SAS-1 LD Vis-12 Izoenzim Kullanım Talimatı REF 201300 REF 201301 (sadece jel kit), REF (sadece reaktif kit)
KULLANIM AMACI SAS-1 LD Vis-12 İzoenzim kit agaroz jel elektroforezi tarafından serum veya plazmada Laktat Dehidrogenaz İzoenzimlerin ayırma ve kantitatif tespiti içindir. Laktat dehidrojenaz (LD) (EC 1.1.1.27) büyük konsantrasyonlara sahip olan böbrek, kalp, iskelet kası, karaciğer gibi hemen hemen tüm insan dokularında bulunan bir enzimdir. Vücut dokularında LD in geniş dağılımı tanıda toplam LD in kullanışlılığını sınırlar. Yüksek LD aktivitesinin kaynağı için test izoenzim değerlendirme ile gösterilebilir 1. LD in beş izoenzimi insan serumunda görülebilir. Her bir izoenzim elektroforetik mobilite ile ilgili bir sayıyla belirtilir. Hızlı hareket eden fraksiyon (en anodik) belirlenmiş LD1 dir ve kalp kasında öncelikle bulunur. Yavaş hareketli (en katodik) karaciğer ve iskelet kasında öncelikle bulunan LD5 dir. Diğerleri - LD2, LD3 ve LD4- tüm dokularda LD1 ve LD5 birlikte değişen derecelerde bulunur 1,2. LD izoenzimlerinin en önemli kullanımı miyokard hasarının tanısında yer almaktadır. LD2 normal insan serumunda en yüksek konsantrasyonda bulunur. LDI/LD2 oranı bu nedenle diğerinden daha azdır. Miyokard enfarktüsü sonrasında, LD1 de önemli yükselme vardır bundan dolayı Ml ardından LD1/LD2 oranı yaklaşık 1 olacaktır veya 1 aşacaktır, flipped LD olarak tanımlanan bir fenomen olacaktır. LD düzeyi sık sık normalin 2-3 kat üst limitine ulaşarak miyokard enfarktüsü sonrası yaklaşık 12-24 saatte yükselmeye başlar. Pik aktivite genellikle 3-4 günde ulaşılır ve aktivite infarktüsü sonrası iki hafta boyunca yükselerek kalabilir 2. Ml tanısında en kesin test LD izoenzim çalışmaları ile birlikte kreatin kinaz(ck) izoenzim çalışmaları yapılarak gerçekleştirilir 1-5. Bu iki test ile elde edilen özgüllük ve duyarlılığı doğru Ml tanısında ek enzim çalışmaları için gerekliliğini ortadan kaldırmıştır. Çalışmalar, uygun klinik ayarları ve EKG sonuçları ile birlikte CK ve LD izoenzim analizleri düzgün miyokard infarktüsü tanısını hemen hemen % 100 doğru olduğunu göstermiştir 2,6. LD izoenzimleri çeşitli yöntemlerle tespit edilmiştir 7-11. Elektroforez diğer yöntemlere göre çok daha fazla bilgi sağlar çünkü beş izoenzimlerin tam ayrılmasını sağlar. Elektroforez de kullanılan destek ortam selüloz asetat, agar, agaroz ve akrilamid jel içerir 1. SAS-1 LD Vis-12 izoenzim kit Preston 8 yönteminin modifikasyonlarını kullanılır ve bir agaroz jelde mobilitelerine göre Laktat Dehidrogenaz İzoenzimleri ayrılır. İzoenzim bant aşağıdaki reaksiyon sırasına göre kantitatif olarak izoenzimleri gösteren bir kolorimetrik reaktif ile daha sonra görüntülenir: Paternler dansitometri tarafından 595nm de kantitatif tespit edilir. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun. BİLEŞENLER 1. SAS-1 LD Izoenzim Jel (x10) Koruyucu olarak sodyum azid ile barbital tamponunda agaroz içerir. Jel paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 2. LD Izoenzim Reaktif (10x 1ml) Yukarı gösterilen reaksiyon sırasına göre laktat dehidrogenaz izoenzim in tanımlanması için gerekli bileşenleri içerir. Çözdürme talimatı için ADIM-ADIM PROSEDÜRE bakın. 1
3. LD Izoenzim Diluent (1x 15ml) Koruyucu olarak sodyum azid ile ph 8.1-8.3, AMP, bicine, barbital ve aspartat tampon içerir. Dilüent paket içinde kullanıma hazırıdır. 4. Diğer Kit Bileşenleri Her kit için kullanım talimatı ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda kurutma kağıdı B,C ve Reaktif Spreading Film içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. SAS-1 LD Izoenzim Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulmasını,1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3) bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun görülür kontaminasyonunu belirtir. 2. LD Izoenzim Reaktif Reaktif 2...6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Hazırlanmış reaktif 2...6 C de karanlıkta 48 saat boyunca stabildir. 3. LD Izoenzim Diluent Dilüent 2...6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüentin kontaminasyonundan kaçının. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKLİ ÖĞERLER Katalog No. 210200 Applicator Blades (1 x 10) Katalog No. 210300 Applicator Blades (5 x 10) Katalog No. 210100 Disposable Sample Cups (100) Katalog No. 5014 Development weight Katalog No. 4062 Incubation Chamber Katalog No. 3100 REP Prep 60-70 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını 45 C li inkübatör Boya arındırıcı Solüsyon: 900ml saf su ve 100 ml glacial asidik asidi karıştırın. Ağzını sıkıca kapatarak saklayın. Saf su ÖRNEK ALMA VE HAZIRLAMA Tercih edilen numune taze toplanmış serumdur. Heparin veya EDTA antikoagüle plazmada da kullanılabilir, Oksalat LD aktivitesini inhibe eder ve kullanılmamalıdır 12. Plazma, LD içeren trombositler olarak trombosit-serbest olmalıdır 13. Örneklerin saklama koşulu tüm izoenzimler için opsiyonel olmadığını için toplandıktan sonra en kısa sürede test edilmelidir 12, 14, 15, 16. Eğer gerekirse, örnekler 15...30 C veya 2...6 C de 48 saate kadar buzdolabında saklanabilir 12. DONDURMAYIN- dondurma LD aktivitesini bozar 12. Örnek Toplama: Örnek toplamanın doğru zamanlaması miyokard infarktüsünün (MI) değerlendirilmesinde LD İzoenzim paternlerin doğru yorumlanması için kritik öneme sahiptir. En az 3 örnek toplanmalıdır - mimimum 24-37 saatte her 6-13 saatte bir örnekler alınmalıdır 2-4. Engelleyici faktörler: 1) Eritrosit LD aktivitesinin yüksek düzeyini içerdiği için hemoliz LD1 ve LD2 kantifikasyonu etkileyebilir 1-2,12. 2) LD aktivitesi üremik serumda üre ve oksalat gibi inhibitörlerinin varlığı nedeniyle azalır. LD5 özellikle etkilenir 17. 3) Aseton ve kloroform LD1 hariç tüm izoenzimleri inhibe eder 14. 4) Bazı ilaçlar LD izoenzim aktivitesi etkileyebilir 18. 2
ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Numune tepsisi veya tek kullanımlık numune kaplarının uygun kuyusuna numunenin 35μl pipetleyin. İ) SAS-1 & SAS- I Plus kullanıcıları: SAS-1 numune tepsisini kullanın. Aplikatör çekmecesinde numune tepsisi dikkatlice yerleştirilir. Tepisinin pozisyonuna kuvvetlice itilmesi sağlanır. İİ) SAS-3 kullanıcıları: SPIFE / SAS-3 numune tepsisini kullanın. Kullanılan numune dikkatlice numune tepsisine yerleştirilir. Poziyonlandırılan tepsinin güvenilirliği sağlanır. 2. Jeli paketinden çıkarın ve: İ)SAS-1 kullanıcıları: Jel SAS-1 e yerleştirilir, agaroz yukarı doğru, uygun elektrot kolları ile negatif ve pozitif uçları ayarlanır. İİ) SAS-1 Plus kullanıcıları: Sıcak havuza 400μL REP Prep boşaltılır. Sıcak havuza jel yerleştirilir, agaroz toplanır, uygun elektrot kolları ile pozitif ve negatif uçları ayarlanır, jelin altında hava kabarcığı oluşumunu önlemeye dikkat edin. İİİ)SAS-3 kullanıcıları: Havuza ayarlama kılavuzunu yerleştirin ve 400μL REP prep tankın merkezine boşaltın. Jeli agaroz yukarı doğru olacak şekilde kuyuya yerleştirin, kılavuzu kullanın, uygun elektrot kolları ile negatif ve pozitif uçları ayarlayın, jelin altında hava kabarcığını oluşumunu önlemeye dikkat edin. 3. Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdını atın. 4.i)SAS-1 kullanıcıları: Elektrot kollarının üst tarafına elektrotlar eklenir böylece jel blokları ile temasa gelirler. ii)sas-1 Plus kullanıcıları:(yukarıdaki gibi) Jelin ve elektrodların üzerine kapak yerleştirilir ve teması sağlamak için 5 saniye kuvvetlice bastırılır. iii)sas-3 kullanıcıları: Elektrot kollarına elektrotlar eklenir böylece jel blokları ile temasa gelirler. 5.Cihaz üzerindeki pozisyonda bir aplikatör ucu bir araya getirilerek yerleştirilir.(sas-3 kullanıcıları: delik 8). 6. LD elektroforezi yapılır: i) SAS-1 kullanıcıları:100 volts, 13 dk, 5 applikatör ii) SAS-1 plus kullanıcıları: Elektroforez: 80 volts, 20 dk, 15 C, 5 applikatör Inkübasyon adımı 1: 25 dk, 45 C iii) SAS-3 kullanıcıları: 7. SAS-1 ve SAS-3 kullanıcıları: Örnekler elektroforez olurken, inkübasyon çemberine su ile nemlendirilmiş bir kurutucu koyun ve dengeye gelmesi için 45 C de ayarlı inkübatöre koyun. 8. Elektroforezin tamamlanmasından önce yaklaşık 3-4 dakika, 1ml LD İzoenzim Diluent ekleyerek 1 şişe LD İzoenzim Reaktifinini sulandırın ve iyice karıştırın. 9. Elektroforez ardından, SAS-1 ve SAS-3 kullanıcıları: inkübasyon tankına agaroz jel tarafı yukarı bakacak şekilde koyun. 10. Jelin ortasına doğru LD Isoenzyme Reaktif şişe içeriğini dökün. Hava kabarcıklarından kaçınarak reaktifi yaymak için reaktif yaymanın bir kısımını uygulayın. 11. SAS-1 ve SAS-3 kullanıcıları: Jeli inkübe edin: 25 dak., 45 C. SAS-1 Plus kullanıcıları: Jeli inkübe edin. 12. Reaktif yayma filmini ve Gel Block Remover kullanarak her iki jeli alın. 13. 2 dakika boya arındırıcı solüsyonda jeli yıkayın. 3
14. Düz bir yüzeye agaroz yukarı olacak şekilde jeli koyun. Jel yüzeyine 3 kat kağıt havluları, bir Kurutucu B (destain solüsyonunda ıslatılmış) koyun. 5 dakika jele basın. 15. 1 dakika boya arındırıcı solüsyona jeli yıkayın. 16. Saf su ile jeli yıkayın ve 60...70 C de jeli kurutun. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Jellerin değerlendirmesi her bir laboratuvarda bu test için oluşturulan normal değerlere göre yapılmalıdır. Tamamlanmış jeller her zaman karanlıkta saklanmalıdır. Kalitatif Değerlendirme: SAS-1 LD Vis-12 Izoenzim jel ilgili bantların varlığı veya yokluğunda incelenecektir. Kantitatif Değerlendirme: 2 saat içinde tamamlanmış jelleri 595 nm de tarayın. Tamamlanmış jeller aynı anda karanlıkta saklanmalıdır. Elektroforezin ardından, LD aktivitesinin 5 bölgesi normal olarak tespit edilir. Hızlı bölge (LD1) alfa1 globulin ile benzer bir göç ile hareket eder ve yavaş bölge (LD5) gama globulin ile hareket eder. Diğer 3 bölge orta hareketliliğe sahiptir. Serumda LD aktivitesi çok sayıda hücre tiplerinin dağılımı yansıtır ve 5 bölge de görülebilir. LD1 ve LD3 ardından LD2 baskındır. LD4 ve LD5 az miktarda görülür. 1. LD2 de normal serumda çok miktarda LD İzoenzim mevcuttur 1-4,12. 2. LD1 yükselir ve aşağıdaki durumlarda LD2 den daha büyük olabilir: a) Miyokard infarktüsü 1-4,12. b) Duchenne's müsküler distrofi MI gibi bir patern sunar ancak klinik semptomlar kolayca iki hastalık ayırımına yardımcıdır 19, 20. c) Total serum LD, 5x normal den daha büyük seviyelere ulaştığında ve izoenzimleri daha büyük LD1 ve LD2 gösterdiğinde Hemolizler (hemolitik anemiler de dahil olmak üzere) düşünülmelidir. MI e şiddetli şok eşlik etmediği sürece toplam LD, MI de hemolitik anemi den daha yüksektir. Tekrar nüks etmede pernisiyöz anemi hemoliz gibi LD patern verir ve yüksek toplam serum LD seviyelerinin bazıları bu koşullarda ile bulunur 2,14. d) Renal enfarkt 2,12. 3. LD3 pulmoner infarktlar da yükselir 7,12,21. 4. LD4 artışı herhangi bir patoloji ile ilişkili olmamıştır. 5. LD5 karaciğer ve kas hasarı ve deri hastalıklarında yükselir 1. 6. Toplam LD belirgin olarak artar ama izoenzimlerin hepsi normal yüzdelerine sahipse, buna bir izomorf patern denir. Klinik tanının yaygın farklı grupları paternin bu türünü göstermiştir ve kardiyorespiratuvar hastalıkları, kanser, kırık, merkezi sinir sistemi, enfeksiyon ve inflamasyon, karaciğer sirozu, alkolizm, kırıksız travma, infeksiyöz mononükleoz, hipotiroidizm, üremi, nekroz, pseudomononucleosis, viremi ve bağırsak tıkanıklığına sahiptir 1,2,22. 7. Açık kalp ameliyatı sonrası - CK ve LD izoenzimlerinin değerleri çoğu tanısal durumlardan daha az spesifiktir. CK-MB, kalbin manipülasyon ve kanülasyonundan kaynaklanan travma ve operatif prosedüründen gelen miyokard hasarı nedeniyle yükselmiş olacaktır. LD2/LD1 ekstrakorporeal dolaşımdan gelen hemoliz sekonder olarak yükselmiş olabilir 22-24. KALİTE KONTROL CK / LD Kontrolü (Kat.No.5134) prosedürünün tüm aşamalarını doğrulamak için kullanılabilir ve her plaka çalışmasında kullanılmalıdır. Kabul edilebilir test değerleri için sağlanan paket prospektüsüne bakın. SINIRLAMALAR SAS-1 LD Vis-12 İzoenzim prosedür tümör belirteçleri tanımlamak için dizayn edilmemiştir. Diğer etkileyici faktörler için ÖRNEK TOPLAMA VE ÇALIŞMAYA bakın. 4
Daha fazla test gerekliyse: 1. Toplam LD aktivitesi tespit edilebilir. Çelişkili raporlar toplam serum enzim düzeylerinin gerçek değeri ve hastalığın şiddeti ile ilgili bulunmaktadır 1,4,25. 2. MI tanısında, CK İzoenzim çalışmaları da yapılmalıdır 1,4. 3. Haptoglobin çalışmalar yükseltilmiş LD1 ve LD2 nedeni olarak hemolizi ekarte etmek için yapılabilir. REFERANS DEĞERLERİ Aşağıdaki normal değerler Helena BioSciences de çalışmalarda elde edilmiştir. Bu değerler sadece bir kılavuz olarak kullanılmalıdır. Her laboratuvar bu yöntem için kendi beklenen normal değerlerini oluşturmalıdır. LD1 = 20.6-32.0% LD2 = 31.1-35.9% LD3 = 19.8-25.7% LD4 = 7.0-10.4% LD5 = 6.5-14.0% PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Doğrusallık Bu sistemin bant başına 650 IU / L veya 1300 IU/L toplam LD aktivitesi kadar lineerdir. BİBLİYOGRAFYA 1. Brish, L.K. CK & LD Isoenzymes A Self-Instructional Text, Am. Soc. of Clin. Path. Press, Chicago, 1984: 85-120. 2. Hadden, D.M. and Prentiss, T., Cardiac Profiling by Electrophoresis, Lab. Mgt., 1977; May: 19-24. 3. Henry, J.D. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 16th Edition, 1979; 1: 366-369, W.B. Saunders Co., Philadelphia. 4. Galen, R.S., Reiffel, J.A. and Gambino, S.R., Diagnosis of Acute Myocardial Infarction, J. Am. Med. Assoc., 1975; 232(2): 145-147. 5. Frolich, J., Brosseuk, A., Grant, A. and McLennan, M., Study of the Value of CPK and LDH Isoenzyme Determinations in the Differential Diagnosis of Ischemic Chest Pain, Clin. Biochem., 1978; 11(6): 232-234. 6. Wagner, G.S., Roe, C.R., Limbird, L.E., Rosati, R.A. and Wallace, A.G., The Importance of Identification of the Myocardial-Specific Isoenzyme of Creatine Phosphokinase (MB Form) in the Diagnosis of Acute Myocardial Infarction, Circulation, 1973; 47: 263-269. 7. Nerenberg, S.T., Electrophoretic Screening Procedures, 1973: 96-125, Lea & Febiger, Philadelphia. 8. Preston, J.A., Briere, R.O. and Batsakis, J.G., Rapid Electrophoretic Separation of Lactate Dehydrogenase Isoenzymes on Cellulose Acetate, Am. J. Clin. Pathol., 1965; 43(3): 256 260. 9. Hsu, M-Y., Kohler, M.M., Barolia, L. and Bondar, R.J.L., Separation of Five Isoenzymes of Serum Lactate Dehydrogenase by Discontinuous Gradient Elution from a Miniature Ion- Exchange Column, Clin. Chem., 1979; 25(8): 1453-1458. 10. Usategui-Gomez, M., Wicks, R.W. and Warshaw, M., Immunochemical Determination of the Heart Isoenzyme of Lactate Dehydrogenase(LDH1) in Human Serum, Clin. Chem., 1979; 25(5): 729-734. 11. Rotenberg, Z., Weinberger, I., Sagie, A., Fuchs, J., Sperling, O. and Agmon, J., Lactate Dehydrogenase Isoenzymes in Serum During Recent Acute Myocardial Infarction, Clin. Chem., 1987; 33(8): 1419-1420. 12. Tietz, N.W. et al., Textbook of Clinical Chemistry, 1986: 691-700, W.B. Saunders Co., Philadelphia. 5
13. Rothwell, D.J., Jendrzejczak, B., Becker, M. and Doumas, B.T., Lactate Dehydrogenase Activities in Serum and Plasma, Clin. Chem., 1976; 22(7): 1024-1026. 14. Latner, A.L. and Skillen, A.W., Isoenzymes in Biology and Medicine, 1968: 146-157, Academic Press, London. 15. Kreutzer, H.H. and Fennis, W.H.S., Lactic Dehydrogenase Isoenzymes in Blood Serum after Storage at Different Temperatures, Clin. Chim. Acta, 1964; 9: 64-68. 16. Galen, R.S., Personal Communication, Dec. 1981. 17. Clark, P.I., Kostuk, W.J. and Henderson, A.R., Time-Dependency of Human Lactate Dehydrogenase Isoenzyme 5 Inhibition by Urea, Clin. Chem., 1976; 22(12): 2059. 18. Young, D.S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3rd Ed., 1990, AACC Press, Washington D.C. 19. Roses, A.D., Roses, M.J., Nicholson, G.A. and Roe, C.R., Lactate Dehydrogenase Isoenzyme 5 in Detecting carriers of Duchenne Muscular Dystrophy, Neurology, 1977; 27(May): 414-421. 20. Yasmineh, W.G., Ibrahim, G.A., Abbasnezhad, M. and Awad, E.A., Isoenzyme Distribution of Creatine Kinase and lactate Dehydrogenase in Serum and Skeletal Muscle in Duchenne Muscular Dystrophy, Collagen Disease, and Other Muscular Disorders, Clin. Chem., 1978; 24(11): 1985-1989. 21. Papadopoulos, N.M., Clinical Applications of Lactate Dehydrogenase Isoenzymes, Annals of Clin. Lab. Sci., 1977; 7(6): 506-510. 22. Jacobs, D.S., Robinson, R.A., Clark, G.M. and Tucker, J.M., Clinical Significance of the Isomorphic Pattern of the Isoenzymes of Serum Lactate Dehydrogenase, Annals of Clin. and Lab. Sci., 1977; 7(5): 411-421. 23. Galen, R.S., Diagnostic Tests in Cardiac and Non-Cardiac Disorders Diag. Med., 1978 Feb., 74-87. 24. Mohiuddin, S.M., Raffetto, J., Sketch, M.H., Lynch, J.D., Schultz, R.D. and Runco, V., LDH Isoenzymes and Myocardial Infarction in patients Undergoing Coronary Bypass Surgery: An Excellent Correlation, Am. Heart J., 1976; 92(5): 584-588. 25. Chapelle, J-P., Albert, A., Smeets, J-P., Marechal, J-P.,Heusghem, C. and Kulbertus, H.E., Does Lactate Dehydrogenase Isoenzyme-5 Contribute to the Predictive Power of Total Lactate Dehydrogenase in Myocardial Infarction? Clin. Chem., 1983; 29(5): 774-777. 6