PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI Bir hücre ve dokudan istenilen bir proteinin saf halde izole edilmesi oldukça güç bir olaydır. Bu proteinin konsantrasyonu düşük ise binlerce farklı protein arasından ayırmak ve saf halde elde etmek için bu proteine uygun olan saflaştırma tekniklerinin seçilmesi gerekir. Proteinlerin saflaştırılmasında bugün kullanılan yöntemler oldukça gelişmiştir. Saflaştırmada kullanılan yöntemlerden bir veya birkaçı arka arkaya kullanılarak protein saf halde veya safa yakın bir şekilde elde edilmektedir. Bugün pekçok enzim ve enzim olmayan proteinin saf ve kristal halde izole edilmesi başarılmıştır. Bir proteinin amino asit kompozisyonunu ve dizilişini, molekül ağırlığını ve diğer fiziksel özelliklerini çalışmak için öncelikle proteinin saflaştırılması gereklidir. Bir doku ve hücre gurubundan proteinleri izole edebilmek için öncelikle yapılmsası gereken bazı işlemler vardır. İlk safhada çalışmak istediğimiz proteinin en fazla bulunduğu doku veya hücre grubu seçilir. İlgilendiğimiz proteini dayanıklı tutacak tampon çözeltiler kullanılarak doku ve hücreler homojenize edilir. Hücre membranının ve nukleus membranının parçalanması gerekir. Daha sonra bu homojenat belirli hızlarda santrifügasyona tabi tutularak hücre partiküllerinden arımdırılır. Böylece elde edilen protein karışımı süpernatan halşnde alınarak saflaştırma yöntemlerinden biri veya birkaçı kullanılarak proteinlerin saf halde izole edilmesi sağlanır. PROTEİN SAFLAŞTIRMA YÖNTEMLERİ 1. KROMATOGRAFİK YÖNTEMLER a. JEL FİLTRASYONU Jel filtrasyonu proteinlerin molekül ağırlıklarına göre ayrılmasını sağlar. Bu yöntemde proteinlerin birbirinden ayrılması, sabit fazdaki jelin oluşturduğu porların çapına göre moleküllerin belirli derecede engellenmesine dayanır. Sabit faz olarak kullanılan sefadeks, biojel, agaroz gibi dolgu maddeleri kolona doldurulduktan sonra uygun bir tampon ile yıkanır ve kararlı hale geçirilir. daha sonra protein çözeltisi tampon ile birlikte kolonun üzerinden yavaş yavaş ilave edilir. Yer çekimine göre aşağı doğru hareket eden protein çözeltisi içerisinde bulunan küçük protein molekülleri kolon dogu maddesinin küçük oyuklarına girerkan,- büyük proteinler bu oyuklara hiç girmeden kolondan ilk çıkan moleküller halinde ayrılırlar. b. ION -EXCHANGE ( İYON DEĞİŞTİRİCİ ) KROMATOGRAFİSİ Proteinleri asit ve baz özelliklerine göre ayırmak için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntemde kolon içine ph= 7 de pozitif yük taşıyan bir selüloz türevi olan DEAE- selüloz ( dietil aminoetil selüloz ) konur. Bu bileşiğe negatif yük taşıyan proteinler bağlanırken diğer proteinler kolondan çıkar. Kolonun içerisine konan diğer bir bileşik ise ph= 7 de negatif yük taşıyan CM-selüloz ( karboksimetl selüloz ) dur. Bu bileşiğe de pozitif yük taşıyan proteinler bağlanır. Diğer proteinler ise kolon dolgu maddesine bağlanmadan kolondan çıkar. Daha sonra kullanılan tamponların iyonik kuvveti değiştirilerek kolon materyaline geçici olarak bağlanmış olan bu proteinler kolonun dolgu maddesinden ayrılarak kolondan çıkmaya başlarlar. Fraksiyon toplayıcısı ile
küçük miktarlar halinde tüplerde toplanan proteinler asidik yada bazik özelliğine göre diğer proteinlerden ayrılmış olur. İyon değiştirici kromatografi aynı zamanda aminoasitlerin ve peptitlerin de birbirinden ayrılmasını sağlar. Bu tip kromatografi özellikle molekül ağırlıkları birbirine çok yakın olan molekülleri ayırmak için kullanılmaktadır. c. AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ Çok kompleks bir karışım içinde bulunan bazı proteinler affinite kromatografisi sayesinde tek basamakta oldukça saf halde elde edilirler. Affinite kromatografisi için polisakkarit yapısındaki agaroz taneciklerine kimyasal bir reaksiyon ile bir enzimin koenzimi bağlanır. Üzerine koenzim bağlanmış olan agaroz tanecikleri kolon dolgu maddesi olarak kullanılır. Proetin karışımı bu kolona uygulandığı zaman yalnız ilgilendiğimiz enzim proteinleri koenzimin serbest ucuna spesifik olarak bağlanmaktadır. Bu bağlanma kovalent bir bağlanma değildir. Diğer proteinler koenzimin serbest ucuna bağlanma özelliğine sahip olmadıkları için kolondan ayrılırlar. Daha sonra serbest koenzim içeren çözelti kolona ilave edildiğinde, agaroz taneciklerine bağlı koenzime bağlanmış olan enzim molekülleri bu defa rekabetten dolayı çözelti ile birlikte gelen serbest koenzime bağlanarak kolondan çıkar. Böylece koenzime spesifik olarak enzim proteini diğer yüzlerce proteinden affinite kromatografisi ile tek basamakta saflaştırılmış olmaktadır.
2. ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER a. ELEKTROFOREZ Elektroforezde bir hareketli bir de hareketsiz faz vardır. Sabit faz olarak kağıt, asetat, selüloz, poliakrilamid, agaroz gibi dolgu maddeleri kullanılır. Sabit ortamdaki en önemli özellik moleküllerin porlardan kolaylıkla geçmesine dayanır. Hareketli faz olarka genellikle tamponlar kullanılır. Elektroforezin diğer yöntemlerden farkı bir elektriksel alan yaratılmasıdır. Protein çözeltisi bu elektriksel alanda farklı hızlarla bir elektrotdan diğerine hareket ederek molekül ağırlıklarına ve taşıdıkları elektrik yüklerine göre birbirleirnden ayrılırlar. Daha sonra boyama yaparak protein bantları görünür hale gelmektedir. b. İZOELEKTRİK FOKUSLAMA İzoelektrik fokuslama, proteinlerin bir ph gradientinde izoelektrik noktalarına göre ayrılması prensibine dayanır. Bu yöntemde; yüksek mobiliteye sahip sentetik poliamino-polikarboksilik asitlerin karışımları olan amfoterik bileşikleri içeren jel polimerleştirilir. ph gradienti oluşturmak için sisteme akım verilir. ve amfolitler izoelektrik noktalarına göre jelde düzenlenirler. En asidik olan anoda, en bazik olanda katoda doğru ilerler. Daha sonra örnek proteinler jele uygulanır ve yüklerine göre anoda ve katoda doğru hareket ederler. Proteinler jel üzerinde net yüklerinin sıfır olduğu ph değerine ( pi ) kadar göç ederler ve bu noktada hareketsiz kalarak dururlar. En son aşamada protein bantlarının gözlenmesi için boyama yapılır fakat boyamanın olması için öncelikle jelden amfolitlerin uzaklaştırılması gerekir. Çünkü amfolitler jelin tamamen boyanmasına neden olur. 3. SANTRİFÜGASYON YÖNTEMLERİ a. DENSİTİ GRADİENT (ZONAL ) SANTRİFÜGASYON Bir protein karışımını santrifügasyon yönyemi ile ayırmak için tüp içerisinde sükroz gibi bileşiklerle bir konsantrasyon gradienti yaratılır. Bunun için plastik tüp içerisinde en yoğundan en az yoğuna doğru bir sükroz gradienti meydana getirildikten sonra tüpün en üzerine protein karışımı ilave edilir. Bu şekilde hazırlanmış olan tüp yüksek devirde santrifüj edilecek olursa her bir protein kendi dansitesi ile aynı olan sukroz bölgesine toplanacaktır. Tüp içerisinde farklı bantlar halinde ayrılmış olan proteinler daha sonra tüpün altı iğne ile delinip toplanarak veya tüp dondurulduktan sonra bu bantlar buz halinde kesilerek çözdürülür ve bu şekilde proteinler birbirlerinden ayrılmış olur. b. DİFFERANSİYEL SANTRİFÜGASYON Differansiyel santrifügasyon ile bir karışımda bulunan partiküller boyutlarındaki farklılıklara bağlı olarak ayrılmaktadır. Homojenat relatif santrifügal kuvvet (RCF) arttırıldıkça fraksiyonlarına ayrılmaktadır.
4. DİALİZ VE ULTRAFİLTRASYON Proteinleri daha küçük molekül ağırlığa sahip moleküllerden ayırmak için diyaliz yöntemi kullanılır. Bu yöntem yarıgeçirgen bir membran içerisine konan protein çözeltisi içerisinden küçük moleküllerin membranın ultramikroskopik porlarından suyla ve tamponla ortam suyuna geçirilmesi tekniğine göre çalışır. Glukoz ve NaCl gibi küçük moleküller membrandan geçerken büyük protein molekülleri diyaliz porlarından geçemediği için içerde kalır. ortam suyunun birkaç kez değiştirilmesi ile küçük moleküllerin protein çözeltisi içerisinden uzaklaştırlması mümkün hale gelmektedir. Ultrafiltrasyon yöntemi de diyaliz tekniğine göre çalışır. Aradaki fark, diyaliz tüpünden küçük moleküllerin çıkması için hidrostatik basınç veya santrifüj gibi transmembran kuvvetlerinin etkisiyle proteinleri molekül büyüklüklerine göre diyalize göre daha hızlı ve daha yüksek verimlilikte ayrılmasını sağlar. Bu basınç sayesinde küçük moleküllerle birlikte bir miktar sıvı kaybedildiği için protein daha konsantre bir şekilde elde edilir. KANDAN HEMOGLOBİN İZOLASYONU ( HEMOLİZAT HAZIRLANMASI) Kan hücreleri plazma içinde bulunurlar. Kanın bir antikoagülant ile pıhtılaşması engellendikten sonra kanı santrifüj edersek üstte kalan sarımtırak sıvı plazmayı oluşturur. Santrifügasyondan sonra tüpün alt kısmında hücre tabakaları görülür. Ağırlıkları nedeni ile alyuvarlar en alttadır ve en fazla olan hücre tabakasıdır. Bunun üzerinde ince beyaz bir tabaka halinde akyuvar tabakası görülür, ayrıca çok miktarda kan ile çalışıldığında en üstte inci taneleri gibi trombositlere de rastlanır. İnsanda alyuvar volümü tüm kanın % 45 ini akyuvar volumü ise % 1' ini oluşturur. Alyuvarda bulunan proteinlerin % 90'ı hemoglobinden oluşmuştur ve hücre ağırlığının 1/3 'ünü teşkil eder. Hemoglobin, akciğerin oksijence zengin gaz fazından oksijeni yüzeyine bağlayarak bunu oksijence fakir periferal dokulara taşır. Bu deneyde protein saflaştırma yöntemlerine örnek olarak kandan hemoglobin proteinini saflaştıracaksınız. DENEYİN YAPILIŞI Deneyde gerekli olan araç ve gereçler: Antikoagülantlı kan örneği % 0.9 NaCl veya 1X Retik Salin Distile su Toluen 1. 1 ml EDTA'lı kan örneği alınır. 3000 rpm'de 5' santrifüj edilerek üstteki plazma kısmı pipet ile alınır. 2. Kan örneği üç kez serum fizyolojik ile yıkanır. Yıkama İşlemi: Örnek üzerine 1x Retik salin ilave edilir ve hafifçe çalkalanır. Ardından 3000 rpm'de 5' santrifüj edilir. Süpernatan kısmı aspire edilir. 3. Santrifügasyondan sonra altta kalan alyuvar tabakası üzerine 1.5 katı distile su ve yarısı kadar da toluen ilave edilir. 4. 8' elle çalkalanır. 5. 20' 3000 rpm'de santrifüj edilir. 6. Aradaki berrak kısım mikropipetle dikkatlice alınır. Elde ettiğiniz bu hemolizat çözeltisini bir sonraki deneyde poliakrilamid jel elktroforezine uygulayarak protein bantlarını göreceksiniz. EDTA: Ca ++ iyonlarını bağlayarak kanın pıhtılaşmasını önler. Retik Salin: Alyuvarların oluşturduğu çöküntü kısmında plazmadan kalan artıkları temizlemek için yıkama işleminde kullanılır. (5x Retik Salin: NaCl KCl MgCl 2 ) Toluen: Hücre membranındaki lipid tabakasını eriterek hücre membranının parçalanmasını sağlar.
Tarih: II. DENEY RAPORU Öğrencinin Adı Soyadı: Numarası: İmzası: Deneyin Adı: Deneyin Amacı: Sorular: 1- Proteinlerinlerin saflaştırılma amaçları neler olabilir? 2- Kanımız kırmızı iken damarlarımız neden mavi görülür? 3- Antikoagülantların görevi nedir? 4- Hemolizat nedir? 5- Kandan hemoglobin izolasyonunda kullanılan EDTA, 1XRetik Salin ve Toluen hangi amaç için kullanılmıştır. Açıklayınız Cevaplar: