1 Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 Prof.Dr. Dilek AK 28.03.2014 /4. DERS BİYOLOJİK SIVILAR
PLAZMA ve SERUM 2 Kan, antikoagülan ilave edilmeden bir tüpe alınır ve pıhtılaşması için bekletilirse pıhtı yumağından sarı renkli bir sıvının ayrıldığı görülür. Buna serum denir. Serumda kanın pıhtılaşmasında görev alan bazı pıhtılaşma faktörleri ve proteinler özellikle fibrinojen ve bazı pıhtılaşma faktörleri (proteinlerin % 2.0-2.5 i) bulunmaz. Bu yüzden seruma fibrinojensiz plazma denir.
3 Plazma ve serumun en önemli özelliği büyük miktarda protein içermesidir. Protein ölçülecek küçük moleküllü ilaçtan kimyasal ve fiziksel olarak farklıdır. Plazmanın toplam protein içeriği: 7.0-7.5 g/100 ml plazma Ancak proteinler ve ilaçlar arasında güçlü bir afinite vardır ve ultrafiltrasyon veya diyalizle proteinin uzaklaştırılması, ilacın büyük bir fraksiyonununda uzaklaştırılmasına neden olur.
4
5 Diğer taraftan ilacın doğrudan ölçümü mevcut toplam ilaç ve ölçülen serbest ilacın karışmasına yol açar. Mikrobiyolojik tayinlerde sadece serbest ilaç ölçülür ancak standartlar da ölçülecek aynı sıvıda çalışıldığı için sonuçların mevcut antimikrobiyal ajanın toplam miktarına karşı geldiği kabul edilir. Serbest ilacın fizyolojik olarak önemli varlığı tartışılmasına karşın ilaçların çoğu protein bağlı olarak bulunur ve serbest konsantrasyonu önemli ölçüde düşüktür. Plazma veya serum numunelerinde toplam ilacı ölçme yolu kullanılır.
6 Bu yüzden problem ilacın proteine bağlanmasını fizyolojik olarak tahrip edilmesi ve analiz için toplam ilacın ekstre edilmesidir. Bağlı fraksiyon, toplamın sabit bir yüzdesi olduğu ve analizcinin analizi basitleştirmesi için bir yükseltme faktörünü kullanması söz konusudur. Günümüzde bu durum bağlı olmayan fraksiyon için analizcinin çok duyarlı yöntemler geliştirmesini gerektirmediği için şanslı bir durumdur; ancak bazı ilaçların metastabil conformerlerinin aktif formda olabileceği iddiaları mevcuttur. Eğer bu iddialar doğruysa farmakokinetiklerinin aydınlatılması biyolojik sıvılarda spesifik conformerlerin analizi gerekir.
7 Analiz için plazma veya serum numunesinin hazırlanmasında ilk basamak proteinsiz sulu çözelti elde etmek ve bir organik çözücü ile uygun ekstraksiyondur. En basit ve eski yöntem proteinleri çöktürmek ve filtratı (supernatan) izole etmektir. Protein çöktürme ile denature edilir ve ilaç bağlama yeteneği zarar görür. Böylece toplam ilaç filtrata salınır.
8 Kostik çözeltiler, plazma ve serumda proteinlerin denature edilmesi ve çöktürülmesi için eşit etkinlikte olmasına karşın bunlar genellikle ekstraksiyonda zorluklara neden olan sabun oluşturma özelliklerinden dolayı tercih edilmezler. Protein çöktürülmesi için yaygın kullanılan asidik reaktifler trikloroasetik asit, perklorik asit ve tungstik asittir ancak bu tip kuvvetli asitler ekstre edilecek ilaca zarar veren etkiye sahip olabilir. Böyle bir prosedür klasik genel reaktiflerle kullanılan biçim yerine standart bileşiklerle test edilmelidir.
9 Stevens ve Bunker bu asitlerin yanı sıra 80 o C de 5 M HCl, alüminyum klorür ve amonyum sülfatın kullanımı üzerine bir araştırma yapmış ve genel olarak hiçbir yöntemin uygulanabilir olmamasına karşın tüm kanda proteinlerin çöktürülmesi için alüminyum klorürün en güvenli reaktif olduğu, bazı ilaçların düşük geri kazanımlarının ilaçların proteinlerle çökmesine ve degredasyonuna bağlı olduğu sonucuna varmışlardır.
10 Düşük ph da ilaçların stabil olmaması, proteinlerin denaturasyonu ve çöktürülmesi için organik çözücülerin kullanımı ile önlenebilir. Dell, bütün plazma proteinlerini çöktürmek için en az iki misli hacmi gerekli olan metanol veya etanolü tavsiye eder. Diğer bir popüler çözücü özellikle HPLC de yaygın kullanılan asetonitrildir. Mathies ve Austin, antikonvülzan ve analjeziklerin analizi için plazmanın eşit hacim asetonitrille karıştırıldığı ve çözeltinin sodyum bisülfat /sodyum klorür ile doyurulduğu ve üst fazın doğrudan kromatografik kolona enjekte edildiği bir yöntem tarif eder.
11 Proteinler, proteolotik enzimler kullanılarak da denature edilebilir. Kimyasal denaturasyon kullanıldığında analitin zarar görme olasılığını azaltmak için uygun bir yoldur. Proteolitik enzimler genellikle doku preparatlarındaki ilaç analizi için uygulanır. Ancak subtilizin enzimi plazma proteinlerinin dijesyonu için başarıyla kullanılmıştır. Osselton, bütün kan ve plazmanın analizinde, doğrudan ekstraksiyon ile enzim hidrolizini karşılaştırdığı çalışmasında dokudan ilacın geri kazanımında enzim hidrolizi ile daha iyi geri kazanım elde edildiğini göstermiştir. Osselton un prosedüründe 200 µl plazma 50 µl TRIS tamponu ile ph 10.5 değerine tamponlanır, enzim katılır ve karışım 50 µl bütil asetat ile ekstraksiyondan önce 55 C de 1 saat inkübe edilir. Organik faz daha sonra uygun bir yöntemle analiz edilir. Osselton spesifik bir bileşik için normal ekstraksiyon işlemlerinin optimizasyonunun olanaklı olmadığı koşullarda genel tarama işlemleri için enzim hidrolizinin çok kullanışlı olduğunu bildirir.
Analit içeren çözeltiden proteinlerin ayrılması icin yöntemler Yöntem Yorum 90 o C de 5-15 dk ısıtmak Çok etkin değildir. Analit dekompoze olabilir. 12 Dondurma çözündürme siklusları Çok etkin değildir. Zaman alıcı bir işlemdir. Amonyum sülfat ile doyurma Orta düzeyde etkindir. Supernatanda yüksek tuz derişimi, final ph 7.0 dolayındadır ZnSO 4 - sulfosalisilik asit ZnSO 4 sodyum hidroksit Metafosforik asit Perklorik asit Trikloroasetik asit Tungstic asit Etanol Asetonitril Aluminyum klorür Temiz bir çözelti, RIA için uygun Mükemmel verim, ph 7.0 dolayında ince bir çökelti, düşük sıcaklıklarda uygun Mükemmel verim, reaktifin soğuk tutulması gerekir, asitlik (ph<3) analiti dekompoze edebilir. Mükemmel verim, reaktifin soğuk tutulması gerekir, patlayıcı reaktif, final ph analite zararlı olabilir. Bir çok bazik ilaç güvenle ekstre edilebilir. İyi verimlilik, reaktifin soğuk tutulması gerekir, analitten uzaklaştırılması zor olabilir. İki hacim etanol tamamlanmış denaturasyon için gereklidir. Düşük ph da ilaç dayanıksız ise uygundur. Tamamlanmış denaturasyon için 1.5 hacim gerekir. Zayıf floc analitin birlikte çökmesini engeller. Özellikle takiben HPLC varsa uygundur. Bazik bileşikler için amonyum sülfat ve tungstik asitten daha uygundur.
13 Proteinlere bağlanma ilacın kanda transportu için ve bazen de ilacın çözünürlüğü için önemli bir olaydır. Yukarıda açıklandığı gibi ekstraksiyonun alışılmış yöntemleri bu tip bağlanmayı kırma eğilimindedir. Böylece genellikle sıvılardaki toplam ilaç ölçülür. Normal olarak proteine bağlanma kapsamından habersiz olarak serbest ilaç ölçülmek istendiğinde bazı durumlarla karşılaşılabilir. Barbituratlar gibi asidik ilaçlar kuvvetli bağlanır. Bazik ilaçların bağlanma eğilimi yoktur. Fenitoinin proteinlere bağlanması valproik asitten etkilenir.
14 Plazma çok kompleks bir sıvı olmasına karşın kompozisyonu önemli ölçüde stabildir ve hastalarda bile içeriğinde büyük değişiklik olmaz. ph 7.30 ile 7.50 aralığındadır ve bu aralığın dışına çıkmaz. Toplam protein ve tuz konsantrasyonları da iyi kontrol edilir. Ancak yağ içeriği yemeğin zamanına ve cinsine göre önemli ölçüde değişebilir. Plazma konsantrasyonu-zaman grafiği çizildiği zaman yağ içeriği analizi etkileyen bir faktör olabilir ve özellikle yağlı numunelerde yağları uzaklaştırmak için özel bir ekstraksiyon basamağı gerekebilir.
15 Plazma bileşenlerindeki bazı değişikliklerin ilacın gerçek düzeyi üzerine etkisi olabilir. Örneğin bazı ilaçlar protein bağlanma kısımlarında diğerleriyle yer değiştirebilir. Böyle durumlarda ilacın fizyolojik etkisi sadece serbest ya da bağlanmayan konsantrasyona bağlı olabilir. Çünkü daha az bağlanma yerleri mevcut olduğu için ölçülen toplam ilaç gözlenen etki için son derece düşük görünecektir. Bu yüzden bir çok araştırmacı serbest ilacın analizini gerçek bir indikatör olarak savunur. Bu tip tayinlerde serbest ilacın bağlı ilaçtan ayrılması için ticari filtrelerin kullanıldığı ultrafiltrasyon yöntemleri popülerdir. Ancak serbest ilacın düşük konsantrasyonları saptama sınırının dışında kalabilir. Alternatif bir işlem toplam ilaç için analizinden önce aynı plazma numunesini radyoaktif işaretli ilaç ile dengeleyerek bağlı yüzdesini belirlemek olabilir.
16 İlaçlar plazma proteinlerine kuvvetlice bağlanabilmesine karşın bağlanma tersinirdir. Bundan dolayı uygun ph da numune organik bir çözücüyle ekstre edilebilir. İyonize olmayan formdaki ilacın organik çözücüye partisyonu yeterince yüksekse, bağlanma dengesi organik çözücüye verimli ekstraksiyonu sağlayacak şekilde kaydırılabilir. Bu strateji tamponun en az miktarı ile gerekli ph ya ayarlamak ve çözücünün bağıl olarak büyük hacmiyle ekstre etmektir. Bu prosedürün avantajı çok sayıda numune için bir rutin işlem olan filtrasyon veya aktarma gibi işlemlerden kaçınmaktır. Toksikoloji ve klinik farmakoloji çalışmalarını destekleyen laboratuarlar için bu işlemler gerçek bir problemdir.
17 Çok sayıda numunenin analizinde gerekli zamanı azaltmak için ekstraksiyon işlemleri ile ilgili basamağı basitleştirmek amacıyla çözeltideki analitin katı bir matrikse adsorpsiyonu ve ardından çözücünün daha küçük bir hacmi ile elüsyonu işlemleri uygulanabilir. Bu amaçla aktif kömür, modifiye silika veya iyon değiştirici reçine gibi bir materyal içeren bir kolona işlem görmemiş numune çözeltisinin eklenir. (katı faz ekstraksiyonu)
18 Ayrıca, numune sağlandıktan sonra plazma veya serum bileşeni olarak bulunan enzimlerin ilaç degredasyonunu sürdürmesi ihtimali mevcuttur. Nonspesifik esterazlar özellikle önemlidir ve esterleri serbest alkol ve asitlere parçalar. Bu esterazların doğası ve aktivitesi kişiye göre değişir.
19 Plazma ve serum büyük miktarda protein içerdiği için ilaçlar kendi fizikokimyasal özelliklerine göre çeşitli derecelerde proteinlere bağlanacaktır. Genelde asit ve nötral yapıdaki laçlar başlıca albümine, bazik ilaçlar ise asit glikoproteinlere bağlanır. Ekstravasküler dağılım ve eliminasyon için sadece serbest ilaç mevcuttur ve hücre membranlarını geçebilecek ve ilaç reseptörleri ile etkileşecek kısım serbest ilaç fraksiyonudur. Amaç toplam ilaç derişiminin ölçülmesi olduğunda proteinsiz serum veya plazmada ilacın doğrudan analizi toplam ilaç derişimini yansıtmayacaktır. Bu yüzden protein, bir organik çözücü ile ekstraksiyon işleminden önce denature edilir. Alternatif olarak proteine kuvvetlice bağlanan ilaçlar ph nin uygun şekilde ayarlanması ile serbest hale geçirilebilir.
Numune Hazırlama 20 1. Osmotik parçalama 2. Protein çöktürme 3. Asit muamelesi 4. İnorganik tuzlar 5. Sonikasyon
Numune Hazırlama 21 1. Osmotik parçalama 1 ml, kan, serum veya plazmaya 4 ml distile su eklenir. Vortex ile karıştırılır veya 5 dk bekletilir. 670 g de 10 dk santrifüj edilir ve pellet atılır. Tampon çözelti ilave edilerek süpernatan ph değeri ayarlanır.
Numune Hazırlama 22 2. Protein çöktürme 1 kısım plazma veya serum için 2 kısım organik çözücü kullanılır. Karıştırılır ve 5-10 dk bekletilir. Numune vortexlenir ve santrifüj edilir. Süpernatan elde edilir ve ekstraksiyon öncesinde tamponlanır. Organik çözücüler içinde protein bağını tahrip etmek için en kuvvetli olanı asetonitrildir. Organik çözücünün daha düşük miktarları % 10-30 da etkili olabilir.
Numune Hazırlama 23 3. Asit muamelesi Kuvvetli asitler (formik, perklorik, trikloroasetik asit) proteinleri ve yapılarını tahrip eder. 50 mkro litre 0.1-1.0 M perklorik veya formik asit 1 ml serum veya plazmaya eklenir. Triklorasetik ast %10 derişimde kullanılır. Numune karıştırılır ve 5-10 dk bekletilir. Vortex ve santrifüj yapılır pellet atılır. Supernatan analiz edilir.
Numune Hazırlama 24 4. İnorganik tuzlar Amonyum sülfat ve çinko sülfat (% 10-20) 1:1 oranında dilüsyon ile proteinleri çöktürmek için kullanılabilir.
Numune Hazırlama 25 5. Sonikasyon (kimyasal, biyolojik, farmakolojik ve fizyolojik çalışmalarda materyallerin parçalanarak homojenize edilmesi ) Biyolojik sıvı 15 dk oda sıcaklığında sonike edilir. Uygun ph değerindeki tampon eklenir ve karıştırılır. Santrifüj (670 g) 15 dk yapılır. Pellet atılır ve supernatan analiz edilir.
İlginiz için teşekkür ederim. 26