B ColorPAC Toxin A Clostridium difficile toksin A nın hızlı tespiti için

B ColorPAC Toxin A Clostridium difficile toksin A nın hızlı tespiti için ABD Pat. 4.743.560; 4.703.017; 4.855.240; 4.695.554; 4.529.561; 5.617.023; 5.369.036; 5.567.591 U 8809761JAA 2006/08 Türkçe KULLANIM AMACI ColorPAC Toxin A Test (Toksin A Testi), C. difficile ile ilişkili hastalıktan şüphelenilen hastalardan alınan dışkı örneklerinde Clostridium difficile toksin A nın (enterotoksin) kalitatif tespiti için hızlı bir kromatografik testtir. Test, aynı zamanda agar plaklarından ve BHI broth dan alınan şüpheli toksijenik C. difficile kolonilerinin doğrulanması için de kullanılabilir. Bu test C. difficile ile ilişkili hastalıkların tanısında yardımcı olarak kullanım için tasarlanmıştır. ÖZET VE AÇIKLAMA C. difficile, en ciddi formu yüksek mortaliteye sahip psödomembranöz kolitin klinik sendromu ile sonuçlanabilen antibiyotiğe dirençli diyarenin önemli bir nedenidir. C. difficile normal bakteriyel bağırsak florasının bir parçası olabilmesine rağmen, hastanın antibiyotiklerle tedavisinden sonra ve sonrasında normal bağırsak florasının değişmesi ile fırsatçı bir patojen haline gelebilmektedir. Uygun koşullar altında, C. difficile nin toksin üreten suşları iki toksin üretir: toksin A, doku hasarı veren bir enterotoksin ve toksin B, in vitro bir sitotoksin. 1 Literatür hem toksin A hem de toksin B nin aynı zamanda üretildiğini gösterir. 2 Hastalık ile ilişkili klinik semptomların temel olarak toksin A ile ilişkili olduğu düşünülmüştür ve bugüne kadar toksin B nin doğal olarak oluşan hastalıkta herhangi bir önemli biyolojik etkinliği olduğuna dair ikna edici bir kanıt yoktur. 3 C. difficile antibiyotik ile ilişkili kolitler için en yaygın klinik tanı desteği hücre kültürü sitotoksisite testleri (CTA), lateks aglütinasyonu (LA) ve enzim immüno testleridir (EIA). 4 CTA, hücre kültüründe sitopatik etki yoluyla toksin B yi tespit eder ve tamamlanması bir ila iki gün sürer. Lateks aglütinasyonu, spesifik toksinlerden ziyade C. difficile antijenlerini tespit eder, fakat diyareli hastalarda C. difficile nin etiyolojik bir rolü olup olmadığını onaylamada değerli bir hızlı test olarak kabul edilmektedir. 5 Mikro kuyucuk enzim immüno testleri, toksin A yı veya bazı durumlarda eşzamanlı olarak hem toksin A hem de toksin B yi tespit edebilir. 6 PROSEDÜR İLKELERİ ColorPAC Toksin A Testi, bir test cihazında bulunan kromatografik test stribi üzerinde tutuklanan C. difficile toksin A antikorunun yakalanmasını kapsar. Örnek (dışkı, koloniler veya BHI broth) örnek tamponu ile seyreltilir ve test cihazının örnek kuyusuna eklenir. Seyreltilmiş örnek kapiler etki ile test stribinde ilerler. Mevcut Toksin A, örnek test stribi boyunca hareket ederken test çizgisinde antikor yakalamak üzere bağlanır. Yıkama reaktifleri ve diğer reaktifler test cihazının reaktif kuyucuğuna eklenir. Detektör A eklenmesi üzerine, pembe boya içeren toksin A antikor kaplı lipozomlar test stribi boyunca ilerleyen ve önceki adımda test stribine bağlanan C. difficile toksin A ya bağlanır. Test çizgisinde Detektör A ve örnek antijeni arasında oluşan komplekse bağlanan İkinci bir lipozom reaktifi olan Detektör B nin eklenmesiyle renk oluşumu artar. Nihai yıkamayı takiben, reaksiyonlar görsel olarak okunur. Örnekte toksin A antijeni tespit edilirse, pozitif sonucu gösterecek şekilde pembe bir test hattı ve pembe bir kontrol hattı görünecektir. Toksin A yokluğunda, yalnızca negatif sonucu işaret eden pembe bir kontrol hattı görünür. REAKTİFLER ColorPAC Toxin A Test Kit: Reaktif 1 (30,0 ml) Örnek Tamponu: Mukolitik ajan içeren tamponlu tuz çözeltisi, %1 deterjan. Reaktif 2 (1,5 ml) Detektör A: Tavşan C. difficile toksin A antikor kaplı lipozomlar. Reaktif 3 (1,5 ml) Detektör B: Detektör A ya özgü tavşan antikoru kaplı lipozomlar Reaktif W (2,3 ml) Yıkama Reaktifi: Sığır protein dengeleyicisi içeren tamponlu tuz çözeltisi, %0,1 deterjan. Kontrol + (1,0 ml) Pozitif Kontrol: Sığır protein dengeleyicisi içeren tamponlu tuz çözeltisi, inaktive edilmiş C. difficile toksin A. Kontrol - (1,0 ml) Kontrol: Sığır protein dengeleyicisi içeren tamponlu tuz çözeltisi. Her biri %0,2 sodyum azit (koruyucu) içeren reaktifler ve kontroller. 30 Test Cihazı Her biri monoklonal C. difficile toksin A antikor ve C. difficile toksin A ile kaplı bir test stribi içerir. 30 SQ-EASY Tüpler ve Filtre Uçları. 30 Aplikatör Çubuk ve Aktarım Pipeti. 1 Damlalık Çubuğu Uyarılar ve Önlemler: In vitro Diyagnostik Kullanım içindir. Reaktifler: Alındıktan sonra, kiti buzdolabında saklayın veya buzdolabında saklanması gereken reaktifleri kartondan çıkarın ve 2 8 C de saklayın. DONDURMAYIN. Reaktifler kullanılmadığında renk kodlu kapakların karışmamasına özen gösterilerek hemen yeniden kapatılmalı ve buzdolabına geri konmalıdır. Son kullanma tarihi geçen ürünleri kullanmayın. Buzdolabından çıkardıktan sonra, reaktiflerin kullanım öncesinde oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Reaktiflerin kuvvetli ışıkta uzun süre kalmasından kaçının. Farklı kit lotlarından reaktifleri ve cihazları değiştirmeyin, karıştırmayın veya birleştirmeyin. Damlanın doğru şekilde uygulanmasını sağlamak için, reaktif dağıtma şişesini dik tutun, tek seferde serbest düşen tek bir damla dağıtın. Uyarı: Reaktifler sodyum azit içerir. Solunması, cilde temas etmesi ve yutulması halinde son derece zehirlidir. Asitlerle temas etmesi çok zehirli gazların açığa çıkmasına neden olur. Ciltle teması halinde, derhal bol suyla yıkayın. Sodyum azit, kurşun

ve bakırla reaksiyona girerek yüksek oranda patlayıcı metal azit oluşturabilir. Atarken, azit oluşumunu önlemek için yüksek hacimde suyla çalkalayın. Test Cihazları: Kullanımdan hemen öncesine kadar test cihazını torbadan çıkarmayın. Açılmamış cihazları oda sıcaklığında (15 30 C) veya isteğe bağlı olarak buzdolabında (2 8 C) saklayın. Kullanılmamış cihazları tekrar tekrar buzdolabı ve oda sıcaklığına maruz bırakmayın. Tek kullanımlıktır; tekrar kullanmayın. Kontroller: Pozitif ve negatif kontroller uygun sonuçlar vermezse kiti kullanmayın. Pozitif kontrol inaktive edilmiş C. difficile toksin A ile yapılmıştır ve potansiyel tehlikeli madde olarak işlenmelidir. Aktarım Pipetleri: Tek kullanımlıktır; tekrar kullanmayın. Filtre Uçları: Uygun test performansını sağlamak için uç, beyaz filtre materyali içermelidir. Tek kullanımlıktır; tekrar kullanmayın. Filtre ucunun üst kenarı SQ-EASY tüpün üstü ile aynı hizada olacak şekilde yerine oturduğundan emin olun. Uyarı: Klinik örneklerde hepatit virüsü ve İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü de dahil olmak üzere patojenik mikroorganizmalar bulunabilir. Kan veya diğer vücut sıvılarıyla kontamine olan tüm öğelerle çalışılırken, Standard Precautions (Standart Önlemler) 7-10 ve kurumsal düzenlemeler takip edilmelidir. Testin gerçekleştirilmesinde kullanılan bütün materyalleri biyolojik tehlike arz eden atıklar için onaylanmış bir zarfa atın. Örnekler, 60 dakika 121 C de otoklavlanabilir veya 30 dakika %0,05 sodyum hipoklorit çözeltisi (çamaşır suyunun 1:100 seyreltimi) ile muamele edilebilir. Sodyum hipoklorit içeren materyalleri otoklavlamayın. ÖRNEK TOPLAMA VE KULLANMA Dışkı örneklerini koruyucu içermeyen ve hava geçirmeyen temiz bir kaba alın. Örnekler laboratuvarda alındıktan sonra mümkün olduğunca kısa sürede test edilmelidir; bununla birlikte, 2 8 C de 72 saat saklanabilir. Örnekler 72 saatten sonra test edilecekse, laboratuvarda alındıktan hemen sonra -70 C de dondurulmalıdır. Örnekler 2 aya kadar dondurulabilir. Pozitif örnekler üç dondurup-eritme döngüsünden sonra ColorPAC Toksin A ile tespit edilen toksin A açısından çok az azalma gösterecek veya hiç azalma göstermeyecektir. Dışkı örneklerinin oda sıcaklığına gelmelerini sağlayın ve kullanmadan önce iyice çalkalayın. ColorPAC Toksin A test sonuçları dışkıda bulunabilen ampisilin, sefaleksin, metronidazol, vankomisin, baryum sülfat, laksatifler, kan ve antidiyare ilaçlarından etkilenmez. C. difficile veya toksin testlerinin diyare (formsuz) dışkı örneklerinde gerçekleştirilmesi önerilir. 7 PROSEDÜR Sağlanan malzemeler: Reaktifler altında listelenen tüm malzemeler. Gerekli fakat sağlanmamış malzemeler: Vorteks karıştırıcı ve zamanlayıcı, mikropipet; (opsiyonel: Brain Heart Infusion Broth veya C. difficile seçici agara yalnızca C. difficile kültür izolatlarında toksin A tespiti için ihtiyaç duyulur, santrifüj kapasitesi 1.500 x g bkz. Test Prosedürü nokta -1). Test Performansı: Prosedürleri gerçekleştirmeden önce Önlemler ve Örnek Toplama ve İşleme bölümlerini gözden geçirin. Test alanı, reaktifler, test örnekleri ve test bileşenleri, testten önce oda sıcaklığında olmalıdır. Kullanmadan önce bütün reaktifleri birkaç defa hafifçe ters çevirerek karıştırın. Köpürtmekten kaçının. DIŞKI ÖRNEĞI HAZIRLANMASI Arka Kapaktaki Açıklamalara Bakın 1. Test edilecek her örnek için bir mikropipet veya tedarik edilen damlalık çubukla, 1 ml Reaktif 1 i (Örnek Tamponu) bir SQ-EASY tüpüne ekleyin. 2. Dışkı örneğini olabildiğince iyi karıştırın. Sıvı veya yarı katı dışkılar için, 0,5 ml örneği sağlanan aktarım pipetini kullanarak Reaktif 1 içeren tüpe pipetleyin. Katı dışkılar için, örneğin ayrı alanlarından iki bezelye büyüklüğünde (0,5 g) örnek almak için sağlanan aplikatör çubuğu veya tahta spatula kullanın ve Reaktif 1 içeren tüpe aktarın. Vortekslemeden önce tüpü bir filtre ile kapatın. 3. Tüpü yüksek hızda 15 saniye vorteksleyin. Seyreltilmiş örnek, artık kullanıma hazırdır. Test Prosedürüne geçin. KOLONI VE BHI BROTH ÖRNEĞI HAZIRLANMASI (opsiyonel) Plak Kültür Ortamından Toksin A Testi: 1. C. difficile morfolojik ve Gram boyama özelliklerini karşılayan 42 48 saatlik kültürlerden alınan şüpheli kolonileri agar yüzeyine yerleştirin. 2. Bir mikropipet veya sağlanan damlalık çubuk ile, 1 ml Reaktif 1 i (Örnek Tampon) 12 x 75 mm kültür tüpüne ekleyin. 2.0 McFarland türbidite standardını elde etmek için izole edilen şüpheli kolonileri aseptik olarak aktarın. 3. Bakteriyel süspansiyonu 2.0 McFarland standardı ile karşılaştırın. Gerektiğinde 2,0 McFarland türbiditesine ayarlamak için ilave Reaktif 1 kullanın. 4. Tüpü yüksek hızda 15 saniye vorteksleyin. Seyreltilmiş örnek, artık kullanıma hazırdır. 5. Test Prosedürüne geçin. BHI Broth dan Toksin A Testi: 1. Bir mikropipet veya sağlanan damlalık çubuğu ile, 1 ml Reaktif 1 i (Örnek Tampon) SQ-EASY tüpüne ekleyin. 2. Şüpheli C. difficile kültürü ile 0,5 ml 72 saatlik BHI broth ekleyin. Vortekslemeden önce tüpü bir filtre ile kapatın. 3. Tüpü yüksek hızda 15 saniye vorteksleyin. Seyreltilmiş örnek, artık kullanıma hazırdır. 4. Test Prosedürüne geçin. 2

Açıklamalara bakın, Arka Kapak Test Prosedürü: Test edilecek örnek ve kontrol sayısı kadar Test Cihazı açın. 1. Test Cihazının Örnek Kuyusuna seyreltilmiş örnekten 3 damla (125 µl) ekleyin. Örneğin 3 dakika absorbe olmasını bekleyin. Not: Bazı durumlarda, filtre ucundan geçmeyen örnekler veya filtre olan fakat akmayan örneklere en az 1.500 x g de 10 dakika santrifüj uygulanması gerekir. Mikropipet kullanarak, yeni bir Test Cihazının Örnek Kuyusuna 125 µl süpernatant ekleyin. Seyreltilmiş bir örnek yerine, kalite kontrolü için Örnek Kuyusuna 2 damla Kontrol + veya Kontrol eklenebilir. 2. Reaktif Kuyusuna 1 damla Reaktif W (Yıkama Reaktifi) ekleyin ve absorbe olmasını bekleyin. 3. Reaktif Kuyusuna 1 damla Reaktif 2 (Detektör A) ekleyin ve 3 dakika bekleyin. 4. Reaktif Kuyusuna 1 damla Reaktif W (Yıkama Reaktifi) ekleyin ve absorbe olmasını bekleyin. Not: Güçlü reaktif örnekler için, adım 5 ve 6 nın tamamlanmasından önce Test Cihazı penceresinde pembe bir test çizgisi (pozitif) görülebilir. 5. Reaktif Kuyusuna 1 damla Reaktif 3 (Detektör B) ekleyin ve 3 dakika bekleyin. 6. Reaktif Kuyusuna 1 damla Reaktif W (Yıkama Reaktifi) ekleyin ve absorbe olmasını bekleyin. 1 dakika sonra iyi aydınlatılmış bir alanda sonuçları okuyun. Renk yoğunluğu ve arka plan zamanla değişebilir, fakat sonuçlar fazladan bir 10 dakika içinde yorumlanabilir. Kalite Kontrolü: Reaktiflerin ve test cihazının performansını doğrulamak için her yeni kit açıldığında sıvı Kontrol + ve Kontrol test edilmelidir. Örnek kuyusuna 2 damla Kontrol + veya Kontrol ekleyin. 3 dakika absorbe olmasını bekleyin. Test Prosedürü altındaki adım 2 ye geçin. Opsiyonel: Kontrol + nın Reaktif 1 ile seyreltilmesi işlemi, daha zayıf bir pozitif reaksiyon gösterecek şekilde aşağıdaki gibi gerçekleştirilebilir ve test edilebilir: 1. 1,5 ml Reaktif 1 (Örnek Tamponu) ve serbest düşen bir Kontrol + damlasını bir test tüpüne ekleyin. Yavaşça karıştırın. 2. Bir SQ-EASY tüpüne 1,0 ml Reaktif 1 (Örnek Tamponu) ekleyin. 3. Bir aktarım pipeti kullanarak, ilk tüpten 0,5 ml seyreltilmiş Kontrol + yı SQ-EASY tüpüne aktarın. 4. SQ-EASY tüpünü bir filtre ucuyla kapatın. Filtrenin yerine oturduğundan emin olun. 5. Tüpü yüksek hızda 15 saniye vorteksleyin. Seyreltilmiş örnek, artık kullanıma hazırdır. Test Prosedürü ne geçin. ColorPAC Toksin A cihazı iki yerleşik kontrol içerir. Test Penceresinde (alan C ) pembe bir kontrol çizgisinin görünmesi, cihazın immünolojik reaktivitesini, uygun tespit reaktifi işlevini ve uygun akış özelliklerini doğrulayan dahili bir pozitif kontrol sağlar. Membran alanı (arka plan) spesifik olmayan renk gelişiminin test sonucu ile etkileşmediğini garantileyen dahili negatif kontrol olarak işlev görür. Gerekli kalite kontrolleri ilgili yerel, resmi ve/veya federal düzenlemeler veya akreditasyon gerekliliklerine veya laboratuvarınızın standart Kalite Kontrol prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Kullanıcının, uygun Kalite Kontrol uygulamaları için ilgili CLSI yönergelerine ve CLIA düzenlemelerine uyması önerilir. Pozitif ve negatif kontroller uygun sonuçlar vermediyse hasta sonuçları bildirilmemelidir. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Resimlere bakın, Arka Kapak Pozitif Test: Test Penceresinde (alan T ) herhangi bir yoğunlukta pembe test çizgisi görünürse sonuç pozitiftir. Pozitif bir test sonucu hasta örneğinde C. difficile toksin A nın tespit edildiğini gösterir. Test Penceresinde herhangi bir yoğunlukta pembe bir kontrol çizgisi görülmelidir (alan C ). Bazı yoğun pozitif reaksiyonlar kontrol çizgisi yoğunluğunda azalmaya neden olabilir. Arka plan yoğunluğu kontrol çizgisini karartmamalıdır. Test: Test Penceresinde (alan T ) görünür test çizgisi yoksa sonuç negatiftir. bir test sonucu hasta örneğinde C. difficile toksin A nın tespit edilmediğini gösterir. Test Penceresinde herhangi bir yoğunlukta pembe bir kontrol çizgisi görülmelidir (alan C ). Bazı hasta örnekleri kontrol çizgisi yoğunluğunun azalmasına sebep olan koyu bir arka plana neden olabilir. C. difficile toksini için dışkı üzerinde gerçekleştirilen birçok tanı testi ile olduğu gibi, eğer sonuç negatif ise ve semptomlar devam ediyorsa, ve C. difficile ile ilişkili diyareden şüpheleniliyorsa, aynı veya sonraki bir dışkı örneğinin farklı bir yöntem kullanılarak test edilmesi önerilir. Yorumlanamayan Test: Test Penceresinde (alan C ) pembe kontrol çizgisi yoksa veya arkaplan, kontrol çizgisinin okunmasını engelliyorsa sonuç yorumlanamazdır. Sonuç yorumlanamazsa, minimum 1.500 x g de 10 dakika santrifüj edilen ve Test Prosedürü nde adım 1 ila 6 da tanımlandığı gibi test edilen yeni bir örnek hazırlanmalıdır. Örnek hala yorumlanamıyorsa yeni bir örnek alınmalıdır. PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR ColorPAC Toksin A Testi C. difficile ile ilişkili hastalık varlığını belirlemez, yalnızca dışkıda toksin A varlığını gösterir. Toksin düzeyinin hastalık varlığı veya yokluğu ile ilişkili olmadığı görülmüştür. Bu test sonuçlarının, doktor tarafından diğer laboratuvar test sonuçları ve hastanın klinik bulguları ile birlikte yorumlanması gerekir. Önceki 2 ay içerisinde antibiyotik alan diyareli hastalarda ve/veya ishali hastaneye yatırıldıktan 72 saat veya daha sonra başlayan tüm hastalarda C. difficile ile ilişkili diyareden (CDAD) şüphelenilmelidir. 11 Teknik veya prosedür hataları gibi faktörler ve dışkı örneğinde Örnek Toplanması ve İşlenmesi altında listelenmeyen maddelerin bulunması testi etkileyebilir ve hatalı sonuçlara yol açabilir. Bazı Clostridium sordellii izolatlarının toksin A ile benzer biyolojik, fizikokimyasal ve immünokimyasal özelliklere sahip olan hemorajik toksin (HT) oluşturduğu gösterilmiştir. HT, toksin A testlerinde çapraz reaksiyon gösterebilir. 4 C. sordellii HT suşları antibiyotik ile ilişkili diyare ve koliti bulunan hastalarda tespit edilmemiştir. 3

Bebekler ve kistik fibröz hastalarının dışkılarında klinik önem taşımayan C. difficile toksini bulunabilir. 12,13 ColorPAC Toksin A testinin performans özellikleri pediatrik popülasyonda (<12 yaş) belirlenmemiştir. Doktor ofisi, laboratuvar veya bakım ortamlarında performans çalışmaları yürütülmemiştir. Diğer testlerde olduğu gibi, toksin A titrelerinin korunması için de örneğin işlenmesi önemlidir. Eğer testler 72 saatten sonra gerçekleştirilecekse, örneklerin -70 C de dondurulması önerilir (bkz Örnek Toplanması ve İşlenmesi ). BEKLENEN DEĞERLER Clostridium difficile, toksijenik etkilerini, bağırsak yolu, antibiyotik tedavisi gibi bir sebeple tehlikeye düştüğünde gösteren fırsatçı bir patojendir. Bu sebeple, yakın zaman önce antibiyotik tedavisi gören hastalar veya kronik bakım altındakiler en sık enfekte olanlardır. Sağlıklı yetişkinlerin yaklaşık %15 inin dışkı sitotoksin testlerinin pozitif olabileceği tahmin edilmektedir. 14,15 Diyare hastalarında C. difficile enfeksiyonu prevalansı, hastanede, evde bakım uygulaması türüne ve hasta popülasyonuna göre değişir. ColorPAC Toksin A testi dört büyük bağımsız tıbbi merkezde gerçekleştirilen klinik deneylerde prospektif örnekler ile değerlendirildiğinde C. difficile ile ilişkili hastalık varlığından şüphe edilen hastalarda prevalans oranları %8,5 ila %13,5 aralığında değişmiştir. 16 PERFORMANS ÖZELLİKLERİ ColorPAC Toksin A testi performansı dört büyük bağımsız tıbbi merkezde yürütülen değerlendirmelerde belirlenmiştir. Tesisler ABD de coğrafi olarak farklı bölgelerde bulunmaktadır. C. difficile ile ilişkili hastalıktan şüphelenilen hastalardan alınan toplam 598 taze ve 162 donmuş dışkı örneği test edilmiştir. Her tesis kendi rutin sitotoksin B testini ColorPAC Toksin A testi ile karşılaştırmıştır. Dışkıların yalnızca %0,1 i bildirilebilir sonuçlar elde etmeden önce santrifüj ve yeniden test gerektirmiştir. Bu ilk karşılaştırmanın sonuçları Tablo 1 de özetlenmiştir. Tesis No. ColorPAC Toksin A 1 240 Pozitif 2 135 Pozitif 3 207 Pozitif 4 178 Pozitif Kombine 760 Pozitif Tablo 1 ColorPAC Toxin A Sonuçlarının Sitotoksin B sonuçları ile karşılaştırılması Sitotoksin B sonuçları Pozitif %95 Güven aralığı 028 006 018 002 021 005 029 010 096 023 006 200 001 114 011 170 001 138 019 622 Duyarlılık %82 Özgünlük %97 Duyarlılık %90 Özgünlük %99 Duyarlılık %81 Özgünlük %94 Duyarlılık %74 Özgünlük %99 Duyarlılık %81 Özgünlük %97 (%65,5, %93,2) (%93,8, %98,9) (%68,3, %98,8) (%95,3, %99,9) (%60,7, %93,5) (%89,4, %96,9) (%57,9, %87,0) (%96,1, %100) (%72,4, %87,3) (%95,4, %98,2) Sitotoksik testlere ilişkin standartların olmaması sebebiyle, uyuşmayan örnekler toksijenik kültür ile daha detaylı araştırılmıştır. ColorPAC Toksin A testinin toksijenik kültür ile uyuşmayan sonuçları Tablo 2 de özetlenmiştir. Tablo 2 ColorPAC Toxin A Sonuçları ve Sitotoksin B Sonuçlarının Uyuşmayan Örneklerin Ayrışması ile Karşılaştırılması Tesis No. ColorPAC Toksin A 1 240 Pozitif 2 135 Pozitif 3 207 Pozitif 4 178 Pozitif Toplu 760 Pozitif Sitotoksin B sonuçları Pozitif 030 005 018 000 022 000 029 007 099 012 004 201 001 116 010 175 001 141 016 633 Beklenen Değerler bölümünde belirtildiği gibi, ColorPAC Toksin A testi dört büyük bağımsız tıbbi merkezde gerçekleştirilen klinik deneylerde prospektif örnekler ile değerlendirildiğinde C. difficile ile ilişkili hastalık varlığından şüphe edilen hastalarda %8,5 ila %13,5 aralığında değişen prevalans oranları gözlenmiştir. Her tesis için pozitif ve negatif tahmini değerler (PPV, NPV) gerçek prevalans ve her klinik tesisin performans özelliklerine dayalı olarak Tablo 3 te gösterilmiştir. 4

Tablo 3 ColorPAC Toksin A Gerçek Prevalans ve Performans Özelliklerine Bağlı Pozitif ve Tahmini Değerler Tesis Duyarlılık Özgünlük Görülme Sıklığı PPV NPV 1 %82 %97 %8,5 %72 %98 2 %90 %99 %13,5 %93 %98 3 %81 %94 %10,2 %61 %98 4 %74 %99 %11,1 %90 %97 ColorPAC Toksin A testi aynı zamanda üç Enzim İmmüno Testi (EIA) ile karşılaştırılmıştır. Dört klinik tesisin her biri en az bir EIA, ColorPAC Toksin A ve sitotoksin B test etmiştir. Her toksin A testinin sonuçları sitotoksin B ile karşılaştırılmış ve Tablo 4 te özetlenmiştir. Tablo 4 Sitotoksin B ve Toksin A Testlerinin Toplu Tesis Karşılaştırması Performans ColorPAC EIA Yöntemi 1 EIA Yöntemi 2 EIA Yöntemi 3 Toksin A Duyarlılık %81 %80 %74 %86 Özgünlük %97 %97 %98 %98 Benzerlik %95 %94 %94 %96 Başlangıçta Yorumlanamayan veya Belirsiz % si %0,1 %0,9 %2,4 %0 Koloni Doğrulama C. difficile nin toksin üreten suşları için şüpheli koloni gelişiminden kültür doğrulanmasını sağlamak için seçici agar, anaerobik kan agar ve Brain Heart Infusion (BHI) broth kullanılarak ColorPAC Toksin A test performansını değerlendirmek için bir çalışma yürütülmüştür. Her besiyerinden C. difficile nin morfolojik özelliklerini karşılayan toplam 111 klinik izolat ColorPAC Toksin A testi kullanılarak test edilmiştir. Biyokimyasal yöntemlerle kolonilerin tanımlanmasından sonra, toksijenik durum sitotoksin B testi ile belirlenmiştir. Bu ilk karşılaştırmanın sonuçları Tablo 5 de özetlenmiştir. Tablo 5 Sitotoksin B ve ColorPAC Toksin A Sonuçlarının Karşılaştırılması Ortam Tipine Göre Koloni Doğrulanması (Başlangıç Testi) Ortam Tipi Örnek No. Duyarlılık %95 Güven aralığı BHI Broth 111 52/55 %95 (%84,9, %98,8) Seçici Agar 111 52/55 %95 (%84,9, %98,8) Anaerobik Kan 111 49/55 %89 Agar (%77,7, %95,9) Özgünlük %95 Güven aralığı 52/56 %93 (%82,7, %98,0) 52/56 %93 (%82,7, %98,0) 53/56 %95 (%85,1, %98,9) Uyuşmayan sonuçlar Toksin A oluşturan koloniler için Toksin A EIA yöntemi kullanılarak test edilerek daha detaylı araştırılmıştır. ColorPAC Toksin A testinin uyuşmayan sonuçlarının sitotoksin B ve Toksin A yöntemi ile karşılaştırılması Tablo 6 da özetlenmiştir. Tablo 6 Sitotoksin B ve ColorPAC Toksin A Sonuçlarının Karşılaştırılması Ortam Tipine Göre Koloni Doğrulanması (Ayrışma ile) Ortam Tipi Örnek Sayısı Duyarlılık Özgünlük BHI Broth 111 55/55 55/56 Seçici Agar 111 55/55 55/56 Anaerobik Kan Agar 111 52/55 56/56 5

Çapraz Reaktivite: ColorPAC Toksin A testi, mikroorganizmalar (bakteriler, mayalar, virüsler ve parazitler), bakteriler ve mayalar için 10 7 10 8 CFU/mL nihai konsantrasyonda, virüsler için 10 3,2-10 6,2 TCID 50 /ml ve 10 6 parazit/ml konsantrasyonda toksin A pozitif ve toksin A negatif dışkı örneklerine inoküle ederek çapraz reaktivite açısından değerlendirilmiştir. Beklendiği gibi, testte çapraz reaksiyon gösteren tek organizma Clostridium sordellii nin (VPI 9048) kuvvetli toksijenik izolatıdır. İzolat, immünolojik ve biyolojik olarak C. difficile toksin A ve B ye benzer olduğu görülen yüksek düzeyde hemorajik ve letal toksin üretir. Protein A üreten Staphylococcus aureus Cowan suşu ATCC 12598, çapraz reaktivite göstermemiştir. Aynı zamanda, Shiga-benzeri toksinler (SLT) üreten Escherichia coli ATCC 43889, 43894 ve 43895 de herhangi bir çapraz reaktivite göstermemiştir. Aşağıdaki mikroorganizmalar toksin A negatif dışkıda hatalı pozitif sonuç veya toksin A pozitif dışkılarda hatalı negatif sonuç vermemiştir. Adenovirus, tip 2, 40, 41 (3) Aeromonas hydrophilia (1) Bacillus cereus (1) Bacillus subtilis (1) Bacteroides fragilis (1) Campylobacter coli (1) Campylobacter fetus (1) Campylobacter jejuni (1) Campylobacter laridis (1) Candida albicans (1) Clostridium botulinum, tip A (1) Clostridium butyricum (1) Clostridium histolyticum (1) Clostridium innocuum (1) Clostridium novyi (1) Mikroorganizmalar (Test edilen suş sayısı) Clostridium perfringens (1) Clostridium septicum (1) Clostridium sordellii, VPI 9048 (1) Clostridium sporogenes (1) Clostridium subterminale (1) Clostridium tetani (1) Coxsackie virus, B1 (1) Cytomegalovirus (1) Echovirus, tip 22 (1) Entamoeba histolytica (1) Enterococcus faecalis, ATCC 29212 (1) Enterococcus faecium, ATCC 51559 (Vankomisine dirençli) (1) Enterovirus, tip 69 (1) Escherichia coli (4) Giardia intestinalis (1) Klebsiella pneumoniae (1) Peptostreptococcus anaerobius (1) Proteus mirabilis (1) Pseudomonas aeruginosa (1) Rotavirus, insan (1) Salmonella choleraesius (1) Shigella dysenteriae (1) Shigella flexneri (1) Shigella sonnei (1) Staphylococcus aureus, ATCC 12598 (Cowan) (1) Vibrio cholerae (1) Vibrio parahemolyticus (1) Yersinia enterocolitica (1) Tespit Sınırı ColorPAC Toksin A testinin analitik duyarlılığı, sıvı, yarı-katı ve katı beş dışkı örneğine bilinen konsantrasyonlarda toksin A eklenerek gerçekleştirilmiştir. Eklenen örnekler üç tekrarlı olarak test edilmiştir. Sonuçlar Tablo 7 de özetlenmiştir. Tablo 7 Dışkı Tipi ile Tespit Sınırı Toksin A Eklenen Matriks LOD Aralığı (ng/ml) Sıvı Dışkı 1,38 5,21 Yarı-Katı Dışkı 1,61 18,71 Katı Dışkı 3,19 22,58 Testin Tekrarlanabilirliği ColorPAC Toksin A testinin tekrarlanabilirliği birkaç klinik laboratuvarda üç düzeyde toksin A ve toksin A negatif antijen kontrolü içeren dışkı panelleri test edilerek değerlendirilmiştir. Kör örnekler üç gün boyunca her gün üç kopya halinde dört klinik deney tesisinde test edilmiştir. ColorPAC Toksin A testler arası ve testler içinde %100 tekrarlanabilirlik göstermiştir. TİCARİ TAKDİM ŞEKLİ Kat. No. Açıklama 274030 ColorPAC Toxin A, C. difficile, 30 Test Kiti. REFERANSLAR 1. Sullivan, N.M., S. Pellet, and T.D. Wilkins. 1982. Purification and characterization of toxin A and B of Clostridium difficile. Infect. Immun. 35:1032-1040. 2. Lyerly, D.M., N.M. Sullivan, and T.D. Wilkins. 1983. Enzyme-linked immunosorbent assay for Clostridium difficile toxin A. J. Clin. Microbiol. 17:72-78. 3. Bartlett, J.G. 1994. Clostridium difficile: history of its role as an enteric pathogen and current state of knowledge about the organism. Clin. Infect. Dis. 18: (Suppl. 4): S265-S272. 4. Lyerly, D.M., H.C. Krivan, and T.D. Wilkins. 1988. Clostridium difficile: its disease and toxins. Clin. Microbiol. Rev. 1: 1-18. 5. Baron, E.J. 1989. Assessment of currently-available laboratory tests for Clostridium difficile-associated diarrhea. Clin. Microbiol. Newsl. 11:118-120. 6. Merz, C.S., C. Kramer, M. Forman, L. Gluck, K. Mills, K. Senft, I. Steiman, N. Wallace, and P. Charache. 1994. Comparison of four commercially available rapid enzyme immunoassays with cytotoxin assay for detection of Clostridium difficile toxin(s) from stool specimens. J. Clin. Microbiol. 32:1142-1147. 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers From occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa. 8. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80. 9. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 6

10. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045. 11. Gerding, D.N., Johnson, S. 1998. Clostridium difficile - associated diarrhea. Clin. Infect. Dis. 26:1027-1036. 12. Cooperstock, M. 1988. Clostridium difficile in infants and children, p. 45-64. In R.O. Rolfe, and S.M. Finegold (ed.), Clostridium difficile: its role in intestinal disease. Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 13. Peach, S.L., S.P. Borriello, H. Gayla, F.E. Barclay, and A.R. Welch. 1986. Asymptomatic carriage of Clostridum difficile in patients with cystic fibrosis. J. Clin. Pathol. 39:1013-1018. 14. Schleupner, M.A., D.C. Garner, K.M. Sosnowski, C.J. Schleupner, L.J. Barrett, E. Silva, D. Hirsch, and R.L. Guerrant. 1995. Concurrence of Clostridium difficile toxin A enzyme-linked immunosorbent assay, fecal lactoferrin assay, and clinical criteria with Clostridium difficile cytotoxin titer in two patient cohorts. J. Clin. Microbiol. 33:1755-1759. 15. Gerding, D. N., S. Johnson, L.R. Peterson, M.E. Mulligan, and J. Silva, Jr. 1995. Clostridium difficile-associated diarrhea and colitis. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 16:459-477. 16. Data on file, BD Diagnostic Systems. 7

ограничения Manufacturer / Výrobce / Producent / Fabrikant / Tootja / Valmistaja / Fabricant / Hersteller / ÊáôáóêåõáóôÞò / Gyártó / Ditta produttrice / Gamintojas / Producent / Fabricante / Výrobca / Tillverkare / Производител / Producãtor / Üretici / Proizvoðaè Use by / Spotøebujte do / Anvendes før / Houdbaar tot / Kasutada enne / Viimeinkäyttöpäivä / A utiliser avant / Verwendbar bis / Çìåñïìçßá ëþîçò / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Naudokite iki / Brukes før / Stosowaæ do / Utilizar em / Použite do / Usar antes de / Använd före / Използвайте до / A se utiliza pânã la / Son kullanma tarihi / Upotrebiti do YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) / RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec mìsíce) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) / JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand) AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp) VVVV-KK-PP / VVVV-KK (kuukauden loppuun mennessä) AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) / JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) / ÅÅÅÅ-ÌÌ-ÇÇ / ÅÅÅÅ-ÌÌ (ÌÌ = ôýëïò ôïõ ìþvá) / ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja) AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) / MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mënesio pabaiga) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesi¹ca) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) / RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca) aaaa-mm-dd / aaaa-mm (mm = fin del mes) / ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet på månaden) / ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = края на месеца) / AAAA-LL-ZZ / AAAA-LL (LL = sfârºitul lunii) / YYYY-AA-GG / YYYY-AA (AA = ayın sonu) / GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj meseca) Catalog number / Katalogové èíslo / Katalognummer / Catalogusnummer / Kataloogi number / Tuotenumero / Numéro catalogue / Bestellnummer / Áñéèìüò êáôáëüãïõ / Katalógusszám / Numero di catalogo / Katalogo numeris / Numer katalogowy / Número do catálogo / Katalógové èíslo / Número de catálogo / Каталожен номер / Numãr de catalog / Katalog numarası / Kataloški broj Authorized Representative in the European Community / Autorizovaný zástupce pro Evropskou unii / Autoriseret repræsentant i EU / Erkend vertegenwoordiger in de Europese Unie / Volitatud esindaja Euroopa Nõukogus / Valtuutettu edustaja Euroopan yhteisössä / Représentant agréé pour la C.E.E. / Autorisierte EG-Vertretung / ÅîïõóéïäïôçìÝíïò áíôéðñüóùðïò óôçí ÅõñùðáúêÞ Êïéíüôçôá / Hivatalos képviselet az Európai Unióban / Rappresentante autorizzato nella Comunità europea / Ágaliotasis atstovas Europos Bendrijoje / Autorisert representant i EU / Autoryzowane przedstawicielstwo w Unii Europejskiej / Representante autorizado na União Europeia / Autorizovaný zástupca v Európskom spoloèenstve / Representante autorizado en la Comunidad Europea / Auktoriserad representant i EU / Оторизиран представител в ЕU / Reprezentant autorizat în Uniunea Europeanã / Avrupa Topluluğu Yetkili Temsilcisi / Ovlašæeni predstavnik u Evropskoj zajednici In Vitro Diagnostic Medical Device / Lékaøské zaøízení urèené pro diagnostiku in vitro / In vitro diagnostisk medicinsk anordning / Medisch hulpmiddel voor in vitro diagnose / In vitro diagnostika meditsiiniaparatuur / Lääkinnällinen in vitro -diagnostiikkalaite / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Medizinisches In-vitro-Diagnostikum / In vitro äéáãíùóôéêþ éáôñéêþ óõóêåõþ / In vitro diagnosztikai orvosi eszköz / Dispositivo medico diagnostico in vitro. / In vitro diagnostikos prietaisas / In vitro diagnostisk medisinsk utstyr / Urz¹dzenie medyczne do diagnostyki in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / Medicínska pomôcka na diagnostiku in vitro / Dispositivo médico de diagnóstico in vitro / Medicinsk anordning för in vitro-diagnostik / Медицински уред за диагностика ин витро / Aparaturã medicalã de diagnosticare in vitro / In Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz / Medicinski ureðaj za in vitro dijagnostiku Temperature limitation / Teplotní omezení / Temperaturbegrænsning / Temperatuurlimiet / Temperatuuri piirang / Lämpötilarajoitus / Température limite / Zulässiger Temperaturenbereich / ¼ñéï èåñìïêñáóßáò / Hõmérsékleti határ / Temperatura limite / Laikymo temperatûra / Temperaturbegrensning / Ograniczenie temperatury / Limitação da temperatura / Ohranièenie teploty / Limitación de temperatura / Temperaturbegränsning / Температурни / Limitare de temperaturã / Sıcaklık sınırlaması / Ogranièenje temperature Batch Code (Lot) / Kód (èíslo) šarže / Batch kode (Lot) / Chargenummer (lot) / Partii kood / Eräkoodi (LOT) / Code de lot (Lot) / Chargencode (Chargenbezeichnung) / Êùäéêüò ðáñôßäáò (Ðáñôßäá) / Tétel száma (Lot) / Codice del lotto (partita) / Partijos numeris (Lot) / Batch-kode (Serie) / Kod partii (seria) / Código do lote (Lote) / Kód série (šarža) / Código de lote (Lote) / Satskod (parti) / Код (Партида) / Numãr lot (Lotul) / Parti Kodu (Lot) / Kod serije Contains sufficient for <n> tests / Dostateèné množství pro <n> testù / Indeholder tilstrækkeligt til <n> test / Voldoende voor <n> tests / Küllaldane <n> testide jaoks / Sisältöon riittävä <n> testejä varten / Contenu suffisant pour <n> tests / Ausreichend für <n> Tests / ÐåñéÝ åé åðáñêþ ðïóüôçôá <n> åîåôüóåéò / <n> teszthez elegendõ / Contenuto sufficiente per <n> test / Pakankamas kiekis atlikti <n> testø / Innholder tilstrekkelig for <n> tester / Zawiera iloœæ wystarczaj¹c¹ do <n> testów / Contémo suficiente para <n> testes / Obsah vystaèí na <n> testov / Contenido suficiente para <n> pruebas / Räckertill <n> antal tester / Съдържанието е достатъчно за <n> теста / Conþine suficient pentru <n> teste / <n> testleri için yeterli miktarda içerir / Sadržaj dovoljan za <n> testova 8

Consult Instructions for Use / Prostudujte pokyny k použití / Læs brugsanvisningen / Raadpleeg gebruiksaanwijzing / Lugeda kasutusjuhendit / Tarkista käyttöohjeista / Consulter la notice d emploi / Gebrauchsanweisung beachten / Óõìâïõëåõôåßôå ôéò ïäçãßåò ñþóçò / Olvassa el a használati utasítást / Consultare le istruzioni per l'uso / Skaitykite naudojimo instrukcijas / Se i bruksanvisningen / Zobacz instrukcja u ytkowania / Consulte as instruções de utilização / Pozri Pokyny na používanie / Consultar las instrucciones de uso / Se bruksanvisningen / Направете справка в инструкциите за употреба / Consultaþi instrucþiunile de utilizare / Kullanım Talimatları na başvurun / Pogledajte uputstvo za upotrebu Positive control / Pozitivní kontrola / Positiv kontrol / Positieve controle / Positiivne kontroll / Positiivinkontrolli / Contrôle positif / Positive Kontrolle / èåôéêüò Ýëåã ïò / Pozitív kontroll / Controllo positivo / Teigiama kontrolë / Positiv kontroll / Kontrola dodatnia / Controlo positivo / Pozitívna kontrola / Control positivo / Положителен контрол / Etalon pozitiv / Pozitif kontrol / Pozitivna kontrola 9

10

B m Becton, Dickinson and Company A BENEX Limited 7 Loveton Circle Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Sparks, Maryland 21152 USA Shannon, County Clare, Ireland 800-638-8663 Tel: 353-61-47-29-20 Fax: 353-61-47-25-46 SQ-EASY is a trademark of Porex Technologies. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo and ColorPAC are trademarks of Becton, Dickinson and Company. 2006 BD