13 de görülmektedir. PCR ile E g DNA sının daha etkili bir şekilde saptanmasına yönelik yapılan bir diğer çalışmada, 0,6 nm AuNP varlığında ve yokluğunda farklı E g DNA miktarlarının 30 döngü ile çalışılan PCR reaksiyonuna etkisi araştırılmıştır (Şekil 14). Şekil 14. 0,6 nm AuNP varlığında ve yokluğunda E g DNA kalıp miktarının 30 döngü için farklı konsantrasyonlarda PCR üzerine etkisinin agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 1: E g DNA sından 132, ng/aunp-, 2: E g DNA sından 132, ng/aunp+, 3: E g DNA sından 13, ng/aunp-, 4: E g DNA sından 13, ng/aunp+, 5: E g DNA sından 5, ng/aunp-, 6: E g DNA sından 5, ng/aunp+, 7: E g DNA sından 2, ng/aunp-, 8: E g DNA sından 2, ng/aunp+, (tüm PCR çalışmalarında döngü sayısı 30 dur)

16 Şekil 14 de, 30 döngüde 0,6 nm AuNP kullanımının EscA proteinini kodlayan gen fragmentinin çoğaltılması için gerçekleştirilen PCR çalışmasında verime etkisi görülmektedir. 1 ve 2 numara ile etiketlenmiş olan jel kuyucuklarında görüldüğü üzere, 132, ng genomik DNA kullanılan denemede AuNP kullanımı, PCR verimini anlamlı bir şekilde arttırmıştır. 4. ve 6. kuyucuklarda, AuNP kullanılmayan 3. ve 5. kuyucuklardaki görüntüleri ile karşılaştırıldıklarında 378 bp lik bandın daha belirgin olduğu, ancak azalan DNA miktarları ile bandın zayıfladığı görülmektedir. 2., 4. ve 6. kuyucuklarda 0,6 nm AuNP varlığında azalan DNA miktarlarına karşın amplifikasyonun gerçekleştiği ve 5, ng E g DNA sına kadar belirlenebildiği gözlemlenmiştir. Şekil 15. 0,6 nm AuNP varlığında ve yokluğunda E g DNA kalıp miktarının 30 döngü için farklı konsantrasyonlarda PCR üzerine etkisinin agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 1: E g DNA sından 132, ng/aunp-, 2: E g DNA sından 132, ng/aunp+, 3: E g DNA sından 13, ng/aunp-, 4: E g DNA sından 13, ng/aunp+, 5: E g DNA sından 5, ng/aunp-, 6: E g DNA sından 5, ng/aunp+, 7: E g DNA sından 2, ng/aunp-, 8: E g DNA sından 2, ng/aunp+, (tüm PCR çalışmalarında döngü sayısı 20 dur). PCR ile E g DNA sının daha etkili bir şekilde saptanmasına yönelik yapılan bir diğer çalışmada, 0,6 nm AuNP varlığında ve yokluğunda farklı E g DNA miktarlarının 20 döngü ile çalışılan PCR reaksiyonuna etkisi araştırılmıştır (Şekil 15). Elde edilen sonuçlara göre, bu koşullarda 20 döngü kullanıldığında E g DNA sına ait belirgin bir bant gözlemlenmedi. 3.2 Farklı DNA Miktarlarında ve Döngü Sayılarında Kuantum Dot Varlığının PCR Verimine Etkisine İlişkin Bulgular L. monocytogenes PrfA Proteinini Kodlayan Gen Fragmentini Çoğaltmak İçin Yapılan Denemeler Projenin bu aşamasında, 5,5 ng L. monocytogenes DNA miktarı kullanılarak farklı kuantum dot konsantrasyonlarının (QD: 0; 6,25; 12,5; 25; 50; 75; 100 nm) 30 döngü ile çalışılan PCR reaksiyonuna etkisi incelenmiştir

17 Şekil 16. Farklı QD konsantrasyonlarında L g DNA sı (5,5 ng) kullanılarak 30 döngü ile gerçekleştirilen PCR çalışmasının agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 8 den 14 e kadar L g DNA sı ile yapılan PCR lar olmak üzere; 8: 0 nm QD, 9: 6,25 nm QD, 10: 12,5 nm QD, 11: 25 nm QD, 12: 50 nm QD, 13: 75 nm QD, 14: 100 nm QD içermektedir. Şekil 16 da görüldüğü üzere, farklı QD konsantrasyonlarının 30 döngü ile gerçekleştirilen L g DNA sının kalıp olarak kullanıldığı PCR üzerine etkisi incelendiğinde 6,25 nm QD konsantrasyonun PCR etkinliğini arttırdığı gözlemlendi. Artan QD konsantrasyonlarına bağımlı olarak da PCR etkinliğinin azaldığı elde edilmiştir. L g DNA sının saptanmasının PCR ile daha verimli saptanabilmesi amacıyla, 6,25 nm QD içeren reaksiyon koşullarında farklı L g DNA miktarlarında 30 döngü sayısında PCR çalıştırılmıştır (Şekil 17). Şekil 17. 6,25 nm QD varlığında L g DNA ları kullanılarak 30 döngü ile gerçekleştirilen PCR çalışmasının agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 2: L g DNA sından 0,55ng, 3: L g DNA sından 0,22 ng, 4: L g DNA sından 0,11 ng. Farklı L g DNA miktarlarının (0,55 ng, 0,22 ng, 0,11 ng) PCR ile amplifikasyon veriminin QD kullanımı ile arttığı Şekil 17 de görülmektedir. Elde edilen sonuçlar standart PCR ve altın nanopcr ile karşılaştırdığında; aynı L g DNA miktarları için, QD kullanımının PCR verimini AuNP ile benzer bir şekilde arttırdığı gözlemlenmiştir. 0,11 ng DNA kullanıldığı durumda ise QD varlığının PCR verimini AuNP göre bir miktar daha fazla arttırdığı belirlenmiştir

18 3.2.2 E. coli O157:H7 EscA Proteinini Kodlayan Gen Fragmentini Çoğaltmak İçin Yapılan Denemeler E g DNA sı (132,28x ng) sabit tutularak farklı kuantum dot konsantrasyonlarının (QD: 0; 6,25; 12,5; 25; 50; 75; 100 nm) 30 döngü ile çalışılan PCR reaksiyonuna etkisi incelenmiştir. Şekil 18. Farklı QD konsantrasyonlarında ve E g DNA sı (132,8x ng) kullanılarak 30 döngü ile gerçekleştirilen PCR çalışmasının agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 1 den 7 ye kadar E g DNA sı ile yapılan PCR lar olmak üzere 1: 0 nm QD, 2: 6,25 nm QD, 3: 12,5 nm QD, 4: 25 nm QD, 5: 50 nm QD, 6: 75 nm QD, 7: 100 nm QD içermektedir. E g DNA sı sabit tutularak farklı QD konsantrasyonları (6, nm) ile kurulan PCR a etkisi Şekil 18 de görülmektedir ve QD ın tüm konstrasyonlarının PCR da herhangi bir inhibisyona neden olmadığı görülmüştür. Tüm bu sonuçlar standart PCR ve altın nanopcr ile karşılaştırdığında; aynı E g DNA miktarları için, QD kullanımının PCR verimini AuNP ile benzer bir şekilde arttırdığı gözlemlenmiştir. Başka bir deyişle, aynı DNA miktarları için hem standart PCR hem de AuNP kullanılan PCR çalışmasına göre daha parlak ve keskin bantlar elde edilmiştir. Dahası, bu durum her QD konsantrasyonu için benzer olarak gözlemlenmiştir. 3.3 Altın Nanopartikül ve Kuantum Dot Kullanımının Dubleks PCR Üzerindeki Etkisine İlişkin Bulgular AuNP kullanımının (0,6 nm) PCR verimi üzerinde etkisinin incelendiği çalışmada E g DNA sı ve L g DNA sı birlikte kullanılarak saptanabilecekleri alt limitler belirlenmiştir (Şekil 19)

19 Şekil 19. 0,6 nm AuNP varlığında ve yokluğunda dubleks PCR verimine etkisini gösteren agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 41: E g DNA sından 132, ng ve L g DNA sından 5,5 ng, AuNP-, 42: E g DNA sından 13, Ng ve L g DNA sından 0,55 ng, AuNP-, 43: E g DNA sından 5, ng ve L g DNA sından 0,22 ng, AuNP-, 44: E g DNA sından 2, ng ve L g DNA sından 0,11 ng, AuNP-, 45: E g DNA sından 132, ng ve L g DNA sından 5,5 ng, AuNP+, 46: E g DNA sından 13, ng ve L g DNA sından 0,55 ng, AuNP+, 47: E g DNA sından 5, ng ve L g DNA sından 0,22 ng, AuNP+, 48: E g DNA sından 2, ng ve L g DNA sından 0,11 ng, AuNP+, (tüm PCR çalışmalarında döngü sayısı 30 dur). AuNP kullanımının PCR verimi üzerinde etkisinin incelendiği çalışmada E g DNA sı ve L g DNA sı birlikte kullanılarak (dubleks nanopcr) saptanabilecekleri alt limitler belirlenmiştir. Agaroz jel görüntüsünde görüldüğü üzere (Şekil 19) iki genomik DNA nın yan yana belirlendiği alt sınırda E g DNA sından 13, ng ve L g DNA sından 0,55 ng olarak tespit edilmiştir. QD kullanımının (6,25 nm) PCR verimi üzerinde etkisinin incelendiği çalışmada E g DNA sı ve L g DNA sı birlikte kullanılarak saptanabilecekleri alt limitler belirlenmiştir (Şekil 20). Şekil 20. 6,25 nm QD ile gerçekleştirilen dubleks PCR çalışmasının agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 18: E g DNA sından 5, ng ve L g DNA sından 0,22 ng, 19: E g DNA sından 2, ng ve L g DNA sından 0,11 ng

20 Şekil 20 incelendiğinde dubleks PCR ın veriminin, standart PCR ve AuNP kullanılan PCR çalışmasına göre anlamlı bir şekilde arttığı görülmüştür. Bu projede, dubleks PCR için tayin alt sınırı E g DNA sından 2,656 x 10-3 ng ve L g DNA sından 0,11 ng olarak belirlenmiştir. 3.4 Örnek Uygulama Çalışmalarına İlişkin Bulgular Gerçek gıda örnekleri ile gerçekleştirilen denemelerde, yağsız süt ve portakal suyu örnekleri farklı konsantrasyonlardaki genomik DNA lar ile yapay olarak kontamine edilmiştir. Daha önce elde edilen veriler ışığında, L. monocytogenes ve E. coli O157:H7 genomik DNA ları ile birlikte ve ayrı ayrı kontamine edilmiş örnekler kullanılmıştır. Örneklerde ilgili DNA ların saptanması için nanopcr yaklaşımının etkisi incelenmiştir. Örnekler, herhangi bir ön işlem yapılmadan hazırlanmıştır. Şekil 21. AuNP varlığında (0,6 nm) ve yokluğunda yapay olarak L g DNA sı ile kontamine edilen örneklerde farklı döngü sayılarında (20 ve 30) varlığının PCR verimine etkisini gösteren agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 1: L g DNA sından 5,5 ng süt örneği/aunp+/20 döngü, 2: L g DNA sından 5,5 ng süt örneği/aunp-/20 döngü, 3: L g DNA sından 5,5 ng portakal suyu örneği/aunp+/ 20 döngü, 4: L g DNA sından 5,5 ng portakal suyu örneği/aunp-/20 döngü, 5: L g DNA sından 5,5 ng süt örneği/aunp+/30 döngü, 6: L g DNA sından 5,5 ng süt örneği/aunp-/30 döngü, 7: L g DNA sından 5,5 ng portakal suyu örneği/aunp+/30 döngü, 8: L g DNA sından 5,5 ng portakal suyu örneği/aunp-/30 döngü, K: L g DNA sından 5,5 ng AuNP-/30 döngü. Şekil 21 de 5,5 ng L g DNA sı ile kontamine edilen süt ve portakal suyu örneklerinde 20 döngüde AuNP kullanımının PCR verimini arttırdığı görülmüştür. Döngü sayısının 30 a çıkarıldığı koşullarda da 5,5 ng L g DNA sı ile kontamine edilen süt örneği için PCR veriminde belirgin bir artış saptanmıştır

21 Şekil 22. AuNP varlığı (0,6 nm) ve yokluğunun, farklı L g DNA miktarıyla yapay olarak kontamine edilen örneklerde PCR verimine etkisini gösteren agaroz jel elektroforezi görüntüsü. 1: L g DNA sından 0,22 ng/süt örneği/aunp-, 2: L g DNA sından 0,22 ng/süt örneği/aunp+, 3: L g DNA sından 5,5 ng/süt örneği/aunp+, 4: L g DNA sından 5,5 ng/süt örneği/aunp-, 5: L g DNA sından 0,22 ng/aunp-, 6: L g DNA sından 0,22 ng/aunp+, 7: L g DNA sından 0,22 ng/portakal suyu örneği/aunp-, 8: L g DNA sından 0,22 ng/portakal suyu örneği/aunp+, 9: L g DNA sından 5,5 ng/portakal suyu örneği/aunp-, 10: L g DNA sından 5,5 ng/portakal suyu örneği/aunp+, 11: L g DNA sından 5,5 ng/aunp+ (kontrol), (tüm PCR çalışmalarında döngü sayısı 30 dur). 1. ve 2. kuyucuklardaki örneklerde görüldüğü gibi AuNP kullanımı süt örneğinde bulunan 0,22 ng L g DNA sının belirlenmesi için PCR verimini önemli bir ölçüde arttırmıştır (Şekil 22). Benzer şekilde, 3. kuyucukta da 5,5 ng L g DNA sı keskin ve parlak bir bant ile belirlenmiştir. Portakal suyu örneklerinde de 0,22 ng ve 5,5 ng L g DNA sı AuNP varlığında standart PCR dan daha verimli bir şekilde belirlenmiştir. Şekil 23. QD varlığının (6,25 nm) farklı L g DNA miktarıyla yapay olarak kontamine edilen örneklerde PCR verimine etkisini gösteren agaroz jel elektroforezi görüntüsü. Tüm PCR reaksiyonları döngü sayısı 30 dur. 5: L g DNA sından 5,5 ng/süt örneği, 6: L g DNA sından 0,55 ng/süt örneği, 7: L g DNA sından 0,22 ng/süt örneği, 8: L g DNA sından 0,11 ng/süt örneği, 9: L g DNA sından 0,055 ng/süt örneği, 10: L g DNA sından 5,5 ng/portakal suyu örneği, 11: L g DNA sından 0,55 ng/portakal suyu örneği, 12: L g DNA sından 0,22 ng/portakal suyu örneği, 13: L g DNA sından 0,11 ng/portakal suyu örneği, 14: L g DNA sından 0,055 ng/portakal suyu örneği. Süt ve portakal suyunun yapay olarak farklı L g DNA ile kirletildiği örnekleri içeren PCR karışımına 6,25 nm QD eklendikten sonra elde edilen agaroz jel görüntüsüne bakıldığında herhangi bir bant elde edilmediği saptanmıştır (Şekil 23)

22 Şekil 24. QD varlığının (6,25 nm) farklı E g DNA miktarıyla yapay olarak kontamine edilen örneklerde PCR verimine etkisini gösteren agaroz jel elektroforezi görüntüsü. A: E g DNA sından 0 ng, B: E g DNA sından 13, ng, C: E g DNA sından 5, ng, D: E g DNA sından 2, ng, E: E g DNA sından 1, ng, F: E g DNA sından 0 ng/süt örneği, G: E g DNA sından 13, ng/süt örneği, H: E g DNA sından 2, ng/süt örneği, J: E g DNA sından 1, ng/süt örneği, K: E g DNA sından 1, ng/süt örneği, L: E g DNA sından 0 ng/portakal suyu örneği, M: E g DNA sından 13, ng/portakal suyu örneği, N: E g DNA sından 5, ng/portakal suyu örneği, O: E g DNA sından 2, ng/portakal suyu örneği, P: E g DNA sından 1, ng/portakal suyu örneği. Kontrol örnekleri olan B, C, D ve E örneklerinde görüldüğü üzere QD kullanımı PCR verimini arttırmıştır (Şekil 24). Ancak, örnek uygulama çalışmasında PCR ın çalışmadığı görülmüştür. Süt içeren F, G, H, J ve K örneklerinde sürüklenmiş bantların 3000 bp civarında olduğu görülmektedir. Portakal suyu içeren örneklerde ise hiçbir bant gözlemlenmemiştir. Bu sonuçlar, Şekil 23 de de L g DNA sı ile elde edilen veriler de benzerlik göstermektedir. 4. Sonuçlar ve Tartışma L. monocytogenes ve E. coli O157:H7 tehlikeli patojenlerdir. CDC verilerine göre, E. coli O157:H7 özellikle çocuklarda %2-7 arasında oranlarda böbrek hasarına neden olmaktadır. L. monocytogenes enfeksiyonu taşıyan bireylerin ise her yıl yaklaşık %16 sı hayatını kaybetmektedir (Uçar ve ark., 2016). L. monocytogenes ve E. coli O157:H7 genomik DNA larının daha duyarlı ve seçimli olarak belirlenmesi büyük bir önem taşımaktadır. Bu proje kapsamında, bu patojen türlerin genomik DNA larının belirlenmesi için PCR yönteminin geliştirilmesi ve veriminin arttırılması için AuNP ve QD kullanılmıştır. Bu amaç doğrultusunda, yapılan literatür taramasına göre AuNP derişimi 0,6 nm olarak belirlenmiştir. AuNP nin PCR spesifikliğine etkisinin araştırıldığı bir çalışmada, AuNP nin farklı konsantrasyonlarında (0,2-1,0 nm) PCR kurulmuştur. 0,2-0,8 nm aralığında PCR çalışırken, en iyi sonuçlar 0,4 ve 0,6 nm AuNP konsantrasyonlarıyla elde edilmiştir. 1,0 nm ve üzerindeki AuNP konsantrasyonlarında ise PCR inhibe olmuştur (Li ve ark., 2005). Ayrıca, PCR etkinliğinin arttırılması için farklı QD konsantrasyonları yine bu projede araştırılmıştır. Çalışmanın ilk denenen parametrelerinden bir tanesi döngü sayısının düşürülmesinin mümkün olup olmadığıdır. Şekil 9 da görüldüğü gibi 30 döngüde standart PCR koşullarında

23 0,055 ng L. monocytogenes genomik DNA sı saptanması mümkündür. 5,5 ng L g DNA kullanıldığında bant beklendiği gibi daha parlak ve keskindir, azalan DNA miktarı amplifikasyonda da azalmaya neden olmuştur. Bulgular 15 döngünün standart PCR koşullarında DNA amplifikasyonu için yeterli olmadığını göstermektedir. Düşük DNA miktarları ve daha az sayıda döngü ile daha yüksek verimde PCR ürünü elde edilmesi için nanopcr yaklaşımının denenmesi bu açıdan önemli bir alternatif niteliğindedir. AuNP varlığının döngü sayısı üzerinde etkileri bu bağlamda araştırılmıştır. Şekil 10 da görüldüğü üzere 5,5 ng L g DNA sı kullanılan durumda 0,6 nm AuNP varlığının hem 15 hem de 20 döngüde amplifikasyonu artırdığı görülmüştür. 0,055 ng DNA kullanıldığı durumda ise belirgin bir amplifikasyon gözlenmemiştir. Deneme sonucunda elde edilen bulgular AuNP kullanılarak döngü sayısının azaltılabileceğini yani PCR sürecinin hızlandırılabileceğini desteklemektedir. 30 döngü ile yaklaşık bir buçuk saat süren PCR sürecinin, AuNP kullanımı ile 50 dakika gibi kısa bir süreye düşürülebileceği belirlenmiştir. Sürenin kısaltılmasına yönelik denemeler farklı DNA miktarlarında ve örnek uygulama çalışmalarında da gerçekleştirilmiştir. Döngü sayısının standart değerlerde kullanıldığı çalışmada ise AuNP kullanımının farklı DNA miktarlarındaki etkisi incelenmiştir. AuNP kullanılan denemelerde kontrollere göre DNA amplifikasyon veriminin arttığı görülmektedir. L. monocytogenes genomik DNA sının amplifiye edildiği örneklerden özellikle daha düşük konsantrasyonda olan 0,22 ng ve 0,11 ng DNA miktarı için verimin artışı Şekil 11 de bariz olarak görülmektedir. Şekil 12 de ise 20 döngü için aynı koşullar denenmiş ve 3. kuyucukta yer alan örnekte görüldüğü gibi 0,55 ng örnek silik bir bant ile belirlenirken, 5,5 ng örnek parlak ve keskin bir bant ile görülmektedir (1. kuyucuk). Sonuç olarak en düşük 0,11 ng L. monocytogenes genomik DNA sı amplifiye edilebilmiştir. E. coli O157:H7 genomik DNA sının kullanıldığı denemelerde ise 30 döngüde, AuNP kullanıldığı durumda 5, ng DNA miktarının saptanabilir en düşük değer olduğu belirlendi (Şekil 14, 6. kuyucuk). 20 döngüde ise amplifikasyon veriminin düşük olduğu belirlendi (Şekil 15). QD ile gerçekleştirilen çalışmada, PCR da kullanılmadan önce QD üzerinde herhangi bir ön işlem veya modifikasyon yapılmadı. Daha önce QD kullanılan PCR çalışmalarının çoğunda zaman alıcı ön hazırlıklar ve modifikasyonlar yapıldığı görülmektedir. Gerçekleştirdiğimiz proje ise karboksil modifiye QD lerin PCR da ön işlemsiz kullanılabilirliğini göstermesi açısından da önemli ve yenilikçi niteliktedir. Şekil 15 ve Şekil 18 da görüldüğü üzere 6, nm QD miktarları PCR üzerinde bir inhibisyona neden olmamıştır. QD kullanılan her PCR reaksiyonunda agaroz jelde keskin ve parlak banlar gözlemlenmiştir. Ancak, artan QD miktarı ile bantların parlaklığında hafif bir azalmanın meydana geldiği görülmüştür. Bu nedenle projenin sonraki aşamalarında 6,25 nm QD değeri optimum olarak belirlenmiştir. Daha önce başka gruplar tarafından gerçekleştirilen çalışmalar ise nm QD kullanımının PCR tamamıyla inhibe edebildiğini göstermiştir. Bu olgu QD ların doğası ve yapısı ile ilgili olarak değişebilmektedir (Liang ve ark., 2011). Bu çalışmada MKBV0066V lot numaralı QD lar kullanılmıştır ve 100 nm konsantrasyonda da PCR ı inhibe etmediği belirlenmiştir. QD lar ile 30 döngüde gerçekleştirilen denemede dubleks PCR için tayin alt sınırı E. coli O157:H7 genomik DNA sından 2, ng ve L. monocytogenes genomik DNA sından 0,11 ng olarak belirlendi. Bu değerler AuNP ile belirlenebilen dubleks PCR değerlerine göre 5 kat daha düşüktür. Örnek uygulama sonuçları değerlendirildiğinde, 5,5 ng L. monocytogenes genomik DNA sı ile kontamine edilen süt ve portakal suyu örneklerinde 20 döngüde AuNP kullanımının PCR verimini arttırdığı görülmüştür (Şekil 21). 30 döngüde ise 5,5 ng L. monocytogenes genomik DNA sı ile kontamine edilen süt örneği için PCR veriminde bariz bir artış

24 gözlemlenmiştir. Portakal suyu ve süt örneklerinde tayin edilebilen en düşük L. monocytogenes genomik DNA sı konsantrasyonu 0,22 ng olarak belirlendi. 0,6 nm AuNP kullanımı PCR verimini anlamlı bir şekilde arttırmıştır (Şekil 22). QD lerin kullanıldığı örnek uygulamada ise reaksiyonun çalışmadığı belirlenmiştir. Standart PCR verimi 6,25 nm QD kullanımı ile anlamlı bir şekilde arttığı halde örnek uygulama açısından AuNP daha başarılıdır. Herhangi bir ön işlem yapılmaksızın örnek uygulanması yöntemin uygulama avantajlarındandır. Proje kapsamında, aynı anda iki gıda patojeninin saptanması için dubleks PCR kullanılmış ve literatürde ilk kez nanopartikül kullanımının dubleks PCR ın etkinliğini arttırdığı gösterilmiştir. Nanopartikül kullanımı sonucunda standart PCR ın hassasiyeti arttırılmıştır. Örneğin, balıklarda bulunan bir gıda patojeni olan Lactococcus garvieae nin PCR temelli saptanmasını amaçlayan bir çalışmada, standart PCR ın saptanma limiti 1 ng DNA olarak bulunmuştur (Jung ve ark., 2009). Proje sonucunda ise, standart PCR için daha düşük saptanma limiti elde edilebilmiştir. 5. Öneriler Sonuç olarak elde edilen veriler nanopcr yaklaşımının kullanılarak PCR hassasiyetinin arttırılması ve süresinin kısaltılmasının mümkün olduğunu göstermektedir. AuNP ve QD lerin kullanıldığı çalışmalarda L. monocytogenes için belirlenebilen en düşük genomik DNA miktarları 0,11 ng olarak belirlenmiştir. E. coli O157:H7 içinse bu değer 5, ng olarak tespit edilmiştir. Özellikle E. coli O157:H7 genomik DNA sı pikomolar düzeyde saptanmıştır. Dubleks PCR için de bu değerler tayin alt limiti olarak belirlenmiştir. Bu değerlerin daha da düşürülerek hassasiyetin arttırılması için farklı boyutlarda ve modifikasyonlara sahip AuNP ler ve QD ler denenebilir. QD kullanımı, hassasiyeti AuNP ye nazaran daha fazla arttırmasına rağmen, örnek uygulamada AuNP lerin PCR verimini daha çok arttırdığı görülmüştür. QD ler, örneklerdeki proteinlerden veya kompleks ortamdaki herhangi bir bileşenden muhtemelen daha fazla etkilenmektedirler. Bu sorunu gidermek için olası etkileşimleri azaltacak yüzey modifikasyonları yapılabilir. Proje sonucunda, AuNP ve QD nin PCR üzerindeki farklı etkileri karşılaştırılabilmiş ve literatüre katkıda bulunulmuştur. Ayrıca, sıvı gıda örnekleri L g DNA ve E g DNA ları yapay olarak kirletilerek geliştirilen PCR tekniğinin etkinliği çalışılmıştır. Projede, katı gıda örnekleri yerine sıvı gıda örnekleri seçilmesinin sebepleri; katı örneklerdeki matriks bileşenlerinin PCR sonuçlarını olumsuz etkilemesi, katı örnekler için ön işlemin gerekmesi ve sıvı örneklere kıyasla PCR ortamının homojenliğinin azalmasıdır. Proje kapsamında geliştirilen bu yöntem, kite dönüştürülme potansiyeli taşımasının yanı sıra diğer gıda patojen DNA larının belirlenmesine yönelik olarak da geliştirilebilecektir. KAYNAKLAR 1. Camargo, A.C., Woodward, J. J., Nero, L. A. (2016). The Continuous Challenge of Characterizing the Foodborne Pathogen Listeria monocytogenes, Foodborne Pathogens and Disease, 13 (8), Duan, N., Wu, S., Dai, S., Gu, H., Hao, L., Ye, H., Wang, Z. (2016). Advances in Aptasensors fort he Detection of Food Contaminants, Analyst, 141, Eleftheriadou, M., Pyrgiotakis, G., Demokritou, P. (2017). Nanotechnology to the Rescue: Using Nano-enabled Approaches in Microbiological Food Safety and Quality, Current Opinion in Biotechnology, 44,