KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI TÜRK ÇELTİK ÇEŞİTLERİNİN (ORYZA SATIVA L.) TOHUM DEPO PROTEİNLERİ VE RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD) BELİRLEYİCİLERİ İLE GENETİK ANALİZİ YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Ocak-2009

T.C KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI TÜRK ÇELTİK ÇEŞİTLERİNİN (ORYZA SATIVA L.) TOHUM DEPO PROTEİNLERİ VE RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD) BELİRLEYİCİLERİ İLE GENETİK ANALİZİ SULTAN BAY YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Ocak-2009

İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER SAYFA İÇİNDEKİLER...I ÖZET...III ABSTRACT...V ÖNSÖZ...VII ÇİZELGELER DİZİNİ...VIII ŞEKİLLER DİZİNİ...IX SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ...X 1. GİRİŞ...1 1.1. Çeltik...1 1.1.1. Oryza Taksonomisi...2 1.1.2. Oryza Genom Özellikleri...2 1.2. Bitki Depo Proteinleri...2 1.3. Genetik Belirleyiciler (Genetik Markörler)...4 1.3.1. Morfolojik Belirleyiciler...5 1.3.2. Protein Belirleyicileri...5 1.3.3. DNA Belirleyicileri...6 1.3.3.1. Polymerase Chain Reaction (PCR)...6 1.3.3.2. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)...7 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR...9 3. MATERYAL ve METOT...12 3.1. Materyal...12 3.1.1. Bitki Materyali...12 3.1.2. Depo Proteinleri Ekstraksiyon Çözeltisi...12 3.1.3. 4X Alt Tampon Çözeltisi...12 3.1.4. 4X Üst Tampon Çözeltisi...13 3.1.5. Acrylamide Stok Çözeltisi (39:1)...13 3.1.6. SDS-PAGE Yürütme Tampon Çözeltisi...13 3.1.7. 2XSDS-PAGE Örnek Çözeltisi...13 3.1.8. Staining (Boyama) Çözeltisi...13 3.1.9. Destaining (Yıkama) Çözeltisi...13 3.1.10. CTAB Ekstraksiyon Çözeltisi...13 3.1.11. Choroform:Isoamylalcohol Çözeltisi...13 3.1.12. TE Çözeltisi...13 3.1.13. TAE Tampon Çözeltisi...14 3.1.14. Agaroz Jeli Yükleme Çözeltisi...14 3.2. Metot...14 3.2.1. Tohum Depo Proteinlerinin Ekstraksiyonu...14 3.2.2. SDS-PAGE Jellerinin Hazırlanması...14 3.2.3. Staining (Boyama)...14 3.2.4. Destaining (Yıkama)...14 3.2.5. Genomik DNA İzolasyonu...15 3.2.6. Agaroz Jellerinin Hazırlanması...15 3.2.7. DNA Miktar Tayini...15 3.2.8. Polymerase Chain Reaction (PCR) Amplifikasyonları...15 3.2.9. PCR Ürünlerinin Elektroforez ile Ayrımı...16 I

İÇİNDEKİLER 3.2.10. RAPD Bant Profillerinin Değerlendirilmesi ve İstatistiksel Analizler...17 4. BULGULAR ve TARTIŞMA...18 4.1. Tohum Depo Proteinleri...18 4.2. RAPD Belirleyicileri...20 4.2.1. Ön PCR Amplifikasyonları...20 4.2.2. PCR Amplifikasyonları...20 4.2.3. Genetik Benzerlik ve Uzaklıkların Belirlenmesi...28 5. SONUÇ ve ÖNERİLER...36 KAYNAKLAR...37 ÖZGEÇMİŞ...43 II

ÖZET T.C KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET TÜRK ÇELTİK ÇEŞİTLERİNİN (ORYZA SATIVA L.) TOHUM DEPO PROTEİNLERİ VE RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD) BELİRLEYİCİLERİ İLE GENETİK ANALİZİ SULTAN BAY Danışman : Yrd. Doç. Dr. E. Banu BÜYÜKÜNAL BAL Yıl: 2009 Sayfa: 43 Jüri: Yrd. Doç. Dr. E. Banu BÜYÜKÜNAL BAL : Doç. Dr. Canan CAN : Yrd. Doç.Dr. Ahmet KAYRALDIZ Bu çalışmada Türk çeltik çeşitleri (Oryza sativa L.) arasındaki genetik polimorfizm tohum depo proteinlerine ve Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) belirleyicilerine bağlı olarak incelenmiştir. Çalışmada 32 adet çeltik çeşidi kullanılmıştır. Bunlardan 21 tanesi Türkiye orijinli melez çeşitler olup, 11 tanesi ise yurtdışı orijinli çeşitlerden oluşmuştur. 20 çeşitten elde edilen tohum depo proteinleri Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) ile incelenmiştir. Sonuçlar, SDS- PAGE profilleri tüm çeşitler için genelde benzer olmakla beraber bazı çeşitler için (Kargı, Demir ve Rodina) elde edilen bantlar daha yoğun olmuştur. Ayrıca Kargı ve Demir çeşitleri için 28 kda büyüklüğünde ekstra bir bant gözlenmiştir. Tüm çeşitler üzerinde 20 adet RAPD primeri test edilerek, çeşitler arasında polimorfik ve tekrarlı PCR uygulamalarında uyumlu bant veren 7 adet primer (OPAJ 01, OPAA 13, OPAL 08, OPO 01, OPB 05, OPG 04 ve OPK 01) belirlenmiştir. Belirlenen primerler ile boyları 250 ile 2500 baz çifti (bç) arasında değişen toplam 42 bant elde edilmiştir. Bu bantların 29 tanesi (%69) polimorfik iken 13 tanesi (%31) non-polimorfik karakterdedir. Bantların skorlanması sonucu elde edilen matrisler, genetik benzerlik (Simple Matching, Jaccard ve Dice katsayılarına bağlı) ve genetik uzaklık (Nei-72) değerlerinin elde edilmesinde kullanılmıştır. Benzerlik ve uzaklık değerlerinin Unweighted Pair-Group Method Arithmetic Average (UPGMA) metodu III

ÖZET ile gruplandırılması sonucunda, birkaç çeşidin birbirinden farklı şekilde yerleşimi dışında temelde benzer dendogramlar (genetik ağaçlar) oluştuğu gözlenmiştir. Bu verilere göre iki ana grup gözlenmiştir. Sürek-95, Serhat-92 ve Rocca çeşitleri bir ana grupta yer alırken, diğer çeşitlerin tümü bir başka ana grupta yer almıştır. Anahtar Kelimeler: Çeltik (Oryza sativa L.), Tohum depo proteinleri, SDS-PAGE, RAPD, PCR, Belirleyici, UPGMA IV

ABSTRACT KAHRAMANMARAS SUTCU IMAM UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOLOGY M.S. THESIS ABSTRACT GENETIC ANALYSIS OF TURKISH RICE VARIETIES (ORYZA SATIVA L.) BASED ON SEED STORAGE PROTEINS AND RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD) MARKERS Supervisor: Assist. Prof. Dr. E. Banu BÜYÜKÜNAL BAL Year: 2009 Pages: 43 Jury : Assist. Prof. Dr. E. Banu BÜYÜKÜNAL BAL : Assoc. Prof. Dr. Canan CAN : Assist. Doç.Dr. Ahmet KAYRALDIZ In this study, genetic polymorphism among Turkish rice varieties (Oryza sativa L.) based on seed storage proteins and Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) markers were assessed. Thirty-two varieties, 21 of them from Turkish origin and 11 of them from different countries were used. Seed storage proteins obtained from twenty varieties were analyzed by Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). SDS-PAGE profiles were revealed that all of the studied cultivars have the similar pattern, but intensity of the bands was higher for some cultivars such as Kargı, Demir, and Rodina. In addition, a presence of an extra band with the size of 28 kda was observed for Kargı and Demir varieties. Twenty RAPD primers were tested on the all varieties and 7 primers (OPAJ 01, OPAA 13, OPAL 08, OPO 01, OPB 05, OPG 04 and OPK 01) producing polymorphic and reproducible bands in repeated PCR applications were detected. Those selected primers produced 42 bands within the size range of 250 to 2500 base pairs (bp). Of those 42 bands, 29 of them were polymorphic (69%), while 13 of them were non-polymorphic (31%). The matrices were obtained by scoring of all bands and those were used to estimate genetic similarities (based on Simple Matching, Jaccard ve Dice coefficients) and genetic distances (based on Nei-72) values. Unweighted Pair-Group Method Arithmetic Average (UPGMA) based grouping of V

ABSTRACT genetic similarity and dissimilarity values were used to construct dendograms and all dendograms were similar to each other, except for the displacement of few cultivars. Based on this data, two main groups were observed. Sürek-95, Serhat-92, and Rocca were placed in one main group, while the others were grouped in another main group. Key Words: Rice (Oryza sativa L.), Seed storage proteins, SDS-PAGE, RAPD, PCR, Marker, UPGMA VI

ÖNSÖZ ÖNSÖZ Bu çalışmada Türkiye de yetiştirilen çeltik çeşitleri, tohum depo proteinleri ve RAPD belirleyicileri kullanarak genetik yönden analiz edilmiştir. Bu çalışmalar sırasında her zaman yanımda ve bana destek olan, ve tez çalışmalarım sırasında yardımlarını esirgemeyen, bilgi ve donanımı ile beni yetiştiren danışman hocam Yrd. Doç. Dr. E.Banu BÜYÜKÜNAL BAL a teşekkür ederim. Ayrıca beni bu günlere getiren, eğitimim sırasında maddi manevi hiçbir desteği esirgemeyen annem, babam ve kardeşlerime sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ocak 2009 KAHRAMANMARAŞ VII

ÇİZELGELER DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Oryza türlerinin genom tiplerine göre gruplandırılması...2 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan Oryza sativa çeşitleri ve ebeveynleri...12 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan RAPD primerlerinin baz dizilimi, T m değerleri ve GC içerikleri...16 Çizelge 4.1. Çeltik örneklerinde polimorfik bant veren RAPD primerleri ve oluşan bantların özellikleri...28 Çizelge 4.2. Genotipler arasındaki Jaccard katsayı benzerlikleri...31 VIII

ŞEKİLLER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Çeltik tohumunun anatomik yapısı...4 Şekil 1.2. Genetik belirleyici çeşitleri...5 Şekil 1.3. PCR yöntemindeki aşamaların şematik olarak gösterimi...7 Şekil 1.4. RAPD tekniğinin şematik gösterimi...8 Şekil 4.1. SDS-PAGE sonrası oluşan tohum depo proteinlerine ait bant profilleri...19 Şekil 4.2. OPAJ 01 RAPD primeri ile elde edilen bant profili...21 Şekil 4.3. OPAA 13 RAPD primeri ile elde edilen bant profili...22 Şekil 4.4. OPAL 08 RAPD primeri ile elde edilen bant profili...23 Şekil 4.5. OPO 01 RAPD primeri ile elde edilen bant profili...24 Şekil 4.6. OPB 05 RAPD primeri ile elde edilen bant profili...25 Şekil 4.7. OPG 04 RAPD primeri ile elde edilen bant profili...26 Şekil 4.8. OPK 01 RAPD primeri ile elde edilen bant profili...27 Şekil 4.9. SM katsayıları kullanılarak elde edilen UPGMA dendogramı...32 Şekil 4.10. Dice benzerlik katsayıları kullanılarak elde edilen UPGMA dendogramı...33 Şekil 4.11. Jaccard benzerlik katsayıları kullanılarak elde edilen UPGMA dendogramı...34 Şekil 4.12. Nei 72 uzaklıklarına bağlı olarak elde edilen UPGMA dendogramı...35 IX

SİMGELER ve KISALTMALAR SİMGELER VE KISALTMALAR CTAP: Hexadecyltrimethylammonium bromide EDTA: Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism PCR: Polymerase Chain Reaction SSR: Simple Sequence Repeat SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis IEF: Isoelectric Focusing kda: Kilodalton bç: Baz Çifti mm: Milimolar UPGMA: Unweighted Pair-Group Method, Arithmetic Average NTSYS: Numerical Taxonomy and Multivariete Analysis System µl: Mikrolitre rpm: Dakikadaki Devir Sayısı dntp : Deoksiribonükleotidtrifosfat DNA: Deoksiribo Nükleik Asit TEMED: N,N,N,N,-tetramethlyathylenediamine APS: Ammonium persulfate Magnesium Chloride (MgCl 2 ): Magnezyum Klorür TE: Trizma base ve EDTA çözeltisi X

GİRİŞ 1. GİRİŞ 1.1. Çeltik Tahıllar dünyadaki besin mahsullerinin %80 ini temsil etmektedir. Bunlar arasında, çeltik (Oryza sativa L.) dünya nüfusunun yaklaşık yarıdan fazlasının besin kaynağı olarak yararlandığı en önemli ürünlerden biridir (Khush, 1997). Tüm dünya popülasyonu için (özellikle hayvansal proteinin pahalı olduğu gelişen ülkelerde) önemli bir kalori (%60) ve protein kaynağını meydana getirmektedir. Asya daki besin diyetlerinin proteinlerine %28 ila %54 arasında katkıda bulunmaktadır (Duff, 1991). Bu özellikleri ile potansiyel bir genetik kaynak olmalarının yanı sıra fazla miktarda ekonomik ve tarımsal öneme sahiptir. Dünya çeltik üretiminde ilk sıraları Çin, Hindistan, Bangladeş, Endonezya ve Tayland almaktadır. Çeltik üretiminin yapıldığı diğer ülkeler arasında, ABD, Vietnam, Brezilya ve Filipinler bulunmaktadır. 2000 yılında dünyada çeltik üretimi 597.154.664 tondur. Aynı yıl dünyada üretilen mısır 589.355.356 ton iken buğday 580.014.595 tondur (Anonim, 2001). Türkiye de 1999 yılında tahıl üretimine ayrılmış alan 9.4 milyon hektardır. Bu alanın 65 bin hektarında çeltik ekimi yapılmaktadır. Türkiye de üretilen çeltik yılda yaklaşık 165 bin tondur. Ülkemizdeki başlıca çeltik üretim alanlarını Marmara, Karadeniz ve Ege bölgeleri oluşturmaktadır. En çok çeltik üretimi yapılan iller ise başta Edirne olmak üzere, sırasıyla Çorum, Samsun, Sinop, İzmir, Manisa, Balıkesir ve Kastamonu dur. Ülkemizde bazı yıllarda üretilen ürün, gereksinimi karşılamadığından çeltik ithal edilmektedir. Çeltik tarımı ilk olarak M.Ö. 3000 yıllarında Hindistan da başlamış, daha sonra Batı ya doğru yayılmıştır. Avrupa ya gelişi ortaçağa rastlamaktadır. Türkiye de ise 500 yıl önce başladığı düşünülmektedir (Kün, 1985). Oryza türleri dünyada geniş bir dağılım göstermekte ve çok çeşitli habitatlarda (bataklık, savan, ormanlık alan, sürekli yeşil ormanlar, tatlı su lagünleri, durgun sular, derin sular sığ sular ve yavaş hareket eden sular gibi) bulunabilmektedirler. Çeltik türleri bu ortamlara değişken uzunlukta boy geliştirerek ve yüksek düzeyde nem ve güneş ışığına (güneşten gölgeye değişebilen) tolerans göstererek adapte olmaktadır (Vaughan, 1994). Tropik, astropik ve ılıman bölgelerde yaygın olarak tarımı yapılan çeltik, su içinde yetiştirilen tek tahıl bitkisidir. Diğer tahıl bitkileri su içinde uzun süre yaşayamayıp canlılığını yitirdiği halde, çeltik suda erimiş oksijeni kullanarak gelişir. İklim isteği açısından Sıcak İklim Tahılları grubundan bir bitkidir. Dünya toplam tahıl ekilişinde %53, üretiminde ise %59 pay alan sıcak iklim tahılları ülkemizde toplam tahıl ekilişinde %4.1, üretiminde ise %9.8 gibi düşük bir seviyededir (Gençtan ve ark., 1995). Hasadın ardından elde edilen çeltik, kavuzları çıkartılarak parlatılır ve beyaz renkli pirinç tanelerine dönüştürülür. Tanelerin görünümünü düzeltmek amacıyla yapılan parlatma işlemi, aslında ürünün besleyici değerinin büyük ölçüde yitirilmesine neden olur. Çünkü bu işlem sırasında tanelerin yüzeyini çevreleyen protein, yağ, tiyamin (B1 1

GİRİŞ vitamini), niyasin (nikotinik asit), riboflavin (B2 vitamini), demir ve kalsiyum bakımından zengin dip katman kaybolmakta ve geriye yalnızca nişastaca zengin bir ürün kalmaktadır. 1.1.1. Oryza Taksonomisi Oryza cinsi 9 farklı genoma sahip yaklaşık 22 türden oluşmakta ve Poaceae familyası ile Oryzoideae alt familyasına dahil bulunmaktadır (Vaughan, 1994; Aggarwal ve ark., 1997) (Çizelge 1.1.). Bu türler arasında iki tür O. sativa and O. glaberrima kültüre edilen, geri kalan 20 tür ise yabani türlerdir. Sistematik olarak Oryza türleri O. sativa, O. officinalis, O. ridleyi ve O. meyeriana olmak üzere 4 tür kompleksinde yer almaktadır (Vaughan, 1994). Çizelge 1.1. Oryza türlerinin genom tiplerine göre gruplandırılması (Vaughan, 1994; Aggarwall ve ark., 1997). Tür İsmi Genom Kaynağı Coğrafi Orijini Oryza sativa AA A.B.D. (Pioneer Valley Seed) O. barthii AA Sierra Leone (USDA), Yeni Gine (USDA) O. rufipogon AA Tayvan (USDA), Myanmar (USDA) O. glaberrima AA Nijerya (USDA), Gana (USDA) O. nivara AA Hindistan (USDA) O. meridionalis AA Avustralya (IRRI) O. officinalis CC Filipinler (USDA) O. rhizomatis CC Sri Lanka (IRRI) O. eichingeri CC Sri Lanka (IRRI) O. latifolia CCDD Guatemala (IRRI) O. alta CCDD Bilinmiyor (IRRI) O. grandiglumis CCDD Brezilya (IRRI) O. punctata BBCC, BB Bilinmiyor O. minuta BB Filipinler (IRRI) O. australiensis EE Avustralya (IRRI) O. brachyantha FF Kamerun (IRRI) O. meyeriana GG Filipinler (IRRI) O. granulata GG Laos (IRRI) O. ridleyi HHJJ Tayland (IRRI) O. longiglumis HHJJ Endonezya (IRRI) O. schlechteri Bilinmiyor Bilinmiyor 1.1.2. Oryza Genom Özellikleri Diploit ve allotetraploit Oryza türlerinin somatik hücre sayısı sırasıyla 2n=24 ve 2n=48 olup, temel kromozom sayısı x=12 dir (Vaughan, 1994). Oryza cinsinde Çizelge 1 de gösterilen 9 genom (AA, BB, CC, BBCC, CCDD, EE, FF, GG, HHJJ) tanımlanmıştır (Vaughan, 1994; Aggarwal ve ark., 1997). Genom ayrımı hibrit bitkilerde kromozom eşleşmesi esas alınarak yapılmaktadır (Morinaga, 1943; Morinaga ve Kuriyama, 1959). Kültür edilen türlerden O. sativa AA genomuna sahiptir. 1.2. Bitki Depo Proteinleri Depo proteinleri bitkilerde genellikle tohum, tüber ve köklerde birikmektedir, ancak angiospermlerde depo proteinleri denilince tohum depo proteinleri anlaşılmaktadır. Bitki depo proteinleri tahıl tohumlarının %50 sini meydana getirmektedir. Tohum içinde protein 2

GİRİŞ kitlesi (protein body) halinde bulunmakta ve tohum çimlenmesi esnasında gerek duyulan iki element olan nitrojen ve sülfürü sağlamaktadırlar (Higgins, 1984; Zhou ve ark., 1993). Bitki depo proteinleri kimyasal yapı itibarı ile birbirinden çok küçük farklılıklar gösteren birkaç gruptan meydana gelmektedir. Çeltik depo proteinleri çözünebilirlik özelliklerine göre dört sınıfa ayrılmaktadır (Osborn, 1924). Bunlar, suda çözünen albüminler, tuzda çözünen globülinler, alkolde çözünen prolaminler ve seyreltik asit veya bazda çözünen glutelinlerdir. Önceleri Osborn un önerdiği çözünebilirlik sınıflaması yerine sonraları Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS- PAGE) gibi standart metodlara dayalı protein ayrım yöntemleri kullanılmaya başlamıştır (Laemmli, 1970). SDS-PAGE ile proteinler moleküler ağırlıklarına göre ayrılmaktadır. Diğer bir elektroforez yöntemi olan ve proteinleri izoelektrik noktalarına göre ayırmayı hedefleyen Isoelectric Focusing (IEF) elektroforezinde çeltik glutelin asidik alt ünitelerinin en az 12, bazik alt ünitelerinin ise en az 9 bant oluşturduğu bildirilmiştir (Wen ve Luthe, 1985). Son olarak gelişen Two-Dimensional (2-D) jel elektroforezi ise SDS-PAGE ve IEF tekniklerinin proteinleri farklı özelliklerine göre ayrım gücünü kullanarak çok daha hassas bir ayrım sağlayabilmektedir. Çeltik tohumunda PB-I ve PB-II olarak isimlendirilen iki farklı protein kitlesi depo vakuolu bulunmaktadır. Glutelin ve globulin PB-II de depolanırken, prolaminler endoplazmik retikulumdan köken alan PB-I de depolanmaktadır (Becthel ve Juliano, 1980). Çeltik glutelinleri 11 S globulin olarak bilinen aynı atasal genden köken almaktadır. Çeltik glutelinleri, 57 kda moleküler ağırlığında öncül bir proteinden sentezlenerek, golgi veya endoplazmik retikulum aracılığıyla PB-II içine taşınmakta ya da direkt olarak endoplazmik retikulumda işlenerek 37 kda moleküler ağırlığındaki asidik ve 20 kda moleküler ağırlığında bazik olgun (mature) alt üniteleri meydana getirmektedir (Yamagata ve ark., 1982; Furuta ve ark., 1986; Krishnan ve Okita, 1986). Tipik bir çeltik tohumunda dıştan içe doğru tohum gömleği, kavuz ve alevron tabakaları bulunmaktadır. Alevron tabakası ile çevrili durumda bulunan nişastalı endosperm kısmı alt alevron tabakası ve iç endospem kısımlarından oluşmaktadır. Alt endosperm tabakası daha detaylı olarak Transmission Electron Mikroskobunda (TEM) incelendiğinde büyük küresel protein kitlesi (PB-II), küçük küresel protein kitlesi (PB-I), kristal protein kitlesi ve nişasta granülleri içermektedir. Tohum embriyosu ise endosperm içinde yer almaktadır.(şekil 1.1.). Son yıllarda tohum depo proteinleri moleküler biyoloji çalışmalarında oldukça dikkat çekmektedir. Bunun sebebi ise proteinlerin ifadesi ve birikimleri aşamasının bitkilerde doku ve büyüme evresi yönünden özgün olmasıdır (Goldberg ve ark., 1989). Diğer tahıllarda temel depo proteinlerini oluşturan prolaminler yerine çeltikde baskın halde bulunan glutelinler ağırlık bazında toplam depo proteinlerinin % 60-75 ini oluşturmaktadır (Ogawa ve ark.,1987). Çeltiğin düşük prolamin içermesi onu tahıllar arasında en yüksek kaliteli hale getirmektedir (Coffman ve Juliano, 1987). Bununla birlikte, diğer tahıllar %60 a varan prolamin içerikleri ile düşük besinsel değere sahip olarak düşünülmektedir (Bhatia ve Rabson, 1987). 3

GİRİŞ Alevron tabakası Nişastalı endosperm İç endosperm Tohum gömleği Nişastalı endosperm Kavuz Embriyo Alt alevron tabakasının Transmission Elektron Mikroskop (TEM) görünümü Alt alevron tabakası Büyük küresel protein kitlesi (PB-II) Küçük küresel protein kitlesi (PB-I) Steril lemna Nişasta granülü Kristal protein kitlesi Şekil 1.1. Çeltik tohumunun anatomik yapısı (Coffman ve Juliano, 1987). Çeltik 10 kda prolamin polipeptidi kükürt içeren sistein ve metiyonin amino asitleri bakımından zengin olmakla birlikte, yüksek düzeyde prolin ve treonin amino asitleri içermektedir (Hibino ve ark., 1989). Tohum depo proteinleri, çeşitli bitki türlerine ait çeşitlerin tohumlarındaki protein varyasyonunun incelenmesinde kullanılmaktadır. Bu bilgi tohumların saflığı hakkında bilgiler sunmakla birlikte ıslah çalışmalarında kullanılacak çeşitlerin seçimi için yarar sağlamaktadır. Çeltikte depo proteinleri varyasyonlarının araştırılması konusunda çok sayıda çalışma bulunmaktadır (Furukawa ve ark., 2003; Jahan ve ark., 2005). Önemli bir protein kaynağı olması nedeniyle çeltikdeki depo proteinlerinin kalitesinin ve besinsel değerinin arttırılması çok önem taşımaktadır. 1.3. Genetik Belirleyiciler (Genetik Markörler) Genom analizlerinde kullanılan genetik belirleyiciler; morfolojik, protein esaslı ve DNA esaslı olmak üzere başlıca üç tiptedir. Bu üç tipe dahil olan farklı tipteki diğer alt grup belirleyiciler ve bunların tarihsel olarak kullanılmaya başlandıkları zaman Şekil 1.2. de gösterilmektedir. Bir tür içindeki genotipler arasında var olan çeşitlilik (varyasyon) genom analizleri için temel oluşturmaktadır. Genetik bir belirleyici olabilmek için belirleyici lokusunun bir test populasyonunun bireyleri arasında deneysel olarak tespit edilebilir çeşitlilik göstermesi gerekmektedir. Çeşitlilik, basit olarak kalıtılabilir bir fenotipten, tek bir nükleotit değişiminin tespitine kadar uzanabilen farklı biyolojik düzeylerde incelenebilir. Çeşitlilik tanımlandığında ve test populasyonunu oluşturan bütün genotipler bilindiğinde, lokuslar arasındaki rekombinasyon olaylarının sıklığı belirleyiciler arasındaki bağlantıyı belirlemede kullanılmaktadır. 4

GİRİŞ Zaman Anonim Belirleyiciler Genom Biliminim Hedefleri İşlevi Bilinmeyen Tüm DNA Dizilimleri AFLP Mikrosatelitler DNA Dizilimi Bilinen veya Tanımlanan Belirleyiciler Tam Protein Arşivleri İşlevi Bilinen Tüm DNA Dizilimleri cdna Dizilimleri ve cdna Belirleyicileri (ETS) SCAR RAPD Dizilim Spesifik PCR (STS) Klonlanmış Genomik Parçalar (RFLP, Minisatelitler) RFLP probu olarak klonlanmış genler İzozimler Sitoloji Morfoloji Şekil 1.2. Genetik belirleyici çeşitleri (Ben Hui Liu, 1998). 1.3.1. Morfolojik Belirleyiciler İlk haritalama çalışmaları, şekil, renk, büyüklük ve uzunluk gibi basit Mendel kalıtımı gösteren özellikler üzerinde yoğunlaşmıştır. Morfolojik özellikler, genetik özellikleri kontrol eden genlerin bire bir cevabına sahiptir. Bu gibi durumlarda, morfolojik karakterler ya da fenotipler belirli bir gen için güvenilir belirleyiciler olarak kullanılabilir ve kromozomlar üzerinde genetik belirleyiciler olarak yarar sağlamaktadır. Pek çok canlıda (insan, fare, mısır, domates vs) morfolojik belirleyiciler çalışılmış ve haritalanmıştır. Morfolojik belirleyicilerin bir kısmı tek bir gendeki değişimleri temsil eden nokta mutasyonlarından kaynaklanmaktadır. Diğer kısmı ise bu şekilde basit bir genetik temele sahip olmayabilir. Morfolojik belirleyicilerin gözlemi kolaydır, ancak tek bir ya da birkaç populasyonda kalıtım özelliği gösteren fazla sayıda morfolojik belirleyicinin bulunma durumu zor olabilmektedir (Ben Hui Liu, 1998). 1.3.2. Protein Belirleyicileri Proteinler gen ürünleridir. Genlerin farklı alelleri, farklı amino asit kompozisyonuna, büyüklüğüne ve modifikasyonuna sahip proteinleri oluşturabilmektedir. Proteinlerin yük veya büyüklüklerindeki farklılıklar jel elektroforezi ile rahatça saptanabilmektedir. İzozimler uzun zamandan beri yaygın şekilde kullanılan protein belirleyici çeşidini meydana getirmektedir. İzozimler; aynı enzim aktivitesine sahip elektroforetik hızı farklılık gösteren alternatif enzim formları olarak tanımlanmakta ve farklı izozimler elektroforez kullanılarak tespit edilebilmektedir. Bu belirleyiciler, enzim aktivitesinden yararlanarak jeller üzerinde enzim bantlarının gözlemlenmesi prensibi ile 5

GİRİŞ çalışmaktadır. İzozimler, sayılarının az olması ve bitkinin gelişim aşamasına bağımlı olmaları nedeni ile sınırlı kullanıma sahiptir. Bununla birlikte izozimler çeltik, mısır, buğday ve diğer birçok bitki ve hayvan türünde yoğun şekilde kullanılmaktadır (Madhavilatha ve ark., 2005; Sanchez ve ark., 2006). Diğer bir protein belirleyici, herhangi bir biyolojik görev ile ilgili olmayan toplam proteinlerin yük ve büyüklüklerine göre jel elektroforezi sisteminde ayrılmasıdır. Bu tür belirleyici bilgilerinin genetik yorumu güç olabilmektedir. Ancak gelecekte bir organizmaya ait daha fazla DNA bilgisinin elde edilmesi ile bu tür bilgilerin protein yapı ve fonksiyon ilişkilerinin aydınlatılmasında kullanılması mümkün olabilecektir. 1.3.3. DNA Belirleyicileri Genom dizilim kompozisyonunu temsil eden ve bu şekilde farklı bireylerde bulunan genetik farklılığın tespit edilmesine izin verebilen DNA belirleyicileri oldukça önem taşımaktadır. Küçük bir DNA parçasında bir türe ait bireyler arasında dizilim polimorfizmine dayanan kalıtılabilir farklılıkların tespitinde iki yaklaşım (hibridizasyon ve PCR) kullanılmaktadır. Son yıllarda çok çeşitli DNA belirleyicileri geliştirilmiştir. İlk olarak geliştirilen belirleyici sistemi olan Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) hibridizasyona dayanmaktadır (Bolstein ve ark., 1980). Hibridizasyona dayalı bu belirleyicilerden sonra Polymerase Chain Reaction (PCR) teknolojisinin keşfi ile birlikte çok sayıda diğer belirleyici sistemler ortaya çıkmıştır. Bunlardan en önemlileri Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Simple Sequence Repeat (SSR), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) gibi belirleyicilerdir (Welsh ve Mcclelland, 1990; Williams ve ark., 1990; Akkaya ve ark., 1992; Vos ve ark., 1995). 1.3.3.1. Polymerase Chain Reaction (PCR) 1983 yılında keşfedilen PCR, hedef bir DNA parçasının laboratuar koşullarında amplifikasyonuna (çoğaltılmasına) izin vermektedir. PCR esnasında amplifiye edilmek istenen DNA bölgesinin yanlarında bulunan DNA dizilimlerine komplementer (tamamlayıcı) primer olarak isimlendirilen kısa oligonükleotidler kullanılmaktadır. Hedef DNA ve iki primere ek olarak reaksiyon için gerekli diğer bileşenlerin (Taq DNA polimeraz, deoksinükleotidler, tampon çözelti, MgCl 2 ) ilavesi sonrasında herbiri 3 aşamadan oluşan (denatürasyon, bağlanma ve polimerizasyon) döngülerin tekrarı ile reaksiyon tamamlanmaktadır (Şekil 1.3.). Denatürasyon aşamasında 94 o C de çift zincirli DNA molekülleri birbirinden ayrılmaktadır. Bağlanma aşamasında primerlerde bulunan nükleotid içeriğine bağlı olarak sahip olacakları erime sıcaklığı (T m ) civarında bir sıcaklıkta, primerler hedef DNA yakınlarına bağlanacaktır. Polimerizasyon aşamasında ise 72 o C de çalışan bir Taq DNA polimeraz aktivitesi ile hedef bölgenin kopyası zincir karşısına primerin bağlanma bölgesinden itibaren 5' yönden 3' yöne doğru sentezlenecektir (Şekil 1.3.). 6

GİRİŞ Şekil 1.3. PCR yöntemindeki aşamaların şematik olarak gösterimi. a.denatürasyon, b. Bağlanma, c. Polimerizasyon. Taq DNA polimeraz büyük P harfi ile temsil edilmektedir. PCR, genetik materyaller üzerindeki çalışmalarda, nükleik asit karekterizasyonunda, moleküler klonlamada, dizi analizlerinde, rekombinant DNA teknolojisinde ve klinik uygulamalarda kullanılmaktadır (Kumar, 1989). 1.3.3.2. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) tekniğinin anahatları gösterilmiştir. (Şekil1.4.) Bu teknikte genellikle 10 baz çifti (bç) uzunluğunda rastgele baz dizilime sahip tek bir primer PCR amplifikasyonlarında kullanılmaktadır. Primerlerin DNA ya bağlandığı DNA bölgesinde var olan bir mutasyon sonucu PCR amplifikasyon ürünlerinin jel elektroforezinde ayrılması sonrasında oluşacak bant görünümünde farklılık olacaktır. RAPD belirleyicileri günümüzde çok yaygın olarak kullanılan bir belirleyici tekniğini oluşturmaktadır. Özellikle ucuz oluşu ve uygulanması için DNA dizilim bilgisine gereksinim duyulmayışı gibi avantajları nedeniyle, genetik çeşitlilik ve genom haritalama çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Radyoaktif olarak yapılmaması ve basit olması nedeniyle bu teknik çoğu organizmada genetik çeşitliliğin tespit edilmesi için kullanılmıştır (Yu ve Nguyen, 1994). Bunun yanı sıra, moleküler parmak izi analizinde (Baird ve ark., 1992; MacGowan ve ark., 1993; Stiles ve ark., 1993; Yu ve Nguyen, 1994), evrimsel analizlerde, genetik haritalamada (Uphoff ve Wricke, 1992; Kiss ve ark., 1993) ve populasyon çeşitliliği analizlerinde (Chapco ve ark., 1992; Kambhampati ve ark., 1992; Dawson ve ark., 1993) kullanılmaktadır. Populasyonlar içinde ve arasında var olabilen çeşitliliği araştırmada RAPD lerden yaralanılması uygundur, ancak bu belirleyicilerde bulunan dominant kalıtım özelliği genlerin alel sıklığının araştırılmasına dayalı populasyonların yapısının incelendiği araştırmalarda olumsuzluk sunmaktadır. Buna ilaveten, RAPD profillerinin rastgele primerler kullanılarak oluşturulması esnasında PCR yönteminin kendi hassaslığından kaynaklanan farklılıklar oluşabilmekte ve bu durum farklı araştırıcılar tarafından oluşturulan RAPD bilgisinin uygunluğunu zorlaştırmaktadır. 7

GİRİŞ RAPD belirleyici tekniği Şekil 1.4. de şematize edilmektedir. RAPD tekniğinde genellikle 10 bç uzunluğunda rastgele nükleotid dizilimine sahip tek bir primer kullanılmaktadır. RAPD tekniği uygulanacak örnek üzerinde primer bağlanma bölgesinde meydana gelebilecek bir mutasyon primerin o bölgeye bağlanmamasına sebep olacaktır. Bunun sonucunda PCR sonrası farklı bant profilleri meydana gelecektir. Çeltik çeşitlerinde genetik çeşitliliğin RAPD belirleyicileri kullanılarak araştırılması konusunda yapılan çeşitli çalışmalar bulunmaktadır (Buu ve Lang, 1999; Saker ve ark., 2005). Ancak bu konuda yapılan Türkiye de yetiştirilen çeltik çeşitlerine ait bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada Türkiye de yetiştirilen çeltik çeşitlerinde tohum depo proteinlerine ve RAPD belirleyicilerine dayalı polimorfizmin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışma sonuçlarının tescilli çeşitlerimizin korunması ve ıslah çalışmalarında kullanılması konularında yarar sağlayacağı düşünülmektedir. Primer Primer baglanma bölgeleri yanindaki kisimlar amplifiye olacak bant 3 bant 1 bant 5 bant 2 Genotip A bant 1 bant 3 bant 4 Genotip B DNA daki bir delesyon bant 5 olarak amplifikasyon yerine bant 4 olusturacak bant 5 bant 4 bant 3 bant 2 bant 1 Genotip A dan J ye 10 birey Için olusan RAPD profili Şekil 1.4. RAPD tekniğinin şematik gösterimi (Ben Hui Liu, 1998) 8

ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Tohum depo proteinlerine bağlı olarak oluşan elektroforez profili her tür için genotipe bağlı olduğundan taksonomik ve evrimsel problemler içinde yarar sağlayabilmektedir (Ladizindsky ve Hymowitz, 1979). Bununla birlikte, tohum depo proteinleri tür içi ve türler arasındaki genetik çeşitliliğin analizinde, genetik kaynakların korunması ve ıslah çalışmalarında genetik belirleyici olarak kullanılmaktadır. Morfolojik yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında gelişme mevsimlerinden bağımsız olması, bitkilerin yetiştirilmesine gerek olmaması, materyalin her an elde edilebilir olması, hızlı analiz edilmesi, kolay saklanması ve ihtiyaç duyulan örnek miktarının az olması gibi avantajlara sahiptir. Tohum depo proteinlerinin analizinde biyokimyasal yöntemlerden biri olan Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis sıklıkla kullanılmaktadır. SDS- PAGE sonucu oluşan tohum depo proteinleri profili buğday, arpa, triticale, biber, fasulye, hurma ve salatalık çeşitlerinin tanımlanmasında kullanılmıştır (Hussain ve ark., 1986; Stegemann ve ark., 1987; Igreas ve ark., 1999; Vladova ve ark., 2000; Cherdouh ve ark., 2005; Stoilova ve ark. 2006) Tsugita ve ark. (1994), 9 farklı organ ve 1 organelden (yapraki kloroplastı, kök, gövde, germ, karanlıkta çimlendirilmiş tohum, tohum, kavuz, chaff ve kallus) elde edilen çeltik proteinlerini 2-D elektroforezi ile incelemişlerdir. Sun ve ark. (1996), çeltik embriyolarından hazırladıkları globulinleri amino-uç amino asit dizilimi ile karakterize etmişlerdir. Montalvan ve ark. (1998) SDS-PAGE yöntemini kullanarak 58 Brezilya ve 2 Japon upland Oryza sativa L. (çeltik) çeşidinde tohum proteinlerini incelemiş ve elektroforez profillerinin densitometrik olarak taranması sonucu 16 protein fraksiyonuna ait göreceli konsantrasyonlar ele alınarak çeşitler birbirinden ayrılmıştır. Mehfooza ve ark. (2000), tohum depo proteinlerini ve izozimleri kullanarak önemli çeltik çeşitlerini tanımlamışlardır. Qu ve ark. (2001), çeltik depo proteinleri glutaminleri SDS-PAGE de %15-25 gradient jeller kullanarak 3 asidik (alpha-) ve 3 bazik (beta-) alt ünite bileşeni gözlemlemişlerdir. Aynı çalışmada amfolit oranının ayarlanması suretiyle IEF elektroforezi sisteminin geliştirilmesi ile daha fazla bandın ayırt edilebileceği görülmüştür. Furukawa ve ark. (2003) böbrek hastalarının beslenmesinde kullanılan az miktarda glutelin ve fazla miktarda prolamin içeren LGC1 isimli çeşidin bu özelliğinin SDS-PAGE sisteminde gözlenlenebileceğini göstermişlerdir. Jahan ve ark. (2005) Bangladeşin altı farklı bölgesinden toplanmış 7 ekotipi temsil eden 576 çeşidin tohum glutelinlerini SDS-PAGE, IEF ve 2D: SDS-PAGE/IEF yöntemleri ile analiz etmişlerdir. 9