DİKLOFENAK ETKİN MADDESİNİN FARMASÖTİK PREPARATLARDA ANALİTİK YÖNTEMLERLE MİKTAR TAYİNİ Ulvihan ÇİLTAŞ Analitik Kimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı Doç. Dr. Bilal YILMAZ Yüksek Lisans Tezi - 2014
T. C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DİKLOFENAK ETKİN MADDESİNİN FARMASÖTİK PREPARATLARDA ANALİTİK YÖNTEMLERLE MİKTAR TAYİNİ Ulvihan ÇİLTAŞ Analitik Kimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi Tez Danışmanı Doç. Dr. Bilal YILMAZ ERZURUM 2014
İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... ÖZET... ABSTRACT... SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... ŞEKİLLER DİZİNİ... TABLOLAR DİZİNİ... V VI VII VIII IX XI 1. GİRİŞ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 3 2.1. Diklofenak...... 3 2.2. Diklofenak ile İlgili Yapılan Çalışmalar...... 3 2.3. Spektroskopik Yöntemler.... 8 2.3.1. Elektromanyetik Işımanın Genel Özellikleri... 8 2.3.2. Işının Absorplanması.... 11 2.3.2.1. Atomik Absorpsiyon Spektrumları... 13 2.3.2.2. Moleküler Absorpsiyon Spektrumları... 13 2.3.3. Lambert-Beer Kanunundan Sapmalar... 16 2.3.4. Ultraviyole-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometreleri... 16 2.3.4.1. UV-Görünür Bölge Spektrofotometre Cihazının Kullanım Amaçları... 17 2.3.4.2. Kalitatif Analiz ve Molekül Yapısını Aydınlatma... 18 2.3.4.3. Kantitatif Analiz... 19 2.3.5. Türev Absorpsiyon Spektrofotometri Yöntemi... 19 2.3.5.1. Türev Absorpsiyon Spektrofotometri Yönteminin Avantajları ve Dezavantajları 22 2.3.5.2. Türev Absorpsiyon Spektrumlarının Değerlendirilmesi... 22 I
2.4. Kromatografik Yöntemler.. 23 2.4.1. Kromatografik Yöntemlerinin Sınıflandırılması... 24 2.4.2. Kromatografide Temel Olan Fiziksel ve Kimyasal Olaylar... 24 2.4.2.1. Dağılma Kromatografisi.... 24 2.4.2.2. Adsorpsiyon Kromatografisi..... 25 2.4.2.3. İyon Değiştirme Kromatografisi... 25 2.4.2.4. Boyut-Eleme Kromatografisi... 25 2.5. Gaz Kromatografisi (GC)...... 26 2.5.1. Gaz Kromatografisi Cihazı... 27 2.5.1.1. Taşıyıcı Gaz... 27 2.5.1.2. Elektronik Basınç Kontrolü (EPC).... 28 2.5.1.3. Enjeksiyon Bloğu.... 28 2.5.1.4. Fırın... 30 2.5.1.5. Kolon... 30 2.5.1.6. Dedektör... 31 2.5.1.7. İdeal bir Dedektörden Beklenen Özellikler... 32 2.6. Voltametri.. 33 2.7. Yöntem Geçerlilik Testi (Validasyon)... 37 2.7.1. Doğruluk ve Kesinlik..... 38 2.7.2. Örneklerin Kararlılığı (Stabilite)... 38 2.7.3. Doğrusallık ve Kalibrasyon Eğrisi... 39 2.7.4. Duyarlılık... 39 2.7.5. Tayin Alt Sınırı (LOQ)..... 39 2.7.6. Gözlenebilme (Teşhis) Sınırı (LOD).... 39 II
2.7.7. Geri Kazanım... 40 3. MATERYAL VE METOT...... 41 3.1.Kimyasal Maddeler ve Malzemeler.... 41 3.2. Kullanılan Cihazlar... 41 3.3. Yöntemler... 42 3.3.1. Spektrofotometrik Yöntem Şartları... 42 3.3.2. Spektroflorometrik Yöntem Şartları.... 42 3.3.3. GC-MS Yöntem Şartları........ 42 4. BULGULAR... 44 4.1. UV-Görünür Bölge ve Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri Yöntemi... 44 4.1.1. Standart Çözeltilerin Hazırlanması... 44 4.1.2. Yöntemin Geçerlilik Testi (Validasyonu)... 45 4.1.2.1. Doğrusal Aralık ve Kalibrasyon Eğrisi... 45 4.1.2.2. Gözlenebilme Sınırı (LOD) ve Tayin Alt Sınırı (LOQ)... 47 4.1.2.3. Doğruluk ve Kesinlik...... 47 4.1.2.4. Kararlılık (Stabilite)...... 48 4.1.2.5 Yöntemin Farmasötik Preparatlara Uygulanması... 49 4.1.2.6. Geri Kazanım... 51 4.2. Voltametri Yöntemi... 52 4.2.1. Dönüşümlü Voltametri (CV) Deneyin Yapılışı... 52 4.2.1.1. Kare Dalga Voltametrisi Deneyinin Yapılışı.. 54 4.2.1.2. Standart Çözeltilerin Hazırlanması... 54 4.2.2. Yöntemin Geçerlilik Testi (Validasyonu).... 55 4.2.2.1. Doğrusal Aralık ve Kalibrasyon Eğrisi... 55 III
4.2.2.2. Gözlenebilme Sınırı (LOD) ve Tayin Alt Sınırı (LOQ)... 56 4.2.2.3. Doğruluk ve Kesinlik.... 57 4.2.2.4. Kararlılık (Stabilite)... 57 4.3. Yöntemin Farmasötik Preparatlara Uygulanması......... 58 4.3.1. Geri Kazanım....... 59 4.4. Gaz Kromatografisi-Kütle Spektroskopisi (GC-MS) Yöntemi...... 60 4.4.1. Standart Çözeltilerin Hazırlanması.... 60 4.4.2. Yöntemin Geçerlilik Testi (Validasyonu)... 61 4.4.2.1. Doğrusal Aralık ve Kalibrasyon Eğrisi... 61 4.4.2.2. Gözlenebilme Sınırı (LOD) ve Tayin Alt Sınırı (LOQ)...... 62 4.4.2.3. Doğruluk ve Kesinlik..... 62 4.4.2.4. Kararlılık (Stabilite)..... 63 4.4.2.5. Yöntemin Farmasötik Preparatlara Uygulanması...... 63 4.4.2.6. Geri Kazanım..... 64 5. TARTIŞMA......... 66 6. SONUÇ VE ÖNERİLER...... 74 KAYNAKLAR....... 75 EKLER... 81 EK-1. ÖZGEÇMİŞ... 81 EK-2. ETİK KURUL ONAY FORMU... 82 IV
TEŞEKKÜR Yüksek Lisans tezimin planlanmasında, yürütülmesinde ve hazırlanmasında ilgisini, fikirlerini, yardımlarını esirgemeyen ve bu yolda her türlü fedakârlığı yapmaktan kaçınmayan danışman hocam Sayın Doç. Dr. Bilal YILMAZ a saygı ve şükranlarımı sunarım. Diklofenak miktar tayininin GC-MS cihazı ile ölçümleri almamda yardımcı olan Uzm. Vedat AKBA ya, Voltametrik yöntemde çalışmalarımda yardımcı olan Selçuk KABAN a, laboratuar çalışmalarımı kimyasal madde ve malzeme yönünden 2012/78 BAP proje numarası ile destekleyen Atatürk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğüne, bana her zaman güvenen, inanan ve hayatım boyunca maddi ve manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen annem Salimet ÇİLTAŞ ve babam Fehim ÇİLTAŞ a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ulvihan ÇİLTAŞ V
ÖZET Diklofenak Etkin Maddesinin Farmasötik Preparatlarda Analitik Yöntemlerle Miktar Tayini Amaç: Bu çalışmada, diklofenakın farmasötik preparatlarda miktar tayini için UV- Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometri, Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri, Kare Dalga Voltametri ve GC-MS yöntemleri geliştirildi. Materyal ve Metot: UV-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometride, diklofenak çözeltilerinin absorbans değerleri 282 nm de ölçüldü. Birinci derece türev spektrofotometride; absorbans değerleri 264 ve 298 nm de ölçüldü. Kare dalga voltametride diklofenak çözeltilerinin pik akım değerleri 1.28 potansiyel değerinde ölçüldü. GC-MS yöntemi ile de analiz gerçekleştirildi. Doğrusallık, kesinlik, doğruluk, stabilite, tayin edilebilme sınırı ve miktar belirleme sınırı gibi parametreler ICH Guidelines e göre çalışıldı. Bulgular: UV-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometri ve Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri yönteminin kalibrasyon eğrileri 2-14 g ml -1 derişim aralığında, Kare Dalga Voltametride 1.5-17.5 g ml -1 derişim aralığında, GC-MS yönteminde 0.25-5 g ml -1 derişim aralığında doğrusaldır. Diklofenak için gün-içi ve günler arası kesinlik değerleri %3.64 den ve doğruluk (bağıl hata) %3.25 den küçüktür. Sonuç: Geliştirilen bu yöntemler ile diklofenak etkin maddesini içeren üç farklı ilaç preparatında (Diclomec, Dicloflam ve Voltaren) diklofenak miktar tayini yapıldı. Elde edilen analiz sonuçları değerlendirildi ve geliştirilen yöntemler istatistiksel olarak karşılaştırıldı. Anahtar Kelimeler: Diklofenak, gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi, geçerlilik testi, kare dalga voltametri, türev-spektrofotometri, UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometri. VI
ABSTRACT Quantification of Effective Substance of Diclofenac with Analytical Methods in the Pharmaceutical Preparations Aim: In this study, UV-Visible Zone Absorption Spectrophotometry, First Derivative Absorption Spectrophotometry, Square wave voltammetry and GC-MS methods were developed for determination of diclofenac in pharmaceutical preparations. Material and Method: In UV-Visible Zone Absorption Spectrophotometry, absorbance values of diclofenac solutions were measured at 282 nm. In first derivative spectrophotometry, absorbance values were measured at 264 and 298 nm. In square wave voltammetry, peak current values of diclofenac solutions were measured at 1.28 potential. It was analyzed by GS-MS method. Parameters such as linearity, precision, accuracy, stability, limit of detection and limit of quantification were studied according to the ICH Guidelines. Results: Calibration curves of UV-Visible Zone Absorption Spectrophotometry and First Derivative Absorption Spectrophotometry methods were linear between the concentration range of 2-14 μg ml -1, in Square Wave Voltammetry between the concentration range of 1.5-17.5 μg ml -1, in GC-MS method between the concentration range of 0.25-5 μg ml -1. Within- and between-day precision values for diclofenac were less than 3.64% and accuracy (relative error) was better than 3.25%. Conclusion: Quantitation of diclofenac was performed with these methods which is developed in three different pharmaceutical preparations containing the active ingredient diclofenac (Diclomec, Dicloflam and Voltaren). Obtained analysis results were evaluated and the developed methods were compared as statistics. Key Words: Diclofenac, gas chromatography-mass spectroscopy, validation test, square wave voltammetry, derivative spectrophotometry, UV-Visible zone absorption spectrophotometry. VII
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ GC-MS MS LOD LOQ ICH : Gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi : Kütle spektroskopisi : Gözlenebilme sınırı : Tayin alt sınırı : International conference on harmonization VIII
ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No Sayfa No Şekil 2.1. Diklofenakın kimyasal yapısı... 3 Şekil 2.2. Düzlem-polarlanmış bir ışın... 9 Şekil 2.3. Elektromanyetik spektrumun bölgeleri... 11 Şekil 2.4. Elektronik yapıların temsili gösterimi... 12 Şekil 2.5. Bir molekül için elektronik titreşimsel ve rotasyonal enerji seviyelerini gösteren enerji diyagramı... 14 Şekil 2.6. Absorblayan bir çözeltiye giren P 0 şiddetindeki ışın demetinin P şiddetine düşmüş olarak çıkması... 15 Şekil 2.7. Çift ışın yolu spektrofotometrenin temel bileşenleri... 17 Şekil 2.8. Absorbans ve türev eğrisi spektrumları... 20 Şekil 2.9. Türev absorbsiyon spektrumlarının değerlendirilmesi a) Pikten pike ölçüm, b) Pikten sıfıra ölçüm ve c) Teğet ile ölçüm... 23 Şekil 2.10. Gaz kromatografi cihazının akış şeması... 27 Şekil 2.11. Kütle spektrometresinin parçaları... 33 Şekil 2.12. Yavaş potansiyel değişiminde katı elektrot voltamogramı......36 Şekil 4.1. UV-Görünür bölge spektrofotometrik çalışmasında diklofenak çözeltilerinin absorbsiyon spektrumları... 44 Şekil 4.2. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında diklofenak çözeltilerinin birinci-türev absorbsiyon spektrumları... 45 Şekil 4.3. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında diklofenak kalibrasyon eğrileri... 45 Şekil 4.4. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında diklofenak kalibrasyon eğrileri... 46 IX
Şekil 4.5. Voltaren farmasötik preparatının UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrumları (4 µg ml -1 ve 10 µg ml -1 )...50 Şekil 4.6. Voltaren farmasötik preparatının birinci-türev absorbsiyon spektrumları (4 µg ml -1 ve 10 µg ml -1 )...50 Şekil 4.7. Diklofenak etkin maddesinin 0.1 M LiCIO 4 içeren asetonitril içindeki dönüşümlü voltamogramı (Kör çözeltisi ve 17.5 μg ml -1 diklofenak standart çözeltisi)...53 Şekil 4.8. Diklofenak etkin maddesinin 0.1 M LiCIO 4 içeren asetonitril içinde tarama hızlarındaki voltamogramları (17.5 μg ml -1 )...54 Şekil 4.9. Diklofenak etkin maddesinin 0.1 M LiCIO 4 içeren asetonitril içindeki kare dalga voltamogramları (Kör çözeltisi, 1.5, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15 ve 17.5 g ml -1 )... 55 Şekil 4.10. Kare dalga voltametrik yöntem kalibrasyon eğrisi... 56 Şekil 4.11. Voltaren farmasötik preparatının kare dalga voltametrik voltamogramları ( 7.5 g ml -1 ve 15 g ml -1 ).....58 Şekil 4.12. GC-MS çalışmasında diklofenak çözeltilerinin kromatogramları (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4 ve 5 g ml -1 ) (SIM modu, m/z 214).... 60 Şekil 4.13. GC-MS çalışmasında diklofenak çözeltisinin (1 g ml -1 ) kütle spektrumu... 61 Şekil 4.14. GC-MS yöntem kalibrasyon eğrisi... 61 Şekil 4.15. Voltaren farmasötik preparatının GC-MS kromatogramı (1 µg ml -1 ve 4 µg ml -1 ) 64 X
TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Sayfa No Tablo 3.1. Diklofenak için GC-MS çalışmasında uygulanan kromatografik yöntem şartları.. 43 Tablo 4.1. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında diklofenaka ait kalibrasyon eğrileri ile ilgili istatistiki değerler...... 46 Tablo 4.2. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında diklofenaka ait kalibrasyon eğrilerinin istatistiki değerleri... 47 Tablo 4.3. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik yönteminin güniçi ve günler arası doğruluk ve kesinlik değerleri...... 48 Tablo 4.4. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik yönteminin güniçi ve günler arası doğruluk ve kesinlik değerleri... 48 Tablo 4.5. Diklofenakın UV-Görünür bölge ve birinci türev absorbsiyon spektrofotometrik yöntemle belirlenen kararlılık (stabilite) değerleri... 49 Tablo 4.6. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri... 51 Tablo 4.7. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri... 52 Tablo 4.8. Kare dalga voltametrik çalışmada diklofenaka ait kalibrasyon eğrisinin istatistiki değerleri... 56 Tablo 4.9. Kare dalga voltametrik yönteminin güniçi ve günler arası doğruluk ve kesinlik değerleri... 57 Tablo 4.10. Diklofenakın kare dalga voltametrik yöntemle belirlenen kararlılık (stabilite) değerleri...... 58 Tablo 4.11. Kare dalga voltametrik yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri... 59 XI
Tablo 4.12. GC-MS çalışmasında diklofenaka ait kalibrasyon eğrisi ile ilgili istatistiki değerler...62 Tablo 4.13. GC-MS yönteminin güniçi ve günler arası doğruluk ve kesinlik değerleri... 63 Tablo 4.14. Diklofenakın GC-MS yöntemle belirlenen kararlılık (stabilite) değerleri...63 Tablo 4.15. GC-MS yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri... 65 XII
1. GİRİŞ Non-steroidal antiinflamatuar ilaçlar günümüzde inflamasyonla gelişen hastalıkların tedavisinde en çok tercih edilen ilaçlardan birisidir. Bu nedenle ağrı, ateş ve inflamasyonla seyreden hastalıkların tedavisinde narkotik analjeziklere ve steroid yapıdaki antiinflamatuar ilaçlara göre oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. 1-3 Diklofenak anti-inflamatuar, analjezik ve antipiretik etkiye sahip güçlü bir nonsteroidal antienflamatuar ilaçtır. 4 Özellikle romatizmal olgularda, ağrı ve sabahları görülen eklem enflamasyonlarında yarar sağlarken fonksiyonları da düzeltir. İntramüsküler yoldan uygulanan 75 mg diklofenak sodyum (bir ampul) yaklaşık 20 dakika içerisinde plazmadaki doruk düzeyine ulaşır. Plazma diklofenak konsantrasyonu verilen dozla doğru orantılıdır. Önerilen doz ve sürelerde kullanıldığında plazmada birikim yapmaz. Gıda ile birlikte alınması ilacın biyoyararlanımını değiştirmez. Eliminasyon yarı ömrü yaklaşık 1.2 saati bulur. % 99'dan fazla oranda plazma proteinlerine bağlanmaktadır. Karaciğerde CYP2C9 enzimi ile metabolize edilir. % 20'si serbest ya da konjuge formda yaklaşık % 50'si ise hidroksillenmiş metabolitleri halinde idrarla atılır. Tavsiye edilen günlük doz 50 mg'dır. Semptomların şiddetine göre günlük doz toplam 200 mg'a çıkarılabilir. Maksimum günlük doz 200 mg'dır. Çocuklarda etkinliği ve güvenliği kanıtlanmadığı için 15 yaşın altındaki çocuklarda kullanılmamalıdır. 5-7 Diklofenak % 99'undan fazlası, geri dönüşümlü olarak plazma albuminine bağlanır. Terminal yarı ömrü 1-2 saattir. 8 En yüksek plazma düzeyine ulaşıldıktan 2-4 saat sonra sinoviyal sıvıda da doruk düzeylere erişir ve bu konsantrasyonda, plazmadakinden daha yüksek olarak kalır. Biyotransformasyonun çoğunluğu hidroksilasyonla oluşan metabolitleri ve % 1'den az miktarı değişmeyen molekül biçiminde idrarla atılır. Geri kalan kısmının atılması ise fecesledir. 1
Literatür taramasında, diklofenakın ticari preparatlarda ve biyolojik sıvılarda miktar tayinine yönelik çalışmalara ulaşıldı. Bu araştırmada diklofenakın farmasötik preparatlarda miktar tayini için Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri, Gaz kromatografisi-kütle Spektroskopisi (GC-MS) ve Voltametri yöntemi ile ilgili bir çalışmaya ulaşılamadı. Bu çalışmada, standart çözeltilerde diklofenakın tayini için UV-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometri, Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri, Kare Dalga Voltametri ve GC-MS yöntemlerinin geliştirilerek, geçerlilik testlerinin yapılması ve bu yöntemlerle diklofenak etkin maddesini içeren farklı ilaç preparatlarında diklofenak miktar tayininin yapılması amaçlandı. 2
2. GENEL BİLGİLER 2.1. Diklofenak Diklofenak, analjezik, antipiretik ve antienflamatuar etkilere sahip fenilalkanoik asit türevi güçlü bir nonsteroidal antienflamatuar ilaçtır. 9-10 Diklofenak kokusuz, hafifçe sarımtırak beyaz-bej renginde hafif hidroskopik kristalize toz halindedir. Diklofenak metanolde kolayca çözünürken sulandırılmış asit ve kloroformda pratik olarak çözünmez. Suda ise yavaş ve zor çözünmektedir Diklofenakın kimyasal yapısı Şekil 2.1 de verilmiştir. Molekül kütlesi 318.13 g mol -1 olup kapalı formülü C 14 H 10 CI 2 NNaO 2 dir. 11 Şekil 2.1. Diklofenakın kimyasal yapısı 2.2. Diklofenak ile İlgili Yapılan Çalışmalar Dorado ve ark. 12 insan idrarında diklofenak ve 3 metabolitinin (4'-hidroksi (OH), 3 -OH ve 5 -OH diklofenak) tayin edilebilmesi için UV dedektörlü HPLC yöntemi geliştirmişlerdir. Çalışmada Hypersil ODS ters faz kolon (5 µm, 250 4,6 mm), asetonitril-metanol-tetrahidrofuran-su (22:10:3:65 h/h) mobil fazı, 1 ml dak -1 kolon akış hızı 10 µl injeksiyon hacmi kromatografik parametreleri kullanılarak HPLC yöntemiyle insan idrarında diklofenak ve 3 metabolitinin analizi yapılmıştır. Kesinlik gün içigünler arası % BSS ile değerlendirilerek % 4.75 den daha küçük, doğruluk bağıl hata 3
ile verilmiş olup % 4.0 den küçük olarak belirlenmiştir. Diklofenakın seri dilüsyonları kulanılarak yöntemin LOQ değeri 0.25 µg/ml olarak bulunmuştur. Çalışmada idrardan diklofenak ve 3 metabolitinin geri kazanımı sıvı sıvı ekstrakiyon yöntemi ile yapılmış olup plazmadan geri kazanım ortalama % 89 olduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak diklofenak ve 3 metabolitinin insan idrarında HPLC yöntemi ile tayin edilebileceği gösterilmiştir. Emami ve ark. 13 insan plazmasında diklofenakın miktarının tayini için duyarlı ve seçici bir HPLC yöntemi geliştirmişlerdir. Çalışmada Bondapack C 18 kolon (5 µm,150 mm x 4.6 mm), hekzan-izopropil alkol (90:10, h/h) mobil fazı, 1 ml dak -1 kolon akış hızı, 50 µl injeksiyon hacmi ve 276 nm dedektör dalga boyu parametreleri ile diklofenakın insan plazmasındaki tayini için bir HPLC yöntemi geliştirilmiştir. Diklofenak ve internal standart (naproksen) in stok çözeltileri 100 µg ml -1 derişimde hazırlanmıştır. Diklofenak için plazma kalibrasyon eğrisi 0.1-40 µg ml -1 derişimlerinde türetilmiş olup eğrinin korelasyon katsayısı (r) 0.99 dan büyük olarak bulunmuştur. Kesinlik bağıl standart sapma ile ifade edilmiş olup gün içi ve günler arası BSS % 8.75 den küçük bulunmuştur. Doğruluk bağıl hata ile ifade edilmiş olup gün içi ve günler arası bağıl hata % 16 dan küçük bulunmuştur. Çalışmanın plazmadan geri kazanımı katı-sıvı faz ekstraksiyon ile gerçekleştirilmiş olup geri kazanım plazma için ortalama % 97.4 bulunmuştur. Geliştirilen ve valide edilen yöntemin uygulaması için 12 sağlıklı gönüllüye 50 mg olacak şekilde oral yoldan Voltarol tablet içirilmiştir. 0.25 ile 10 saat arası farklı zamanlarda gönüllülerden kan alınıp katı sıvı ekstraksiyonu sonucu kromatogramlar alınmış ve pik alanları oranından kalibrasyon eğrisi denkleminde yerine koyularak diklofenakın plazma derişimleri bulunmuştur. Elde edilen sonuçlardan diklofenakın biyoyararlanım parametreleri bulunmuştur. Maksimum zaman, maksimum derişim ve eğri altında kalan alan sırası ile 2.46 saat, 2.24 µg ml -1 ve 4
3.47 µg ml -1 h olarak bulunmuştur. Sonuç olarak diklofenakın insan plazmasında UV dedektörlü HPLC yöntemi ile tayin edilebileceği gösterilmiştir. Demircan ve ark. 14 tarafından subretinal sıvılarda diklofenak tayini için hassas ve seçici biyoanalitik yöntem olan elektrokimyasal dedektörlü ters-faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi yöntemi geliştirilmiştir. Kromatografik ayırım Nucleosil C 18 analitik kolonda gerçekleştirilmiştir. Hareketli faz asetonitril ve glasiyel asetik asit karışımı olup, akış hızı 1.0 ml dk -1 olarak ayarlanmıştır. Yöntem 20-1000 ng ml -1 diklofenak derişimi aralığı için doğrusaldır. Diklofenak için gözlenebilme sınırı 10 ng ml -1, tayin alt sınırı 20 ng ml -1 olarak belirlenmiştir. Gün içi ve günler arası bağıl hata sırası ile % 1.72 ve 1.4 olarak bulunmuştur. Gün içi ve günler arası bağıl standart hata ise sırasıyla % 2.19 ve 1.94 dür. Geliştirilen metot kullanılarak katarakt ameliyatı öncesi Voltaren göz damlası uygulanan hastalardan sağlanan göz içi sıvıları analiz edilmiştir. Geliştirilen ve valide edilen elektrokimyasal dedektörlü HPLC yöntemi subretinal sıvılarda diklofenak düzeyinin miktar tayini için başarı ile kullanılmıştır. Kasperek ve ark. 15 diklofenak ve papaverinin eş zamanlı olarak tablette tayinine yönelik UV dedektörlü bir HPLC yöntemi geliştirmişlerdir. Çalışmada C 8 Zorbax SB ters faz kolon (5 µm, 4.6 mm x 15 mm), metanol:su (60:40 h/h) mobil fazı, 278 nm dedektör dalga boyu, 1.0 ml dak -1 kolon akış hızı parametreleri ile çalışma gerçekleştirilmiştir. Doğrusallık için 0.05-0.6 mg/ml derişim aralığında kalibrasyon eğrisi türetilmiş olup, eğrinin korelasyon katsayısı 0.999 dan büyük olarak tespit edilmiştir. Kesinlik çalışması için diklofenakın düşük, orta ve yüksek derişimlerde 3 farklı standart çözeltisi hazırlanmış olup kesinlik BSS ile doğruluk bağıl hata ile verilmiştir. Kesinlik gün içi-günler arası % BSS ile değerlendirilerek % 3.34 den daha küçük, doğruluk bağıl hata ile verilmiş olup % 1.04 den küçük olarak belirlenmiştir. Ayrıca geri kazanım çalışması yapılmış olup diklofenakın geri kazanımı % 98.99-% 5
98.96 arasında bulunmuştur. Geliştirilen yöntem ile diklofenak ve papaverini aynı anda bulunduran tablette diklofenakın başarıyla tayin edilebileceği gösterilmiştir. Yilmaz ve ark. 16 insan plazmasında diklofenakın tayini için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemini geliştirmişlerdir. Çalışmada Ace marka C 18 kolonu (25 cm, 4.6 mm, 5 µm), %0.1 Trifloroasetik asit (TFA)-asetonitril (65:35 h/h) mobil fazı, 1.0 ml dak -1 kolon akış hızı, 20 µl enjeksiyon hacmi parametreleri kullanılmıştır. Çalışmada ibuprofen internal standart olarak kullanılmıştır. Stok diklofenak çözeltisi metanolde hazırlanmıştır. Bu çözeltiden 75-4000 ng ml -1 derişim aralığında standart çözeltiler hazırlanarak kromatogramları alınmıştır. Diklofenak etkin maddesi çözeltisi kromatogramlarının pik alanı/internal standart pik alanı oranı ile derişimi göz önünde bulundurularak kalibrasyon eğrisi türetilmiştir. Eğrinin regresyon denklemi y=0.035x 0.016 ve korelasyon katsayısı (r) 0.999 olarak tayin edilmiştir. Çalışmanın miktar tayin sınırı 75 ng ml -1 olarak tayin edilmiştir. Kesinlik bağıl standart sapma ile ifade edilmiş olup % BSS % 3.60 dan küçük bulunmuştur. Çalışmada plazmadan diklofenak ekstraksiyonu sıvı-sıvı faz yöntemi ile yapılmış olup ortalama geri kazanım % 94.7 olarak bulunmuştur. Geliştirilen seçici ve hassas HPLC yöntemi insan plazmasında diklofenakın belirlenmesi için de kullanılmıştır. Bunun için 6 insana 50 mg etkin madde içeren diklofenak formülasyonu (Dolorex graje) oral yoldan verildikten sonra 0-5 saat aralığında farklı zamanlarda kan örnekleri alınmıştır. Ekstraksiyon sonucu analizler yapılmış ve derişim zaman grafiği çizilmiştir. Sonuç olarak HPLC yöntemi valide edilerek insan plazmasında diklofenak tayini başarılı bir şekilde yapılmıştır. Başka bir çalışmada Nasir ve ark. 17 farmasötik preparatlarda diklofenakın tayini için bir HPLC yöntemini geliştirmişlerdir. Çalışmada Hypersil BDS marka C 18 kolonu (25 cm, 4.6 mm, 5 µm), %0.2 Trietilamin (TEA)-asetonitril (40:60 h/h) mobil fazı, 1.0 6
ml dak -1 kolon akış hızı, 50 µl enjeksiyon hacmi parametreleri kullanılmıştır. Diklofenak etkin maddesinin alıkonma zamanı 5.6 dakika civarındadır. Diklofenakın 0.05-2 µg ml -1 derişim aralığında kalibrasyon eğrisi türetilmiştir. Eğrinin regresyon denklemi y=3.955x+0.01 ve korelasyon katsayısı (r) 0.999 olarak tayin edilmiştir. Kesinlik bağıl standart sapma ile ifade edilmiş olup gün içi ve günler arası % BSS % 6.20 den küçük bulunmuştur. Yöntemde diklofenakın gözlenebilme tayin limiti 0.25 µg ml -1 olarak bulunmuştur. Geliştirilen ve geçerlilik testi yapılan HPLC yöntemi diklofenak içeren bir farmasötik dozaj formuna uygulanmış ve tabletten geri kazanım % 95.1 ile % 98.2 arasında bulunmuştur. Sonuç olarak geliştirilen yöntemin farmasötik preparatlarda diklofenak etkin maddesinin tayininde başarı ile kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. Lee ve ark. 18 insan plazmasında diklofenakın tayini için doğru, basit ve seçici bir yöntem olan UV dedektörlü HPLC yöntemi geliştirmişlerdir. Çalışma Capcell Pak kolon (5 µm, 20 mm x 4.0 mm), asetonitril-0.1 M fosfat tamponu (ph 7.1) (14:86, h/h) içeren mobil fazı, 1.0 ml dak -1 kolon akış hızı, 100 µl enjeksiyon hacmi kullanılarak plazma örneklerinde diklofenak miktar analizi yapılmıştır. Plazmadan diklofenak ekstraksiyonu sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Geliştirilen ve geçerlilik testi yapılan HPLC yönteminin insan plazmasında diklofenak için iki gönüllüye oral yoldan verildikten sonra farklı zamanlarda kan örnekleri alınmıştır. Elde edilen sonuçlardan diklofenak biyoyararlanım parametreleri bulunmuştur. Maksimum zaman, maksimum derişim ve eğri altında kalan alan sırası ile 1.30 saat, 3.0 µg ml -1 ve 5.1 µg ml -1 h olarak bulunmuştur. Sonuç olarak geliştirilen HPLC yönteminin insan plazmasında diklofenakın tayini başarılı bir şekilde gerçekleştirilerek farmakokinetik çalışma yapılmıştır. 7
2.3. Spektroskopik Yöntemler Spektroskopik yöntemler; atomik ve moleküler spektroskopiye dayanan geniş bir analitik yöntemler grubudur. İnorganik ve organik bileşiklerin kalitatif ve kantitatif analizlerinde spektroskopik yöntemler sıklıkla kullanılmaktadır. Spektroskopi, çeşitli tipte ışınların madde ile etkileşimini inceleyen bilim dalı için genel bir terimdir. Bir örnekteki atom, molekül veya iyonların bir enerji düzeyinden diğerine geçişleri sırasında absorplanan veya yayılan elektromanyetik ışımanın ölçülmesi ve yorumlanmasına spektroskopi denir. 19 Atom, molekül veya iyonun elektromanyetik ışıma ile etkileşimi sonucu dönme, titreşim ve elektronik enerji seviyelerinde değişiklikler spektroskopinin temelini oluşturur. 20,21 Eskiden sadece elektromanyetik ışıma ile madde arasındaki etkileşimlerle ilgilenilirdi; ancak bugün için spektroskopinin kapsamı madde ve diğer enerji türleri arasındaki etkileşimleri de içerecek şekilde genişletilmiştir. 2.3.1.Elektromanyetik Işımanın Genel Özellikleri Işın veya elektromagnetik ışıma uzayda çok büyük bir hızla hareket eden bir enerji şeklidir. Elektromanyetik ışımanın en çok karşılaşılan türleri, gözle algıladığımız görünür ışık ve ısı şeklinde algıladığımız infrared ışın, radyo dalgaları ve X ışınlarıdır. Işının uzaydaki hareketi dalgalar halinde olur. Gama ışınları, ultraviyole ışınları, mikrodalgalar ve radyo frekansı ışınları varlıkları daha zor anlaşılan ışınlardır. 19 Elektromanyetik ışımanın dalga ve tanecik olarak davrandığı ispatlanmıştır. Işın enerjisinin absorpsiyonu ve emisyonuyla ilgili olayların açıklanmasında dalga modeli başarılı olamamıştır. Bu olayların anlaşılabilmesi için, bir parçacık modeli geliştirilmiştir; bu modelde elektromanyetik ışın, enerjileri ışın frekansıyla orantılı ve foton adı verilen parçacıklar veya dalga paketlerinden oluşmuş olarak görülür. Işının bu şekilde parçacıklar ve dalgalar halinde, çift özellikle algılanması, birbirini dışlayan 8
değil, aksine tamamlayan kavramlar olarak alınmalıdır. Gerçekten de dalga-parçacık çift özelliği elektron, proton ve diğer temel parçacıkların davranışlarını açıklamada kullanılmış ve dalga mekaniği tarafından tümüyle kabul görmüştür. 21 Elektromanyetik ışının, dalga boyu, frekans, hız ve genlik gibi parametreleri de içeren birçok özelliği klasik sinüs dalga modeliyle açıklanabilir. Ayrıca elektromanyetik ışının, yayılımı hiçbir destek ortamı gerektirmez ve boşluktan (vakum) kolaylıkla geçebilir. 22 Elektromanyetik ışıma, hem elektrik alan vektörü hemde magnetik alan vektörüne sahiptir. Bu iki alan sinüsoidaldır ve ışının yayılma yönüne ve birbirlerine diktir. Bir ışının maddeyle ilişkisi, bu iki alan vektörü ile olur. Şekil 2.2, düzlempolarlanmış bir ışını gösterir. Düzlem-polarlanmış ifadesi ile elektrik ve manyetik alanların sadece birer düzlemde titreşim yaptığı, diğer doğrultulardaki titreşimlerin sönümlendiği kastedilmektedir. 19 Şekil 2.2. Düzlem-polarlanmış bir ışın Görünür ışık dalgaları, elektromanyetik dalganın sadece çıplak gözle görülebilen kısmına karşılık gelir. Biz bu dalgaları, gökkuşağında oluşan renkler olarak görebiliriz. Buradaki her bir renk farklı bir dalga boyuna karşılık gelir. Kırmızı renge karşılık gelen dalga, görünür bölgenin en uzun dalga boyuna karşılık gelirken, mor en kısa dalga boylarına karşılık gelir. Görünür bölgedeki bütün dalgalar birlikte gözlendiği 9
zaman beyaz ışığı oluştururlar. Bunun terside doğrudur. Yani beyaz ışığı bir prizmadan geçirirsek görünür bölgedeki bütün dalgaları gözleriz. Spektroskopi kavramı önceleri görünür bölge ışınının çeşitli dalga boylarına ayrılıp spektrumlarının elde edilmesi için kullanılırken günümüzde ise elektromagnetik ışınların madde ile etkileşimini inceleyen genel bir bilim dalı olarak tanımlanmaktadır. Elektromagnetik ışının madde (atom ya da molekül) tarafından soğrulması veya yayılması inceleniyorsa sırasıyla, soğurma (absorpsiyon) veya yayma (emisyon) spektroskopileri olarak adlandırılır. Işının moleküller tarafından soğrulması moleküldeki atomların türüne, düzenlenmesine, moleküllerin şekline, büyüklüğüne vb. özelliklerine bağlı olduğundan spektroskopik yöntemler maddelerin yapılarının ve stereokimyasal özelliklerinin bulunması, tanınması ve saflık kontrolü gibi çok geniş bir alanda uygulanmaktadır. Spektroskopik çalışmalarda bütün dalga boylarını verecek ve hangi dalga boylarının absorplandığını tespit edecek tek bir cihaz yapmak mümkün olmadığından, belirli dalga boyları arasında çalışan cihazlar geliştirilmiştir. 10
Şekil 2.3. Elektromanyetik spektrumun bölgeleri 110-800 nm dalga boylarındaki ışınlarla çalışan cihazlara ultraviyole ve görünür alan, 0.78-1000 µm dalga boylarında çalışan cihazlara infrared ve dalga boyları yüzlerce metreye kadar değişen radyo dalgalarıyla çalışan cihazlara da nükleer magnetik rezonans cihazları denir. Bu cihazların geçerli oldukları spektroskopi yöntemleri sırasıyla Ultraviyole-Görünür Bölge (UV-Visible), Infrared (IR titreşim) ve Nükleer Magnetik Rezonans (NMR) spektroskopileri olarak adlandırılır. 22,23 Analitik amaçlar için enerjiye göre elektromagnetik ışıma spektrumunu gösteren diyagram Şekil 2.3 de verilmiştir. 2.3.2. Işının Absorplanması Çeşitli dalga boylarında ışın içeren bir demet, saydam ve şeffaf bir ortamdan geçirilirse, içinden bazı dalga boylarının kaybolduğu görülür. Buna ışının absorplanması denir. Absorpsiyonla ışın enerjisi, maddenin iyon, atom veya moleküllerine aktarılır. Böylece iyon, atom veya moleküller uyarılmış hale geçerler. Uyarılmış bir atom veya molekül 10-8 saniye kadar yaşayabilir. Sonra absorpladığı ışın 11