ÜNİTE 6 Boyaların ve Boyama Yöntemlerinin Tanıtılması Amaçlar Bu üniteyi çalıştıktan sonra, Mikrobiyolojide kullanılan başlıca boyaları, boyanma mekanizmalarını ve en çok kullanılan boyama yöntemlerini öğrenmiş olacaksınız. İçindekiler Giriş Mikrobiyolojide Kullanılan Boyalar ve Boyama Yöntemleri Boyanma ve Boyalar Gram Boyama Yöntemi Aside Dirençli Boyama Diğer Boyama Yöntemleri Özet Değerlendirme Soruları Sözlük Yararlanılan Kaynaklar Öneriler Bu üniteyi işledikten sonra bir mikrobiyoloji laboratuvarına giderek, kullanılan boyaları tanıyın, boyama yöntemlerini izleyin.
1. GİRİŞ Mikrobiyoloji laboratuvarlarında mikroorganizmaları tanımlamak için boyama yöntemlerine sıkça başvurulur. Boyama yöntemlerinde tek bir boya kullanıldığı gibi daha sıklıkla birden fazla boya birbiri ardına eklenerek kullanılır. Boyama işlemleri genellikle bir lam üzerinde yapılır. Kullanılacak lam, daha önceden eteralkol karışımı ile iyice temizlenmelidir. Boyama yapılacak örnek, bir lam üzerine ince tabaka halinde yayılır. Bu örnek çeşitli vücut sıvıları ve iltihabi akıntılar olabileceği gibi, kültürde üreyen bakteriler de olabilir. Boyanacak örneğin, lam üzerine yayılmasını takiben, preparatın, havada kuruması beklenir. Boyama yöntemine başlamadan önce, lam üzerinde hazırlanan preparatın tesbit edilmesi gerekir. Tesbit işleminin amacı, lam üzerindeki materyalin lama yapıştırılmasını ve bulaşıcı olan mikroorganizmaların ölmesini sağlamaktır. Laboratuvarda, bakteriyolojik preparatların tesbitinde en sık kullanılan yöntem, ısıdır. Isı ile bozulabilecek ökaryot hücrelerden zengin örnekler ile kan ve doku preparatlarının tesbitlerinde alkol, eter, aseton gibi maddelerden yararlanılır. Tesbit işlemi için preparatın alevden üç kez geçirilmesi, %95 alkolde veya eşit miktar alkol-aseton karışımında 10-20 dakika süre ile tutulması yeterlidir. Lam üzerine yayılan örneğin tesbitinde neler kullanılır Tesbit işlemindeki amaç nedir 2. MİKROBİYOLOJİDE KULLANILAN BOYALAR VE BOYAMA YÖNTEMLERİ 2.1. Mikroskobik Preparatların Hazırlanması Mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla hem boyamadan direkt mikroskopta hem de boyanarak incelenmeleri gerekir. Bu yöntemlerle mikroorganizmaların hareket, spor, kapsül, boyanma varlığı ve şekli gibi özellikleri araştırılır. Bu amaçla kültürlerden veya hastalık örneklerinden kurallara uygun preparatlar alınarak hazırlanır ve incelenir. İncelemeler çok yönlü olduğundan, hazırlanacak preparatların da inceleme bakımından çeşitli ayrıcalıkları olmaktadır. - 85 -
2.2. Boyanma ve Boyalar Boyama, mikrobiyolojik tanıda yardımcı bir yöntemdir. Boyanma, kimyasal bir olaydır. Boyalar genellikle tuz yapısındadırlar ve ph'larına göre asidik, bazik, nötral olabilirler. Mikrobiyolojide, daha çok bazik ve nötral boyalar kullanılır. Bazik boyalar, renkli katyon ve renksiz anyon içerirler. Bazik boyalara, metilen blue + chloride ve kristal viyole (Hexamethyl-prosanaline + chloride ) örnek olarak verilebilir. Bu iki örnek boyanın renkli katyon kısımları, pozitif yüklü metilen mavisi ve rosanaline'dir. Bakteri hücresi, nükleik asitten zengin fosfat grupları nedeniyle negatif yüklüdür. Bu nedenle bakteri hücreleri bazik boyalar ile iyi boyanırlar. Asidik boyalar renksiz katyon içerirler ve bakterileri boyamazlar. Zemin boyamada ya da asit ph'lı ortamlarda kullanılırlar. Nötral boyalara örnek, Giemsa ve Wright verilebilir. Bu boyalar, özellikle kan ve doku preparatlarının boyanmasında, kanın şekilli elemanları, hücreler ve bazı parazitlerin daha etraflıca gözlenmelerinde üstündür. Boyama işlemlerinde tek bir bazik boya kullanılmışsa, basit boyamadan söz edilir. Metilen mavisi, en çok kullanılan basit boyama yöntemidir. Birden fazla bazik boya kullanılarak, çeşitli mikroorganizmalar, farklı renkte boyanırlar. Birleşik boyama yöntemlerine örnek olarak Gram ve Aside-Alkole Rezistan Boyama (ARB veya AARB) verilebilir. Bakteri hücresi boyayı nasıl alır Boyalar ph'larına göre kaça ayrılırlar Birleşik boyamanın özelliği nedir 2.3. Gram Boyama Yöntemi 1884 yılında Danimarkalı Bakteriyolog Christian Gram tarafından tarif edilmiştir. Gram boyası ile mor renk alan bakteriler Gram pozitif (+) veya Gram olumlu, kırmızı renkte boyanan bakteriler ise, Gram negatif ( ) ya da Gram olumsuz olarak adlandırılırlar. Basillerin yaklaşık yarısı, kokların büyük kısmı ve mantarlar, Gram olumludurlar. Spiral şekilli bakteriler ise Gram negatiftirler. - 86 -
A: Gram (+) bakteri hücre duvar yapısı Kalın bir peptidoglikan (= mürein) tabaka taşırlar. Peptidoglikan zincirleri çapraz bağlı bir dev moleküldür. Peptidoglikan tabakaya ve membran glikolipidine bağlı teikoik asit ile polisakkaritler yeralır. B : Gram (-) bakteri hücre duvar yapısı Peptidoglikan tabaka Gram (+) bakterilere göre çok incedir. Peptidoglikanın dışında, lipoprotein, dış membran, lipopolisakkarit ve periplazmik aralık bulunur. Şekil 1 : Gram pozitif ve Gram negatif bakteri hücre duvar yapıları görülmektedir. - 87 -
Gram (+) pozitif veya Gram ( ) negatif olsun kristal viyolet boyası ile tüm bakteriler mor renge boyanırlar. Ortama eklenen lugol solusyonu ile Gram (+) bakterilerin oluşturdukları yapı, daha sonra ortama eklenen alkol ile giderilemez. Oysa Gram ( ) bakterilerin kristal viyole + lugol karışımları alkol ile giderilebilir. Bir başka deyişle, boya, bakteri hücresinden dışarıya salınır (dekolorizasyon). Gram ( ) negatif bakterilerin, alkolle renkleri gittiğinden, ortama daha sonra eklenen sulu füksin ile boyanır. Böylece Gram (+) bakteriler mor renkte (kristal viyole rengi), Gram ( ) bakteriler kırmızı - pembe renkte (sulu fuksin) boyanırlar. Gram boyanma özelliği bakteri duvar yapısı ile ilgilidir. Bakteriye Gram (+) boyanma özelliği veren Gram negatif ve Gram pozitif bakteri duvar ince yapıları Şekil 1 de gösterilmektedir. Gram Boyama Yönteminde Aşağıdaki işlemler Sırasıyla Uygulanır: Havada kurutulup alevde tesbit edilmiş preparat üzerine, Kristal viyolet damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Preparat su ile yıkanır. Lugol damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Su ile yıkanır. Alkol ile renksiz sıvı akana kadar renk giderilir. Su ile yıkanır. Sulu füksin damlatılır, 30 saniye beklenir. Su ile yıkanır. Kurutma kağıdı arasında hafifçe bastırılarak kurutulur. 100'lük büyütmeli objektif ile immersiyon yağı damlatılarak incelenir. Gram olumlu ve olumsuz bakteriler hangi renkte görülür Gram olumsuz bakteriler neden mor renkte boyanmazlar Gram boyamada dekolorizasyon (renk giderme) hangi madde ile yapılır Tüberküloz basili ve benzer özellikteki bakteriler bazik boyalar ile diğer bakteriler gibi kolayca boyanmazlar. Bakteri duvar yapısının özelliği nedeniyle bazik boyalar ısıtılarak ve daha uzun süre bekletilerek hücre içine alınabilirler. Boyayı aldıktan sonra, ortama eklenen alkol ve asit karışımı ile renkleri giderilemez. Oysa diğer bakterilerin asit + alkol karışımında renkleri gider ve zemin boyamak için kullanılan boyanın rengini alırlar. Bu nedenle, bazı bakteri- - 88 -
lerin mikroskobik incelemelerinde asit ve alkole dirençli boyama yöntemlerine başvurulur. Ehrlich Ziehl-Neelsen metodu, ARB yöntemlerinden en sık kullanılanıdır. Tüberküloz, lepra basili, nokardialar ve diğer mikobakteriler ARB ile boyanırlar. Tüberküloz hastalığının tanımlanmasında, özellikle balgam başta olmak üzere çeşitli vücut ve sıvı örneklerinden, basil aranmasında değerli bir boyama yöntemidir. ARB Yönteminde aşağıdaki işlemler sırası ile uygulanır : Havada kurutulup alevde tesbit edilen preparat üzerine : Karbol füksin damlatılır. Kaynatmamaya özen göstererek preparat alttan 2-5 daki ka süre ile ısıtılır. Boya azaldığında tekrar damlatılarak eklenir. Kurumamasına özen gösterilir. Su ile yıkanır. Asit alkol karışımı ile renk giderilir. Su ile yıkanır. Metilen mavisi ile 1 dakika boyanır. Su ile yıkanır. Boyanan preparat üzerine bir damla immersiyon yağı damlatılarak x 100 büyütmeli objektif ile mikroskopta incelenir. Sonuçta asidoresiztan bakteriler, mavi zeminde kırmızı renkte görülürler. Aside dirençli boyama için Kinyoun ve Fluorochome yöntemleri de kullanılır. ARB yöntemi ile boyanan bakterilere örnekler veriniz. Tüberküloz basili ARB yönteminde ne renkte boyanır - 89 -
2.4. Bakteriyolojide Kullanılan Diğer Boyama Yöntemleri 2.4.1. Metilen Mavisi İle Boyama Bu amaçla en sık Löffler'in metilen mavisi kullanılır. Boyama işlemi için hazırlanan yayma havada kurutulur ve alevden geçirilerek tesbit edildikten sonra üzeri metilen mavisi ile örtülür. Yayma 30-60 saniye arasında boyayla temas ettirilir. Eğer daha uzun süre temas olursa, bakteriler ile diğer cisimlerin ayırt edilmesi güçleşir. Suyla yıkanıp, havada kurutulan yayma preparat immersiyon objektifi ile incelenir. 2.4.2. Kapsüllerin Boyanması Kapsül ya boyanarak ya da zemin ve bakteri gövdesinin boyanması sonucunda boyasız bir bölge olarak gösterilebilir. Kapsülü, boyanmayan boşluk görünümünde incelemek için, en sık kullanılan boya çin mürekkebidir. Bu mürekkepten temiz bir lam üzerine bir damla konur. İncelenecek örnek veya kültürden aynı miktarda alınarak karıştırılır. İnce yayma yapar gibi bir lam yardımı ile yayılır. Yaymada kapsüller, siyah zemin üzerinde renksiz olarak görülürler. Kapsülün boyanarak incelenmesinde Muir veya benzeri yöntemler kullanılır. Bu boyama sonucunda kapsüller mavi, hücreler kırmızı renkte görülürler. 2.4.3. Sporların Boyanması Modifiye Wirtz yöntemi kullanılabilir. Bu yöntemle sporlar yeşil, hücreler kırmızı görülür. Sporlar Gram boyasını almazlar. Sporlar, bakterilerin içerisinde boyanmayan boşluklar şeklinde görülürler. Sporları boyayarak gösterebilmek için Modifiye Wirtz yöntemi kullanılabilir. Ayrıca bakterilerin hücre içi vakuollerini, kirpiklerini, metakromatik cisimciklerini boyamada kullanılan özel yöntemler vardır. Sayılan yöntemler ve diğer birçok boyama işlemlerinin amacı direkt mikroskobik incelemelerde mikroorganizmalara ait özel yapıların gösterilebilmesidir. Bu çalışmalar, tanımsal ve aynı zamanda araştırma amaçlıdır. 2.4.4. Mantar Boyaları Maya ve maya benzeri mantarlar, bakteri boyalarıyla (özellikle Gram yöntemi) kolayca boyanabilirler. Küf biçiminde üreyen mantarların tanımlanmasında ise bazı özel boyalar kullanılır. Bu boya ve maddeler şunlardır: - 90 -
Laktofenol pamuk mavisi : Laktik asit, fenol, gliserin ve pamuk mavisinin distile sudaki karışımıdır. Hif yapılarının ve sporların daha iyi görülmesini sağlar. KOH : %4-10-30'luk sulandırımları kullanılır. Dokudan hazırlanan direkt preparatlarda kitin ve mukus dokusunun parçalanmasını sağladığından mantar elemanlarının daha kolay bir biçimde açığa çıkmasını sağlar. Özellikle deri, saç ve tırnağın mantar infeksiyonlarının tanımlanmasında kullanılır. Kapsül ve sporların varlığının gösterilmesinin önemi nedir Deri kazıntıları, saç ve tırnak örneklerinin potasyum hidroksit ile karıştırılmasındaki amaç nedir Ayrıca daha özel amaçlarla kullanılan boyalar da vardır. Bunlar; PAS (Periyodik Asit Schiff) Gomori metanamin silver boyası Hematoksilen-eozin boyası Papanicalou direkt yayma boyası Sözü edilen bu boyama yöntemleri patoloji dersleriniz içerisinde geçecektir. 2.4.5. Virus Boyaları Viruslar ancak elektron mikroskobu ile görülebilecek boyutlardadır. Elektron mikroskobik incelemeler için preparat hazırlanması özel teknikleri ve bu konuda deneyimli personeli gerektirir. Virusların üremeleri sonucunda hücre içerisinde oluşturdukları inklüzyon cisimcikleri ışık mikroskobunda özel boyalarla boyandığında gözlenebilir. Bu amaçla en çok kullanılan boyalar Giemsa ve Wright'dir. Kuduz virusunun beyinde oluşturduğu ve Negri cisimciği olarak anılan yapılar, Seller metodu ile boyanır. Bu boyama ile Negri cisimcikleri parlak vişne renginde, çekirdek maddeleri koyu mavi, sinir hücreleri mavimsi renktedir. Viruslar ayrıca hücre kültürlerinde üretilerek, gerek hücrelerde oluşturdukları değişiklikler gerekse oluşturdukları inklüzyon cisimleri çeşitli boyalar kullanılarak incelenebilir. IIşık mikroskobunda viruslara aitgözlenen oluşumların adı nedir Negri cisimciği nedir - 91 -
2.4.6. Parazit Boyaları Dışkının parazitolojik açıdan mikroskobik olarak incelenmesi boyalı ve boyasız olarak yapılır. Boyasız preparatların hazırlanmasında serum fizyolojik kullanılır. Ayrıca biyokimyasal incelemeler için çeşitli boya ya da kimyasal maddelerden yararlanılır. Serum fizyolojik ile inceleme: Lam üzerine bir damla serum fizyolojik konur. Temiz bir tahta çöp yardımı ile bir parça dışkı alınarak serum fizyolojik ile karıştırılıp, süspansiyon haline gelmesi sağlanır. Daha sonra üzerine lamel ile kapatılarak ışık mikroskobunun önce 10'luk, daha sonra 40'lık objektifleriyle incelenir. Bu yöntemde boya kullanılmadığından protozoonların insanlarda hastalık yapan hareketli trofozoit şekillerini görmek mümkün olur. Boyalı inceleme: Bu amaçla kullanılan başlıca boyalar eozin ve lugol'dür. Bu metodlar ile dışkıda parazit yumurtaları, kistleri ve larvalarının ince yapılarının görülmesi mümkündür. Eozin boyası: Eozinin serum fizyolojik içindeki %0,1'lik sulandırımından bir kaç damla taze dışkı üzerine eklenir. Lamel ile kapatılır. Zemin kırmızı, parazit yumurtaları ise soluk pembe boyanır. Lugol: Potasyum iyodür ile iyot karışımı olan lugol solusyonu taze dışkı preparatı üzerine 1 damla damlatılır ve lamel ile kapatılır. Parazit yumurtaları sarı-kahverengi olarak boyanırlar. Dışkının parazitolojik incelenmesinde santrifüj ve diğer yöntemlerle yoğunlaştırma işlemi yapılarak parazit elemanlarının görülme oranı arttırılabilir. Taze dışkının serum fizyolojik damlatılarak incelenmesi sırasında hangi canlılar incelenebilir Parazit yumurtalarını incelemek için kullanılan madde nedir 2.4.7. Giemsa Boyama Yöntemi Kanın şekilli elemanlarının değerlendirilmesinde ve kan parazitlerinin tanısında yararlanılan bir boyadır. Giemsa boyamada kullanılacak lamın temizliği önemlidir. Bu amaçla alkoleter karışımı veya asetondan yararlanılır. İnce yayma preparat hazırlamak için, hastanın sol elinin yüzük parmağının ucu iyot-alkol karışımı ile dezenfekte edildikten sonra, steril lanset ile delinir. Parmak daha geriden ya- - 92 -
vaşça sıkılarak ilk damlanın dışarı atılması sağlanır. İkinci damla temizlenmiş lamın üzerine ve kısa kenarına yakın kısmına değdirilerek alınır. Daha sonra ikinci bir lam veya lamel yardımı ile, birinci lamla arasında 45 açı olacak şekilde kan damlasına doğru yaklaştırılır, kan, lamın kenarına yayıldıktan sonra ileri doğru çekilip ince yayma tamamlanır. İnce yaymada tüm hücreleri incelemek mümkündür. Şekil 2 : İnce yayma preparatının hazırlanışı0 Üstteki lam önce küçük ok çizgisinde itilir, daha sonra büyük ok istikametinde çekilir. İşlemler 1-2 - 3 sırasına göre tamamlanır. Kalın damla preparat hazırlamak için, aynı şeklide parmak ucundan kan alınarak lam üzerine konur. Bu kez diğer lamın sivri ucu kullanılarak 1,5 cm 2 'lik bir alanı geçmeyecek şekilde karıştırılarak kanın pıhtılaşmadan kuruması sağlanır. Bu durumda eritrositler parçalanarak parazitler açığa çıkacak, az bir alana daha yoğun parazit düşmesi sağlanacaktır. Şekil 3 : A-Kalın damla preparatın hazırlanışı B-Kalın damla ve ince yayma aynı lamda bir hasta için hazırlanmıştır. - 93 -
Bir hastadan alınan kan örneğinin aynı lam üzerinde hem ince yayma hemde kalın damla preparatın yapılmasında pratik açıdan yarar vardır. Giemsa boyası 15 ml. daha önceden hazırlanmış stok Giemsa solusyonuna 35 ml. fosfat tamponu karıştırılarak taze olarak hazırlanır. Giemsa boyama yönteminde aşağıdaki işlemler sırasıyla yapılır. İnce yayma preparat metil alkol ile 3 dakika tespit edilir. Kalın damla için tespit işlemi uygulanmaz. Daha sonra preparat Giemsa boyasına daldırılarak 30 dakika bekletilir. Fosfat tamponuna batırılarak yıkanır. Havada kurutulur. Giemsa boyası kullanılarak kanda aranan başlıca parazitler; sıtma, kala-azar, filiariazis etkenleridir. Sıtma hastalığı etkenleri plazmodyum'lardır. Plazmodyumlar insanlara sivrisineklerle bulaşır. Parazitler öncelikle karaciğer hücrelerine daha sonra eritrositler içine yerleşirler. Eritrositler içerisinde başlangıçta tipik taşlı yüzük görünümleri vardır. Yüzüğün taşlı kısmını çekirdek oluşturur ve pembe kırmızı renktedir. Sitoplazma, yüzüğün halkasına benzer ve mavi renktedir. Sıtma parazitlerine ait diğer elemanlar bu yöntemle incelenirler ve etkenin tanımlanması gerçekleştirilir. Şekil 4 : İnce yayma preparatta sıtma plazmodyumlarının görülmesi (A-Nukleus B- Sitoplazma) - 94 -
Kalın damla preparatta neden eritrosit görülmez İnce yayma preparat ne ile tesbit edilir Sıtma hastalığının tanısında neden ince yayma ve kalın damla incelemeye gerek vardır 3. MİKROORGANİZMALARIN HAREKETLERİNİN İNCELENMESİ Mikroorganizmalar gerçek aktif hareketleri yanında, bulundukları yerde titreşim tarzında moleküler hareket de yaparlar. Bu harekete ilk kez Brown tarafından gösterilmesi nedeniyle Brownian hareket denir. Bazen de lam lamel arası incelemelerde sıvı içinde kayma ve akmalar görülebilir. Tüm bu gibi özellikler inceleme sırasında dikkat ve deneyimli olmayı gerektirir. Hareket muayenesinde en çok kullanılan yöntemler aşağıda verilmiştir. 3.1. Lam-lamel Arası Muayene Hareket yönünden incelenecek mikroorganizmanın uygun koşullarda taze saf kültürü yapılmalıdır. Kültürden bir öze dolusu bakteri alınarak temiz bir lam üzerine konur. Üzerine temiz bir lamel kapıtılarak karanlık saha veya normal ışık mikroskobunda inceleme yapılır. Ayrıca katı besiyerinden alınan koloniler serum fizyolojik ile karıştırılarak da lam lamel arası hareket muayenesi yapılabilir. Mikroskopta hareket muayenesi yapılırken dikkat edilecek konular aşağıda özetle verilmektedir. Mikroskop düzgün bir masa üzerinde olmalıdır. Lam üzerinde homojen bir süspansiyon bulunmalıdır. Hareket için etüvden çıkarılan kültürden hemen preparat yapılıp incelenmelidir. Lam soğuk olmamalı, oda ısısında olmalıdır. Lam üzerindeki kültür sıvısında bir akma hareketi varsa, bu duruncaya kadar inceleme yapılmamalıdır. İnceleme sırasında masa hiç bir şekilde sallanmamalıdır. - 95 -
3.2. Asılı Damla Yöntemi Bu yöntemde inceleme yapabilmek için özel lamlara gereksinim vardır. Taze sıvı kültürden bir damla alınarak lamel üzerine konur. Daha sonra lamel tersine döndürülerek lamın çukur kısmı veya silindir halkanın üzerine kapatılır. Damla boşlukta sarkar bir duruma getirilir. Lamelin kenarları sıvı parafin veya oje ile kapatılıp mikroskobik inceleme yapılır. Katı basiyerinde üretilmiş mikroplardan da hareket muayenesi yapılabilir. 3.3. Yarı Katı Besiyerinde İnceleme Yarı katı ortamlarda hareket muayenesi zaman alıcı olup, sonucu kesin olarak belirtmek de oldukça zordur. Bu nedenlerden dolayı daha az tercih ediilir. Hareket muayenesi istenen mikroorganizmanın, tek koloniden oluşan taze ve saf sıvı kültürü hazırlanır. Bu kültüre daldırılan steril iğne, 10 cm. yüksekliğindeki berrak yarı katı ortama dibe kadar daldırılır ve çıkarılır. Daha sonra besiyeri 24-48 saat 07 C de inkubasyonu takiben sonuçlar gözle değerlendirilir. Besiyerinin yüzeyinde inokulasyon çizgisi boyunca üreme var, sağa veya sola doğru bir dallanma yoksa, mikroorganizma hareketsizdir. Eğer inokulasyon çizgisinden etrafa agarın içine doğru bir yayılma ve dallanma gözlenirse, mikrop hareketlidir. 3.4. Kirpik (=flagel) Yapılarının Gösterilmesi Flagelli bakteriler hareketlidir. Flagel yapılarının gösterilmesi için Leifson boyama tekniği kullanılır. Flagel yapılar, rutinde kullanılmamasına karşın elektron mikroskop incelemelerinde de gösterilebilir. Bakterilerin hareketlilikleri nasıl gösterilir Yarı katı besiyerinde hareket varlığı nasıl saptanır Özet Mikroorganizmaların dokulardaki, çeşitli vücut sıvı ve akıntılarındaki veya besiyerlerinde üretilmiş şekillerinin mikroskobik özelliklerinin belirlenmesi için boyama yöntemlerine başvurulur. Hazırlanan yayma preparatlara, alınan örneğe ve muhtemel etkene yönelik bo- - 96 -
yama yöntemleri uygulanır. Bakteriyolojide en çok kullanılan boyama Gram tarafından tarif edilen ve adının verildiği bir yöntemdir. Bakteriler bu boyamaya dayanarak Gram olumlu ve Gram olumsuz olarak tanımlanırlar. Aynı zamanda mikroskobik görünümleri belirlenir. Tüberküloz basili için asidorezistan boyama yöntemleri uygulanır. Mantarlar, virusların inklüzyon cisimcikleri, hücre kültürlerinde üremiş şekilleri, parazitlerin yumurta, kist ve trofozoit şekilleri ile kan ve dokudan hazırlanan preparatların özel boyama yöntemleri vardır. Bu ünitede, ışık mikroskobundan yararlanarak, birkaç boya ya da çözelti yardımı ile lam, lamel kullanarak boyalı veya boyasız birçok mikroorganizma veya hücre incelenebileceğini öğrendiniz. Olanakları kısıtlı bir laboratuvarda bile edindiğiniz bilgileri kullanabilirsiniz. Değerlendirme Soruları 1. Dışkı preparatlarının hazırlanmasında ve Gram boyama yönteminde kullanılan ortak madde hangisidir A) Serum fizyolojik B) Lugol C) Alkol D) Füksin E) Eozin 2. Gram boyama yönteminde ikinci sırada hangi boya kullanılır A) Kristal viyole B) Lugol C) Sulu fuksin D) Karbol fuksin E) Metilen mavisi 3. Gram pozitif bakteriler mikroskopta hangi renkte görülürler A) Pembe B) Kırmızı C) Mor D) Mavi E) Yeşil 4. Ehrlich-Ziehl-Neelsen yöntemi ile boyanmada tüberküloz basilleri nasıl görünürler A) Mavi zeminde kırmızı basil B) Mavi basil C) Yeşil basil D) Mavi zeminde mor basil E) Kırmızı zeminde mavi basil - 97 -
5. Nötral boyama yönteminde preparatın tesbiti ne ile yapılır A) Isı B) Alkol C) Giemsa boyası D) Lugol E) Su 6. Aşağıdaki boyama yöntemlerinden hangisi nötral boyadır ve kan-doku preparatları için kullanılır A) Gram B) Laktofenol C) Çin mürekkebi D) Metilen mavisi E) Giemsa 7. Deri, saç ve tırnakta mantar elemanlarının gösterilmesinde kullanılan madde veya boya hangisidir A) Alkol B) KOH (%20-30'luk) C) Lugol D) Formol E) Hiçbiri 8. Sıtmalı bir hastadan hazırlanan kalın damla preparatta aşağıdakilerden hangisi görülmez A) Lökosit B) Lenfosit C) Eritrosit D) Plazmodyum E) Trombosit 9. Ehrlich-Ziehl-Neelsen yönteminde renk giderici olarak kullanılan madde hangisidir A) Alkol B) Eter C) Asit-alkol D) Metilen mavisi E) Lugol-alkol 10. Gram boyama yöntemindeki işlem sırası hangi seçenekte doğru olarak verilmiştir 1-Kristal viyolet 2-Karbol füksin 3-Sulu füksin 4-Lugol 5-Alkol A) 2-3-4-5 B)1-4-5-3 C) 1-5-4-3 D) 3-4-5-1 E) Hepsi yanlıştır. - 98 -
Sözlük Negri cisimciği : Kuduz hastalığında beyinde (ammon boynuzu) oluşan intrasitoplazmik oluşumlar. Genç trofozoit : Plazmodyumların genç halka şekilleridir. Genellikle taşlı yüzük şeklinde görülürler. Şizont : Olgun trofozoitlerin şizogonik çoğalma gösterdikleri form. Gametosit : Cinsiyet hücrelerinin ana şekilleridir. Dağınık pigment taşırlar. Kala-azar : Leishmania donovaninin etken olduğu tatarcıklarla bulaşan karaciğer dalak büyümesi ile seyreden bir hastalıktır. Filariazis : Kanda ve lenf bezlerinde etkenin yerleştiği, sivrisinekler aracılığı ile bulaşan bir helmint hastalığıdır. Peptidoglikan : Gram (+) bakterilerde kalın, Gram (-) lerde ince olarak duvarda yer alan kompleks bir polimerdir. Teikoik asit : Yalnızca Gram (+) bakterilerde biri hücre duvarında diğeri membranda yer alan suda çözünür polimerlerdir. Yararlanılan Kaynaklar BAUER, J. D.Clinical Laboratory Methods, The C.V. Mosby Company, St. Louis. Toronto. London, 1982. BİLGEHAN, H. Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, Barış Yayınları, Fakülteler Kitabevi. İzmir, 1989. ÇETİN, E.T., Anğ, Ö., Töreci, K., Tıbbi Parazitoloji, Fatih Gençlik Vakfı Matbaa İşletmesi. İstanbul, 1985. JAWETZ, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A., Medical Microbiology, Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut / Los Altos, California, 1989. - 99 -