DNA REPLİKASYONU Yrd.Doç.Dr. Seda Örenay Boyacıoğlu
DNA REPLİKASYONU Replikasyon genetik materyelin tamamen kendi benzeri yeni bir molekül oluşturma işlemidir. DNA kendini eşleyebilen yegane biyomoleküldür Replikasyon sonrası ana DNA molekülü ile tüm nukleotid dizisi tamamen aynı olan DNA molekülü ortaya çıkar. Böylece DNA da taşınan genetik bilgi her replikasyon olayı ile dölden döle aktarılır.
3
DNA replikasyonu yarı koruyucu bir model ile açıklanır. Bu model iki zincirli sarmal DNA nın her bir ipliğinin kalıp görevi yaparak kendine yeni bir eş DNA ipliği oluşturması işlemidir. Böylece bir ana molekülden yeni oluşan her bir yavru molekül, ana DNA nın bir zincirini taşıyacaktır
DNA Replikasyonunun Temel Mekanizmaları Hem prokaryotik hemde ökaryotik hücrelerde replikasyonun temel mekanizmaları aynıdır. Replikasyon başlangıç noktalarının tayini DNA çift ipliğinin çözünmesi Replikasyon çatalının oluşması
Replikasyonda, DNA polimerazdan başka, herbirinin özel bir görevi olan, 20 den fazla enzim ve proteinler gerekmektedir. Tümüne DNA replikaz sistemi veya replizom denir. 6
Replikasyon başlangıç noktalarının tayini: Replikasyonun gerçekleştiği genom birimine replikon denir. Her replikonda bir başlangıç ve bir bitiş noktası vardır. Prokaryotlarda çembersel DNA da bir başlangıç ve bir bitiş noktası, Ökaryotik hücrede ise çok sayıda başlangıç ve bitiş noktaları vardır.
Başlangıç noktaları özel nukleotid dizilerinden oluşur ( A ve T den zengin tekrarlayan nukleotid dizileri) ve diziye özel olan DNA ya bağlanan proteinler = başlatıcı proteinler tarafından tanınır. Bu proteinlerin başlangıç noktalarına bağlanması ile replikasyonun ilk adımı atılır.
9
10
DNA çift ipliğinin çözünmesi Replikasyonun başlıyabilmesi için DNA çift zincirinin sarmal yapısının çözülmesi gereklidir. Çözülme işlemi başlatıcı protein kopleksinde yer alan DNA helikazlar ile gerçekleştirilir.
Replikasyon çatalının oluşması Helikaz aktivitesi ile açılan çift zincirde replikasyonun olduğu bölgeye replikasyon çatalı denir. Replikasyon olayı replikasyon çatalı nın ana DNA molekülü boyunca ilerlemesi ile gerçekleşir.
Replikasyon çatalında replikasyonda iş gören 4 temel yapı vardır; DNA helikaz, DNA sarmalını çözen enzim Primaz, DNA sentezinin başlıyabilmesi için gerekli olan RNA primerlerini (RNA öncül molekül) sentezleyen enzim DNA Polimerazlar, kalıp zincire komplamenter yeni DNA zincirini sentezleyen enzim Tek zincire bağlanan (SSB) proteinler, replikasyon çatalının sürekliliğini saglayan,tek DNA ipliğine bağlanarak katlanmayı önleyen proteinler
DNA polimeraz III, her bir nükleotidin kalıp üzerindeki tamalayıcı bazına uygun olarak, yeni zincire eklenmesini kontrol eder. Eğer kalıp bazdaki adenine uyan, timin yerine sitozin taşıyan nükleotid yeni zincire eklenirse, DNA polimeraz III, yapıya yanlışlıkla katılan nükleotidi hidrolitik olarak uzaklaştırarak, timin taşıyan doğru nükleotidi yerine yerleştirir. 16
Öncül RNA molekülünün Çıkartılıp Atılarak DNA ile Yer Değiştirmesi DNA polimeraz III sentezi, yeni bir öncü RNA ile karşılaşıncaya kadar devam eder. Öncü RNA molekülüne gelindiğinde, DNA polimeraz I ile RNA çıkarılarak DNA polimeraz I ile boşluk doldurulur. 17
DNA replikasyon yönü (yeni sentezlenen zincirin yönü) 5 3 ucuna doğrudur
DNA replikasyon yönü (yeni sentezlenen zincirin yönü) 5 3 ucuna doğrudur DNA molekülü birbirize zıt yönde paralel iki zincir içerdiginden (biri 5 3 diğeri 3 5 ) sentezin aynı anda ve devamlı olarak ilerlemesi mümkün değildir. Bu nedenle replikasyon çatalında iki farklı sentez tipi ortaya çıkar. 1- Devamlı iplik (DNA) sentezi ( 3 5 kalıbına uygun sentez ) 2- Kesikli iplik (DNA) sentezi ( 5 3 kalıbına göre yapılan sentez)
Kesikli DNA zincirlerinin oluşumunu deneysel olarak gösteren Okazaki ve Ark.(1968) dan dolayı bunlara Okazaki Parçaları adı verilmiştir. (ökaryotlarda 100-200 nukleotidlik parçalar) Her bir Okazaki parçasınında başlangıcında RNA primerleri bulunmaktadır.
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Bu teknik (PCR) Cetus firmasının insan genetiği departmanında çalışan araştırmacı Kary MULLIS tarafından 1985 te bulunmuş ve patenti alınmıştır. PCR; ilk defa aynı yıl R. SAIKI, K. MULLİS ve arkadaşları tarafından ortak hücre anemisinin tanısının konulmasında uygulamaya sokulmuştur. 1993 yılında bu çalışma K. MULLIS e NOBEL ödülünü kazandırmıştır. PCR, herhangi bir organizmaya ait genomik DNA daki özgül bölgelerin çoğaltılmasını (amplifikasyonunu) sağlayan basit ama çok başarılı bir invitro DNA sentezi yöntemidir.
PCR; DNA molekülünün milyonlarca hatta milyarlarca kopyasını kısa zamanda yapan bir tekniktir.
Escherichia coli den DNA Polimeraz enziminin kullanılmasının dezavantajı, PCR reaksiyonunda kullanılan yüksek ısılarda denatüre olması ve bu sebeple her PCR siklusu sonucunda taze enzimin yeniden ilave edilmesi zorunluluğuydu. Bu problem termofilik bir bakteri olan, ısıya karşı çok dayanıklı Thermus aquaticus tan DNA polimeraz enziminin elde edilmesiyle ortadan kalkmıştır. Bu enzimin geliştirilmesi aynı zamanda otomatik PCR cihazının geliştirilmesine de imkan tanımıştır. Böylece PCR reaksiyonunda gerekli olan ısı ve zaman ayarlamaları otomatik olarak bu cihazlar vasıtasıyla yapılmış ve teknik daha güvenilir bir hale getirmiştir.
PCR IN PRENSİBİ ve TEKNİĞİ Günümüzde PCR tekniğinin otomasyonu, her bir siklus esnasındaki ısıtma ve soğutma işlemlerini yazılan program doğrultusunda yapan Thermocycler adı verilen PCR otonomları yardımıyla sağlanmıştır.
PCR IN PRENSİBİ ve TEKNİĞİ RNA karakterindeki genomik materyallerde önce, reverse transkriptaz (rt) ile komplementer DNA ya (cdna) çevrilerek amplifikasyonu yapılır. Amplifiye edilecek bölgenin uzunluğu ve primerlerin dizisi tarafından belirlenir. Tepkimenin sahip olduğu yüksek doğruluk ile 20 döngü, kalıbın 1.000.000 kez amplifikasyonuna neden olur. Etkinsizliğin kaynakları örnek DNA sının hedef olmayan bölgelerine primerlerin yapışması, yükseltilmiş ısıda polimerazların etkinsizleşmesi, hazırlanmış kalıbın tam olmayan uzaması oluşturur.
PCR IN PRENSİBİ ve TEKNİĞİ PCR ın çalışma prensibi oldukça basittir. Özet olarak, izole edilen veya patolojik materyallerde bulunan hedef genetik materyallerin (DNA veya RNA), spesifik kısa zincirli oligonükleotit primerler yardımıyla enzimatik olarak sayısal çoğaltılması (amplifikasyon) olarak tanımlanabilir. PCR ın prensibi tekrarlanan üç basamağa dayanır. 1. Denatürasyon (parçalanma) 2. Hibrididasyon (pirimerlerin yerleşmesi) 3. Polimerizasyon (sentez)
PCR IN PRENSİBİ ve TEKNİĞİ Reaksiyonun özgünlüğü çok iyi tanımlanmış oligonükleotitlerin seçilmesi ile sağlanır. Primerler çiftler halinde biri çift zincir DNA yı oluşturan zincirlerden birine, diğeri de o zincirin komplementerine eşleşecek şekilde farklı dizilimlerde tasarlanır. Amplifikasyon için DNA dizisinin bilinmesi gerekli değildir. Birleşme bölgesinin bilinmesi yeterlidir. PCR için saf DNA kullanmaya gerek yoktur. Kaba hücre özütü, total DNA preparatı, bir damla kan
PCR IN PRENSİBİ ve TEKNİĞİ DNA replikasyonunda DNA polimeraz enzimi templatedna (hedef DNA) adı verilen kopya edilmesi amaçlanan sarmalın içerdiği bilgileri kullanarak DNA molekülünün bir kopyası üretilir. Neticede hedef bölgenin uçlarına bağlanarak (annealing yada hibridizasyon işlemi) amplifiye olacak DNA bölgesinin sınırlarını belirlerler. PCR reaksiyonlarında 3 basamak, denatürasyon, hibridasyon ve uzamadan oluşan bu 3 basamak bir siklusu teşkil eder.
1-DENATURASYON PCR işleminin ilk aşamasında amplifiye edilecek matris DNA başlangıçta 95-100 o C ye kadar ısıtılır. DNA yapısının zarar görmesi durumunda, PCR boyunca yanlış yapılan nükleotitler çoğalır. Denatürasyon için genellikle 90-95 o C 30 sn ısı uygulanır. PCR basamakları için kullanılan bu dereceler ve süreler çeşitli faktörlere bağlı olarak değişebilir. Hedef DNA nın Guanin ve Citosin bakımından zengin olduğu durumlarda denaturasyon için 95 o C den daha yüksek bir ısı uygulanabilir.
2-HİBRİDİZASYON DNA nın ısıyla denatüre edilmesi yani çift sarmallı DNA sarmalının birbirinden ayrılması ve sıcaklığın 50 o C ye düşürülmesi ile primerler DNA matrisi üzerinde yoğunlaşırlar. Primerlerden biri kendine ait 5 -terminusu ile hedef DNA lardan birinin 3 -ucu ile ve diğer primerler de, ikinci tek iplikçik DNA nın, anti paralel olarak diğer ucunda bulunan 3 -ucuna bağlanarak, DNA polimeraz ın çalışması yönüne uygun olarak (5-3 ) bağlanırlar. Hibridasyon ısısı genellikle primerlerin erime ısısının 5 o C altında olup 55-65 o C lerde en iyi sonuç verir.
2-HİBRİDİZASYON Yüksek ısının kullanılması yanlış nükleotitlerin primerlerin 3 ucuna bağlanmasını önler. Hibridasyon ısısının düşük tutulduğu durumlarda spesifik olmayan küçük DNA fragmentlerinin oluşması söz konusu olur.
3-POLİMERİZASYON (SENTEZ) Sentez basamağında ise primerlerin DNA polimeraz enzimi vasıtasıyla hedef DNA sarmalını tamamlamaları işlemi gerçekleşir. Yeni şekillenmiş olan sarmal orijinal hedef DNA dan denatürasyon yolu ile ayrılır ve primer hibridizasyonunu, DNA sentezi ve denatürasyon siklusu tekrar edilir. Bütün DNA molekülleri reaksiyonun sonunda çift sarmallı olarak bulunur. TaqDNA polimeraz enzimi, 5-3 yönünden olmak üzere, ortamdaki nükleotidleri kullanırlar, primerlerin 3 terminusuna nükleotidleri yerleştirir ve böylece hedef DNA sekansının bir kopyası elde edilir.
ÖZET OLARAK Enzim reaksiyonu için uygun sıcaklığa ulaşması ile DNA polimerazı, primeri uzatır. Her yeni sarmal sentezi yeni bir çoğalma anlamına gelmektedir. Sentezlenmiş DNA sarmalları matris olarak fonksiyon görmekte ve bu şekilde her bir siklus ile çoğaltılan kalıp DNA sarmal konsantrasyonu da artmaktadır. Önce orijinal matris boyunca yeni bir DNA sarmalı oluşturulur. DNA polimerazı kendiliğinden durana kadar veya yeni bir üreme siklusunun başlamasına kadar DNA sentezler.
n üreme siklusu sayısı, 2 n bir ve ikinci siklustaki ürün (uzunluğu belli değil), x orijinal DNA matrisinin kopya sayısıdır. ÖZET OLARAK İkinci siklusta negatif kopyanın uzunluğu henüz tam olarak belirgin değildir. Üçüncü siklustan itibaren aranan uzunlukta yeni ürünler oluşur. Dördücü siklustan itibaren bu kalıp sequens exponensial çoğalır. Bu kalıp sequensin kopyalama sayısı reaksiyon bitiminde (2 n -2n) x formülü ile hesaplanır.
Kalıp Sequensin Kopyalama Sayısı
ÖZET OLARAK Yüksek DNA-ürün konsantrasyonunda, ürünlerin kendisi de primer olarak etkiyerek spesifik olmayan ürünlerin sentezlenmesine de neden olabilir. Genelde 25-35 siklus sayısı 100ng-1µg DNA nın 50ng genomik DNA dan sentezlenmesi için yeterlidir. Normalde PCR 25-35 siklus arasında yapılır. Artan siklus sayısı ile birlikte siklusta arzu edilmeyen ürünler (artefekt) sayısı, kalıp DNA miktarı bu süre içerisinde sabit kalırken, artefekt sayısı çoğalır.
PCR AMPLİFİKASTON İŞLEMİNİN ETKİNLİĞİ Burada dört faktör önemli rol oynar: Birincisi, PCR daki amplifiye siklus sayısıdır. Geç PCR siklularının erken sikluslara oranla daha az etkili olduğu bildirilmiştir. İkinci önemli faktör, amplifiye edilecek hedef DNA miktarıdır. Yüksek konsantrasyonda hedef DNA ihtiva eden numunelerle çalışıldığında düşük konsantrasyondakilere nazaran daha küçük düzeyde bir amplifikasyonla neticelenir.
PCR AMPLİFİKASTON İŞLEMİNİN ETKİNLİĞİ Üçüncü faktör hedef DNA sekanslarının uzunluğudur. PCR ın etkinliği ile sekanslar arasında ters orantılı bir ilişki mevcuttur. Dördüncü önemli faktör ise primer bağlanması ve hibridizasyon için kullanılan ısı ile alakalıdır. Yüksek ısıda PCR de önemli bir problem olarak kendini gösteren yanlış hibridasyon oluşma ihtimali küçüktür.
TaqDNA polimeraz enzimi en iyi 70 o C de aktivite gösterir ve PCR de denatürasyon için gerekli olan ısılara dayanıklıdır (90-95 o C) PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI PCR da kullanılan önemli komplementler TaqDNA polimeraz, primerler, deoksinükleotidler, hedef DNA ve magnezyum iyonlarıdır. TaqDNA Polimeraz Enzimi DNA polimeraz enzimi için önerilen miktar 1.0-2 U/100µl olup bu miktarı aştığı takdirde spesifik olmayan ürünler şekillenebilir.
PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI TaqDNA polimeraz enziminin, sıcaklığa duyarlı enzimlere karşı iki önemli üstünlüğü vardır; 1. Her denatürasyon siklusunu takiben enzim ilavesine gerek kalmaması. 2. Primerlerin bağlanmasının yüksek sıcaklıklarda daha spesifik ve DNA sentezinin de daha hızlı olmasıdır.
PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI Primerler Konsantrasyonu için ise 0.1-0.5 µmolar tavsiye edilmiştir. Yüksek konsantrasyonlarda kullanılan primerler, özellikle primer dimer adı verilen spesifik olmayan bantların oluşmasına yol açar. Primer dimerler küçük DNA ürünleri olup primerlerin birbirine bağlanması yada DNA polimeraz enziminin spesifik olmayan nükleotidleri kullanılmayan primerlerin uçlarına bağlanması neticesinde oluşan bantlardır.
PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI Sentetik olarak kolayca hazırlanabilen tek iplikçikli DNA segmentleri olan primerler kullanılma amaçlarına göre, 15-40 oligonükleotid den oluşmuşlardır. Bunlar, hedef DNA üzerinde kendine komplementer olan baz sıralarını bularak bağlanır ve burada (3 terminus) DNA sentezinin ilerlemesine teşkil eder.
PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI Pirimerlerin dizaynı Primerlerin dizaynında dikkat edilmesi gereken hususlar aşağıdaki gibi sıralanılabilir. 1. Prokaryotikler için primer uzunluğu 18-22 nükleotidden ve ökaryotikler için ise 24-28 nükleotidden ibaret olmalıdır. 2. Uzun primerler spesifiteyi arttırır. 3. Sarmalların 3 uçlarına bağlanmasından kaçınılmalıdır. Bu primerlerin birbirlerine bağlanmalarına ve böylece primer dimerlerin oluşmasına sebep olabilir.
PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI Pirimerlerin dizaynı 4. Adenin/timin ve guanin/citozin oranları yaklaşık olarak %50 veya hedef DNA dakine benzer olmalıdır. 5. Primerler sürekli olarak 5 ucundan 3 ye doğru sentezlenmeli ve yazılmalıdır. 6. Primerlerin PCR reaksiyonundaki konsantrasyonları 0.1-0.5 µmolar arasında olmalıdır.
PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI Deoksinükleotid trifosfat Yeni DNA sarmalının sentezi için; datp, dttp, dgtp, dctp; hepsi dntps olarak adlandırılan dört farklı deoksinükleotid trifosfata gereksinim vardır. Nükleotidlerin PCR karışımındaki konsantrasyonları 20-200 µmolar olmalı ve 4 nükleotid de aynı oranda kullanılmalıdır.
PCR UYGULAMALARINDA KULLANILAN REAKSİYON KARIŞIMIMLARI Magnezyum iyonları Mg ++ iyon konsantrasyonunun primer bağlanması, kalıp DNA ve PCR ürünlerindeki çift sarmal yapının ayrılma ısısı, primer-dimer yapısı ve enzim aktivitesi üzerine etkisi bulunmaktadır. Gereğinden fazla miktarda Mg ++ ortamda bulunması nonspesifik ürünlerin oluşumuna yol açarken; gerektiğinden az miktarlar ise istenen ürünün yeterince sentezlenmemesine neden olur.
PCR SONUÇLARININ DEĞERLENDİRİLMESİ PCR ile amplifiye edilmiş ürünlerin saptanmasında en yaygın kullanılan metot, bu ürünlerin uygun moleküler ağırlıkta bir marker ile birlikte Ethidium bromide ile boyalı agarose gel üzerine yükleyerek elektroforez işlemine tabi tutmak ve neticede ayrılan bandları UV transimulatör ile gözle görülür bir hale getirmektir. Bunun yanısıra bu teknikten daha duyarlı fakat hazırlanması ve kontrolü daha zor olan Poliakrilamide gel elektroforez (PAGE) metodu da
PCR SONUÇLARININ DEĞERLENDİRİLMESİ
PCR DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ PCR ın en önemli avantajlarından biri olan çok yüksek duyarlılığı aynı zamanda bir dezavantaj olabilir. PCR da en büyük risk, amplifiye edilmiş DNA nın yeni bir reaksiyonundaki kontaminasyonudur. Yeni eldivenin PCR çalışma alanında kullanılması aynı şekilde kirlenmeleri de önler. Birçok kontaminasyonun kaynağının çalışanların eldivenlerine bulaşmış DNA lar olduğu unutulmamalıdır.
PCR DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ Reaktiflerin bulunduğu tüplerin kapakları açılıp kapatılırken özen gösterilmeli; kolay açılan kapaklı tüpler tercih edilmelidir. Deneylerde PCR için özel olarak hazırlanmış otomatik pipetler kullanılmalıdır. PCR ürünlerinin incelenmesinde kullanılan aletler (elektroforez tankları vs.) bir molar HCl ile yıkanmalıdır. Kalıp DNA nın hazırlanması mümkünse ayrı bir yerde ve PCR çalışma yerinden uzak yapılmalıdır.
PCR DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ Kalıp DNA içermeyen negatif kontrol her PCR da birlikte yürütülmeli ve bu şekilde muhtemel bir kontaminasyonun olup olmadığı saptanmalıdır. DNA-plazmidi pozitif kontrol olarak diğer bir laboratuarda hazırlanmalı ve pipetlenmelidir. Her PCR işlemi ile her zaman arzu edilen sonuç sağlanamaz.
PCR DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ Sıklıkla, çift veya daha çok DNA bandı oluşması veya daha az yada hiç reaksiyon olmaması gibi problemler ortaya çıkabilmektedir. Çift veya daha fazla bandlar, asimetrik PCR, çok fazla kalıp DNA ilavesi, primer-dimerlerin oluşması, primerlerin tamplete DNA nın birden fazla yerine bağlanması veya yabancı bir genin bulunması nedeniyle şekillenmektedir.
PCR DA KONTAMİNASYON KAYNAKLARI VE ÖNLENMESİ Çok az veya hiç reaksiyon ürünü olamaması, çok düşük kalitede veya çok düşük miktarda tampletedna oluşmasına, uygun olmayan denatürasyon-bağlanma-çoğalma süresi zamanı veya sıcaklığına yada primer ile birleşecek DNA alanında sekunder yapı oluşumuna bağlıdır. Bu bakımdan her durumda PCR protokolü yeniden gözden geçirilmeli ve gerektiğinde optimize edilmelidir. Yukarıda belirtilen açıklamalar dışında aşağıda belirtilen metodlarla PCR probleminin çözülmesi denenebilir.
PCR çeşitleri Multipleks PCR: Reaksiyon ortamına birçok primer çifti eklenirse, aynı reaksiyonda birden fazla fragmentin üretimi için kullanılabilir ve eğer bu fragmentler farklı uzunluklarda ise jel üzerinde kolayca ayrıştırılabilir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 57
Bu birçok primer çifti setinin kullanıldığı multipleks PCR: Dokuları infekte eden patojen mikroorganizmaları belirlemek, Su veya gıda kontaminasyonuna neden olabilen mikroorganizmaların varlığını belirlemek Mutasyon analizleri Gen delesyon analizi vb. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 58
Ters PCR: Temel PCR'de yapılan düzenlemeler temel primer çifti ile çoğaltılan bölgenin downstreamine ve upstreamine doğru ilerleyen sekansları çoğaltmayı mümkün kılar. Açıklayacak olursak bilinen bir diziye primerlerin bağlandığını düşünürsek bu primerlerin 5'- bölgesinin dışında kalan bölgelerdeki sekansların bulunması için genomik DNA, gen bölgesini ve bilinmeyen dış bölge sekansını içine alan bir ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 59 restriksiyon enzimi ile kesilir.
Bu DNA fragmentine halkasal bir yapı kazandırılır (tıpkı plazmid gibi) böylece primerlerin bağlanacağı noktalar artık içte kalmıştır. Daha sonraki işlem ise bilinen gen bölgesindeki bir restriksiyon enzimi ile tekrar kesim yapılmasıdır. Böylece primerlere ekleme yapıldığında gen bölgesi ile birlikte dış bölgelerde (flanking region) amplifiye edilmiş olur. İşte bu ters PCR olarak bilinir (invers PCR). ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 60
RT-PCR (Reverse Transcriptase) PCR: Reverse Transcriptase tarafından bir cdna fragmenti üretildiğinde, cdna'nin ilk ipliğine kuyruğu [örneğin, oligo(dc)] eklemek için, önce terminal transferaz kullanarak 5'-uç sekansını çoğaltmak mümkündür. Bu oligo(dg) primeri ile spesifik bir gen primerinin kombinasyonu, 5'-bölgesinin çoğaltılmasına imkan tanır. Bu teknik cdna uçlarının hızlı amplifikasyonu (RACE) olarak adlandırılır. 3'-RACE için ökaryotik mrna'ların 3'-uç sekansını çoğaltmak amacıyla gen spesifik primeri ve mrna'nın 3'-ucundaki poli(a) kuyruğuna tutunacak oligo(dt) primeri kullanılır. PCR kütüphaneleri taramak veya blotlama deneylerini gerçekleştirmek için reaksiyonun ilerleyen safhalarında radyoaktif veya modifiye edilmiş nükleotidlerin eklenmesiyle, prob üretimi amacıyla PCR ürününü etiketlemek için PCR kullanılır. PCR aynı zamanda, verilen DNA fragmenti içine spesifik mutasyonların sokulmasında da kullanılır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 61
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 62
Real Time PCR: Geleneksel PCR yöntemlerinde oluşan ürünler, PCR sonrasında gerçekleştirilen ikincil yöntemler (Agaroz jel, PAGE v.b.) ile kontrol edilmektedir. Real Time PCR da ise primerler ile birlikte amplifikasyonu yapılacak kalıp bölgesine spesifik işaretli problar (üzerinde işaretli gruplar bulunduran oigonükleotidler) kullanılmaktadır. Bu problar tıpkı primerler gibi kalıp ile bağlanır (işaret verir: SYBER GREEN problar), bağlanma sonrasında polimeraz sentezine devam ederken bu poblar ile karşılaşır ve 5' - 3' ekzonükleaz aktivitesi ile probu uzaklaştırır (işaret verir: TagMAN problar). Bu yöntem sayesinde reaksiyon devam ederken oluşan ürün miktarı hakkında bilgi sahibi olmak mümkün hale gelmiştir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 63
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 64
RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) PCR: Bu yöntemde ise spesifik primerler yerine spesifik olmayan primerler kullanılır. Bu yöntemdeki amaç ise farklı kaynaklardan elde edilen kalıp DNA ların birbirine benzerliklerinin araştırılmasıdır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 65