Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 11 Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real-Time) PCR ile Nicel Saptanması N. Foti WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 2 İçindekiler Bölüm 11 Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real-Time) PCR ile Nicel Saptanması Deneysel 3 Giriş 3 ABI PRISM 7700 kullanarak Eş Zamanlı (Real-Time) PCR 3 LightCycler (Roche) kullanılarak RT-PCR 8 Kaynaklar 14

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 3 Deneysel Giriş Aşağıdaki protokoller, özel bir GD soya (Roundup Ready soya) vakası için ham ve işlenmiş materyallerde miktar tayini için kullanılan eş zamanlı PCR yöntemleridir. Bu eş zamanlı PCR ölçümleri amplikon üretimini florasan kullanarak eş zamanda tespit eden iki farklı PCR termal döngü cihazı ile gerçekleştirilmiştir: ABI PRISM 7700 SDS (Applied Biosystems) ve LightCycler (Roche). Eş zamanlı PCR, genetik değişikliğe uğramış soya varlığını gösteren bir DNA hedef sekansına ek olarak bir de endojen referans DNA (soyaya özgü) sekansının amplifiye edilmesinde kullanılır. Her iki ölçüm de her biri özel DNA primerleri ve boya-işaretli problar içeren iki farklı PCR sisteminden oluşur. Bir PCR sistemi GDO ya spesifik DNA sekansını tespit ederken, diğeri GD ve GD olmayan soya tespit edilmesinde miktarsal referans olarak görev yapmak üzere tasarlanmış bir endojen referans sistemidir. Not: Bu kitapçığın içerdiği protokoller eğitici amaçlarla seçilmişlerdir ve eş zamanlı (real-time) PCR yöntemi kullanarak yapılan GDO miktar tayini çalışmalarının temel örnekleri olarak düşünülmelidirler. En son geliştirilen ve onaylanan protokoller hakkında bilgi edinmek için uygun kaynakların ve literatürün periyodik olarak gözden geçirilmesini tavsiye ederiz. Bu protokollerin bizim laboratuvarımızda bulunan aletlere göre seçilmiş olduğuna lütfen dikkat ediniz. JRC ve WHO, hiç bir şirketin ya da markanın kullanılmasını özel olarak desteklememektedir. ABI PRISM 7700 kullanarak Eş Zamanlı (Real-Time) PCR RR soyaya spesifik RT- PCR için protokol: çok hedefli (multiplex) PCR metodu Bu metod, lektin referans geni ve RR soyaya eklenmiş olan gen kasetinin bir bölümünün Multipleks PCR analizi ile amplifikasyonu ve nicel saptanmasından oluşur (Foti ve ark., 2006). TaqMan lektin ve RR probları sırasıyla VIC ve FAM boyalarıyla işaretlenmiştir, bu da aynı tüpte birden fazla hedefin amplifikasyonunu tespit etmeyi mümkün kılar. Reporter boya FAM emisyonu, farklı maksimal yayılım dalga boyu

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 4 özelliği ile VIC den ayrılabilir. ABI PRISM 7700 SDS emisyonu farklı dalga boylarında olan birden fazla boyayı tespit etme özelliğine sahiptir. RR soyaya karşılık gelen boya miktarı (FAM), her örnekte tespit edilen bitki materyaline karşılık gelen boya (VIC) miktarı ile normalize edilir. Böylelikle tekrar örnekleri için ortalaması alınan CT değerleri ortaya çıkar. Bu değerler bilinen RR soya konsantrasyon standartlarından elde edilen kalibrasyon eğrisi ile hesaplanmış olan CT değerleri ile karşılaştırılır ( karşılaştırmalı CT metodu veya CT ). Bu prosedür çeşitli ham madde, katkı maddesi ve soya içeren gıdalarda (yoğurt, un, lesitin, soya içeceği) başarıyla uygulanmıştır. Bu metodun analitik performansı birçok yeterlilik testi sırasında başarıyla gözlemlenmiştir (FAPAS, GIPSA). Alet ve malzemeler ABI PRISM 7700 Tespit Sistemi (Applied Biosystems) MicroAmp Optik 96-Kuyucuk Reaksiyon Plateleri (Cat No. N801-0560) MicroAmp Optik kapaklar (Cat No. N801-0935) TaqMan Universal PCR Master karışım (Cat No. 4304437) 2X içeriği: TaqMan Tamponu 2X AmpliTaq Gold DNA Polimeraz (5U/µl), AmpErase UNG (1U/ml), dntp ler 200 µm dutp ile, Pasif Referans 1 Mikrosantrifüj 15 ml konik tüpler için soğutmalı santrifüj Mikropipetler Vorteks karıştırıcı Reaksiyon tüpleri için taşıyıcı raf 1,5ml mikrosantrifüj tüpleri 15 ml polypropylene konik santrifüj tüpleri Nükleaz ari su Referans genine(lektin) özel primerler (Le-F ve Le-R) ve prob (Le-Probe) Transgene özel primerler (RR-F ve RR-R) ve prob (RR-Probe)

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 5 Referans geni primerleri ve probunun özellikleri Le-F TCC ACC CCC ATC CAC ATT T Uzunluk (bp) 19 Mol. Ağırlık 5586.0 Le-R GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA Uzunluk (bp) 24 Mol. Ağırlık 7532 Le-Probe 5 -(VIC)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-(TAMRA)-3' Uzunluk (bp) 23 Mol. Ağırlık 7019.0 Transgen primerleri ve probunun özellikleri RR-F GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT Uzunluk (bp) 23 Mol. Ağırlık 7014 RR-R GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C Uzunluk (bp) 25 Mol. Ağırlık 7712 RR-Probe 5 -(FAM)-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG-(TAMRA)-3' Uzunluk (bp) 33 Mol. Ağırlık 10137 Master karışım hazırlanması İşlem için gerekli ayraçları ihtiyaç duyulan miktarlarda çözüp, yavaşça karıştırın ve santrifuj edin. Çözülmüş bileşenleri buz içinde tutun.

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 6 Buz içindeki tüpün içine, master karışım hazırlamak için gerekli bileşenleri aşağıda belirtilen sırayla (DNA dışında) ekleyin. Ekstrakte edilen her DNA üç kere analiz edilir. Solüsyonun akıcılığına bağlı pipetleme hatalarına karşı dört fazla reaksiyon karışımı hazırlandığına dikkat edin. Tablo 1. Çok hedefli (multiplex) PCR ölçümünün bir plate için master karışım hazırlanması Son Konsantrasyon Bir örnek için µl Bir örnek için master karışım (3 tekrar) Bir plate için master karışım (32+4 örnek) Steril, deiyonize su 18,3 54,9 1976,4 TaqMan Universal 1X 25 75 2700 Master karışım 2X Primer Le-F(20µM) 40 nm 0,1 0,3 10,8 Primer Le-R(20µM) 40 nm 0,1 0,3 10,8 Primer RR-F(20µM) 100 nm 0,25 0,75 27 Primer RR-R(20µM) 100 nm 0,25 0,75 27 Le-Prob(10µM) 100 nm 0,5 1,5 54 RR-Prob (10µM) 100 nm 0,5 1,5 54 DNA 50-250 ng 5 15 Toplam 50 150 Yavaşça karıştırın ve kısaca santrifüjleyin. Test edilecek her DNA örneği için bir tane 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü hazırlayın: standart eğri örnekleri (CRM-RR soya % 0,1; 0,5; 1; 2; 5), bilinmeyen örnekler ve kontrol örnekleri (%0 RR soya, RR soya DNA sı ve hedef içermeyen kontrol). Her mikrosantrifüj tüpüne 3 tekrar için gerekli master karışım miktarını ekleyin (135 µl master karışım). Her tüpe 3 tekrar için uygun miktarda DNA ekleyin (15 µl DNA). Her tüpü en az üç kere yaklaşık 10 sn vorteksleyin. Bu adım her örneğin 3 tekrarı (replikalar) arasındaki farkı en aza indirmek için önemlidir. Çok kısa santrifüjleyin. 96-well reaksiyon tepsisini yerleştirin ve yatay olarak soldan sağa her kuyucuğa 50 µl ekleyin. Master karışımı dikey kuyu sütunlarından her birine eklendikten sonra optik kapaklarla kapatın. Not: optik kapağın üzerine yazmayınız ve kapağa dokunmayınız. Yüklenen master karışım sıvısının kuyuların tabanında olduğuna, kapakta ve kuyu kenarında damla ve baloncuk olmadığına emin olun. Reaksiyon tepsisini ABI PRISM 7700 cihazına yerleştirin; her kuyu için örnek türünü düzenlemek için erkandan yeni bir tepsi ayar penceresi açın: VIC boya için IPC, FAM boya için UNKN örnek türü seçilir. Tablo 2 de belirtildiği gibi cihazı başlatın.

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 7 Tablo 2. RR soya için ABI PRISM 7700 SDS de çok hedefli (multiplex) program Set: Eş zamanlı (real time) PCR modu 50µl reaksiyon hacmi Aşama Kademe TC Zaman(sn) Okuma Döngüler 1 UNG 50C 120 Yok 1X 2 İlk denatürasyon 95C 600 Yok 1X 3 Amplifikasyon Denatürasyon 95C 15 Yok 45X 4 Bağlanma ve 60C 60 Ölçüm Uzama Veri analizleri ve sonuçların değerlendirilmesi Çalışılan her örneğin reporter boyasının C T değerini hesaplamak için çalışmadan sonra veriler ABI PRISM 7700 SDS bilgisayar programı ile analiz edilir. Örneklerin SDS bilgisayar programının Plate Setup (tepsi ayarları) penceresinde doğru bir şekilde numaralandırılması önemlidir. Her kuyu Replicatea (tekrarlar) alanında özgün bir sayı ile numaralandırılmalıdır. Tekrarlarda örneklere aynı numara verilmelidir. Amplifikasyon çizim penceresine otomatik olarak ulaşabilmek için analiz menüsünden Analyse (analiz et) seçeneği işaretlenerek çalışılır. Eşik değer FAM ve VIC seviyeleri için ayarlanır. Çalışmayı analiz ettikten sonra elde edilen sonuçları excel dosyasına aktarılır. Aktarılan dosyalar Microsoft Excel programına açılı. Her kuyucuk için C T değeriyle birlikte FAM ve VIC boya seviyelerine ilişkin veri iki bloklu bir tabloda toplanır. C T (C T FAM - C T VIC) değerini hesaplamak için her tekrar grubunun C T (FAM) ve C T (VIC) ortalamaları hesaplanır. Her örnek için, derişim standart ayarlarından elde edilen C T ve log (%GDO) değerleri karşılaştırılıp, numunenin C T analizi sonucunda % GDO hesaplanır.

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 8 LightCycler (Roche) kullanılarak RT-PCR RR-soya spesifik RT-PCR için protokol Bu yöntem, iki bağımsız PCR reaksiyonunda, lektin referans geni ve RR soyaya aktarılmış transgenik gen kasetinin bir bölümü için miktar ölçümünden oluşur (BgVV, EU Tender Report, 2000). Bu iki PCR sistemi FAM la işaretlenmiş problar kullanır. Her örnek için GD soya ve referans gen (lektin geni) miktarı, transgen ve referans gen için gereğine uygun olarak hazırlanmış standart eğrilerden saptanır. GD soya içeriği, normalize edilmiş GD soya değerini belirlemek için referans gen miktarına bölünür. Cihaz ve Ayraçlar Roche LightCycler sistemi LightCycler örnek kapillerleri. Roche, Kat No 1909339 LightCycler kapiller adaptörü. Roche, Kat No 1909312 LightCycler FastStart DNA Master Hibridizasyon Probları. Roche, Kat No 3003248 İçeriği: FastStart Taq DNA Polimeraz, dntp karışımı (dttp yerine dutp ile) ve reaksiyon tampon solusyonu buffer, 10X kons.; PCR için uygun steril su Bovine serum albumin (BSA), nükleaz içermeyen (DNAaz & RNAaz içermeyen) örn. Promega Kat No. R9461 (1µg/µl) Platinum Taq DNA Polimeraz 5U/µl (10X buffer ve 50 mm MgCl2 ile beraber). Invitrogen- life technologies Kat No. 10966026 Mikrosantrifuj Miropipetler Vorteks karıştırıcı Reaksiyon tüpleri için taşıyıcı raf 1,5 ml mirosantrifuj tüpleri Nükleaz ari su Referans gene sözel primerler (GM1-F ve GM1-R) ve prob (GM1-Probe) Transgene özel primerler (GM2-F,GM2-R) ve prob (GM2-Probe)

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 9 Referans geni için primer ve prob özellikleri GM1-F 5'-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3' GM1-R 5'-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3' GM1-Probe 5'-(FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC -(TAMRA)-3' Transgen için primer ve prob özellikleri GM2-F 5'-CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3' GM2-R 5'-GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3' GM2-Probe 5'-(FAM)-CAA GCT GAC TCT AGC AGA TCT TTC (TAMRA)-3' Standart eğriler Her işlemde 5 farklı standart DNA seyreltmesi kullanıalrak iki standart eğri oluşturulur. Her standart kalibrasyon DNA sı için ın, her iki master karışımla birer reaksiyon gerçekleştirilir. Toplam soya ve GD materyali ölçümü için standart eğriler, %2 RR soya ile başlayıp, 0,1M, ph 8,0 TE tampon ile seyreltmek suretiyle azalan standart DNA solüsyonları ile oluşturulur. Standart eğrilerin ilk noktası için yaklaşık 100 ng DNA kullanılır. Tüm seyreltmeler ve derişimler Tablo 3 te özetlenmiştir.

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 10 Tablo 3. DNA miktarları ve standart eğri seyreltmeleri DNA miktarı Soya DNA % GD DNA % Seyreltme Faktörü (ng)/reaksiyon STD1 100 100 2 STD2 50 50 1 1:2 STD3 25 25 0,5 1:4 STD4 12,5 12,5 0,25 1:8 STD5 6,25 6,25 0,125 1:16 Master karışım hazırlanması İşlem için gerekli ayraçları ihtiyaç duyulan miktarlarda çözüp, yavaşça karıştırın ve santrifuj edin. Çözünmüş bileşenleri buz içinde tutun. Her sistem için master karışım hazırlamak üzere buz içindeki 1,5 ml mikrosantrifuj tüpünün içine, master karışım hazırlamak için bileşenleri aşağıda belirtilen sırayla (DNA dışında) ekleyin. Solüsyonun akıcılığına bağlı pipetleme hatalarına karşı iki fazla reaksiyon karışımı eklendiğine dikkat edin. Tablo 4. GM1 sistemi için master karışım hazırlanması Bileşenler Son konsantrasyon µl/reaksiyon Toplam µl (18 reaksiyon için) Platinum Taq pol.buffer 10X 1X 2 36 MgCl2 (50mM) 4mM 1,6 28,8 datp,dgtp,dctp,dttp(4mm) 0,8mM 4 72 GM1-F primer (20µM) 500mM 0,5 9 GM1-R primer (20µM) 500mM 0,5 9 GM1-prob (10µM) 200mM 0,4 7,2 BSA nükleaz free(1µg/µl) 0,1 mg/ml 2 36 Platinum Taq pol.(5u/µl) 0,8 U 0,16 2,9 Nükleaz ari su # 6,85 123,5 DNA 2 Toplam hacim: 18µl+2µl DNA 324,2µl (DNA hariç)

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 11 Tablo 5. GM2 sistemi için master karışım hazırlanması Bileşenler Son konsantrasyon µl/reaksiyon Toplam µl (18 reaksiyon için) Platinum Taq pol.buffer 10X 1X 2 36 MgCl2 (50mM) 4mM 1,6 28,8 datp,dgtp,dctp,dttp(4mm) 0,8mM 4 72 GM2-F primer (20µM) 500mM 0,5 9 GM2-R primer (20µM) 500mM 0,5 9 GM2-probe (10µM) 200mM 0,4 7,2 BSA nükleaz ari (1µg/µl) 0,1 mg/ml 2 36 Platinum Taq pol.(5u/µl) 0,8 U 0,16 2,9 Nükleaz ari su # 6,85 123,5 DNA 2 Toplam hacim: 18µl+2µl DNA 324,2µl (DNA hariç) Yavaşça karıştırın ve çok kısa santrifüjleyin. Test edilecek her DNA (standart eğri örnekleri ve bilinmeyen örnekler) örneği için iki (bir tane GM1 sistemi için ve bir tane GM2 sistemi için) 0,5 ml reaksiyon tüpü hazırlayın. Her reaksiyon tüpüne 2 tekrar için gerekli master karışım miktarını ekleyin (36 µl masterkarışım). Her tüpe 2 tekrar için uygun miktarda DNA ekleyin (4 µl DNA). Her tüpü en az üç kere yaklaşık 10 sn vorteksleyin. Bu adım bir örnek için tekrarlar arasındaki farkı en aza indirmek için önemlidir. Kapillerleri önceden soğutulmuş santrifuj adaptörüne yerleştirin. Şemada belirtilene göre her kapillere 20µl master karışım pipetleyin (Tablo 6 Tepsi kurulumu- yükleme sırası). Düşük hızda mikrosantrifujde çevirin (700 rpm). Bu adım reaksiyon karışım hacminin tamamının kapillerlerin ucunda konsantre olmasını sağlar. Kapillerleri LightCycler (Roche) carousel içine transfer edin. Tablo 7 de belirtildiği gibi cihazı başlatın.

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 12 Tablo 6. LightCycler carousel yükleme sırası: 1 den 16 ya GM1 sistemi, 17 den 32 ye GM2 sistemi. Rferans gen ve transgen (GDO) sistemi için her örnek çift çalışılmış. Pozisyon Örnek(%) Pozisyon Örnek(%) Pozisyon Örnek(%) 1 STD (100) 13 U2 25 STD (0.125) 2 STD (100) 14 U2 26 STD (0.125) 3 STD (50) 15 NTC 27 U1 4 STD (50) 16 NTC 28 U1 5 STD (25) 17 STD (2) 29 U2 6 STD (25) 18 STD (2) 30 U2 7 STD (12.5) 19 STD (1) 31 NTC 8 STD (12.5) 20 STD (1) 32 NTC 9 STD (6.25) 21 STD (0.5) 10 STD (6.25) 22 STD (0.5) 11 U1 23 STD (0.25) 12 U1 24 STD (0.25) Tablo 7. LightCycler programı Her adım için eğimi 20C/s oalarak ayarlayın Fluoresen gösterim modu F1/1 Denatürasyon: Döngü: Soğutma: Cycles: 1 Type: None Fluorescence Display Mode: F1/1 Segment Number Temp. Time Slope 2 Target Temp. Step Size Step Delay (Cycles) Acquisition Mode 1 96 C 120 sec 20 C/sec 0 C 0 C 0 None Cycles: 45 Type: Quantification Fluorescence Display Mode: F1/1 Segment Number Temp. Time Slope 2 Target Temp. Step Size Step Delay (Cycles) Acquisition Mode 1 95 C 5 sec 20 C/sec 0 C 0 C 0 None 2 60 C 15 sec 20 C/sec 0 C 0 C 0 Single 3 72 C 15 sec 20 C/sec 0 C 0 C 0 None Cycles: 1 Type: None Fluorescence Display Mode: F1/1 Segment Number Temp. Time Slope 2 Target Temp. Step Size Step Delay (Cycles) Acquisition Mode 1 40 C 30 sec 20 C/sec 0 C 0 C 0 None

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 13 Çalışma sırasında EDIT SAMPLE düğmesini tıklayarak, yükleme ekranında örnek adlarını girin. Tüm pozisyonları (kalibrator DNA da dahil) Unknown (Bilinmeyen)olarak belirtin. Data analizleri ve sonuçların değerlendirilmesi Data analizi için data analizi ön penceresinde Fluorescence F1/F2 yi seçin. Ölçüm için quantification düğmesine tıklayın. LightCycler bilgisayar programı ölçüm için iki farklı metod önerir: Second derivative Maximum metodu ve Fit Points metodu. RR soya DNA tespit kiti ile miktar tayini için tercihen Fit Points metodu kullanılır. Belirtilen ayarları kullanınız: baseline adjustment = Proportional ; number of points = 2. Standart eğriyi diğer tüm ilgili bilinmeyen reaksiyonlarla beraber gösterin. Step 2: Noise Band dosyasını açın. Noise band pozisyonunu 0,1 e getirin (aşağıdaki nota bakınız). Noise band elle veya Chance Graph Settings düğmesinin altındaki tuşa basarak hareket ettirilebilir. Bu tuş ile Manual Cursor Adjustment penceresi açılır ve cursor değeri 0,1 olarak ayarlanır. Step 3: Analysis dosyasını açın. Step 3: Analysis de çakışma noktaları, kalibrasyon standartlarının ve bilinmeyen DNA hedeflerinin ilgili konsantrasyonları hesaplanır. Standart eğrinin r-değerini kontrol edin. r 0,98 değeleri kabul edilebilir; r= 1 değeri optimaldir.

Roundup Ready Soya nın Eş Zamanlı (Real Time) PCR ile Nicel Saptanması 14 Kaynaklar EU Tender Report. (2000). Development of qualitative as well as quantitative detection methods to identify a genetic modification in soybean and maize products. Report of the EU Tender n. XXIV/98/A3/001. LightCycler Operator s Manual, version 3.0 (Roche Molecular Biochemicals). User Bulletin #2. Relative quantitation of gene expression. ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1997. User Bulletin #5. Multiplex PCR with TaqM VIC probes. ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1998. Foti, N., Onori, R., Donnarumma, E., De Sanctis, B., and Miraglia, M. (2006). Real- Time PCR multiplex method for the quantification of Roundup Ready soybean in raw material and processed food. European Food Research and Technology Journal 222, 209-216.