BİTKİSEL GIDALARIN TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTELERİ ve BAŞLICA FENOLİK BİLEŞENLERİ Esma TÜTEM İstanbul Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Bölümü, Analitik Kimya Anabilim Dalı, Avcılar - 34320
Serbest radikaller, dıģ yörüngelerinde eģleģmemiģ elektronu bulunan moleküllerdir. Bu tip maddeler, eģleģmemiģ elektronları sebebiyle genellikle kararsız ve çok reaktiftirler 1,2,3. 1. FANG, Y. Z., YANG, S., WU, G., 2002, Free radicals, antioxidants, and nutrition, Nutrition, 18, 872-879. 2. HALLIVEL, B., ARUOMA, O. I., 1991, DNA damage by oxygen-derived species:its mechanisms and measurement in mammalian systems, FEBS Lett, 281, 9-19. 3. LESCEY, K. M. W., LISA, G. W., MANOHAR, L. G., 2006, Methodology for the determination of biological antioxidant capacity in vitro: a review, Journal of the Science of Food and Agriculture, 86, 2046-2056.
Hayvanlarda ve insanlarda fizyolojik ve patolojik koģullarda oluģan serbest radikaller; Reaktif oksijen türleri (reactive oxygen species, ROS) Süperoksit anyonu (O 2.- ) Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) Peroksil radikali (ROO. ) Hidroksil radikali (OH. ) Singlet oksijen (O 2 ) Reaktif azot türleri (reactive nitrogen species, RNS) Azot oksit (NO) Azot dioksit (. NO 2 ) Peroksinitrit (ONOO - ) Reaktif klor türleri (reactive chlorine species) Hipoklorik asit (HOCl)
Antioksidanlar, bu reaktif türlerin olumsuz etkilerini önemli ölçüde azaltabilen bileģiklerdir 2. Antioksidanlar, yiyeceklerde veya vücutta düģük deriģimlerde bulunduğu zaman, oksidasyonu önemli derecede engelleyen veya geciktiren maddelerdir 4. 4. HALLIWELL, B., AESCHBACH, R., LÖLIGER, J., ARUOMA, O. I., 1995, The characterization of antioxidants, Food and Chemical Toxicology, 33, 601-617.
DOĞAL ANTİOKSİDANLAR C Vitamini (Askorbik asit) E Vitamini Karotenoidler (A vitamini öncülleri) Fenolik Bileşikler Fenolik Asitler Flavonoidler Fenolik Polimerler (Tanenler)
FENOLĠK ASĠTLER Hidroksisinnamik Asitler Hidroksibenzoik Asitler p-kumarik asit Kafeik asit Ferulik asit Gallik Asit Protokateşuik Asit Klorojenik asit Sinapik asit p-kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit, klorojenik asit ve sinapik asit in kimyasal yapıları Vanilik Asit Gallik, protokateşuik ve vanilik asit in kimyasal yapıları
FLAVONOİDLER Flavonoidler Antoksantinler Antosiyaninler Flavonlar Flavonoller Flavonoidlerin genel yapısı Flavanoller Flavanonlar İzoflavonlar
Apigenin, luteolin ve krisin in kimyasal yapıları Kuersetin, kamferol, mirisetin ve izoramnetin in kimyasal yapıları
Kateşin, epikateşin, epigallokateşin in kimyasal yapıları
Hesperetin ve naringenin in kimyasal yapıları Genistein ve daidzein in kimyasal yapıları
Antosiyanidinlerin kimyasal yapısı Antosiyanidin Siyanidin Malvidin Apigenidin Delfinidin Siyanidin, malvidin, apigenidin ve delfinidin in kimyasal yapıları
Fenolik Polimerler (Tanenler) n=0 epikateşin dimer (prosiyanidin B2); n=1 epikateşin trimer; n=2 epikateşin tetramer; n 2 epikateşin oligomer Prosiyanidinler in genel kimyasal yapısı
Polifenollerin kronik dejeneratif hastalıklara, özellikle kalp-damar hastalıklarına karģı koruyucu etkisini destekleyen bilimsel kanıtların sayısı hızla artmaktadır 5,6. Bu nedenle meyveler, sebzeler, tahıllar ve tıbbi bitkilerin fenolik bileģenlerinin ayrı ayrı tanımlanması, miktarlarının belirlenmesi, keza toplam antioksidan kapasitelerinin tayini, önemli ve güncel araģtırma konularıdır 7,8. 5. KAY, C.D., 2010, The futture of flavonoid research, Br. J. Nutr., 104, S91-S95. 6. HOOPER, L., et al., 2008, Flavonoids, flavonoid-rich foods, and cardiovascular risk: a meta analysis of randomized controlled trials, Am. J. Clin. Nutr.. 88, 38-50. 7. LEE, K.W., 2003, Major phenolics in apple and their contribution to the total antioxidant capacity, J. Agric. Food Chem., 51, 6516-6520. 8. US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, 2009, USDA National Nutrient Database for Standard Reference, http://www.ars.usda.gov
TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN YÖNTEMLERİ Elektron Aktarımına Dayalı Toplam Antioksidan Kapasite Yöntemleri CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) Ġyonu Ġndirgeyici Antioksidan Kapasite) Yöntemi TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks EĢdeğeri Antioksidan Kapasite) / ABTS Yöntemi FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power; Demir(III) Ġyonu Ġndirgeyici Antioksidan Gücü) Yöntemi DPPH Yöntemi
Hidrojen Atomu Aktarımına Dayalı Toplam Antioksidan Kapasite Tayin Yöntemleri TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter; Toplam Radikal Tutucu Antioksidan Parametre) Yöntemi ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity; Oksijen Radikal Absorplama Kapasitesi) Yöntemi Luminol Yöntemi TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity; Toplam Oksiradikal Süpürme Kapasitesi) Yöntemi Diklorofloresin-diasetat (DCFH-DA) Yöntemi Fikoeritrin (PE) Esaslı Yöntem Krosin Yöntemi
UYGULANAN YÖNTEMLER Spektrofotometrik Toplam Antioksidan Kapasite CUPRAC yöntemi ABTS/HRP yöntemi Kromatografik RP-HPLC yöntemi Toplam Fenol İçeriği Folin-Ciocalteu Yöntemi Toplam Flavonoid İçeriği AlCl 3 / KAc Yöntemi AlCl 3 / NaNO 2 Yöntemi Toplam Antosiyanin İçeriği Farklı ph Yöntemi
CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) İyonu İndirgeyici Antioksidan Kapasite) Yöntemi Apak ve arkadaģlarının 9 geliģtirdiği bu yöntemde, 2,9- dimetil-1,10-fenantrolin (Neokuproin-Nc) in Cu(II) ile oluturduğu bakır(ii)-neokuproin kompleksinin (Cu(II)-Nc), 450 nm de maksimum absorbans veren bakır(i)-neokuproin [Cu(I)-Nc] kelatına (ġekil 2.16) indirgenme yeteneğinden yararlanarak antioksidan kapasite hesaplanmaktadır. 9. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S.E., 2004, Novel total antioxidant capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC Method, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52 (26), 7970-7981.
(A) Cu(II)-Nc, (B) Cu(I)-Nc komplekslerinin spektrumları n Cu(Nc) 2 2+ + Ar(OH) n n Cu(Nc) 2 2+ + Ar(=O) n + n H +
CUPRAC Yöntemi Normal Yöntem 1 ml Cu(II) klorür + 1 ml Neokuproin + 1 ml Amonyum Asetat + x ml Antioksidan çözeltisi + 1 x ml Bidistile su Oda sıcaklığı 30 dakika A 450 nm
Ġnkübasyonlu Yöntem 1 ml Cu(II) klorür + 1 ml Neokuproin + 1 ml Amonyum Asetat + x ml Antioksidan çözeltisi + 1 x ml Bidistile su 50 0 C 30 dakika Soğutma A 450 nm
TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks Eşdeğeri Antioksidan Kapasite) / ABTS Yöntemi Troloks eģdeğeri antioksidan kapasite olarak ifade edilen TEAC/ABTS yöntemi, ilk olarak Miller ve arkadaģları 10,11 tarafından geliģtirilmiģtir. Bu yöntem; 2,2 -azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat) (ABTS) kromojen radikal katyonunun absorbansının, antioksidanlar tarafından inhibisyonunu temel alır. Antioksidanlar varlığında ABTS.+ radikal katyonunun absorbansında belirli bir süre içindeki azalmadan yararlanarak toplam antioksidan kapasite troloks cinsinden bulunur. 10. MILLER, N.J., DIPLOCK, A.T., RICE-EVANS, C., DAVIES, M.J., GOPINATHAN, V., MILNER, A., 1993, A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates, Clin. Sci., 84, 407-412. 11. MILLER, N.J., RICE-EVANS, C., 1994, Total antioxidant status in plasma and body fluids, Methods in Enzymology, 234, 279-293.
ABTS.+ radikal katyonunun absorbsiyon spektrumu ABTS.+ radikal katyonu 660, 734 ve 820 nm de maksimum verir.
Cano ve arkadaģları 12 tarafından hidrofilik bileģenlerin antioksidan aktivitesini ölçmek için ABTS/H 2 O 2 /HRP (horse radish peroxidase) enzimatik sistemi geliģtirilmiģtir. Bu yöntemde ABTS radikal katyonu (ABTS.+ ) enzimatik olarak oluģturulur ve antioksidan veya örnek çözelti bu reaksiyon ortamına ilave edilir. Sonuçlar ABTS.+ radikal katyonunun yok olması yani absorbansının düģüģü ile elde edilir. 12. CANO, A., HERNÀNDEZ-RUÍZ, J., GARCÍA-CÀNOVAS, F., ACOSTA, M., ARNAO, M.B., 1998, An endpoint method for estimation of the total antioxidant activity in plant material, Phytochemical Analysis, 9 (4), 196-202.
ABTS / HRP Yöntemi 0.5 ml ABTS + 0.5 ml H 2 O 2 + 0.5 ml HRP 5 dakika bekleme x ml Örnek + 0.5 x ml Etanol 5 dakika bekleme A 730 nm A = A Radikal çözeltisi - A Örnek Çözeltisi Radikal çözeltisi; örnek yerine örnek çözücüsü içeren çözeltidir.
TOPLAM FENOL ĠÇERĠĞĠ TAYĠN YÖNTEMĠ Folin Ciocalteu Yöntemi Bu yöntem, Singleton ve arkadaşları 13,14 tarafından toplam fenolik içeriği ölçmek için geliştirilmiştir. Yöntemin temeli, fenolik bileşiklerin Folin Ciocalteu ayıracı (FCR) ile sadece bazik ortamda reaksiyon vermesine dayanmaktadır. Toplam fenolik bileşenlerin tayin yöntemi olarak bilinen Folin- Ciocalteu ayıracı (fosfomolibdik fosfotungstik asit) kullanılan bu yöntem, gerçekte örneğin indirgenme kapasitesini tayin etmektedir. 13. SINGLETON, V.L., ROSSI, J.A., 1965, Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents, American Journal of Enology and Viticulture, 16, 144-158. 14. SINGLETON, V.L., ORTHOFER, R., LAMUELA-RAVENTOS, R.M., 1999, Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent, Methods in Enzymolology, 299, 152-178.
Lowry A: 0,1 M NaOH içinde % 2 (w/v) Na 2 CO 3 Lowry B: % 1 (w/v) NaKC 4 H 4 O 6 içinde % 0,5 (w/v) CuSO 4 Lowry C: 50 ml Lowry A + 1 ml Lowry B x ml Örnek + (2-x) ml distile su + 2,5 ml Lowry C oda sıcaklığı 10 dakika 0,25 ml Folin-Ciocalteu Reaktifi (1:3, v/v) oda sıcaklığı 30 dakika A 750 nm Toplam fenol içeriği, genellikle gallik asit eģdeğeri olarak hesaplanır.
TOPLAM FLAVONOĠD ĠÇERĠĞĠ TAYĠN YÖNTEMLERĠ Alüminyum Klorür/Potasyum Asetat Spektrofotometrik Yöntemi Alüminyum klorür, flavon ve flavonol grubu bileģiklerin C-4 keto grubu ve C-3 veya C-5 hidroksil gruplarından biriyle kararlı bir kelat oluģturmaktadır (Al-Flavon veya Al-Flavonol kompleksi). Bununla birlikte alüminyum, flavonoid grubu bileģiklerin A ve B halkalarındaki orto-dihidroksi gruplarıyla da kararsız kompleksler oluģturmaktadır.
Al(III) un kuersetin ile oluşturduğu komplekslerin kimyasal yapısı
Yöntem; etanol, alüminyum(iii) klorür çözeltisi ve potasyum asetat çözeltilerinin karıģtırılmasından sonra, üzerine flavonoid çözeltisinin (flavon, flavonol veya isoflavon bileģikleri) ilave edilmesi ve bunu takip eden 30 dakika sonunda referansa karģı 415 nm de absorbans değerlerinin ölçülmesinden ibarettir 15. 15. R. WOISKY, A., SALATINO, 1998, Analysis of propolis: some parameters and procedures for chemical quality control, J. Apic. Res., 37, 99-105.
AlCl 3 /KAc Yöntemi 16 x ml Örnek + 1.5 ml Etanol + 0.1 ml %10 AlCl 3 + 0.1 ml 1 M CH 3 COOK + (3.3 x) ml distile su oda sıcaklığı 30 dakika A 427 nm 16. CHANG, C.C., YANG, M.H., WEN, H.M., CHERN, J.C., 2002, Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis by Two Complementary Colorimetric Methods, Journal of Food and Drug Analysis, 10 (3), 178-182.
Alüminyum Klorür/Sodyum Nitrit Yöntemi Jia Zhishen ve diğerleri 17 tarafından rapor edilen AlCl 3 /NaNO 2 yönteminde toplam flavonoid içeriği, alüminyum klorür ve sodyum nitrit ayıraçları kullanılarak, alkali ortamda pembe renkli flavonoidalüminyum kompleksinin meydana gelmesiyle belirlenmiģtir. 17. ZHISHEN, J., MENGCHENG, T., JIANMING, W., 1999, The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals, Food Chem., 64, 555-559.
x ml Örnek + (3.4 x) ml distile su + 0.2 ml %5 NaNO 2 oda sıcaklığı 5 dakika 0,4 ml %10 AlCl 3.6H 2 O oda sıcaklığı 20 dakika 1 ml 1 M NaOH hemen A 510 nm AlCl 3 /KAc ve AlCl 3 /NaNO 2 yöntemleriyle bulunan toplam flavonoid içerikleri, genellikle kuersetin eģdeğeri olarak hesaplanır.
TOPLAM ANTOSĠYANĠN ĠÇERĠĞĠ TAYĠN YÖNTEMĠ Farklı ph Yöntemi 18 Antosiyanin pigmentleri, ph taki değiģim ile farklı absorbans spektrumlarına sahip tersinir yapısal dönüģümlere uğrarlar. ph 1.0 de renkli oksonyum türü ve ph 4.5 da renksiz hemiketal türü hakimdir. Farklı ph yöntemi bu duruma dayanır 19. 18. WROLSTAD, R.E., DURST, R.W., LEE, J., 2005, Tracking color and pigment changes in anthocyanin products, Food Science andtechnology, 16, 423-428. 19. WROLSTAD, R.E., ACREE, T.E., DECKER, E.A., PENNER, M.H., REID, D.S., SCHWARTZ, S.J., SHOEMAKER, C.F., SMITH, D., SPORNS, P., 2005, Handbook of Food Analytical Chemistry: Water, Proteins, Enzymes, Lipids, and Carbohydrates, A John Wiley&Sons, Inc., New Jersey, 0-471-71817-3.
ph 1.0 ve ph 4.5 tamponlarında saflaştırılmış turp antosiyaninlerinin (açillenmiş pelargonidin-3-soforozit-5-glukozit türevleri) spektral karakteristikleri
Farklı ph değerlerinde antosiyaninlerin baskın yapısal türleri
Wrolstad ve arkadaģlarının 18 geliģtirdiği bu yöntemde örnekler sulu ph 1.0 ve 4.5 tamponları ile seyreltilir ve absorbans ph 1.0 çözeltisinin maksimum absorbansının dalga boyunda ölçülür. Örnek matrikslerindeki baģlıca antosiyaninin (çoğunlukla siyanidin- 3-glukozit) molekül ağırlığını ve molar absorplama katsayısını kullanarak toplam antosiyanin içeriği hesaplanır.
ph 1.0 Tamponu: 125 ml 0.2 M KCl + 375 ml 0.2 M HCl ph 4.5 Tamponu: 400 ml 1 M CH 3 COONa + 240 ml 1 M HCl + 360 ml H 2 O Örnekler, ph 1.0 ve ph 4.5 tamponları ile seyreltilir. Çözeltilerin absorbansları 510 ve 700 nm de ölçülür 18.
Toplam Antosiyanin (mg/l) = A x MW x DF X 10 3 ε x l MW = Molekül Ağırlığı DF = Seyreltme Faktörü ε = Molar absorplama katsayısı, L x mol 1 x cm 1 l = ışıma yolu (1 cm) A = (A 510nm - A 700nm ) ph1.0 - (A 510nm - A 700nm ) ph4.5 Molekül ağırlığı 449.2 ve molar absorptivitesi 26900 olan siyanidin-3-glukozit eşdeğeri olarak hesaplandı.
BULGULAR Tablo 1. CUPRAC VE ABTS yöntemlerine ait TEAC * katsayıları TEAC N TEAC I ABTS Askorbik asit 1.00 1.32 1.06 Hidroksibenzoik asitler Gallik asit 2.99 3.25 3.64 Hidroksisinnamik asitler Klorojenik asit 2.47 2.72 1.38 Kafeik asit 2.89 2.96 1.11 p-kumarik asit 0.55 1.00 1.63 Ferulik asit 1.20 1.23 2.16 Rozmarinik asit 5.65 6.02 2.30 Flavonlar Luteolin 2.90 3.14 1.01 Apigenin 0.27 0.82 0.65 * TEAC = ε Standart / ε Troloks
Tablo 1 (devam) Flavonoller Kuersetin 5.49 5.57 4.01 Mirisetin 4.27 4.79 3.43 Kamferol 1.47 1.92 0.86 Rutin 2.56 2.56 3.19 Izokuersitrin 3.14 3.60 3.21 Flavanoller KateĢin 3.09 3.56 4.56 EpikateĢin 4.04 4.80 4.58 Flavanonlar Naringenin - 2.28 0.64 Naringin 0.02 0.13 0.62 Hesperetin 0.99 1.05 1.11 Hesperidin 0.97 1.11 1.40 Dihidrokalkonlar Floridzin 1.47 2.99 1.83
Tablo 1 (devam) Prosiyanidinler Prosiyanidin B2 7.11 8.89 6.61 Antosiyanidinler Siyanidin klorür 4.56 6.87 5.00 Kuromanin klorür 4.80 5.87 4.58 Kerasiyanin klorür 4.80 5.94 4.59 Idaein klorür 4.70 5.25 3.58 Peonidin klorür 2.60 4.20 2.41 Peonidin-3-O-glukozit 3.40 4.56 3.75
Bitkiler (maydanoz, kereviz yaprağı, ısırgan otu) 20 Bitki -40 C Kurutulmuş (liyofilize) bitki örneği Öğütme Toz örnek Çözücü Ultrasonik banyo 15 ml 45 + 5 ml 45 + 5 ml 15 20.YILDIZ, L., SÖZGEN BAġKAN, K., TÜTEM, E., APAK, R., 2008, Combined HPLC CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity) assay of parsley, celery leaves, and nettle, Talanta, 77, 304 313. Ekstrakt (25 ml ye tamamlandı) Süzgeç kağıdı Süzüntü Mikrofiltrasyon Örnek (Analize kadar -20 0 C de bekletildi.)
Elma suları 21 Elma Kabuk soyulması Et Rendeleme Püre Bezden Süzme Posa + Su 5000 rpm de 15 santrifüj 21. KARAMAN, ġ., TÜTEM, E., SÖZGEN BAġKAN, K., APAK, R., 2010, Comparison of total antioxidant capacity and phenolic composition of some apple juices with combined HPLC CUPRAC assay, Food Chemistry 120, 1201 1209. Su fazı Mikrofiltrasyon Elma suyu örneği
Lahana 22 Lahana parçaları - 40 C Kurutulmuş (liyofilize) lahana örneği Öğütme Toz örnek ( 2 g ) Çözücü ultrasonik banyo 10 ml 40 + 10 ml 40 + 5 ml 30 Ekstrakt (25 ml ye tamamlandı) Süzgeç kağıdı Süzüntü Mikrofiltrasyon (GF/PET, 1.0/0.45µm mikrofiltre) 22. ENCU Sevinç, 2010, Yüksek Lisans Tezi, Ġ.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü,. Örnek (Analiz süresine kadar -20 0 C de saklandı.)
Tablo 2. Bitki, lahana ve elma sularının Toplam Antioksidan Kapasite (Total Antioxidant Capacity, TAC) değerleri (elma suları için mmol troloks L -1, bitki ve lahanalar için mmol troloks g -1 ) ÖRNEK CUPRAC N CUPRAC I ABTS MAYDANOZ 70% MeOH eks. 0.050 0.079 0.040 m-fosforik asit eks. 0.016 0.023 0.008 KEREVĠZ YAPRAĞI 70% MeOH eks. 0.148 0.180 0.087 ISIRGAN 70% MeOH eks. 0.076 0.097 0.058 ELMA SULARI King Luscious 8.26 11.4 5.32 Amasya 5.43 7.67 3.91 Ervin Spur 9.74 13.70 7.59 Sky Spur 5.85 9.06 4.55 Arap Kızı 4.70 7.77 3.08 Lutz Golden 3.39 5.78 2.84 Granny Smith 4.37 5.83 3.06
Tablo 2 (devam) ÖRNEK CUPRAC N CUPRAC I ABTS LAHANALAR Beyaz 0.021-0.017 Kırmızı 0.168-0.189 Brüksel 0.034-0.028 Kara 0.058-0.078
CUPRAC yöntemiyle TAC (mmol TR/g) Lahana Örneklerinin Spektrofotometrik Sonuçlarının Karşılaştırılması Lahana Ekstraktlarının Folin-CUPRAC Korelasyonu 0,25 0,2 0,15 y = 0,4467x - 0,0152 R 2 = 0,9972 0,1 0,05 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Toplam fenolik madde içeriği (mmol GA/g)
CUPRAC yöntemiyle TAC (mmol TR/g) Lahana Ekstraktlarının AlCl 3 /CH 3 COOK-CUPRAC Korelasyonu 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 y = 0,0241x + 0,0013 R 2 = 0,751 0,06 0,04 0,02 0 0 1 2 3 4 5 6 Toplam flavonoid içeriği (mmol QR/g) x 10 3
CUPRAC yöntemiyle TAC (mmol TR/g) Lahana Ekstraktlarının AlCl 3 /NaNO 2 - CUPRAC Korelasyonu 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 y = 0,0043x + 0,0197 R 2 = 0,9842 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Toplam flavonoid içeriği (mmol QR/g) x 10 3
Kromatografik Analiz HPLC Analizi Maydanoz, kereviz yaprağı ve ısırgan otundaki fenolik bileģenler için geliģtirilen HPLC metodu (1); Mobil faz: Metanol (A) % 0.2 o-h 3 PO 4 içeren bidistile su (B) 8 dak 7 % (A), eğim (0.0); 8-13 dak 30 % (A), eğim ( 4.0); 13-48 dak 66 % (A), eğim (1.0); 48-55 dak 75 % (A), eğim ( 4.0). AkıĢ hızı 1 ml / dakika, Dedeksiyon (belirleme) dalga boyu 280 nm. Kolon C18
Elma suyundaki fenolik bileģenler için geliģtirilen HPLC metodu (2); Mobil faz: Metanol (A) % 0.2 o-h 3 PO 4 içeren bidistile su (B) 5 dakika % 30 (A), eğim (0.0) 35 dakika % 66 (A), eğim (1.0). AkıĢ hızı 1 ml / dakika, Dedeksiyon (belirleme) dalga boyu 280 nm. Kolon C18
Askorbik asit, malik asit ve fumarik asit analizi için geliģtirilen HPLC metodu (3); Mobil Faz: Metanol (A) % 0.2 o-h 3 PO 4 içeren bidistile su (B). 3 dakika % 2 (A), eğim (0,0) 4 dakika % 7 (A), eğim (4,0) 3 dakika % 7 (A), eğim (0,0). AkıĢ hızı 1 ml/dakika, Dedeksiyon (belirleme) dalga boyu 215 nm. Kolon C18
Isırgan otunun %70 (v/v) metanoldeki ekstraktının kromatogramı 1: KateĢin; 2: Klorojenik asit
Elma suları King Luscious elma suyunun kromatogramı 1: KateĢin + Prosiyanidin B2; 2: Klorojenik asit; 3: EpikateĢin; 4: Kafeic asit; 5: Floridzin Amasya elma suyunun kromatogramı 1: KateĢin + Prosiyanidin B2; 2: Klorojenik asit; 3:EpikateĢin; 4: Kafeic asit; 5: Floridzin
Sky Spur elma suyunun kromatogramı 1: KateĢin + Prosiyanidin B2; 2:Klorojenic asit; 3: EpikateĢin; 4: Kafeik asit; 5: Floridzin Ervin Spur elma suyunun kromatogramı 1: KateĢin + Prosiyanidin B2; 2:Klorojenik asit; 3: EpikateĢin; 4: Kafeik asit; 5: Floridzin
Lutz Golden elma suyunun kromatogramı 1: KateĢin + Prosiyanidin B2; 2:Klorjgenik asit; 3: EpikateĢin; 4: Kafeik asit; 5: Floridzin. Arap Kızı elma suyunun kromatogramı 1: Kateġin + Prosiyanidin B2; 2:Klorojenik asit; 3: EpikateĢin; 4: Kafeik asit; 5: Floridzin
Tablo 3: Elma sularının içerdiği fenolik bileşen miktarları (mg L -1 ) ÖRNEK KATEŞİN KLOROJENİK ASİT EPİKATEŞİN KAFEİK ASİT FLORİDZİN TOPLAM King Luscious 115.30 276.36 16.63 79.09 12.43 499.81 Amasya 89.41 126.84 43.54 27.20 6.61 293.60 Ervin Spur 81.39 111.25 66.76 20.72 20.13 300.25 Sky spur 9.09 72.99 45.28 21.80 11.80 160.16 Arap kızı 67.52 242.30 28.04 12.14 0.52 350.52 Lutz Golden 41.62 71.92 11.58 8.22 3.57 136.91 Granny Smith 76.77 41.10 3.38 3.04 1.15 125.44
Elma suları içeriklerine göre sıralandığında; KateĢin açısından King Luscious Amasya Ervin Spur Granny Smith Arap kızı Lutz Golden Sky Spur Klorojenik asit açısından King Luscious Arap Kızı Amasya Ervin Spur Sky Spur Lutz Golden Granny Smith EpikateĢin açısından Ervin spur Sky Spur Amasya Arap Kızı King Luscious Lutz Golden Granny Smith
Kafeik asit açısından King Luscious Amasya Sky Spur Ervin Spur Arap Kızı Lutz Golden Granny Smith Floridzin açısından Ervin Spur King Luscious Sky Spur Amasya Lutz Golden Granny Smith Arap Kızı
Askorbik asit miktarlarına göre elma suları Sky Spur Ervin Spur King Luscious Amasya Arap Kızı, Lutz Golden ve Granny Smith elma sularında ise malik asit miktarı çok yüksek olduğu için askorbik asit miktarı belirlenememiģtir.
Elma suyu örneklerinin toplam antioksidan kapasite sıralaması: (CUPRAC ve ABTS) Ervin Spur King Luscious Sky Spur Amasya Arap Kızı Granny Smith Lutz Golden
BİRLEŞTİRİLMİŞ HPLC-CUPRAC YÖNTEMİ: Sadece kromatografik ayırımla, gıdaların hem antioksidan bileģenleri hem de toplam antioksidan kapasiteleri açısından değerlendirilmesine olanak sağlayan yöntem HPLC de belirlenen deriģimlerin sırasıyla CUPRAC-normal, ve CUPRAC-inkübasyonlu yöntemleriyle elde edilen TEAC katsayıları ile çarpılmasıyla hesaplanan kapasiteyi ifade etmektedir.
(Antioksidan Kapasite) Toplam = TEAC i C i : i- bileģeninin HPLC yoluyla bulunan deriģimi TEAC i : i- bileģeninin seçilen kapasite ölçüm yöntemine göre TEAC katsayısı
Tablo 4. BirleĢtirilmiĢ HPLC-CUPRAC yöntemiyle hesaplanan TAC değerlerinin deneysel TAC değerlerine göre % karģılıkları ÖRNEK CUPRAC N (%) CUPRAC I (%) ISIRGAN 70% MeOH eks. 81 71 ELMA SULARI King Luscious 71 63 Amasya 77 71 Ervin Spur 69 66 Sky Spur 72 84 Arap Kızı 75 53 Lutz Golden 42 29 Granny Smith 40 36
BirleĢtirilmiĢ HPLC-CUPRAC yöntemi, ayrıca toplam antioksidan kapasite tayin yöntemi uygulamak gerekmeksizi karmaģık örneklerin hem antioksidan bileģenleri hem de toplam antioksidan kapasiteleri açısından gerçekçi bir Ģekilde karģılaģtırılmalarını olanaklı kılar. Bu karģılaģtırma, HPLC ile bulunan fenolik bileģiklerin kütlelerinin toplanması yoluyla gerçekleģtirilen karģılaģtırmalardan kesinlikle daha anlamlıdır 23-26. 23. Gliszczynska-Swiglo, A. and Tyrakowska, B., 2003, Quality of commercial apple juices evaluated on the basis of the polyphenol content and the TEAC antioxidant activity, J. Food Sci., 68, 1844 1849. 24. Sultana, B. and Anwar, F., 2008, Flavonols (kaempeferol, quercetin, myricetin) contents of selected fruits, vegetables and medicinal plants, Food Chemistry, 108, 879 884. 25. Markowski, J., & Płocharski, W., 2006, Determination of phenolic compounds in apples and processed apple products. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 14, 133 142. 26. Wu, J., Gao, H., Zhao, L., Liao, X., Chen, F., Wang, Z.,. Hu, X., 2007, Chemical compositional characterization of some apple cultivars. Food Chemistry, 103, 88 93.
Sentetik karıģımlar için birleģtirilmiģ HPLC-CUPRAC değerleri, deneysel CUPRAC değerlerine çok yakındır. Bu bulgu, bir karıģımdaki bileģenlerin tanımlanabilmesi ve miktarlandırılabilmesi durumunda, toplam kapasiteye katkılarının doğru olarak hesaplanabileceğinin kanıtıdır. Böylece sadece iyi bir kromatografik ayırımla bitkisel gıdaları hem tek tek fenolik bileşikleri hem de toplam antioksidan kapasiteleri açısından karşılaştırmak olası hale gelir.
İlginize TEŞEKKÜRLER