FARKLI RUMEN FUNGUSLARINA AİT SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ANALİZİ

T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI FARKLI RUMEN FUNGUSLARINA AİT SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ANALİZİ TANER YILDIZ YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Eylül-2008

T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI FARKLI RUMEN FUNGUSLARINA AİT SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ANALİZİ TANER YILDIZ YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Eylül-2008

T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI FARKLI RUMEN FUNGUSLARINA AİT SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ANALİZİ TANER YILDIZ YÜKSEK LİSANS TEZİ Kod No : Bu Tez 10/09/2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği/Oy Çokluğu ile Kabul Edilmiştir......... Yrd. Doç. Dr. Özlem Eren KIRAN Doç. Dr. Metin DIĞRAK Doç. Dr. Emin ÖZKÖSE DANIŞMAN ÜYE ÜYE Yukarıdaki imzaların adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Süleyman TOLUN Enstitü Müdürü Bu çalışma Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No:2007/3-14 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

İÇİNDEKİLER Taner YILDIZ İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... I ÖZET III ABSTRACT.. IV ÖNSÖZ... V ÇİZELGELER DİZİNİ.... VI ŞEKİLLER DİZİNİ. VII SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... IX 1. GİRİŞ.... 1 1.1. Rumenin Yapısı ve Rumen Mikrobiyal Ekosistemi. 1 1.2. Anaerobik Fungusların İzolasyonu ve Sınıflandırılması.. 3 1.3. Anaerobik Funguslarda Yaşam Döngüleri.... 5 1.3.1. Monosentrik Yaşam Döngüsü.... 5 1.3.2. Polisentrik Yaşam Döngüsü... 6 1.4. Bitki Hücre Duvarı Yapısında Bulunan Polimer Grupları.. 7 1.4.1. Selüloz..... 7 1.4.2. Lignin...... 8 1.4.3. Hemiselüloz... 9 1.4.3.1. Ksilan....... 9 1.4.4. Pektin...... 10 1.5. Bitki Hücre Duvarının Anerobik Funguslar Tarafından Yıkımı. 10 1.6. Tezin Amacı ve Kapsamı.. 11 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR... 12 2.1. Anerobik Fungusların Cins Düzeyinde Tanımlanmalarına Yönelik Çalışmalar... 12 2.1.1. Piromyces sp... 12 2.1.2. Caecomyces sp...... 12 2.1.3. Neocallimastix sp... 12 2.1.4. Anaeromyces sp... 13 2.1.5. Orpinomyces sp...... 13 2.1.6. Cyllamyces sp.. 13 2.2. Bitki Hücre Duvarının Yıkımına Yönelik Çalışmalar. 13 2.2.1. Selülazlar ve Glikosidazlar... 15 2.2.2 Ksilanazlar... 16 2.2.3. Pektinazlar.. 16 2.2.4. Lignin Parçalayıcı Enzimler... 17 2.2.5. Proteolitik Enzimler...... 17 3. MATERYAL VE METOT.. 19 3.1. Materyal. 19 I

İÇİNDEKİLER Taner YILDIZ 3.1.1. Kimyasallar 19 3.1.2. Aletler... 19 3.1.3. Dışkı Örnekleri... 19 3.2. Metot... 19 3.2.1. Anaerobik Besi Yeri... 19 3.2.1.1. Anaerobik Besi Yerinin Hazırlanması... 20 3.2.1.2. Kontaminasyonu Engelleyici Antibiyotik İlavesi 20 3.2.2. Anaerobik Fungusların İzolasyonu ve Saflaştırılması... 21 3.2.2.1. Anaerobik Fungusların İzolasyonu... 21 3.2.2.2. Anaerobik Fungusların Saflaştırılması. 21 3.2.2.3. Saf Kültürlerin Sıvı Azot Stoğuna Alınması..... 22 3.2.3. Anaerobik Fungusların Fibrolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi... 23 3.2.3.1. Hücre Ekstraktları ve Süpernatantlarının Hazırlanması... 23 3.2.3.2. Enzim Testi (Assay)... 23 3.2.4. Protein Tayini... 24 4. BULGULAR VE TARTIŞMA.... 25 4.1. Bulgular... 25 4.1.1. Anaerobik Fungusların İzolasyonu. 25 4.1.2. Protein Miktarının Belirlenmesi.. 27 4.1.3. Anaerobik Fungusların Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi. 29 4.1.3.1. Enzimlerin Çalışma Şartlarının Belirlenmesi.. 29 4.1.3.1.1. Enzimlerin Optimum Sıcaklıklarının Belirlenmesi... 29 4.1.3.1.2. Enzimlerin Optimum ph larının Belirlenmesi... 34 5. SONUÇ ve ÖNERİLER.. 41 KAYNAKLAR. 42 ÖZGEÇMİŞ. 49 II

ÖZET Taner YILDIZ T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET FARKLI RUMEN FUNGUSLARINA AİT SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ÖZET ANALİZİ TANER YILDIZ Danışman:Yrd. Doç. Dr. Özlem Eren KIRAN Yıl : 2008, Sayfa :49 Jüri :Yrd. Doç. Dr. Özlem Eren KIRAN (Başkan) Doç. Dr. Metin DIĞRAK Doç. Dr. Emin ÖZKÖSE Farklı bölgelerden toplanan ruminant hayvan dışkı örneklerinden anaerobik fungus izolasyonu yapılmış ve izolasyonu yapılan funguslardan Neocallimastix, Piromyces, Orpinomyces ve Caecomyces cinsleri saflaştırılmıştır. Neocallimastix, Piromyces, Orpinomyces ve Caecomyces cinslerinin selülaz ve ksilnaz enzim aktiviteleri için optimum ph ve sıcaklık değerleri incelenmiş ve bu değerlerin sırasıyla ph 6-7 ve 45-50 C arası olduğu tespit edilmiştir. Her 4 cins fungusun hücresel enzim aktivitelerinin yüksek olduğu belirlenmiştir.. Anahtar Kelimeler: Anaerobik rumen fungusları, izolasyon, saflaştırma, enzim aktivites, selülaz, ksilanaz III

ABSTRACT Taner YILDIZ T.R. UNIVERSITY OF KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOLOGY MSc THESIS ABSTRACT ANALYSES OF CELLULASE AND XYLANASE ENZYMES FROM VARIOUSE RUMEN FUNGI TANER YILDIZ Supervisor: Assist. Prof. Dr. Özlem Eren KIRAN Year : 2008, Page : 49 Jury : Assist. Prof. Dr. Özlem Eren KIRAN Assoc. Prof. Dr. Metin DIĞRAK Assoc. Prof. Dr. Emin ÖZKÖSE Feacal samples from different regions were used to isolate anaerobic rumen fungi 4 different species belong the genera, Neocallimastix, Piromyces, Orpinomyces and Caecomyces were isolated and purified. Enzymatic activities of these 4 isolates were determined. Optimum ph and tempareture for, celulase and xylanase of these 4 isolates were found 6-7 and 45-50 o C respectively. All enzymes of these isolates were found to be cell associated. Key Words : Anaerobic rumen fungi, isolation, purification, enzyme activity, cellulose, xylanase IV

ÖNSÖZ Taner YILDIZ ÖNSÖZ Tez konusunun belirlenmesi, çalışmanın yürütülmesi ve yazım aşamasında beni yönlendiren danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Özlem Eren KIRAN a ve hocam Doç. Dr. Metin DIĞRAK a, Çalışma sürem boyunca laboratuarlarının tüm imkanlarını kullanmama izin veren Doç. Dr. Emin ÖZKÖSE, Doç. Dr. M. Sait EKİNCİ ve Yrd. Doç. Dr. İsmail AKYOL hocalarıma, Fungusların izolasyonlarının yapılmasında ve enzim denemelerindeki yardımlarından dolayı Ar. Gör. Uğur ÇÖMLEKÇİOĞLU ve Ar. Gör. Bülent KAR a, farklı bölgelerden dışkı örneklerinin toplanması ve ulaştırılmasındaki yardımlarından dolayı Ar. Gör. Selahattin KİRAZ a, teşekkür ederim. Ayrıca, çalışmama katkılarından dolayı tüm Ziraat Fakültesi Zootekni Bölümü Biyoteknoloji ve Gen Mühendisliği Laboratuarı elemanlarına teşekkür ederim. Projeyi maddi olarak destekleyen KSÜ, BAPYB Başkanlığı na teşekkür ederim. Eylül /2008 KAHRAMANMARAŞ Taner YILDIZ V

ÇİZELGELER DİZİNİ Taner YILDIZ ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 1. Cins düzeyindeki Anaerobik fungusların morfolojik farklılıkları... 4 Çizelge 2. Anaerobik fungus cinsleri, türleri ve izolasyon kaynakları.. 5 Çizelge 3. Anaerobik fungus besi yeri içeriği... 20 Çizelge 4. Enzim Aktivitesinin Saptanmasında Kullanılan Solüsyonlar.. 23 Çizelge 5. Protein tayininde kullanılan solüsyonların içeriği... 24 Çizelge 6. İzole Edilip Cins Düzeyinde Tanımlanan Anerobik Funguslar... 25 Çizelge 7. Selüloz İçeren Ortamda Gelişen Fungusların Ürettikleri Protein Miktarı. 28 Çizelge 8. Ksilan İçeren Ortamda Gelişen Fungusların Ürettikleri Protein Mikt.. 28 Çizelge 9. Kağıt endüstrisinde enzim kullanımının tarihi gelişimi 41 VI

ŞEKİLLER DİZİNİ Taner YILDIZ ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 1. Ön mideli ruminantlarda sindirim sisteminin bölümleri... 2 Şekil 2. Rumenin mikroorganizma çeşitliliği... 2 Şekil 3. Monosentrik yaşam döngüsü... 6 Şekil 4. Selülozun diyagramatik yapısı... 8 Şekil 5. Ligninin diyagramatik yapısı... 8 Şekil 6. Hemiselülozun diyagramatik yapısı... 9 Şekil 7. Ksilanın diyagramatik yapısı.... 10 Şekil 8. Pektinin Diyagramatik yapısı... 10 Şekil 9. Hungate Tüpleri ve Içerisinde Gelişen Fungal İzole.... 21 Şekil 10. Anaerobik fungusların saflaştırılması.... 22 Şekil 11. Karbondioksit Düzeneği... 25 Şekil 12. Safl anaerobik fungusların samanlı ortamda gelişimi... 26 Şekil 13 Çok kamçılı zoospor yapısı..... 26 Şekil 14. Neocallimastix sp... 27 Şekil 15. Piromyces sp....... 27 Şekil 16. Protein Standartı Grafiği.. 28 Şekil 17. Neocallimastix sp. F10 un hücre içi ve hücre dışı selülaz aktivitesinin 29 optimum sıcaklık grafiği.. Şekil 18. Caecomyces sp. F12 nin hücre içi ve hücre dışı selülaz aktivitesinin 30 optimum sıcaklık grafiği.. Şekil 19. Piromyces sp. F17 nin hücre içi ve hücre dışı Selülaz aktivitesinin 31 optimum sıcaklık grafiği.. Şekil 20. Orpinomyces sp. F18 in hücre içi ve hücre dışı Selülaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği.. 31 Şekil 21. Neocallimastix sp. F10 un hücre içi ve hücre dışı ksilanaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği.. 32 Şekil 22. Caecomyces sp. F12 nin hücre içi ve hücre dışı ksilanaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği.. 33 Şekil 23. Piromyces sp. F17 nin hücre içi ve hücre dışı ksilanaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği.. 33 Şekil 24. Orpinomyces sp. F18 in hücre içi ve hücre dışı ksilanaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği.. 34 Şekil 25. Neocallimastix sp. F10 un hücre içi ve hücre dışı selülaz aktivitesinin optimum ph grafiği. 35 Şekil 26. Caecomyces sp.f12 nin hücre içi ve hücre dışı selülaz aktivitesinin optimum ph grafiği.. 36 VII

ŞEKİLLER DİZİNİ Taner YILDIZ Şekil 27. Piromyces sp. F17 nin hücre içi ve hücre dışı selülaz aktivitesinin optimum ph grafiği.. 36 Şekil 28. Orpinomyces sp. F18 in hücre içi ve hücre dışı selülaz aktivitesinin optimum ph grafiği.. 37 Şekil 29. Neocallimastix sp. F10 un hücre içi ve hücre dışı ksilanaz aktivitesinin optimum ph grafiği. 38 Şekil 30. Caecomyces sp. F12 nin hücre içi ve hücre dışı ksilanaz aktivitesinin optimum ph grafiği. 38 Şekil 31. Piromyces sp. F17 nin hücre içi ve hücre dışı ksilanaz aktivitesinin optimum ph grafiği. 39 Şekil 32. Orpinomyces sp. F18 in hücre içi ve hücre dışı ksilanaz aktivitesinin optimum ph grafiği. 39 VIII

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Taner YILDIZ SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ g L LB mg/ml ml mm μg/ml μm nm OD rpm SDS sp w/v P A X dk : Gram : Litre : Loura Broth : Miligram/mililitre : Mililitre : Milimetre : Mikrogram/mililitre : Mikromol : Nanometre : Optical density : Rotary per minute : Sodium Dodesil Sülfat : Species : Weight/volume : Protein Miktarı : T 60 T 0 arasındaki absorbans farkı : Standart : Dakika IX

1. GİRİŞ Taner YILDIZ 1. GİRİŞ 1.1. Rumenin Yapısı ve Rumen Mikrobiyal Ekosistemi Ruminantları, tek mideli hayvanlardan ayıran önemli özellikler midelerinin dört bölümden oluşması, sindirim sistemlerindeki mikroorganizma popülasyonundan ve sindirim sistemlerinde mikrobiyal sindirimin hakim olmasından kaynaklanmaktadır. Ruminantların sindirim sistemi ağız, ösefagus, dört kompartımanlı mide, ince bağırsaklar, kalın ve kör bağırsaktan oluşur. Ruminantlar, sindirim sistemlerindeki mikroorganizmalar sayesinde tek mideli hayvanlara göre selülozu daha fazla sindirebilmekte, birçok protein ve protein türevlerinden faydalanabilmekte, basit bileşiklerden esansiyel amino asitleri ve esansiyel yağları sentezleyebilmektedir. Ruminantlar, toplam yem tüketimlerinin önemli bir bölümünün, insan tüketimine elverişli olmayan yem hammaddelerinden sağlanması ve diğer bazı hayvan türlerinin değerlendiremediği yem hammaddelerini değerlendirmesi bakımından yetiştiricilikte avantaj sağlarlar. Ruminantları, yem hammaddelerini değerlendirme bakımından üstün kılan ise sindirim sistemlerindeki mikroorganizmalardır. Ruminantlarda mide dört bölümden oluşur. Bunlar özefagustan başlayarak sırasıyla rumen (işkembe), retikulum (börkenek), omasum (kırkbayır) ve abomasum dan (şirden) ibarettir. Bu 4 bölmenin ilk 3 ön mide bölümü özefagusun değişimi ile oluşmuştur. Bu 3 ön midenin sindirimdeki fonksiyonları, besinlerin mekanik olarak küçültülmesi, karıştırılması ve mikroorganizmalar ile fermantasyonunu kapsamaktadır. Dördüncü bölüm olan abomasum gastrik sindirimin gerçekleştiği yerdir ve monogastrik herbivorlardaki mideye karşılık gelmektedir (Şekil 1). Rumen, ruminant sindirim sisteminin hacim olarak en büyük kısmını teşkil eder ve retikulumla beraber, sığırlarda 100 150 L, koyunlarda 10 L hacmine ulaşan (Hobson ve Wallace, 1982) ve yoğun bir mikroorganizma popülasyonu içeren, büyük bir fermantasyon kabı vazifesi görür. Retikulum ile rumen, retikulorumen kıvrımı denilen dokusal bir kıvrımla birbirinden ayrılmakta olup, bu oluşum sindirim içeriğinin birinden ötekine kolayca geçişine olanak sağlar. Mide, ruminantlarda çok geniş olup, karın boşluğunun yaklaşık 3/4 ünü kaplar. Özellikle, karın boşluğunun sol yarısını hemen hemen tümüyle kaplamakta olup, bu kısımda, dalak ile ince bağırsağın birkaç kıvrımından başka bir şey yoktur. 1

1. GİRİŞ Taner YILDIZ Şekil 1. Ön Mideli Ruminatlarda Sindirim Sisteminin Bölümleri (Anonim, 2008a) Ruminantların farklı yaşam dönemlerinde temel besin maddeleri ile rumenin mikroorganizma çeşitliliği ve yoğunluğu farklılık göstermektedir (Şekil 2). Yeni doğan canlılarda ön mideler çok küçük olduğu için temel besinlerini süt oluştur ve besinin sindirimini, rumende o dönemin ana mikroorganizması olan Lactobacilli, Streptococci ve Clostridium gibi bakteriler yapmaktadır. Bununla beraber, kaba yemin ilk alınmasıyla beraber hayatlarında başlıca gereksinim duydukları temel mikroorganizmaları alırlar. Rumen mikroorganizmalarının yetişkinlerden yavrularına; salya, emzirme ya da ortak kullanılan su ve yem aracılığıyla taşındığı düşünülmektedir. Yetişkin hayvanların geviş getirmeleri sırasında rumen içeriği ağıza taşınmakta ve burada salyayla temas ederek, rumen içeriğinde bulunan bakteri ve protozoalar salyaya geçmektedir (Hobson, 1971). Anaerobik fungusların yetişkin ruminantlardan yavrularına geçişinin ise salya ve yemlerine bulaşmış olan dışkılarıyla olduğu düşünülmektedir (Lowe ve ark., 1987b; Milne ve ark., 1989) Şekil 2. Rumenin mikroorganizma çeşitliliği (Anonim, 2008b) 2

1. GİRİŞ Taner YILDIZ Sıvı fazdaki bakteri, protozoa ve fungusların ulaşacağı rakamlar, rumen iç epiteline bağlanan bitki parçacıkları ile ilişkilidir (Latham, 1980). Rumen sıvısındaki bu popülasyonların konsantrasyonları bakteriler için 10 9-10 10 ml -1, protozoalar için 10 5-10 6 ml -1 (Hungate, 1966), ve fungal zoosporlar için yaklaşık olarak 10 4-10 5 ml -1 dir (Theodorou ve ark., 1990). Davies ve ark. (1993 b), anaerobik fungusları rumen, omasum, abomasum, ince bağırsak, sekum ve kalın bağırsaktan izole etmişlerdir. Bu sonuç, anaerobik fungusların ağızdan anüse kadar ruminantların tüm sindirim kanalında ve dışkıda bulunabileceğini göstermektedir. 1.2. Anaerobik Fungusların İzolasyonu ve Sınıflandırılması Anerobik rumen fungusu olarak bilinen organizmaların ilk defa gözlemlenmesi geçtiğimiz yüzyılın başına dayanmaktadır. Bu organizmalar ilk defa Liebetanz (1910) ve Braune (1913) tarafından sırasıyla Sphaeromonas communis ve Callimastix frontalis adlarıyla kayıtlara geçirilmiş fakat o dönemde bu organizmaların kamçılı protozoa oldukları düşünülmüştür. Orpin (1975), Callimastix frontalis in (bugünkü adlandırılmasıyla, Neocallimastix frontalis) ve Monas communis in (Piromyces communis) yaşam döngülerini incelemiştir. Böylelikle daha önce protozoa olduğu sanılan kamçılı hücrelerin aslında zorunlu anaerobik fungusların zoosporları olduğunu göstermiş ve bu tarihten itibaren anaerobik funguslar üzerine yapılan çalışmalar yoğunlaştırılmıştır. Orpin, takip eden çalışmalarında koyun rumeninden her biri hareketli evre (zoospor) ve hareketsiz zoospor keseli 3 anaerobik fungus tanımlamış ve bunları Neocallimastix frontalis, Sphaeromonas communis, Piromonas communis olarak adlandırmıştır (Orpin, 1975; 1976; 1977). Orpin ve Munn (1986), yaptıkları çalışma ile daha önce Neocallimastix frontalis olarak tanımlanan fungusun adlandırmasını Neocallimastix patriciarum olarak değiştirmişlerdir. Anaerobik fungus cinslerinin farklıklarının ortaya konulmasında monosentrik ya da polisentrik tallus yapısına, filament ya da küresel tipte rizoid yapılarının bulunmasına, her zoosporlarındaki kamçı sayısına ve zoosporun kesitinin incelemesine dayanarak yapılabileceğini belirtilmiştir (Munn ve ark., 1988). Çok kamçılı zoospor ve polisentrik tallus yapısına sahip olan anerobik fungus türü koyun rumeninden izole edilmiş ve Neocallimastix joyonii olarak adlandırmışlardır (Breton ve ark., 1989). Tek kamçılı ve küresel zoospor yapısında, hem ana gövdesi hem spor kesesi hem de gövdenin farklı noktalarından gelişmiş, spor kesesi boyunlarının çekirdek ihtiva etmesi nedeniyle birden fazla üreme bölgesine sahip olan fungus türü sığır dışkısından izole 3

1. GİRİŞ Taner YILDIZ edilmiş, polisentrik olarak tanımlamış ve Cyllamyces aberensis olarak adlandırılmıştır (Ozkose ve ark.,2001) Aneorbik funguslar morfolojik yapıları itibariyle birlerinden oldukça büyük farklılıklar göstermektedirler. Caecomyces ve Cyllamyces cinsleri küresel rizoid yapısına sahip olmaları ile dallanmış rizoid yapısına sahip Neocallimastix, Piromyces, Orpinomyces, ve Anaeromyces cinslerinden oldukça faklıdırlar. Neocallimastix, Caecomyces ve Piromyces monosentrik yaşam döngüsüne sahipken, Orpinomyces, Cyllamyces ve Anaeromyces cinsleri polisentrik yaşam halkasına sahiptirler (Çizelge 1). Neocallimastix ve Orpinomyces in zoosporları çok kamçılı (>4 kamçı) iken Piromyces ve Anaeromyces cinslerinin zoosporları tek kamçılıdır (<4 kamçı). Çizelge 1. Cins düzeyindeki Anaerobik fungusların morfolojik farklılıkları Cins Spor Kesesi Rizoid Yapısı Zoospor Kamçı Sayısı Neocallimastix Tek (Monosentrik) Dallanmış rizoid Çok (>4 ) Piromyces Tek (Monosentrik) Dallanmış rizoid Tek (<4 ) Caecomyces Tek (Monosentrik) Küresel rizoid Tek (<4 ) Anaeromyces Çok (Polisentrik) Dallanmış rizoid Tek (<4 ) Orpinomyces Çok (Polisentrik) Dallanmış rizoid Çok (>4 ) Cyllamyces Çok (Polisentrik) Küresel rizoid Tek (<4 ) Günümüzde anerobik fungusların sınıflandırılmasında morfolojik farklılıkların yanı sıra, fungusların zoospor kesitleri alınarak ve bu kesitlerin elektron mikroskobu altında ince yapı karakteristiklerine bakılarak, morfolojik verilerle elde edilen bulgular daha sağlam temellere oturtulmuştur. Zoosporların ince yapı karakteristiklerinin incelenmesi, kamçıların zoosporlara kepçe ve mahmuz şekilli bağlantı noktalarındaki (kinetozomlar) farklılıklar göz önünde bulundurularak yapılmaktadır. Anaerobik fungusların sınıflandırılmasında morfolojik özelliklerin çevresel faktörlerden fazlasıyla etkilenebiliyor olması sınıflandırma çalışmalarındaki en büyük sorunu teşkil etmektedir (Heath 1988). Günümüzde morfolojik sınıflandırma çalışmalarına destek olarak moleküler düzeyde çalışmalar yapılmakta ve bu çalışmalar neticesinde çevresel şartlardan kaynaklanabilecek hataların sınıflandırma çalışmalarına olumsuz etkisinin önlenmesi sağlanmaktadır. Anaerobik funguslara ait 19 tür 6 cins içerisinde tanımlanmış ve sınıflandırılmıştır (Çizelge 2.). 4

1. GİRİŞ Taner YILDIZ Çizelge 2. Anaerobik fungus cinsleri, türleri ve izolasyon kaynakları Cins Tür İzolasyon Kaynak Kaynağı communis 1 Koyun Gold ve ark. (1988) Caecomyces equi At Gold ve ark. (1988) sympodialis Sığır Chen ve ark. (2007) communis 2 Koyun Gold ve ark. (1988) mae At Li ve ark. (1990) dumbonicus 7 Fil Li ve ark. (1990) Piromyces rhizinflatus 7 Fil Breton ve ark. (1991) minutus Geyik Ho ve ark. (1993c) spiralis Keçi Ho ve ark. (1993d) citronii At Gaillard-Martinie ve ark. (1995) frontalis Koyun Heath ve ark. (1983) Neocallimastix patriciarum 3 Koyun Orpin ve Munn (1986) hurleyensis Koyun Webb ve Theodorou (1991) variabilis Sığır Ho ve ark. (1993a) Anaeromyces elegans 4 Sığır Ho ve ark. (1993b) mucronatus Koyun Breton ve ark. (1990) Orpinomyces joyonii 5 Koyun Breton ve ark. (1989) intercalaris Sığır Ho ve ark. (1994) Cyllamyces aberensis Sığır Ozkose ve ark. (2001) Orijinal isimleri; 1 Sphaeromonas communis (Orpin, 1976); 2 Piromonas communis (Orpin, 1977); 3 Neocallimastix frontalis (Orpin, 1975); 4 Ruminomyces elegans (Ho ve ark., 1990); 5 Orpinomyces bovis (Barr ve ark., 1989); 6 Neocallimastix joyonii (Breton ve ark., 1989); 7 Piromyces dumbonicus, 7 Piromyces rhizinflatus (Ho ve Barr, 1995). 1.3.Anaerobik Funguslarda Yaşam Döngüleri Anerobik Funguslarda Monosentrik ve Polisentrik olmak üzere iki farklı yaşam döngüsü gözlemlenmektedir. Bu iki yaşam döngüsü arasında bazı temel farklılıklar bulunmaktadır. 1.3.1. Monosentrik Yaşam Döngüsü Monosentrik yaşam döngüsüne sahip funguslarda hareketli ve hareketsiz iki evre bu evler arasındaki geçiş dönemi söz konusudur. Hareketli olan evre zoosporik evre, hareketsiz olanı ise vejetatif evre olarak adlandırılmaktadır. Hareketli evrede kamçılı zoosporlar spor kesesinden serbest bırakılır ve kamçılarını dökerek kist oluşturur (encystment). Germ tüpün üretilmesi ile kistin çimlenmesi sağlanır ve devamında rizoidler gelişir (Orpin, 1977). Yaşam döngüsü tamamlanıncaya kadar zoosporların büyümesi spor kesesi içindedir ve döngü tamamlanınca spor kesesinden serbest bırakılırlar (Şekil 3.). Spor kesesinin parçalanmasıyla dışarıya çıkan zoosporlar genel olarak rumen sıvısında birkaç saat yüzerler ve bu arada rumendeki bitki parçalarına tutunurlar. Zoosporlar bitki parçalarına tutunmalarından hemen önce çoğunlukla kamçılarını kaybederler (Heath ve ark., 1986). Kamçılarını kaybetmiş olan zoosporların oluşturulduğu kistler bitki hücre duvarlarını yıkarak hücre içinde rizoidleri filizlendirirler. Rizoidlerin yapıları da farklı türlere göre çeşitlilik göstermektedir. Anaeromyces, Orpinomyces, Piromyces ve Neocallimastix cinslerinin rizoidleri yüksek oranlarda dallanmalar gösterirken, Cyllamyces ve Caecomyces cinsleri çoğunlukla dallanmamış tek bir rizoid 5

1. GİRİŞ Taner YILDIZ yapısına sahiptir. Rizoidlerin filizlenmesi ile vejetatif büyüme dönemi başlamış olur. Bu dönemle birlikte çekirdeğin (nükleus) nükleer bölünme ile çoğalması sonucu spor kesesi içerisinde çok sayıda zoosporun oluşumu söz konusu olur (Munn, 1994). İlerleyen evrelerde gelişmiş durumdaki zoosporlar sporkesesi içerisindeki kese zarından ayrılırlar. Daha sonraki aşamada sporkesesi kamçının tam karsısındaki bir noktadan sindirilir ve zoosporlar serbest halde yüzmeye başlarlar (Munn, 1994; Ozkose ve ark., 2001). Böylece monosentrik bir fungusun yaşam döngüsü tamamlanmış olur. Şekil 3. 1. Zoospor 2. Kist oluşumu 3. Zoosporun çimlenmesi 4. Vejetatif rizomiselyum. (Anonim, 2008c) Zoosporların çimlenmesi Monosentrik yaşam döngüsü gösteren funguslarda iki farklı şekilde olmaktadır. Bunlardan ilkinde zoosporun kist oluşturması ve çimlenmesi spor kesesi içerisinde gerçekleşir. Bu büyüme şekline endojenyus zooporangial büyüme denir. İkinci şekilde ise zoosporlar spor kesesini terk edip kese boynunun spor kesesi ile birleştiği noktada yeni ve küçük bir spor kesesi oluşturur. Bu şekildeki gelişim gösterilmesine ise ekzojenyus gelişim denir. Monosentrik funguslarda tek bir noktadan çoğalma söz konusudur. Yukarıda bahsedilen her iki büyüme şeklinde de her bir birey için bir tek spor kesesi oluşur ve sadece spor kesesi nükleik materyal içerir (Barr ve ark., 1989). 1.3.2. Polisentrik Yaşam Döngüsü Monosentriklerden farklı olarak Polisentrik funguslarda zoosporların gözlemlenmesi zordur. Bunun sebebi polisentrik fungusların çoğalmaları için zoosporun hücre dışına salınımına gerek duyulmamasıdır. Zoosporlar direk olarak rizoidlere göç eder ve nükleer bölünmeyle her bir birey için fungusun değişik bölgelerinde birkaç tane spor kesesi şekillenir (Barr ve ark., 1989). Polisentrik funguslar yaşam döngülerinin devam etmesi için zoospor salınımına ihtiyaç duymadıklarından teorik olarak sonsuz bir yaşam döngüsüne sahiptirler (Ho ve Bauchop, 1991). 6

1. GİRİŞ Taner YILDIZ 1.4. Bitki Hücre Duvarı Yapısında Bulunan Polimer Grupları Bitki hücresinde bulunan karbonhidratların yapısı çok çeşitlilik gösterir. Bu yapıda şeker, nişasta, pektin, hemiselüloz, selüloz ve lignin bulunur (Sniffen ve ark.,1994). Bu karbonhidratların bitki içersindeki miktarları bitki çeşidine, bitki aksamına (kök, gövde, yaprak ve meyve), bitki olgunluğuna, hasat zamanı, kimyasal ve fiziksel muameleye göre farklılık arz eder. Rumendeki selülotik bakteriler, suda cözünen seker, nişasta ve pektini hızlı bir şekilde fermente edebilirler. Bununla beraber hücre duvarı yapısında olup, suda çözünmeyen karbonhidrat parçaları (lif) olan hemiselüloz ve selüloz yavaş fermente olur fakat lignin fermente olmaz. Bu özelliğinden dolayı yemlerdeki lif fazlalığı rumende diğer besinlerin fermentasyonunu yavaşlatır. Ruminantların, lifi sindirebilmesi için geviş getirerek hücre duvarını fiziksel olarak parçalaması gerekir. Hayvanlar tarafından kullanım özelliğine göre karbonhidrat parçalarını iki kısma ayırabiliriz. Tek mideli ve geviş getiren hayvanlar, hücre içeriğinde olan şeker ve nişastayı parçalayacak enzimleri üretebilmektedirler. Bununla beraber bitki hücre duvarında olan pektin, hemisellüloz, sellüloz, ve lignini sindirebilecek enzim bu hayvanlar tarafından üretilemez (Belyea ve Ricketts, 1980). Bitki hücre duvarını oluşturan başlıca polimer grupları; selüloz, hemiselüloz, pektin, lignin ve az miktarda proteindir. 1.4.1. Selüloz Sellüloz, fibröz, çok sert, suda çözünmeyen bir maddedir; bitkilerin hücre duvarlarında, özellikle yaprak sapları, ağaç gövdeleri ve bitki dokularının odun kısımlarında bulunur, (b1 4) bağları vasıtasıyla birbirine bağlanmış glukoz ünitelerinin dallanmamış uzun zincirlerinden oluşmuş bir glukoz polimeridir (Şekil 4). Selülozun şekilsiz formu daha az molekül içi hidrojen bağına sahip olması nedeni ile nispeten kolay yıkılır ancak kristal formdaki selüloz fiziksel yapısı nedeniyle biyolojik yıkıma karşı daha dayanıklıdır (Beguin, 1990). Bu kristal yapı selülozun hidrolizinde selüloz fibrillerine göreceli olarak elastikiyet ve dayanıklılık kazandırır (Yamanaka ve ark., 1989). Selülozun glikoza kadar yıkımı için başlıca 3 enzim sınıfı gerekmektedir; endoglukanazlar (endo-1,4-β-glukanaz EC 3.2.1.4), sellobiyohidrolazları da içeren ekzoglukanazlar (1,4-β-D-glukan sellobiyohidrolaz EC 3.2.1.91) ve ekzoglukohidrolaz (1,4-β-D-glukan glukohidrolaz EC 3.2.1.74) ve β-glukosidazlar EC 3.2.1.21. Bu enzimler molekül içi glikozidik bağlarını poliglukan halka boyunca kırarlar. Ekzoglukanazlar (Sellobiyohidrolaz ve ekzoglukohidrolaz) poliglukan halkanın uçlarına saldırır ve bu uçlardan sellobiyoz ya da glikoz ünitelerini yıkıma uğratır (Coughlin ve Ljungdahl, 1988; Goyal ve ark., 1991). 7

1. GİRİŞ Taner YILDIZ Şekil 4. Selülozun diyagramatik yapısı (Anonim, 2008d) 1.4.2. Lignin Lignin bir karbonhidrat olmamasına karşın doğada daha çok selüloz ve hemiselüloz ile bir arada bulunduğundan karbonhidratlar içinde incelenenir. Lignin, pektin ve hemiselüloz gibi bir heteropolisakkarittir (Şekil 5). Lignin molekülünün büyük kısmı merkez lignin molekülüne direkt C-C dan bağlanan ya da eter bağları ile bağlanan fenilpropanoid alt ünitelerinden oluşur. Yaygın bağlantı fenilgliserol-β-aril eter bağları ile olur ve fenilkumaran, diarilpropan ve bifenil bağları bunu takip eder. Kendine özgü bir şekilde ama düşük oranda da difenil eterleri ve pinoresinol bağlantıları da bulunmaktadır. Tüm bu bağlar hidrolizin imkansız ya da oldukça zor olmasını sağlamaktadır (Bresnak ve Brune, 1994). Lignin, karbonhidrat polimerleri ile çok yakın ilişkili olduğundan ve hemiselülozla kovalent bağlı olduğundan kısmi denatürasyon olmadan lignoselülozdan izole edilemez. Bu kovalent bağlar hücre duvarındaki polimerizasyon işlemi boyunca oluşur, oluşan tepkime sadece diğer oligolignoller ile değil eterlerin ve esterlerin benzeri olan hemiselülozların ürünlerinde glukuronik asidin karboksi ve hidroksi grupları ile de gerçekleşir (Freudenberg ve Neish, 1968; Higuchi, 1990). Şekil 5. Ligninin diyagramatik yapısı (Anonim, 2008d) 8

1. GİRİŞ Taner YILDIZ 1.4.3. Hemiselüloz Hemiselülozlar alkali çözünen genel olarak heteropolisakkarit yapısında olan polisakkaritlerdir (Wilkie, 1983). Düz ya da dallanmış yapıda, D-ksiloz, L-arabinoz ya da D-galaktoz veya bunların kombinasyonundan oluşan, farklı cinslerde polisakkarit gruplarını içerirler (Zimmermann, 1992) (Şekil 6). Birçok hemiselüloz ksilanca zengin bir yapı teşkil eder; β-1,4-ksilopiranosidaz gruplarından oluşan omurgaya, α-d-glukuronik asit ya da 4-0-metil-α-D-glukuronik asit ve α-l-arabinofuranoz birimleri bağlanır (Joseleau ve ark., 1992). Şekil 6. Hemiselülozun diyagramatik yapısı (Anonim, 2008d) 1.4.3.1. Ksilan Ksilan hemiselülozun başlıca bileşenidir ve hemiselülozlar doğada toplam biyokütlenin % 30-35 ini oluşturmaktadır (Kulkarni ve ark., 1999). Yenilenebilen bu kaynaktan bugün gıda ve yem sanayi çeşitli şekillerde yararlanırken (Biely, 1985 ; Berovic ve Ostroversnik, 1997), kağıt sanayi (Techapun ve ark. 2003 ; Haarhoff ve ark. 1999) ve ayrıca atık arıtım ve değerlendirme proseslerinde de (Biely, 1985 ; Carmona ve ark. 1997; Duarte ve Ferreira, 1994) ksilana yönelik uygulamalar bulunmaktadır. Ksilanın tüm bu sanayilerdeki işleme ve değerlendirme basamaklarında enzimatik hidrolizi ön plana çıkmaktadır. Ksilanın enzimatik hidrolizinde yer alan başlıca enzim ise ß-1,4 bağları ile bağlanmış ksiloz birimlerinden oluşan iskeleti hidrolizleyen endo-1,4-ß-ksilanazlar (1,4-ß- D-ksilan ksilanohidrolaz) (EC 3.2.1.8) dır (Singh ve ark. 1993) (Şekil 7). Bazı ksilanların özelliği, bilhassa tahıl türlerinde, arabinosil kısımları üzerinden kovalent bağlı fenolik alt ünitelerin bulunmasıdır. Ksilanların yıkımı için, endo 1,4-β-Dksilanaz, β-ksilobiaz, β-ksilosidaz ve yan grupların yıkılması için gereken enzimlerin bileşiminin gerektiği belirtilmektedir (Orpin ve Letcher, 1979). 9

1. GİRİŞ Taner YILDIZ Şekil 7. Ksilanın diyagramatik yapısı (Anonim, 2008d) 1.4.4. Pektin Pektik maddeler, bitki duvarlarında ve orta lamelde oluşan yapısal polisakkaritlerdir. Bu maddeler büyük oranda anhidrogalakturonik asit birimlerinden oluşan karmaşık, kolloidal karbonhidrat türevlerinden meydana gelen yüksek su tutma kapasitesine sahiplerdir. Bu durumda pektik maddeleri oluşturan birim, poligalakturonik asit olup, düz bir zincir yapmak üzere birbirleriyle α-1.4 bağı yapmışlardır. 30000-300000 moleküler ağırlıklı eteropolisakkaritlerdir. Pektik maddeler pektinik asit, pektin, pektik asit ve bunların tuzlarını içeren bir grup maddeye verilen genel addır (Willats ve Ark., 2001). Pektin, meyve sebze gibi daha yüksek bitkilerde bulunan bir polisakkarittir. D- Galakturonik asit üniteleri ve metoksil gruplarını oluşturmak için α-1.4 bağlanmasıyla oluşan uzun zincirli bir dizidir (Şekil 8). Şekil 8. Pektinin diyagramatik yapısı (Anonim, 2008d) 1.5. Bitki Hücre Duvarının Anaerobik Funguslar Tarafından Yıkımı Doğada en çok bulunan biyolojik materyallerin başında selüloz ve lignin gelir. Bunların, doğada mikrobiyolojik olarak sürekli parçalanması söz konusudur. Her yıl milyonlarca ton biyolojik molekül çeşitli organizmalar tarafından yıkılmaktadır. Ancak ligninin parçalanmasında moleküler oksijene ihtiyaç duyulur ve bunun da rumende eser miktarda bulunan oksijenin kullanılarak gerçekleştirilmesi mümkün olmamaktadır (Theodorou ve ark., 1996). Anaerobik funguslar rumen mikoorganizma popülasyonu içerisinde bitki hücre duvarını parçalaması ve takip eden fermentasyonda en büyük rolü üstlenen organizma grubudur. Rumen funguslarının bitki parçalarının sindiriminde fiziksel ve enzimatik rolleri bulunmaktadır. Funguslar rizoidler veya rizomiselyalar meydana getirerek bitki hücre 10