İÇERİK Tanım...2 SDS-PAGE jel elektroforez metodu...3 SDS-PAGE jel elektroforezi yürütme ortamının hazırlanması...4 Protein örneklerinin yüklenmesi...8 Jelin yürütülmesi...9 Jelin boyanması ve boyanın uzaklaştırılması...11 1
Yüklü moleküllerin bir elektrik alanı içinde yürütülerek ayrıştırılması tekniğine elektroforez denir. Elektroforezin çalışma ilkesi; molekül ağırlığı ve molekülde bulunan elektrik enerjisinin jel içinden bir yükten diğerine giderken katettiği mesafe farklılıklarını ele almaktır. Elektroforezde katedilen mesafe, net yük ile doğru; molekül büyüklüğü ve elektroforetik ortamın viskozitesi ile ters orantılıdır. Elektroforez, elektriksel bir alanın etkisi altında likid bir ortamda yüklü solüt veya partiküllerin göçüdür. Elektroforez tüm partikül türlerinin göçünü sağladığından iyontoforez terimi özellikle küçük iyonların göçünü ifade eder. Protein çalışmalarında kullanılan ilk elektroforez yöntemi Tiselius tarafından 1937 de tanımlanan serbest solüsyon elektroforezi, frontal elektroforez veya moving boundary elektroforezidir. Tiselius bir elektrolit solüsyonunda çözünmüş olan proteinleri, protein-elektrolit solüsyonunun bulunduğu U şeklindeki kuartz bir borunun içinden elektrik akımı geçirerek ayırmıştır. Arne Tiselius tarafından geliştirilmiş olan elektroforezden, özellikle tıpta ve biyokimyada, kandaki çeşitli protein ve lipitlerin ayrılması, tanınması ve miktarının ölçülmesinde yararlanılır. Ayrıca elektroforezden sanayide yaygın biçimde yararlanılmaktadır. SDS-Page (sodyum dodesil sülfat (SDS) poliakrilamid jel elektroforez) proteinlerin moleküler büyüklüğünü analiz etmek için kullanılmaktadır. Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez, örnekteki bileşenlerin daha iyi ayrışmalarına yol açar çünkü ayrışım hem moleküler elekleme hem de elektroforetik harekete dayanır. SDS: oligomerik proteinleri altbirimlerine ayıran bir deterjandır. Bu deterjan polipeptidlere bağlanarak bir kompleks oluşturur ve bu oluşan kompleks polipeptidlerin negatif yüklü kalmalarını sağlar. PAGE: Elektriksel çekim kuvveti kullanılarak proteinleri boyutlarına göre ayırmak için kullanılan ortama denir. 2
SDS-PAGE HAZIRLANIŞI Poliakrilamid jeller akrilamid ve çapraz bağlayıcı N,N - metilen-bis-akrilamidin serbest radikal polimerizasyonu ile hazırlanır. Kimyasal polimerizasyon bir başlatıcı-katalizör sistemi (amonyum persülfat-temed) tarafından kontrol edilir. Poliakrilamid jel elektroforezi çubuk (tüp) biçiminde veya düzlemsel (slab) biçiminde hazırlanmış jellerde gerçekleştirilir. Çubuk tipinde cam tüpler jel materyaliyle doldurulur; polimerizasyon 30-40 dakikada tamamlanır. Jel tüpü iki ayrı tampon deposu arasına yerleştirilir. Üstteki depoda genellikle katod, alttakinde anod bulunur. Biyolojik moleküllerin çoğu negatif yüklü olduğu için anoda doğru hareket edeceklerinden jel elektroforezi genellikle bazik ph da gerçekleştirilir. Analiz edilecek örnek bir izleme boyası ile birlikte jelin tepesine uygulanır ve sistemden elektrik akımı geçirilir. Örnekteki bileşenlerden daha hızlı hareket eden izleme boyası jelin bitimine ulaştığında akım kesilir, jel tüpten çıkarılır ve boyanır. Tabaka jeller aynı anda çok sayıda örneğin aynı destek ortamında analiz edilmesine olanak vermeleri nedeniyle, kolonlara göre daha geniş çapta kullanılmaktadır. Polarizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar. Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır, kuyucuklar tuzların ve polimerize olmamış akrilamidin uzaklaştırılması amacıyla tamponla yıkanır. Jel kaseti iki tampon deposu arasına yerleştirilir, kuyucuklara örnekler konur ve akım geçirilir. Poliakrilamid jel elektroforezi uygulamalarında bazı zorluklar vardır. Jellerin hazırlanmasında kullanılan akrilamid monomeri bir nörotoksindir ve kanser oluşturma tehlikesi olan bir maddedir, bu nedenle eldiven ile çalışılmalıdır. A. YÜRÜTME ORTAMININ HAZIRLANMASI 3
a. Proteinlerin ayrılması için kullanılan standart bir jel genelde % 7.5 poliakrilamid içerir. Poliakrilamid içeriği yürütülen polipeptidin büyüklüğüne göre düzenlenebilir. Düşük poliakrilamid içeriği jelde büyük porların oluşumunu sağlar. Bu durum yüksek konsantrasyondaki moleküllerin nitelendirilmesinde kolaylık sağlar. b. Cam tabakalar önce %70 etanol ve sonra saf su ile temizlenir ve oda sıcaklığında kurutulur. Cam plakalar arasına 0.75 mm kalınlığında spacer adı verilen boşluk oluşturucular konulur ve plakalar dik bir vaziyette plaka tutucuya yerleştirilir. Burada dikkat edilmesi gereken şey kısa cam plakanın bize doğru bakmasıdır. Plaka tutucusu içerisine kilitlenen jelsiz cam plaka sistemi jellerin döküleceği tutucu üzerine dikkatle oturtulur. c. Bir 50-mL hacimli tüp içerisinde önce ayırım yapılacak jel tabakası hazırlanır. Bunun için aşağıdakilere ihtiyaç vardır. %12 lik seperasyon jeli 1.5 M Tris.HCl, ph 8.8 2.5 ml Distile su 3.5 ml %10 SDS 0.1 ml %30 Akrilamid 4 ml d. TEMED 0.005 ml (cam şişede saklanmalıdır, en son eklenmeli ve daha sonra hafifçe karıştırılmalı, zaman kaybetmeden plakalara yüklenmelidir) 4
e. 1 ml lik otomatik pipet aracılığı ile jel karışımı cam plakalar arasına yukarıdan 2 cm boşluk bırakacak şekilde dökülür. Jelin üst kısmının düz olması için jel daha polimerize olmadan üzerine su ile doyrulmuş bütanol (distile suda konulabilir, buradaki amaç jelin pürüzsüz düz bir şekilde polimerizasyonunu sağlamaktır) ilave edilir ve jel en az 15 dk kadar oda sıcaklığında polimerize olması için bırakılır. 5
f. Jelin polimerize olduğundan emin olduktan sonra üzerindeki butanol tabakası su ile yıkanarak temizlenir (tamamen uzaklaştığından emin olunmalı) ve jel yapımında ikinci adım olan stacking jel yapımına geçilir. Stacking Gel Hazırlanışı; % 4 lük stacking jeli 0.5 M Tris.HCl, ph6.8 1.25 ml Distile su 3.05 ml %10 SDS 0.05 ml %30 Akrilamid 0.65 ml TEMED 0.005 ml 6
g. 50-mL hacimli deney tüpü içerisinde hazırlanan karışım yukarıda hazırlanan ayırım jeli üzerine dökülür ve kuyucukları oluşturmak için jelin üzerine tarak takılır. Bu tarak 12 adet diş içerir ve bu dişlerin bulunduğu kısımlar jel üzerinde polimerizasyondan sonra kuyucuk olarak kalırlar. Dişlerin kalınlığı ile cam plakalar arsındaki boşluğun kalınlığı aynı olmalıdır. Jelin polimerleşmesi için an az 15 dk beklenmelidir. 7
B. PROTEİN ÖRNEKLERİNİN YÜKLENMESİ a. Protein örnekleri 4x lik bir yükleme tamponu ile karıştırılarak ve 95 o C ta 4 dk ısıtılarak hazırlanırlar. Bu 4x lik yükleme tamponu içerisinde aşağıdaki bileşenler bulunur. 4x Yükleme Tamponu 0.5 M Tris.HCl, ph6.8 ml distile su 4.0 ml %10 SDS 1.6 ml Gliserol 0.80 ml BFB (bromophenolblue) 0.2 ml Örnekler ısıtıldıktan hemen sonra buz üzerine alınmalı ve deney süresince buz üzerinde tutulmalıdır. (Hazırlanan örnekler uzun süre +4 o C da bekletilebilir). 8
C. JELİN YÜRÜTÜLMESİ a. Cam tabakalar içerisinde polimerize olmuş jel tank içerisine özenle yerleştirilir. Jeli bulunduran tank yaklaşık 3 cm yüksekliğe kadar yürütme tamponu ile doldurulur. Aşağıda 4x olarak hazırlanan yürütme tamponu ana çözeltisinin içeriği verilmiştir. 4x yükleme tamponu (ph 8.3) Tris 9 gr Glisin 48.3 gr SDS 3 gr 9
b. Hazırlanan protein örnekleri pipet kullanılarak yürütme tankının içinde bulunan jelin içine yüklenir. c. Hacim su ile 600 ml ye tamamlanır. Jel 150 ile 180 volt arasında bir voltaj seçilerek yürütülmelidir. 10
D. JELİN BOYANMASI a. Protein elektroforezi bittikten sonra jel sistem üzerinden çıkartılır. Bu işlemin çok dikkatli bir biçimde jeli kırmadam ve zarar vermeden yapılması şarttır. b. Bunun için en uygun metot cam tabakaların taziksiz akan su altında jelden ayrıştırılmasıdır. Jel üzerindeki proteinler boyanmadan önce jel üzerine sabitlenmelidir (fiksasyon). c. Bunun için jel en az 30 dk kadar fiksatif içerisinde tutulmalıdır (%40 metanol, %10 acetik asit içeren bir çözelti). Fiksatiften geçirilen jel hafif distile su ile yıkandıktan sonra boyama işlemine alınır. d. Coomassie Brilliant Blue (CBB) ile Boyama i. En sık kullanılan boyama metodudur. CBB nin % 0.25 lik çözeltisi fiksatif içerisinde hazırlanır. En az 4 saatlik bir boyama gereklidir. 11
Boya jelin yüzeyini tamamen boyadığı için protein olmayan bölgelerden uzklaştırılması şarttır. Bu amaçla jel birkaç kez %7 lik asetik asit çözeltisi ile yıkanmaladır. Boyama Solüsyonu 0,25 g coomassie brillant blue 125 ml methanol 25 ml asetik asit 100 ml d H20 Not: Boyanan jelin uzaklaştırılması için alternatif olarak kaynatma yöntemi kullanılabilir. Boyama solüsyonunda bekletilen jel dikkatli bir şekilde, içinde distile su bulunan kabın içine konularak mikrodalga fırında, kabın içindeki su kaynamaya başladıktan sonra 3-5 dakika kaynaması bekletilir. Bu işlem kabın içindeki su değiştirilerek birkaç kez tekrarlanır. Kaynatma yöntemi ile uzaklaştırma solüsyonu kullanmaya gerek yoktur ve kısa zamanda boyama solüsyonunun uzaklaşmasını sağlar. 12