1 GĐRĐŞ Nişasta α-d-glukoz birimlerinin polimerleşmesiyle oluşan polisakkaritir. Nişasta bitkilerin enerji deposu olup bitkilerin tohum, kök, yumru, gövde, meyve ve/veya yapraklarında bulunabilmektedir. Besleyici değerinin yanı sıra gıdaların fiziksel özellikleri üzerinde de önemli etkiye sahiptir [1]. Nişasta miktarının saptanmasında kullanılan yöntemler genel olarak iki grup altında toplanabilmektedir. Bunlardan birincisi asit hidrolizinin gerçekleştirildiği yöntemlerdir. Asit hidrolizinin gerçekleştirildiği yöntemler nişasta harici parçalanma ürünü glukoz içeren örneklerde nişasta tayini için uygun değildir. Đkinci grup yöntemlerde ise nişastanın parçalanması spesifik olarak enzimlerle gerçekleştirilmektedir. Kullanılan enzim kaynağına ve ön işlemlere bağlı olarak farklılık arz etmekle birlikte temel olarak örnek içerisindeki nişastanın α-amilaz tarafından parçalanabilir hale getirilmesi (ısıl işlemler), önce α-amilaz ile dekstrine ve sonrasında amiloglukozidaz ile glukoz birimlerine kadar parçalanması ve son olarak oluşan glukoz miktarının enzimatik yöntemle saptanması aşamalarından oluşmaktadır. Biyozim Toplam Nişasta Analiz Kiti nde Amerikan Hububat Kimyası Birliği (AACC) tarafından resmi metot olarak kabul edilen (AACC#76-13) toplam nişasta yöntemi takip edilmiştir. Yöntemde yüksek saflıkta α-amilaz ve amiloglukozidaz enzimleri kullanılarak kısa sürede, yüksek doğrulukta tekrarlanabilir sonuçların üretilebilmesi mümkün kılınmıştır. Geliştirilen yöntem dünya genelinde 32 laboratuvarda 16 farklı örnek kullanılarak test edilmiş ve sonuçların uyum içerisinde olduğu saptanmıştır [2]. Ayrıca analiz yöntemi modifiye edilerek besinsel lif özelliği taşıyan ve çözünürlüğü düşük olması nedeniyle enzime dirençli nişasta ve/veya sindirime dirençli nişasta olarak tanımlanan nişasta türevinin saptanmasında da kullanılabilmektedir. ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR Mikro pipet (1000 µl) Mikro pipet (20-200 µl) -1-
Balon joje (100 ml) Makro küvet (3 ml) 1 Cam tüp (16X100 mm) Santrifüj (3000 rpm) Analitik terazi Spektrofotometre (505 nm) Vorteks Su banyosu (37ºC, 50ºC ve kaynar su banyosu) Spektrofotometre (505 nm) ANALĐZ KĐTĐ ĐÇERĐĞĐ Toplam nişasta analiz kiti; α-amilaz, amiloglukozidaz, TAE tamponu, asetat tamponu, kontrol örneği, glukoz analiz reaktifi, glukoz analiz tamponu ve glukoz standardından oluşmaktadır. 1 nolu şişe (#01-050-1): Glukoz analiz reaktifi (50 analiz/şişe) Glukoz oksidaz 10,000 IU/şişe Peroksidaz 1,000 IU/şişe 4-Aminoantipirin 0.2 mm 2 nolu şişe (#01-125-2): Glukoz analiz tamponu (ph 7.4, 50 ml) 400 mm Potasyum dihidrojen fosfat 0.2 mm fenol 2 3 nolu şişe (#01-001-3): Glukoz standardı Glukoz 0.5 g (MA=180.42 g/gmol) 4 nolu şişe (#05-050-4): α-amilaz enzimi (10,000 IU) 5 nolu şişe (#05-050-5): Amiloglukozidaz enzimi (1,000 IU) 6 nolu şişe (#05-050-6): TAE tamponu (ph 7.0, 50 ml) Tris HCl (100 mm) Sodyum asetat (50 mm) EDTA (2.5 mm) Kalsiyum klorit (5 mm) Sodyum azid (% 0.2) 1 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilmektedir. 2 Fenol toksik bir madde olduğundan çözelti kullanılırken dikkatli olunmalıdır. -2-
3 7 nolu şişe (#05-050-7): Sodyum asetat tamponu (ph 4.5, 50 ml) Asetik asit (200 mm) Sodyum azid (% 0.2) 8 nolu şişe (#05-001-8): Nişasta örneği (0.5 g) 9 nolu şişe (#05-050-9): Etanol ÇÖZELTĐLERĐN HAZIRLANMASI Toplam Nişasta Analiz Kiti nde tüm kimyasallar kullanıma hazır olarak sunulmuştur. Aşağıdaki prosedür gerçekleştirilerek çok kısa bir sürede ölçüme başlanabilmektedir. Glukoz analiz reaktifinin hazırlanması: 1 nolu şişe üzerine 2.5 ml glukoz analiz tamponu ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde 1 dk süresince çalkalayınız. Bu süre sonunda analiz reaktifiniz hazır olacaktır. Zedelenmiş nişasta analiz reaktifleri hazırlandıktan sonra 2-8 C de 1 ay süre ile saklanabilir. Çözeltiler hazırlandıktan sonra dondurulmamalıdır. 3 Glukoz analiz tamponu: Kullanıma hazır halde sunulmuştur. Glukoz standart çözeltisinin hazırlanması: 3 nolu şişe içerisinde bulunan glukoz standardı kullanılarak 0.25 g/l, 0.50 g/l, 0.75 g/l ve 1 g/l derişimlerindeki glukoz çözeltilerini saf su kullanarak hazırlayınız. Dört farklı derişimdeki glukoz çözeltileri kalibrasyon grafiğinin çizilmesinde kullanılacaktır. α-amilaz Çözeltisi: Kullanıma hazır halde sunulmuştur. Amiloglukozidaz çözeltisi: 5 nolu şişe üzerine 1 ml asetat tamponu (7 nolu şişe), 1.5 ml saf su ilave ediniz ve vorteks 3 Đhtiyacınıza göre 50 analizlik hacimler halinde hazırlayınız. Analiz reaktifinin muhafazası süresince pembe renk oluşumu gözlenebilir. Analiz reaktifi 1/25 oranında saf su ile seyreltildikten sonra 505 nm de ölçülen absorbans değerinin 0.05 in üzerinde olması durumunda analiz reaktifi kullanılmamalıdır. -3-
kullanarak kuvvetli bir şekilde 1 dk süresince çalkalayınız. Bu süre sonunda analiz reaktifiniz hazır olacaktır. TAE tamponu: Kullanıma hazır halde sunulmuştur. Sodyum asetat tamponu: Kullanıma hazır halde sunulmuştur. STABĐLĐTE Analiz kimyasalları belirtilen koşullarda saklandığı takdirde 12 ay içerisinde herhangi bir problemle karşılaşılmadan kullanılabilmektedir. Analiz çözeltisi hazırlandıktan sonra 2-8ºC de muhafaza edilmesi durumunda 1 ay saklanabilmektedir. Kalibrasyon grafiğinin oluşturulması aşamasında kullanılmak üzere hazırlanan glukoz çözeltilerinin günlük olarak hazırlanması gerekmektedir. Söz konusu çözeltilerin uzun süre kullanımı için koruyucu ilave edilmeli ve/veya 2-8ºC de muhafaza edilmelidir. Analiz sayısına göre gerekli miktarda analiz çözeltisini hazırlayınız. Bu sayede analiz kimyasalları daha verimli olarak kullanılabilecektir. Glukoz ölçümü için bir seferde 50 adedin üzerinde analiz yapılması gerekiyorsa 50 analiz için gerekli kimyasalların yer aldığı şişe içerikleri daha büyük hacimli amber renkli cam bir şişe içerisinde birleştirilmelidir. Bu sayede her bir analiz şişesi için ayrı bir kalibrasyon grafiği hazırlamaksızın tek bir kalibrasyon grafiği ile ölçümler gerçekleştirilebilecektir. ÖRNEK HAZIRLAMA Örnek ile α-amilaz enziminin etkileşmesi sonrasında örneğin santrifüj edilmesi ve süpernatantın berrak ve homojen olarak elde edilmesi gerekmektedir. Katı veya bulanık olması durumunda santrifüj hızını ve/veya süresini arttırınız. Analiz kiti örneğin % 100 (a/a) nişasta içerebileceği düşünülerek hazırlanmıştır. Analiz kitinde kullanılan yüksek aktiviteye sahip enzimler sayesinde örnek içerisindeki % 2 nişasta içeriği analiz prosedüründe herhangi bir değişiklik yapılmaksızın ölçülebilmektedir. Düşük oranda nişasta içeren örneklerin analizinde örnek miktarı arttırılarak nişasta analizi gerçekleştirilebilir, analiz doğruluğu arttırılabilir. -4-
5 ANALĐZ BĐLGĐLERĐ Spekrofotometre dalga boyu : 505 nm Küvet : 1 cm standart (Plastik veya cam) Ölçüm sıcaklığı : 25ºC veya 40ºC Spekrofotometre sıfır ayarı : Kör çözeltisi UYARILAR Analiz çözeltilerini hazırladıktan sonra dondurmayınız. Analiz çözeltilerini çapraz-kontamine etmeyiniz. Analiz kimyasallarının ve çözeltilerinin gözle veya deriyle temasına izin vermeyiniz. Analiz kimyasallarını ve çözeltilerini herhangi bir şekilde koklamayınız ve içmeyiniz. ANALĐZ PROSEDÜRÜ 1. Çözeltileri prosedüre göre hazırlayınız. 2. Yaklaşık 100 mg örneği cam tüp (16x100 mm) içerisine tartınız ve tartım değerini kaydediniz (ÖM) 3. Örnek üzerine 80 µl etanol (9 nolu şişe) ilave ediniz ve kuvvetli şekilde vorteks kullanarak çalkalayınız. 4. Örnek üzerine 400 µl TAE tamponu (6 nolu şişe), 50 µl α- amilaz enzim çözeltisi ve 3 ml saf su ilave ediniz, kuvvetli bir şekilde vorteks kullanarak çalkalayınız. 5. Kaynar su banyosunda 10 dk inkübe ediniz. 4 6. Bu süre sonunda tüpleri soğutunuz (musluk altında), 400 µl sodyum asetat tamponu (7 nolu şişe), 50 µl amiloglukozidaz enzimi ve 3 ml saf su ilave ediniz ve kuvvetli şekilde vorteks kullanarak çalkalayınız. 7. 50ºC de 30 dk inkübe ediniz. 4 4 Reaksiyon sıcaklığının ve süresinin belirtilen sıcaklık ve sürede olmasına dikkat edilmelidir. -5-
8. Test tüpü içeriklerini 100 ml lik balon jojelere aktarınız, test tüplerini en az üç defa saf su ile yıkayarak yıkama çözeltilerini balon çözeltilere aktarınız ve son hacmi 100 ml ye tamamlayınız. 9. Çözeltinizi 3,000 RPM de 10 dk santrifüj ediniz. 5 10. Süpernatantta glukoz miktarını saptayınız. 11. Glukoz ölçümü için test tüplerini numaralandırınız (kör, standart ve örnekler). 12. Test tüplerine 50 µl süpernatant veya standart çözeltisi koyunuz. 13. Tüplerin ve analiz çözeltilerinin analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız. 14. 400 µl glukoz analiz tamponu ilave ediniz. 15. Son hacim 2.50 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz. 16. 25ºC de 40 dk veya 37ºC de 20 dk inkübe ediniz. 17. Kör çözeltisini kullanarak spektrofotometreyi sıfırlayınız. 18. 505 nm de absorbans değerlerinizi ölçünüz, ölçümlerde ışık yolu 10 mm olan cam veya plastik küvet kullanınız. 6 5 Santrifüj kullanımının mümkün olmaması durumunda süspansiyon filtre edilerek (Whatman No:41 veya benzeri filtre kağıdı) elde edilen berrak filtrat analizde kullanılabilir. VEYA test tüpü içeriği 10 ml ye tamamlanır, 3000 RPM de 10 dk santrifüj edilir ve sonrasında berrak çözelti 1-10 oranında seyreltilerek analizde kullanılabilir. 6 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilir. -6-
7 Analizin kolay takip edilebilmesi için aşamalar aşağıda özetlenmiştir. KÖR ÖRNEK Örnek 100 mg 100 mg Etanol 80 µl 80 µl Kuvvetli şekilde çalkalayınız TAE tamponu 400 µl 400 µl α-amilaz enzim - 50 µl Saf su 3.00 ml 3.00 ml Kuvvetli şekilde çalkalayınız Kaynar su banyosunda 10 dk inkübe ediniz Soğutunuz (~40-50ºC) Asetat tamponu 400 µl 400 µl Amiloglukozidaz enzimi - 50 µl Saf su 3.00 ml 3.00 ml Kuvvetli şekilde çalkalayınız 50ºC de 30 dk inkübe ediniz. Balon joje içerisinde son hacmi 100 ml ye tamamlayınız ve 3,000 RPM de 10 dk santrifüj ediniz Süpernatantta glukoz tayini yapınız. -7-
GLUKOZ ANALĐZĐ KÖR ÖRNEK Örnek veya standart - 0.05 ml Tüplerin, analiz çözeltisinin ve saf suyun analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız. Glukoz analiz reaktifi 0.05 ml 0.05 ml Glukoz analiz tamponu 7 0.40 ml 0.40 ml Saf su 2.05 ml 2.00 ml 25ºC de 40 dk veya 37ºC de 20 dk inkübe ediniz Kör çözeltisini kullanarak spekrofotometreyi sıfırlayınız. 505 nm de absorbans artışını ( A) ölçünüz. GLUKOZ KALĐBRASYON GRAFĐĞĐNĐN ÇĐZĐLMESĐ VE SÜPERNATANT GLUKOZ DERĐŞĐMĐNĐN HESAPLANMASI Farklı derişimlerde hazırlanan glukoz standart çözeltileri kullanılarak derişim-absorbans grafiğini çiziniz ve eğilim çizgisini orjinden geçiriniz. 8, 9 Eğilim çizgisinin eğimini (M, L abs x g glukoz ) saptayınız. Örneğin glukoz derişim i (g/l) = Örnek için ölçülen absorbans artışı ( A) Kalibrasyon grafiğinin eğim i (M) 7 Analiz tamponunu ölçüm sıcaklığına gelmesini sağladıktan sonra ilave ediniz. 8 Kalibrasyon grafiğini günlük ve hazırlanan her analiz çözeltisi için yeniden çiziniz. 9 Eğilim çizgisinin korelasyon katsayısının (r 2 ) 0.985 in üzerinde olması gerekmektedir. Bu değerden düşük bir korelasyon değeri elde etmeniz durumunda hazırlamış olduğunuz standart çözeltilerin hazırlanması aşamasında veya analiz aşamasında bir hata yapılmıştır. Olabilecek hataları gözden geçiriniz ve ölçümünüzü tekrarlayınız. -8-
9 ÖRNEĞĐN NĐŞASTA ĐÇERĐĞĐNĐN HESAPLANMASI Absorbans artışı ( A) 162 100 Nişasta Oranı (%) = x x 0.1 x Glukoz kalibrasyon grafiğinin eğimi (M) 180 ÖM SF : Seyreltme faktörü ÖM : Örnek miktarı (0.1 g) M : Glukoz kalibrasyon grafiğinin eğimi 0.1 : Örneğin enzimatik hidroliz sonrası son hacmi (0.1 L) 162/180 : Çevirme faktörü (Nişasta molekülündeki glukozun molekül ağırlığı/serbest glukozun molekül ağırlığı) DOĞRUSALLIK SINIRI Toplam nişasta analiz kitinin doğrusallık sınırının % 100 nişasta oranı olduğu saptanmıştır. HASSASĐYET ve ÖLÇÜM SINIRI Toplam nişasta analiz kiti; % 1.0 ölçüm hassasiyetine ve % 2.0 ölçüm sınırı değerlerine sahiptir. 10 Düşük oranda nişasta içeren örneklerde; örnek miktarı arttırılarak ve/veya nişasta hidrolizi sonrası daha düşük oranda seyreltme yapılarak analizin hassasiyeti arttırılabilir, ölçüm sınırı düşürülebilir. DOĞRULUK Toplam nişasta analiz kitinin ölçüm doğruluğunu saptamak için iki farklı glukoz derişiminde beş tekrarlı ölçüm alınmış ve ölçümler arasındaki standart sapma değerleri hesaplanmıştır. Standart sapma (ss) değerleri kullanılarak yüzde değişim katsayısı (%DK= 10 Ölçüm sınırı spektrofotometre gürültü seviyesinin 3 katı absorbans değerine eşdeğer zedelenmiş nişasta oranı olarak hesaplanmıştır. -9-
ss/ortalama X 100) hesaplanmıştır. Her iki zedelenmiş nişasta oranı için de %DK değerinin % 5 deneysel hata sınırlarının altında kaldığı saptanmıştır. Zedelenmiş nişasta oranı (%) Standart Sapma % DK 92 ± 3.0 3.26 14 ± 0.6 4.3 Biyozim tayin kiti kullanılarak tekrarlanabilir doğru sonuçlar üretilebilmektedir. Aynı örnek için gerçekleştirdiğiniz ölçümlerde % 5 in üzerinde farklılığın olması durumunda analiz sürecinde gerçekleştirdiğiniz aşamaların gözden geçirilmesi gerekmektedir. Muhtemel hata kaynakları aşağıda verilmiştir. 1. Yanlış mikro pipet kullanımı, 2. Analiz sıcaklığının kontrolsüz olması, 3. Çözeltilerin iyi karıştırılmaması, homojen olmaması, 4. Örneğin homojen olmaması, bulanık veya renkli olması, 5. Reaksiyon ortamının temiz olmaması. GÜVENLĐK Glukoz analiz tamponu içerisinde fenol bulunmaktadır. Fenolün organik toksik bir madde olması nedeniyle analiz sürecinde dikkatli olunmalıdır. Fenol içeren çözeltilerin koklanmaması, içilmemesi, vücuda temas ettirilmemesi gerekmektedir. Vücuda temas etmesi durumunda temas eden bölge bol su ile yıkanmalıdır. GĐRĐŞĐM FAKTÖRLERĐ Geliştirilen yöntemde nişasta glukoza kadar parçalanmakta ve sonrasında glukoz miktarı glukoz oksidaz ve peroksidaz enzimleri varlığında saptanmaktadır. Analiz ortamında glukoz, hidrojen peroksit, yapısında glukoz ve/veya hidrojen peroksit içeren bileşikler ve bu bileşiklerin parçalanmalarını katalizleyen kimyasalların bir arada bulunması durumunda nişasta analiz kiti yanlış sonuç -10-
üretecektir. Böyle bir durumla karşılaşıldığında üretici firma ile temasa geçiniz. Gerekli teknik destek üretici firma tarafından sağlanacaktır. 1 REFERANSLAR UYARI 1. Saldamlı, Đ., Gıda Kimyası, Hacettepe Üniversitesi Basımevi, Ankara, 527 s (1998). 2. http://secure.megazyme.com/downloads/en/data/k- TSTA.pdf Cooper, G.R., CRC Crit Rev. Clin Lab. Sci. 4:101 (1973). Bu kitapçıkta; ulusal ve uluslararası yayınlarda yer alan, doğruluğu kesin olarak kabul edilmiş bilgiler yer almakta ve ürünlerimiz bu bilgiler doğrultusunda üretilmektedir. Fakat kullanım koşulları bizim kontrolümüz dışında olduğundan, analiz sonuçlarının doğruluğuyla ilgili üretici firma tarafından herhangi bir garanti verilmemektedir. -11-
NOTLAR -12-