PEDİATRİK MAKROTROMBOSİTOPENİLİ OLGULARDA MYH9 & TUBB1 GEN MUTASYONLARI 1 Didem Torun Özkan, 2 Abdullah A. Waheed, 3 Yeşim Oymak, 3 Canan Vergin, 2 Ayten Kandilci, 4 Nejat Akar 1. Okan Üniversitesi, Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu, İstanbul 2. Gebze Teknik Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, İstanbul 3. Dr. Behçet Uz Eğitim ve Araştırma Hastanesi,Hematoloji ve Onkoloji Kliniği, İzmir 4. TOBB-ETU Hastanesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı, Ankara Bu çalışma TÜBİTAK- 3001-Başlangıç Ar-Ge Projelerini Destekleme Kapsamında (214S601) desteklenmektedir.
TROMBOSİTLER Boyutu: 1-4 µm Yaşam Süresi: 7-10 gün Bulunduğu Yer: 1/3 Dalak 2/3 Dolaşım Normal Trombosit Sayısı: 150000-450000/mm 3 Düşük sayıda olmasıyla karakterize olan trombositopeni Trombositopeni + dev trombosit sendromu ise makrotrombositopeni
Makrotrombositopeni Otozomal dominant kalıtım MYH9 (Miyozin Ağır Zincir-9) Geni May-Hegglin anomalisi (MHA) Sebastian sendromu (SBS) Fechtner sendromu (FTNS) Epstein sendromu (EPTS) Proteinin farklı doku ve organlarda sentezlenememesi sonucu; non hematolojik bulgular: işitme kaybı, katarakt, nefrit
MYH9 Geni 5.8kb lık mrna 40 ekzon Kromozom 22q13.1 de lokalize Baş Boyun Helikal Olmayan Kuyruk
Makrotrombositopeni Genetiği
Makrotrombositopeni Tübülin Beta-1 (TUBB-1) Geni Mikrotübüllerin fonksiyonunda oluşan defekt proplatelet formasyonunda değişime sebep olarak makrotrombositopeni ye yol açar mı?
TUBB-1 Geni Kromozom 20q13.32 de lokalize 451 aa 4 ekzon Mikrotübüllerin en önemli bileşeni GTP bağlanma bölgeleri Özellikle ekspresyonu; trombositler ve megakaryositlerde Otozomal dominant; Makrotrombositopeni
2000-2017 yılları arasında literatürde MYH9 geninde, 17 tanesi makrotrombositopeni taşıyan hastalarda olmak üzere, toplam 52 mutasyon tanımlanmıştır. Makrotrombositopeni ile ilişkili olarak TUBB1 geni ile ilgili ise yalnızca 2 mutasyon tanımlanmıştır. (Kunishima ve ark., 2015)
Amaç Türkiye nin farklı hematoloji kliniklerinden makrotrombositopeni tanısı alarak laboratuvarımıza ulaştırılan hastalarda makrotrombositopeniyle ilişkili olduğu öngörülen genlerden MYH9 ve TUBB1 genindeki değişimlerin, DNA ve RNA boyutundaki genetik ve fonksiyonel değişimlerini tek bir çalışmada ve ilk kez Türk populasyonunda gerçekleştirmektir
Materyal ve Yöntemler Hasta Grubunun Oluşturulması DNA Ekstraksiyonu Polimeraz Zincir Reaksiyonu DNA Dizi Analizi Verilerin Değerlendirilmesi
Hasta Grubunun Oluşturulmasında Klinik Bulgular TOBB- ETU Hastanesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Bölümü Dr. Behçet Uz Eğitim ve Araştırma Hastanesi Hematoloji Kliniği Kriterler: Trombosit sayısı genelde 20000-130000mm 3 arasındadır. Hastaların kanama semptomları hafif ve ender olup, hematomlar ve kolay morarma gözlenebilmektedir. Lökositlerde inklüzyon cisimciği periferik yaymada saptanan tipik bir bulgudur.
DNA İzolasyonu Klasik Fenol- Kloroform Yöntemi PCR MYH-9 7 ekzon TUBB-1 Geni 4 ekzon Hedef Bölge DNA Dizi Analizi
TUBB-1 Geni Ekzon Forward primer Reverse primer Amplikon uzunluğu (bç) Ekzon 1 CATACCACGGTCACTAGGGC AAAGCCCAAAGGCATTGTC 587 Ekzon 2 GGAAACAGGCTTGGGAATG CATTTCCATCTCCTGGGC 282 Ekzon 3 TTTGGACCAGTATCACAAAGTTC AAAAGAGAAACCAGCAGGGG 295 Ekzon 4-1 GCATTCGATCTAGCAAATTAGG ATCGAACATCTGCTGGGTG 766 Ekzon 4-2 TACCCTGAAGCTGACGACAC GCTGCAGGAGAAACACTCATC 789 Ekzon4-3 Ekzon 4-4 AACGAATTTGGGGAAGCTG GAAAGCAGGATGCCAGTCAG 608 GGATTTGCAGGGAGCCAC TTCCTGCATTTGAATGGTTG 623 4010 bç Ekzon 4-5 TTTCATTCAGTCATCACCCC TTGGTATGTATTTTAGTTATTTCCTCG 604 Ekzon 4-6 GGGTTCTCATCTCTTGATTTGC CGAAAGAGTAGGATGGTGAGATG 620 Santa Cruz Genom Browser Database /Primer tasarım programı
BULGULAR
BAŞVURU NEDENİ YAŞ & CİNSİYET TROMBOSİT 10 3 / ul MPV (f L) PCT (%) PDW (f L) MYH9 TUBB1 C. Ailesi- MYH9 /Ekzon 26 Klinik Tablo AMELİYAT ÖNCESİ 19E 39 11,1 0,04 14,1 c.3756 C>A, c.821 C>T, c.920g>a TROMBOSİT c.3762 G>A DÜŞÜKLÜĞÜ
MYH9 Geni/ Ekzon 26 İki yeni mutasyon birlikteliği c. 3756 C>A (p.l1176m) + 3762 G>A (p.e1182k) İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir
Çocukta görülen bu mutasyon De Novo Mutasyon olarak adlandırılabilir mi?
Marker Baba (A.C.) Anne (F. C.) (Hasta) /Çocuk (M.H.C.) D851179 210/218 206/218 206/210 TMOI 333/338 338/346 333/346 D355818 251/255 246/246 246/251 D18551 461/465 461/472 461/472 D351358 193/197 193/197 193/193 D21511 183/191 191/191 183/191 FGA 293/297 297/305 297/305 %99,9 oranında baba, çocuğun babası Düzen Laboratuvarı- DNA Fingerprint Analysis
C.Ailesi TUBB1/ Ekzon 4 (821C>T (p. T274M)+ 920 G>A (p.r307h)) Forward primer Reverse primer
p.t274m Threonine (T) Hydrophilic/Polar Neutral Methionine (M) Hydrophobic/Non-Polar Species Match AA Alignment Human 274 LHFFMPGFAPLTAQGSQQYRALSV Mutated not conserved 274 LHFFMPGFAPLMAQGSQQYRALS P.troglodytes all identical 274 LHFFMPGFAPLTAQGSQQYRALS M.mulatta all identical 274 LHFFIPGFAPLTAQGSQQYRALS M.musculus all identical 274 LHFFMPGFAPLTAQGSQQYRALS G.gallus all identical 274 LHFFMPGFAPLTARGSQQYRALS D.rerio all identical 274 LHFFMPGFAPLTARGSQQYRALT D.melanogaster all identical 283 LHFFMPGFAPLTSRGSQQYRALT C.elegans all conserved 274 LHFFMPGFAPLSAKGTQAYRALT Natarajan K. and Senepati S., 2012, PLoSONE, 78(8); e42351.
p.r307h Species Match AA Alignment Human 307 ARNTMAACDLRRGRYLTVACIFRG Mutated not conserved 307 AACDLRHGRYLTVACIFR P.troglodytes all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR M.mulatta all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR M.musculus all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR G.gallus all identical 307 AACDPRRGRYLTVACIFR D.rerio all identical 307 TACDPRRGRYLTVAGIFR C.elegans not conserved 307 AACDPRHGRYLTVAAMFR D.melanogaster not conserved 316 AKNMMAACDPRHGRYLTVAAIFR
p.t274m ve p. R307H mutasyonlarının TUBB1 proteinine etkisi PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer)
MYH9 ve TUBB1 mutasyonlarının aynı hastada birlikte görülme durumu şimdiye kadar yapılan çalışmaların hiçbirinde gösterilmemiş olup ilk kez bu araştırma ile ortaya konulmuştur. Aynı zamanda Human Gene Mutation Database de (HGMD) daha önce tanımlanmayan mutasyonlarla makrotrombositopenili bir ailede ilk kez de novo mutasyon varlığı da gösterilmiştir.
BAŞVURU NEDENİ YAŞ& CİNSİYET TROMBOSİT MYH9 Geni Ekzon 1 10 3 / ul MPV (f L) PCT(%) PDW (f L) MYH9 TUBB1 c.286 T>G, p.s96a AMELİYAT ÖNCESİ TROMBOSİT DÜŞÜKLÜĞÜ 20E 22 9,0 0,02 16,6 c.286 T>G c.803g>t
BAŞVURU NEDENİ YAŞ & CİNSİYET TROMBOSİT 10 3 / ul MPV (f L) PCT(%) PDW(f L) MYH9 TUBB1 Ekzon 25 c.3814 T>G, p. S1195A BURUN KANAMASI 18E 94 11,6 1,08 16,6 c.3814 T>G, p. S1195A c.803g>t İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir
BAŞVURU NEDENİ YAŞ & CİNSİYET TROMBOSİT 10 3 / ul MPV(f L) PCT(%) PDW(f L) MYH9 TUBB1 Ekzon 26 c.3660 T>G, p.a1144l Ensembl / rs71081 polimorfizmi AMELİYAT ÖNCESİ TROMBOSİT DÜŞÜKLÜĞÜ 11 E 89 8,4 0,074 17,1 c.3660 T>G, p.a1144l c.803g>t
TUBB1 Geni Ekzon 4 TUBB1 geni 635C>T, p.h122h TUBB1 geni 636 G> C, p. E123Q Hasta Hasta İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir
TUBB1 Geni Ekzon 4 c.705g>a, p. G146R Hasta İlk kez bu çalışmada gösterilmiştir
Mutasyon mu, polimorfizm mi? E123Q G146R
Sonuçlar.. TUBB1 geninde bulduğumuz bazı değişimler literatürde daha önce farklı hastalıklarda bildirilmiş olmakla birlikte, makrotrombositopeniyle ilişkisi henüz bilinmemektedir. Bu çalışma ile TUBB1- makrotrombositopeni ilişkisi net biçimde ortaya konulmuştur. Human Gene Mutation Database de (HGMD) yer almayan mutasyonlar ilk kez bu çalışmada bildirilmiş olmakla birlikte, yine ilk kez bu çalışma ile makrotrombositopenili bireyde de novo mutasyon varlığı da gösterilmiştir.
Sağlıklı ve hasta (C.U.) periferik kan örneklerinden (trombosit) RNA izolasyonu yapıldıktan sonra cdna sentezi yapılmıştır. TUBB1 ve referans gen olarak seçilen HPRT ye ait Ct değerleri saptanarak replikaların aritmetik ortalamaları alınmıştır.
TUBB1 de meydana gelen mutasyon mikrotübül organizasyonunda defektlere yol açmaktadır.
TEŞEKKÜRLER