1. Öğretmen Kılavuzu a. Konu b. Kullanıcı Kitlesi c. Deney Süresi d. Materyaller e. Güvenlik f. Genel Bilgi g. Deney Öncesi Hazırlık h. Ön Bilgi i. Deneyin Yapılışı (Prosedür) j. Deney Sonuçları k. Öğrenci Kılavuzundaki Soruların Cevapları l. Kaynaklar 2. Öğrenci Kılavuzu a. Genel Bilgi b. Deney Süresince Uyulması Gereken Kurallar c. Deneyin Yapılışı d. Sorular 1
Canlı hücrede en çok bulunan makromoleküller olan proteinler, 20 standart amino asidin farklı sayı ve konfigürasyonda bir araya gelmesinden meydana gelmektedir. Proteinler sahip oldukları 3 boyutlu yapıları sayesinde vücudun farklı bölgelerinde çeşitli görevlerde yer alabilirler. 1. deneyde amino asitlerin ninhidrin reaksiyonu ile 2. deneyde ise proteinlerin biüret tepkimesiyle tanımlanması gerçekleştirilecektir. Kit içeriği 10 öğrencinin her 2 deneyi de yapabileceği şekilde dizayn edilmiştir. a) Konu Öğrenciler; 1. deneyde amino asit tayini ve amino asitlerin yapılarındaki farklılıklar hakkında bilgi sahibi olacaktırlar. 2. deneyde karışık olarak verilen çözeltiler içerisinde biüret reaktifi kullanarak protein varlığını belirleyeceklerdir. b) Kullanıcı Kitlesi DNA izolasyon ve görüntüleme kiti, 9 yaş ve üstü çocukların kullanımına uygundur. c) Deney Süresi 1. Deney: 30 dakika 2. Deney: 30 dakika d) Materyaller 1.Deney Ninhidrin çözeltisi; 40 ml Amino asit çözeltileri Alanin; 30 ml Prolin; 30 ml Glisin; 30 ml Lösin; 30 ml Protein çözeltisi Albumin; 30ml 2.Deney Biüret reaktifi; 50 ml Protein çözeltileri Kazein; 30 ml Albümin ; 30 ml 2
Jelatin; 30 ml Amino asit çözeltisi Lösin; 30 ml Deneylerde Ortak Kullanılacak Malzemeler Cam tüp; 50 tane Pastör pipeti; 20 tane Eldiven; 20 tane Kit içerisinde bulunmayan kullanılacak aletler Bunsen beki 3 ayak Tahta maşa Isıya dayanıklı kap e) Güvenlik Laboratuvarda uyulması gereken genel kurallara dikkat edilmelidir. Deney süresince öğrenciler eldiven kullanmalıdır. Deney süresince kullanılan kimyasallar ile istenmeyen bir temas olması durumunda bulaşan bölge bol sabun ve su ile yıkanmalıdır. Kullanılan kimyasalların solunmamasına özen gösterilmeli, deneyin yapıldığı laboratuvar havalandırılmalıdır. Laboratuvar sorumlusu olmadan kit kullanılmamalıdır. f) Genel Bilgi 1. Amino Asitler Amino asitler proteinlerin temel yapısal alt üniteleridir. Protein yapısında bulunan 20 amino asitin hepsi ortak bir yapıya sahiptir (aynı karbona bağlı bir karboksil (-COOH) ve amino (NH2) grubu) (Şekil 1). R gruplarındaki farklılıklar, ortak yapısal iskeleti paylaşan amino asitlerin değişik yapıya, farklı elektrik yüküne ve suda değişik oranlarda çözünürlüğe sahip olmalarını sağlar. 3
Proteinlerin yapısında yer alan 20 temel (standart) amino asit, R gruplarının yapı ve özelliğine göre sınıflandırılmaktadır(şekil2). Şekil 2. Standart amino asit çeşitleri Amino asitlerin bazıları vücutta sentezlenebildiği halde bir kısmı da sentezlenemez. Vücudun sentezleyemediği ve besinlerle dışardan alınmaları zorunlu olan amino asitlere esansiyel amino asitler veya eksojen amino asitler denir. Vücutta sentezlenebilen ve dışarıdan besinlerle alınması zorunlu olmayanlara ise esansiyel olmayan amino asitler veya endojen amino asitler denir. 2. Proteinler Proteinler canlı hücrede en çok bulunan makromoleküllerdir. Hücrenin tüm kısımlarında ve çeşitli görevlerde binlerce farklı protein bulunabilir. Fonksiyonu ve biyolojik aktivitesi ne olursa olsun bütün proteinler 20 standart amino asitten meydana gelmiştir. protein yapısında Bu amino asitlerin farklı sayı ve dizilimde bulunması, bir protein zincirinin sayısız kombinasyonuna olanak tanımakta ve protein çeşitliliği sağlanmaktadır. 4
a) Proteinlerin Yapısı Her proteinin karakteristik üç boyutlu doğal bir yapısı vardır. Üç boyutlu yapısı bozulmuş (denatüre olmuş) bir protein biyolojik etkinliğini de kaybeder. Proteinlerin karakteristik üç boyutlu yapılarını oluşumundan primer, sekonder, tersiyer ve kuarterner olarak adlandırılan yapılar sorumludur. Primer Yapı Amino asitlerin birbirine kovalent bağlarla (peptid) bağlandığı düz zincir yapısıdır. 2 amino asitin peptit bağı ile bağlanması iledipeptit, 3 amino asitin birbiriyle bağlanmasıyla tripeptit, birkaç amino asitin bağlanmasıyla oligopepetit, çok sayıda amino asitin bu şekilde bağlanmasıyla da polipeptitler oluşur (Şekil 3). Şekil 3. Dipeptit yapısı ve peptit bağı Sekonder Yapı Bir proteinin sekonder yapısı, polipeptit zincirlerinin bükülmeler ve katlanmalarla oluşturdukları özgün yapısıdır. Bu bükülme ve katlanmalar, polipeptit zincirindeki amino asitlerin belirli bir düzende hidrojen bağlarıyla bir araya gelmesiyle oluşmaktadır. Zayıf hidrojen bağları bir polipeptit zincirinin içinde oluştuğu gibi komşu polipeptit zincirleri arasında da oluşabilir. Proteinlerin sekonder yapısına α helix ve β pilili yapılar örnek verilebilir. Üçüncül Yapı İkinci yapıyı oluşturan alfa ve beta konfigürasyonlar tersiyer yapıyı oluşturmak üzere üst üste katlanmalar geçirirler ve yumak şeklinde sarılmalarla elipsoid bir yapı oluştururlar. Bu durumun gerçekleşmesi aminoasitlerin yan zincirlerin reaksiyona girmesi ile mümkün olur. Bu etkileşimler zayıf hidrojen bağları, kovalent bağlar, tuz bağları, iyonik bağları, Van der Waals çekim ve itim gücü ile sağlanmaktadır (Şekil 4). Kuarterner Yapı Primer, sekonder ve tersiyer yapıya sahip polipeptit zincirlerinin daha büyük yapılı agregatlar halinde bir araya gelmesiyle oluşan yapıdır. Her proteinin kuarterner yapısı olmayabilir, fakat molekül ağırlığı 100.000 kda nun üzerinde olan bir protein genellikle kuarterner yapıya sahiptir. Bir proteinin 5
kuarterner yapısını oluşturan polipeptit zincirlerinin her birine alt birim veya monomer denir; bu monomerler, hidrojen bağları, Van der Waals etikleşimleri ve iyon bağları etkisiyle polimerize olmuşlardır (Şekil 4). Şekil 4. Proteinlerin 3 boyutlu yapısı Proteinlerin Sınıflandırılması Proteinler sahip oldukları 3 boyutları yapıları sayesinde vücudun farklı bölgelerinde çeşitli görevlerde yer alabilirler. Proteinler yapılarına, kimyasal komposizyonlarına ve işlevsel özelliklerine göre 3 gruba ayrılırlar (Şekil 5). Şekil 5. Proteinlerin sınıflandırılması 6
g) Deney Öncesi Hazırlık 1. Kit kitapçığı öğretmen ve öğrenci kılavuzu olmak üzere 2 kısımdan oluşmaktadır. Uygulama öncesi öğrenci kılavuz bölümü öğrencilere çoğaltılıp verilecektir 2. Deneyde kullanılan ayırma yöntemlerinde gerçekleşen reaksiyonların bilgisi sadece öğretmen kılavuzuna koyulmuştur. Öğrenci kılavuzunda deney sonunda reaksiyonlar ile ilgili sorular verilerek, öğrencilerin akıl yürütmesi ve araştırması hedeflenmiştir. 3. Kullanılan kimyasalların ortam koşullarından etkilenmesi sebebiyle deneyde kullanılacak su banyosu süresi minimum sıcaklık koşulları baz alınarak belirlenmiştir. h) Ön Bilgi 1. Deney: Amino asitlerinninhidrin yöntemi ile tanımlanması Amino asitlerin, amino ve karboksil gruplarının birlikte verdikleri bir reaksiyonla ninhidrin ile mor renkli kompleks oluşturmaları prensibine dayanır. Ninhidrin, güçlü bir organik oksidandır. Amino asitler, ninhidrin etkisiyle oksidatif deaminasyona ve dekarboksilasyona uğrarlar; amino asitten aldehit, amonyak ve karbondioksit oluşurken ninhidrin indirgenir. İlk sıralarda oluşan indirgenmiş ninhidrin de henüz indirgenmemiş ninhidrin ve amonyak ile reaksiyona girerek mor renkli bir kompleks oluşturur; tüpte gözlenen mor renk, oluşan bu mor renkli kompleksten ileri gelmektedir. 2. Deney : Proteinlerin biüret tepkimesi ile tanımlanması Proteinlerin, biüret reaktifi ile mor renkli kompleks oluşturmaları prensibine dayanır. Biüret reaktifindeki Cu +2 iyonları, alkalik ortamda, en az iki peptit bağı içeren maddelerle mor renkli kompleksler oluştururlar. Proteinlerin yapısında en az iki peptit bağı bulunduğundan proteinler, biüret reaktifindeki Cu +2 iyonları ile alkali ortamda, mor renkli kompleksler oluşturmaktadır. 7
i) Deneyin Yapılışı 1.Deney: Amino asitleri ninhidrin yöntemi ile tanımlama 5 adet cam tüp içerisine amino asit ve protein çözeltilerinden 2 şer ml pastör pipeti yardımıyla eklenir. Üzerlerine 0.5 ml ninhidrin çözeltisi pastör pipeti yardımıyla eklenir. Kaynar suda 30sn bekletilir (Ortam sıcaklığına göre renk değişimi çok daha kısa zamanda gerçekleşebilmektedir.). Deney sonucu elde edilen renk değişimleri tabloya kaydedilir. Renk değişimi olan ve olmayan tüplerde bulunan çözeltiler arasındaki farklar tartışılır. 2.Deney: Proteinleri biüret tepkimesi ile tanımlama 4 adet cam tüp içerisine amino asit ve protein çözeltilerinden 2 şer ml pastör pipeti yardımıyla eklenir. Üzerlerine 1 ml biüret çözeltisi pastör pipeti yardımıyla eklenir. Deney sonucu elde edilen renk değişimleri tabloya kaydedilir. Renk değişimi olan ve olmayan tüplerde bulunan çözeltiler arasındaki farklar tartışılır. j) Deney Sonuçları Renk Değişimleri Alanin Glisin Lösin Prolin Albumin Koyu mor Koyu mor Koyu mor Sarı Renksiz Renk Değişimleri Kazein Albumin Lösin Jelatin Mor Mor Renk değişimi yok Mor k) Öğrenci Kılavuzundaki Soruların Cevapları 1. Proteinlerin sınıflandırılması sahip oldukları R gruplarının yapı ve özelliğine göre yapılmaktadır. 2. Amino asitlerin bazıları vücutta sentezlenebildiği halde bazıları sentezlenemez. Vücudun sentezleyemediği ve besinlerle dışardan alınmaları zorunlu olan amino asitler esansiyel 8
amino asitler olarak isimlendirilken; vücutta sentezlenebilen ve dışarıdan besinlerle alınması zorunlu olmayanlara ise esansiyel olmayan amino asitler olarak isimlendirilmektedir. l) Kaynaklar Biochemistry ;Fifth Edition; Jeremy M.Berg, John L.Tymoczko, Lubert Stryer. Biyokimya II; Prof. Hikmet Geçkil; Şubat 2012. Harper s Illustrated Biochemistry; Twenty-sixth edition; Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell. Lehninger Principles of Biochemistry; Fifth edition; David L. Nelson, Michael M. Cox. 9
Ad-Soyad: Tarih: Öğrenci Kılavuzu Canlı hücrede en çok bulunan makromoleküller olan proteinler, 20 standart amino asitin farklı sayı ve konfigürasyonda bir araya gelmesinden meydana gelmektedir. Proteinler sahip oldukları 3 boyutları yapıları sayesinde vücudun farklı bölgelerinde çeşitli görevlerde yer alabilirler. İlk deneyde amino asitlerin ninhidrin reaksiyonu ile ikinci deneyde ise proteinlerin biüret tepkimesiyle tanımlaması gerçekleştirilecektir. Genel Bilgi 1. Amino Asitler Amino asitler proteinlerin temel yapısal alt üniteleridir. Protein yapısında bulunan 20 amino asitin hepsi ortak bir yapıya sahiptir (aynı karbona bağlı bir karboksil (-COOH) ve amino (NH2) grubu) (Şekil 1). R gruplarındaki farklılıklar, ortak yapısal iskeleti paylaşan amino asitlerin değişik yapıya, farklı elektrik yüküne ve suda değişik oranlarda çözünürlüğe sahip olmalarını sağlar. Proteinlerin yapısında yer alan 20 temel (standart) amino asit, R gruplarının yapı ve özelliğine göre sınıflandırılmaktadır(şekil2). Şekil 2. Standart amino asit çeşitleri 10
Öğrenci Kılavuzu Amino asitlerin bazıları vücutta sentezlenebildiği halde bazıları sentezlenemez. Vücudun sentezleyemediği ve besinlerle dışardan alınmaları zorunlu olan amino asitlere esansiyel amino asitler veya eksojen amino asitler denir. Vücutta sentezlenebilen ve dışarıdan besinlerle alınması zorunlu olmayanlara ise esansiyel olmayan amino asitler veya endojen amino asitler denir. 2. Proteinler Proteinler canlı hücrede en çok bulunan makromoleküllerdir. Hücrenin tüm kısımlarında ve çeşitli görevlerde binlerce farklı protein bulunabilir. Fonksiyonu ve biyolojik aktivitesi ne olursa olsun bütün proteinler 20 standart amino asitten meydana gelmiştir. protein yapısında Bu amino asitlerin farklı sayı ve dizilimde bulunması, bir protein zincirinin sayısız kombinasyonuna olanak tanımakta ve protein çeşitliliği sağlanmaktadır. a) Proteinlerin Yapısı Her proteinin karakteristik üç boyutlu doğal bir yapısı vardır. Üç boyutlu yapısı bozulmuş (denatüre olmuş) bir protein biyolojik etkinliğini de kaybeder. Proteinlerin karakteristik üç boyutlu yapılarını oluşumundan primer, sekonder, tersiyer ve kuarterner olarak adlandırılan yapılar sorumludur. Primer Yapı Amino asitlerin birbirine kovalent bağlarla (peptid) bağlandığı düz zincir yapısıdır. 2 amino asitin peptit bağı ile bağlanması iledipeptit, 3 amino asitin birbiriyle bağlanmasıyla tripeptit, birkaç amino asitin bağlanmasıyla oligopepetit, çok sayıda amino asitin bu şekilde bağlanmasıyla da polipeptitler oluşur (Şekil 3). Şekil 3. Dipeptit yapısı ve peptit bağı Sekonder Yapı Bir proteinin sekonder yapısı, polipeptit zincirlerinin bükülmeler ve katlanmalarla oluşturdukları özgün yapısıdır. Bu bükülme ve katlanmalar, polipeptit zincirindeki amino asitlerin belirli bir düzende hidrojen bağlarıyla bir araya gelmesiyle oluşmaktadır. Zayıf hidrojen bağları bir polipeptit zincirinin içinde oluştuğu gibi komşu polipeptit zincirleri arasında da oluşabilir. Proteinlerin sekonder yapısına α helix ve β pilili yapılar örnek verilebilir. 11
Üçüncül Yapı İkinci yapıyı oluşturan alfa ve beta konfigürasyonlar tersiyer yapıyı oluşturmak üzere üst üste katlanmalar geçirirler ve yumak şeklinde sarılmalarla elipsoid bir yapı oluştururlar. Bu durumun gerçekleşmesi aminoasitlerin yan zincirlerin reaksiyona girmesi ile mümkün olur. Bu etkileşimler zayıf hidrojen bağları, kovalent bağlar, tuz bağları, iyonik bağları, Van der Waals çekim ve itim gücü ile sağlanmaktadır (Şekil 4). Kuarterner Yapı Primer, sekonder ve tersiyer yapıya sahip polipeptit zincirlerinin daha büyük yapılı agregatlar halinde bir araya gelmesiyle oluşan yapıdır. Her proteinin kuarterner yapısı olmayabilir, fakat molekül ağırlığı 100.000 kda nun üzerinde olan bir protein genellikle kuarterner yapıya sahiptir. Bir proteinin kuarterner yapısını oluşturan polipeptit zincirlerinin her birine alt birim veya monomer denir; bu monomerler, hidrojen bağları, Van der Waals etikleşimleri olmuşlardır (Şekil 4). ve iyon bağları etkisiyle polimerize Şekil 4. Proteinlerin 3 boyutlu yapısı 12
Öğrenci Kılavuzu b) Proteinlerin Sınıflandırılması Proteinler sahip oldukları 3 boyutları yapıları sayesinde vücudun farklı bölgelerinde çeşitli görevlerde yer alabilirler. Proteinler yapılarına, kimyasal komposizyonlarına ve işlevsel özelliklerine göre 3 gruba ayrılırlar (Şekil 5). Şekil 5. Proteinlerin sınıflandırılması a) Deney Süresince Uyulması Gereken Kurallar Laboratuvar dersinde uyulması gereken genel kurallar dışında kit içerisinde bulunan kimyasal malzemeler eldivensiz kullanılmamalıdır. Deney süresince kullanılan kimyasallar ile istenmeyen bir müdahale olması durumunda bulaşan bölge bol sabun ve su ile yıkanmalıdır. Kullanılan kimyasalların solunmamasına özen gösterilmeli, deneyin yapıldığı laboratuvar havalandırılmalıdır. Deney sırasında kullanılacak olan kaynar su laboratuvar sorumlusu gözetiminde kullanılmalıdır. Deneyler tamamlandıktan sonra verilen tablolara sonuçları yazılmalı ve üzerinde tartışılmalıdır. Deney sonunda verilen sorular işlenen konuyu ve yapılan deneyi pekiştirici niteliktedir. Deney tamamlandıktan sonra soruların çözülmesi ve cevaplarının tartışılması önerilmektedir. Laboratuvar sorumlusu olmadan kit kullanılmamalıdır. 13
b) Deneyin Yapılışı 1.Deney: Amino asitleri ninhidrin yöntemi ile tanımlama 5 adet cam tüp içerisine amino asit ve protein çözeltilerinden 2 şer ml pastör pipeti yardımıyla eklenir. Üzerlerine 0.5 ml ninhidrin çözeltisi pastör pipeti yardımıyla eklenir. Tüpler kaynar suda ~ 30sn bekletilir (Ortam sıcaklığına göre renk değişimi çok daha kısa zamanda gerçekleşebilmektedir.). Deney sonucu elde edilen renk değişimleri tabloya kaydedilir. Renk değişimi olan ve olmayan tüplerde bulunan çözeltiler arasındaki farklar tartışılır. Renk Değişimleri Alanin Glisin Lösin Prolin Albumin 2.Deney: Proteinleri biüret tepkimesi ile tanımlama 4 adet cam tüp içerisine amino asit ve protein çözeltilerinden 2 şer ml pastör pipeti yardımıyla eklenir. Üzerlerine 1 ml ninhidrin çözeltisi pastör pipeti yardımıyla eklenir. Deney sonucu elde edilen renk değişimleri tabloya kaydedilir. Renk değişimi olan ve olmayan tüplerde bulunan çözeltiler arasındaki farklar tartışılır. Renk Değişimleri Kazein Albumin Lösin Jelatin d) Sorular 1. Proteinlerin sınıflandırılmasında hangi özellikleri kullanılır? 2. Amino asitlerin tamamı vücutta mı sentezlenmektedir? Açıklayınız. 14