Pozitif kan kültürü şişesinden doğrudan MALDI-TOF MS ile identifikasyon Serap Süzük Yıldız 1, Salih Altınok 1, Banu Kaşkatepe 2, Hüsniye Şimşek 1, Selçuk Kılıç 1,3 1, Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarı Daire Başkanlığı, Ankara 2 Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji AD, Ankara 3 Sağlık Bilimleri Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji AD, İstanbul
AMAÇ Sepisis Bakteriyemi SIRS HIZLI TANIMLAMA/ADT DOĞRU TANIMLAMA/ADT Morbidite ve mortalitenin azalması Hastanede kalış süresinin kısalması Hastane maliyetlerinin düşmesi Akılcı antibiyotik kullanımının sağlanması KAL KÜLTÜRÜ Altın Standart MALDI TOF (Tanımlama/ADT) (Saponin, SepsiTyper) Deneysel olarak bakteri inokülasyonu yapılan kan kültürü şişelerinden doğrudan MALDI TOF MS ile saponin ve tween 80 kullanımının değerlendirilmesi amaçlanmıştır
YÖNTEM ve GEREÇLER 45 Gram pozitif olmak 69 Gram negatif Toplam 114 bakteri 0,5 McFarland 1 ml 48-72 saat Pozitif Sinyal
YÖNTEM ve GEREÇLER Çalışmaya dahil edilen gram negatif bakteriler Çalışmaya dahil edilen köken sayısı Çalışmaya dahil edilen gram pozitif bakteriler Çalışmaya dahil edilen köken sayısı Escherichia coli 13 Staphylococcus aureus 9 Klebsiella pneumoniae 12 Stapylococcus epidermidis 7 Enterobacter cloacae complex 6 Staphylococcus haemolyticus 2 Proteus mirabilis 4 Streptococcus pyogenes 3 Citrobacter cosseri 3 Streptococcus agalactiae 3 Providencia stuarttii 3 Streptococcus pneumoniae 8 Salmonella spp 3 Enteococcus faecalis 3 Serratia marcescsens 3 Enteococcus faecium 3 Pseudomonas aeruginosa 8 Enterococcus gallinarum 1 Acinetobacter baumannii 7 Listeria monocytogenes 4 Stenotrophomonas maltophilia 4 Haemophylus influenzae 2 Moraxella cattarhalis 3 Gram pozitif bakteri sayısı 43 Gram negatif bakteri sayısı 71 Toplam 114
1 ml %20 Saponin 100 ml 10 Saniye 14000 rpm 5 dakika 1 ml distile su ile süspanse edilip süpernatan yıkandı x2 Pellet slayta sürüldü 1 µl %70 formik asit, kurut 1 µl HCCA, kurut Analiz 1 ml %10 Tween 80 100 ml 10 Saniye 14000 rpm 5 dakika 1 ml distile su ile süspanse edilip süpernatan yıkandı x2
YÖNTEM ve GEREÇLER İzolatlardan her biri 3 tekrarlı çalışılmıştır İstatistiksel değerlendirme SPSS 20 paket programı kullanılarak yapılmıştır Veriler normal dağılım göstermediği için; Gruplar arası ilişkiler Mann-Whitney-U testi Saponin ve tween 80 ile elde edilen sonuçlar arasındaki ilişki Wilcoxon testi Aralıklar arasındaki ilişki Kruskal-Wallis testi kullanılarak değerlendirilmiştir (p< 0.05)
BULGULAR
Gram pozitif bakteri tanımlama Bakteri Adı Bakteri Sayısı Saponin Tween 80 < 1,7 1.7-1.9 > 2 < 1,7 1.7-1.9 > 2 Staphylococcus aureus 9 0 1 8 0 0 9 Stapylococcus epidermidis 7 4 2 1 2 4 1 Staphylococcus haemolyticus 2 0 2 0 0 2 0 Streptococcus pyogenes 3 2 1 0 0 3 0 Streptococcus agalactiae 3 2 1 0 0 3 0 Streptococcus pneumoniae 8 3 4 1 3 3 2 Enteococcus faecalis 3 0 1 2 0 1 2 Enteococcus faecium 3 0 1 2 0 0 3 Enterococcus gallinarum 1 0 1 0 0 0 1 Listeria monocytogenes 4 0 3 1 0 2 2 Toplam 43 11 (25,58) 17 (39,53) 15 (34,88) 5 (11,63) 18 (41,86) 20 (46,51)
Gram negatif bakteri tanımlama Bakteri Adı Bakteri Sayısı Saponin Tween 80 < 1,7 1.7-1.9 > 2 < 1,7 1.7-1.9 > 2 Escherichia coli 13 0 3 10 0 3 10 Klebsiella pneumoniae 12 0 2 10 0 0 12 Enterobacter cloacae complex 6 0 3 3 0 1 5 Proteus mirabilis 4 0 2 2 0 2 2 Citrobacter cosseri 3 0 1 2 0 0 3 Providencia stuarttii 3 0 1 2 0 1 2 Salmonella cloraceus spp arizona 2 0 2 0 0 2 0 Salmonella enteritidis 1 0 1 0 0 1 0 Serratia marcescsens 3 0 0 3 0 0 3 Pseudomonas aeruginosa 8 0 0 8 0 0 8 Acinetobacter baumannii 7 3 2 2 2 3 2 Stenotrophomonas maltophilia 4 0 3 1 0 3 1 Haemophylus influenzae 2 0 1 1 0 1 1 Moraxella cattarhalis 3 1 0 2 1 0 2 Toplam 71 4 (5,63) 21 (29,58) 46 (64,79) 3 (4,23) 17 (23,94) 51 (71,83)
Gram pozitif ve gram negatif bakteri tanımlama dağılımları 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 73,33 44,74 55,26 75,41 62,50 37,50 51,43 48,57 71,83 30,00 26,67 24,59 28,17 20,00 10,00 0,00 < 1,7 1.7-1.9 > 2 < 1,7 1.7-1.9 > 2 Saponin Tween 80 Gram Pozitif Gram Negatif
Bulgular 95,65 95,65 100,00 88,89 90,00 75,56 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 24,44 30,00 20,00 11,11 4,35 4,35 10,00 0,00 Gram Pozitif Bakteri Gram Negatif Bakteri Saponin Saponin Tween 80 Tween 80
İstatistiksel değerlendirme Gram pozitif ve negatif bakteriler için saponin ve tween 80 sonuçları arasındaki fark tween 80 lehine anlamlı bulunmuştur (p=0.000) Gram pozitif ve negatif bakteriler arasında saponin ve tween 80 ile elde edilen sonuçlar açısından anlamlı fark tespit edilmiştir (p=0.000)
Bulgular Saponin % 87,72 Tween 80 % 92,98 p=0.000
Literatür ne diyor? Literatür Açıklama Tanner et al. BMC Res Notes 2017; 10: 48-56 Materyal-Metot: 144 Kan kültürü şişesi / Saponin, SDS ve SensiTyper (Bruker MS) Sonuç: Tür düzeyinde tanımlama: Saponin (%48), SDS (% 60) ve SensiTyper (%63) Yonetani et al. Int J Infect Dis. 2016; 52: 37-42 Materyal Metot: 195 Kan kültürü şişesi /Saponin, Santrifügasyon, SensiTyper, (Bruker MS) Sonuç: Tür düzeyinde tanımlama SensiTyper (%78.5), Santrifügasyon (%68.7), Saponin (%76.4) Jin Jo et al. Ann Lab Med. 2016; 36(2): 117-23 Materyal-Metot: 254 Kan kültürü şişesi / Vitek MS Sonuç: Tür düzeyinde tanımlama Vitek MS (%81.8) Jakovljev and Bergh BMC Microbiology 2015; 15: 258-266 Materyal-Metot: 149 Kan kültürü şişesi/ Saponin ve modifiye ekstraksiyon Sonuç: Tür düzeyinde tanımlama Saponin (%81.9) ve modifiye ekstraksiyon (%91)
Sonuç Maldi Tof MS Sistemi ile pozitif sinyal veren kan kültürü şişelerinden doğrudan identifikasyona gidilebilir Tanımlama için ekstraksiyon aşamasında laboartuvar koşullarında daha kolay elde edilebilen tween 80 tanımlamada kullanılabilir
Teşekkür ederiz Serap Süzük Yıldız, Salih Altınok, Banu Kaşkatepe, Hüsniye Şimşek, Selçuk Kılıç serap.suzuk1@saglik.gov.tr serapsuzuk@gmail.com