Hemoglobinopatilerde Tanı Yönetimi Genetik Testler

1 2 3 4 5 6 7 8 Hemoglobinopatilerde Tanı Yönetimi Genetik Testler Doç.Dr.Hüseyin Onay Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD

16. Kromozom üzerinde α globin gen bölgesi 11. Kromozom üzerinde β globin gen bölgesi

Globin Genleri globin gen ziniri Gen Uzunluk (bç) Uzunluk (aa) HBB 754 147 HBD 785 147 HBE1 906 147 HBG1 808 147 HBG2 692 147 globin gen ziniri HBA1 605 142 HBA2 577 142 HBZ 755 142 HBQ1 536 142 HBM 506 141

3 ekzon, 2 intron HBB geni

talasemiye neden olan mutasyonlar Tein SL, Cold Spring Harb Perspet Med, 2013

HBA geni

Talasemi Mutasyonları

Talasemide Genetik Danışma 1. Tarama testlerinde taşıyıılık saptanması 2. Öneki çoukta talasemi major hastalığı 3. Kan akrabalarında talasemi major tanısı almış olgu 4. Kan akrabalarında taşıyıılık saptanması 5. Öykü olmadan bu hastalık için riski öğrenmek

talasemide hematolojik çalışmalarda yol haritası MCV MCH Hb >78 >27 A A 2 <%3 < 78 < 27 A A 2 >%3,5 F %0.1-7 < 78 < 27 A A 2 <%3,5 < =78 < =27 A A 2 <%3 F %2-30 Varyant Hb Doğrulayıı test Normal Taşıyıı Sık mutasyonlar için DNA analizi Tanımlanmamış mutasyonların analizi Fe eksikliği Fe tayini Demiri tamamla Tekrar test yap α talasemi taşıyıısı Normal HbH inkülizyonları α gen analizi βgen analizi Kantitaif HbF, F hüre dağılımı DNA analizi δβ talasemi HPFH HbS Oraklaşma+ α talasemi taşıyıısı Hb C,D,E Hb O Arab Hb Lepore Oraklaşma - Diğer Gerekirse İleri araştırma δ+β tal. taşıyıı δβ taşıyıı Normal Hb A 2

Old J. Sand J Clin Lab Invest, 2007

Moleküler Genetik Testler Algoritma Talasemilerin oğrafi yayılımı Gen tayini Mutasyonların oğrafi yayılımı Panel tayini Hematolojik parametrelerden gelen ipuçları Yöntem tayini

Stripassay Uygulamaları Çoklu mutasyon taramasına olanak veren sistemler Günümüzde sık gözlenen birçok hastalıkla ilgili stripler mevut Hızlı sonuç vermeleri, uuz olmaları ve kolay uygulanabilir olmaları nedeniyle sıklıkla kullanılan yöntemler

Reverse Hibridizasyon talasemi 22 mutasyon içeren testle mutasyonların %90 ı taranır* *Tadmouri ve ark. Am J Haemetol 1998-87 -30 Codon 5 HbC HbS Codon 6 Codon 8 Codon 8/9 Codon 22 Codon 30 IVS 1.1 IVS 1.2 IVS 1.5 IVS 1.6 IVS 1.110 IVS 1.116 IVS 1.25 Codon 36/37 Codon 39 Codon 44 IVS 2.1 IVS 2.745

Reverse Hibridizasyon talasemi

DNA Dizi Analizi DNA nükleotid dizisinin yarı otomatik ya da otomatik genetik analiz ihazları yardımıyla ortaya çıkartılması Mutasyon saptanmasında altın standart kabul edilmekte

HBA Dizi Analizi

Kimerizm Analizi Moleküler genetikte kaydedilen gelişmeler, tek yumurta ikizleri hariç bir kişi için özgün olan DNA profilinin tanımlanmasını sağlamıştır

STR Belirteçleri STR lar (Short Tandem Repeat) polimorfik olmaları ve düşük mutasyon hızına sahip olmaları nedeniyle bu amaçla kullanılan önemli genetik markırlardır. a) 100bp N = 10 100bp 240bp b) 100bp N = 13 100bp 252bp

STR Marker Analizi

MLPA Çalışma Prensibi 1. MLPA probemix denatüre genomik DNA ya eklenir 2. Probun her iki parçası hedef diziye hibridize olur 3. Thermostable ligaz ile probun iki parçası birleştirilir X 5 Y X 5 Y 3 Hedef A 5 3 Hedef B 5

MLPA Çalışma Prensibi Örnek Kontrol Amplifiye ürünler kapiller elektroforezle ayrıştırılır Hedef bölgedeki kopya sayısı değişiklikleri kontrol örneklerle karşılaştırılarak elde edilir Pik alanları aynı örneğe ait diğer örneklerin pik alanlarının ortalaması ile normalize edilir

HBA Probları

HBB MLPA DT: 23.12.1988 Muğla Hb: 12,6 Ht: 33,7 MCV: 65 MCH: 24,4 RBC: 5,18 RDW: 18,1 Hb: 11,1 Ht: 30,4 MCV: 69 MCH: 25,1 RBC: 4,41 RDW: 18,1 Tarama Kendisi Eşi Talasemi Taşıyıılığı HbA: 91,4 HbA2: 4,8 HbF: 3,8 IVS 2.745 [C >G ] 6-7 hafta HbA: 86,4 HbA2: 2 HbF: 11,5 Normal Dizi analizi: EÜTF Tıbbi Genetik Polikliniği

1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 20-04-2012-MLPA.4.fsa^GMsTXT.txt 11-006.4 SMPD1 11-005.2 HS5 11-005.2 HS4 11-005.2 HS4 11-005.2 HS3 11-005.2 HS3 11-005.2 HS3 11-005.2 HS2 11-005.2 HS1 11-005.2 HBE1 exon 01 11-005.2 HBG2 11-005.2 HBG2 exon 03 11-005.2 HBG1 11-005.2 HBBP1 exon 01 11-005.2 HBBP1 exon 03 11-005.2 HBD 11-005.2 HBD exon 01 11-005.2 HBD exon 03 11-005.2 HBB 11-005.2 HBB 11-005.2 HBB promotor 11-005.2 HBB exon 01A 11-005.2 HBB intron 01 11-005.2 HBB intron 02 11-005.2 HBB exon 03A 11-005.2 HBB exon 03B 11-005.2 HBB 11-005.2 HBB Mapview Ratio Delta beta talasemi taşıyıısı 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 20-04-2012-MLPA.3.fsa^GMsTXT.txt 11-006.4 SMPD1 11-005.2 HS5 11-005.2 HS4 11-005.2 HS4 11-005.2 HS3 11-005.2 HS3 11-005.2 HS3 11-005.2 HS2 11-005.2 HS1 11-005.2 HBE1 exon 01 11-005.2 HBG2 11-005.2 HBG2 exon 03 11-005.2 HBG1 11-005.2 HBBP1 exon 01 11-005.2 HBBP1 exon 03 11-005.2 HBD 11-005.2 HBD exon 01 11-005.2 HBD exon 03 11-005.2 HBB 11-005.2 HBB 11-005.2 HBB promotor 11-005.2 HBB exon 01A 11-005.2 HBB intron 01 11-005.2 HBB intron 02 11-005.2 HBB exon 03A 11-005.2 HBB exon 03B 11-005.2 HBB 11-005.2 HBB Mapview Ratio Normal

Talasemi Mutasyon Veritabanları LOVD http://lovd.bx.psu.edu/home.php?selet_db=hbb http://lovd.bx.psu.edu/home.php?selet_db=hba1 http://lovd.bx.psu.edu/home.php?selet_db=hba2 http://lovd.bx.psu.edu/home.php?selet_db=hbd http://lovd.bx.psu.edu/home.php?selet_db=hbg1 HGMD HbVar http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html IthaGenes http://www.ithanet.eu/db/ithagenes

Bilimsel Güçlükler Prenatal genetik danışmada globin genleri ve düzenleyii bölgelerindeki kompleks yapılanmaların fenotipi etkileyebileeği söylenmelidir HS-40 5 LCR // // ζ ε γg γa α2 5 3 Embriyo Fetus ζ2 ε2 Hb Gower α2 γ2 Hb F I α2 ε2 Hb Gower II ζ2 γ2 Hb Portland I ζ2 β 2 Hb Portland II δ α1 Adult α2 β2 Hb A α2 γ2 Hb A2 β 16. Kromozom 11. Kromozom 5 3

Bilimsel Güçlükler β talesemide fenotipik spektrumu etkileyen genetik modifiye edii faktörler Primer: β globin gen mutasyonları + ++ Sekonder: Globin sentezinde rol alan diğer genler Tersiyer: Globin sentezi dışında hastalığın komplikasyonları üzerine etkili genler

Fetal Hemoglobin Regülatörleri Sankaran VG et al. Cold Spring Harb Perspet Med 2013

Fetal Hemoglobin Regülatörleri

Hemoglobinopatilerde Prenatal Tanı Aşamaları Hasta çouk sahibi olma riski içinde olan çiftlerin belirlenmesi Genetik danışma Çiftlerdeki moleküler defektin tanımlanması Bu bozukluğun fetüste araştırılması için fetüsten materyal elde edilmesi Genetik test ve sonuun aileye iletilmesi Fetüs hasta ise ailenin kararı ile gebelik terminasyonu Ailenin izlenmesi

Prenatal Tanı Koriyonik villus biyopsisi CVS) 16-18.haftalarda Kordosentez 10-12. haftalarda 20-. haftalarda

CVS CVS talasemi prenatal tanısında uygun bir yöntem Elde edilen materyal anne hürelerinden mikroskop altında iyi temizlenmeli

Preimplantasyon Genetik Tanı Sperm 2. 2. Preimplantasyon genetik tanı oosit Döllenme zigot 8 blastomer Fetus-adult PCR PCR DNA DNA analizi FISH ytogenetik Sağlam embriyo yerleştirilir. Prenatal tanı ile Kontrol önerilir

Preimplantasyon Genetik Tanı In-vitro oluşturulan embriyolardan, belirlenmiş genetik hastalıklar açısından, sağlam olanlarını seçip anne adayına transfer etmek için uygulanan yöntem Tek hüre biyopsisi Hasta Sağlam Sağlam Hasta Hasta SAĞLAM EMRİYO TRANSFERi

Non-invazif Prenatal Tanı