helena www.helena-biosciences.com BioSciences Europe Kullanım Talimatları SAS-1 LIPOPROTEIN Katalog No: 201100
KULLANIM AMACI SAS-1 Lipoprotein Kit agaroz jel elektroforez ile plazma veya serumda lipoproteinin miktarını belirlemek ve ayırmak için tasarlanmıştır. Fredrickson ve Lees tarafından 1965 1 yılında fenotip hiperlipoproteinemi için bir sistem önerildiği için, lipoprotein elektroforez olarak kullanılan koroner arter hastalığı tespit ve önlem kavramı oldukça yaygın bir test olmuştur. Epidemiyolojik çalışmalar, yağların diyet alımında özellikle kolesterol ve aterosklerozun görünme oranı ile lipitlerin kan düzeyleri ve kalp-damar hastalığı ve krizi gibi büyük belirtiler ile ilgilidir. lskemik kalp hastalığı da hiperkolesterolemi ile ilişkiliymiş 2,3. Hiperlipoproteinemi tanımada sonuçlanan lipoprotein fenotiplerin doğru belirlenmesi için ihtiyaç klinik özellikleri, prognozu ve tedaviye yanıt olarak birbirine benzemeyen bozuklukların bir grup semptomasidir. Farklı fenotipler ile değişen bozuklukların tedavisi için kesinlikle tedaviye başlamadan önce doğru fenotip kurulması gereklidir. Fredrickson ve Lees tarafından önerilen sınıflandırma sistemi, sadece tip II, III ve IV ateroskleroz için kanıtlanmış bir ilişkiye sahiptir. Plazma lipitleri serbestçe plazmada dolaşamazlar, ancak proteine bağlı taşınabilir ve böylece lipoproteinler olarak sınıflandırılabilirler. Çeşitli fraksiyonlar protein, kolesterol, gliseritler, kolesterol esterleri, fosfatides ve serbest yağ asitlerinin farklı kombinasyonlarda yapılır 5. Çeşitli teknikler, ültrasantrifüj, ince tabaka kromatografisi, immünolojik teknikler ve elektroforez dahil plazma lipoproteinlerini ayırmak için kullanılmıştır. Elektroforez ve ültrasantrifüj en çok kullanılan yöntemlerin ikisidir ve her biri kendi terminolojisine sebep olmaktadır. Tablo 1 deki sınıflandırmalar relativ lipit ve her fraksiyonun protein bileşimi korelasyonunu gösterir. Aşağıdakilere göre sınıflandırma: Kompozisyon - % her fraksiyonda Elektroforetik Ultra-santrifüj Protein Gliserit Kolesterol Fosfolipid Mobilite Kilomikronlar Beta pre-beta Alfa LDL* VLDL* HDL* 2% 21% 10% 50% 98% 12% 55% 6% 45% 13% 18% 22% 22% 26% Yukarıdaki sınıflandırma için çeşitli istisnalar vardır. Bunlardan biri LDL(beta yerdeğiştirme) fraksiyonuna ait ultrasentrifuj içinde çökme olan ön-beta yer değiştirme malzemesi olan "ön-beta çökme" dir 6. Bu Lp(a) lipoprotein Dahien tarafından rapor edildi 7. Nüfusun % 10 da normal bir variant olarak kabul edildi. Diğer istisna VLDL ile ultrasentrifujde yüzen beta yer değiştirme malzemesi olan yüzen beta dır. Bu anormal lipoprotein Tip III hiperlipoproteinaemialar da görünür.
Destek ortamının çeşitli türleri lipoproteinlerin elektroforetik ayrılması için kullanılmıştır. Fredrickson başlangıçta sınıflandırma sistemi geliştirdiğinde, kağıt elektroforezi kullanıldı 1,8. Son zamanlarda agaroz-jelde, nişasta blok ve poliakrilamid jel kullanılmıştır 5,7. SAS-1 Lipoprotein Kiti, agaroz jel yüküne göre serum/plazma lipoproteinlerini ayırır. Lipoprotein, sonra görüntülenmek için boyandı ve sabitlendi. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostik kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına başvurun. BİLEŞENLER 1. SAS-1 Lipoprotein Jel Koruyucu olarak sodyum azid ve thimersal ile bir Tris/Barbital buffer agaroz içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. SAS-1 Lipoprotein Boya Yağlı Kırmızı 7B boya içerir. 1lite methanol ile şişenin içeriğini çözün, 24 saat kadar karıştırın ve kullanımdan önce filtre edin. Çalışma boyasının hazırlanması: Kullanım öncesi hemen stok boyaya 5 ml saf su ekleyin. Karışıyorken damla damla su ekleyin. 3. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım talimatları da içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. SAS-1 Lipoprotein Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulması : 1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3) bakteriyal ya da fungal kaynaklı agarozun kontaminasyonunu belirtir. 2 - SAS-1 Lipoprotein Boya Toz boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Çözünmüş boya 15-30 derecede 6 ay stabildir. İyi kapatılmış bir şişede saklanır. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katalog No. 210200 Numune Aplikatör Ucu (1 x 10) Katalog No. 210300 Numune Aplikatör Ucu (5 x 10) Katalog No. 210100 Tek kullanımlık numune kapları (100)
Katalog No. 3100 REP Prep 60-70 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını Boya arındırıcı solüsyon: Kullanımdan önce hemen 25 ml saf su ve 75 ml metanolle karıştırın. Metanol Saf su NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune EDTA antikoagulate plazma ve ya taze serumdur. Numuneler 2-6 C de 5 güne kadar buzdolabında saklanmalıdır. DONDURMAYINIZ. Hastanın Hazırlanması: Lipoprotein paternlerin en doğru fenotipi için, aşağıdaki önlemleri numune hazırlama öncesi dikkat edilmelidir: 1) Hasta yemek-indüklenen silomikronlardan gelen girişi önlemek için örnekleme öncesi 12-14 saatlik bir süre boyunca hızlı olmalıdır. 2) Mümkünse 3-4 hafta tüm ilaçlar durdurun. 3) Hasta uygun kilosunu korumalı ve en az 1 hafta normal bir diyet yapmalıdır. 4) Miyokardial infarktüs veya benzeri travmatik episoden sonra 4-8 hafta bekleyin. Müdahale eden faktörler: 1) Heparin tedavisi özellikle beta lipoproteine ve lipoproteinlerin göçünde değişikliğe yol açabilir. 2) Numuneler benzer nedenlerle heparin antikoagülan içine toplanmamalıdır. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Numune tepsisine veya tek kullanımlık numune kaplarının uygun kuyusuna numunenin 35 μl pipetleyin. i) SAS-1 & SAS- I Plus kullanıcıları: SAS-1 numune tepsisi kullanın. Aplikatör çekmecesinde numune tepsisi dikkatlice yerleştirilir. Tepisinin pozisyona kuvvetlice itildiğinden emin olun. ii) SAS-3 kullanıcıları: SPIFE / SAS-3 numune tepsisi kullanın. Kullanılan numune dikkatlice numune tepsisine yerleştirin. Tepsinin güvenli bir şekilde yerleştirilmiş olduğundan emin olun. 2. Jeli paketinden çıkarın ve: i)sas-1 kullanıcıları: SAS-1 e jeli yerleştirin, agarozu toplayın, uygun elektrot uçları ile negatif ve pozitif uçları ayarlayın. ii) SAS-1 Plus kullanıcıları: Soğutucu üzerine 400 μl REP Prep boşaltın. Soğutucu üzerine jeli, Agaroz düzgün ve hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirin, uygun elektrot çubukları pozitif ve negatif kısımlara yerleştirin. iii)sas-3 kullanıcıları: Havuza ayarlama kılavuzunu yerleştirin ve 400μL REP prep odanın merkezine boşaltın. Jeli agarozun toplandığı kuyuya yerleştirin, kılavuzu kullanın, uygun elektrot uçları ile negatif ve pozitif uçları ayarlayın, jelin altında hava kabarcığından kalmamasına dikkat edin. 3. Elektroforez öncesi soğutucu üzerinde 10 dakika boyunca kuruması için jeli bırakın. Jel yüzeyini kurutmayın.
4.i)SAS-1 kullanıcıları: Jel blokları ile elektrotların temasa girmesi için elektrot kollarının üst tarafına elektrotları ekleyin. ii)sas-1 Plus kullanıcıları:(yukarıdaki gibi) Jelin ve elektrotların üzerine kapak yerleştirin ve teması sağlamak için 5 sn kuvvetlice bastırın. iii)sas-3 kullanıcıları: Jel blokları ile elektrotların temasa girmesi için elektrot kollarının üst tarafına elektrotları ekleyin. 5.Cihaz üzerindeki üst pozisyonda 1 aplikatör ucu bir araya getirilerek yerleştirilir (SAS-3 kullanıcıları: kısım 8) 6. Lipoprotein elektroforez yapılır: i)sas-1 kullanıcıları: 80 volt, 22 dk, 2 aplikasyon ii)sas-1 Plus kullanıcıları: Elektroforezler: 80 volt, 30 dk, 23 C, 2 aplikasyon iii)sas-3 kullanıcıları: Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık( C) Voltaj Diğer Elektroforez Numune Yükleme 00:30 21 Hız 1 Numune Uygulama 00:30 21 Hız 1* 2 uygulama toplamı için numune yükleme, numune uygulama adımlarını tekrarlayın. Elektroforez 20:00 20 100 Kurutma 15:00 54 * Yerleştirme 2 kullanılır NOT: Kurumadan önce jel blokları çıkarın. 7. Elektroforezin ardından: i)sas-1 Plus kullanıcıları: kapağı çıkarın ii) SAS-1 ve SAS-1 Plus kullanıcıları: Jel Blok Çıkarıcı kullanarak her jel blokları çıkarın. 8. SAS-1 ve SAS-1 Plus kullanıcıları: 60...70 C de jeli kurutun. 9. Boyama küveti içine jeli yerleştirin ve jel içine 30ml taze hazırlanmış çalışma boyasını boşaltın. 2 dakika boyunca boyayın. 10. 2 x 15-30 saniye boya arındırıcı solüsyonda yıkayarak jeli boyadan arındırın. 11. Kısa sürede jeli saf su ile yıkayın ve kurutun. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Jellerin değerlendirmesi her bir laboratuarda bu yöntem için üretilen normal değerlere karşı yapılmalıdır. 1.Kalitatif Değerlendirme: Belli ilgili bantların varlığı veya yokluğu için jeller görünüşte incelenecektir.
2.Kantitatif Değerlendirme: 525nm de jel yüzü aşağıda olarak jelleri tarayın. Alfa-lipoprotein (HDL) fraksiyon hareketi hızlıdır ve uzakta olan anoda doğru göç eder. Beta-lipoprotein (LDL) bandı genellikle uygulama noktasına en yakın göç eden en belirgin fraksiyonudur. Pre-beta lipoprotein (VLDL) alfa ve beta lipoproteinler arasında göç eder. Elde edilen kararlılık derecesi ile pre-beta lipoprotein değişkenlerinin miktarı, pre-beta türleri ve beta-lipoproteinin miktarı bellidir. Pre-beta bazen beta-lipoproteinlerin önünde sadece bir leke olarak ve diğer zamanlarda 2 ayrı fraksiyona ayrılmış veya tamamen eksik görünebilir. Pre-beta fraksiyonun bütünlüğü numune yaşı ile azalır. Silomikronlar varsa uygulama noktasında kalırlar. Her lipid fraksiyonunun miktarının hesaplaması mg/dl veya mmol/l olarak önerilmez (SINIRLAMALARA bakın). Normal bir aç insandan alınan serum ihmal edilebilir kilomikronlar ve normal kolesterol ve trigliserit düzeyleri ile net bir serum olarak tanımlanabilir. Elektroforez üzerinde, betalipoprotein zayıf yada yokmuş gibi ön-beta lipoproteinin büyük fraksiyonu olarak görünür ve alfa-lipoprotein bandı bellidir fakat beta dan daha az yoğundur. Bir hastanın hiperlipoproteinemisini yapmak için bir yüksek kolesterolu ve trigliseriti olmalıdır. Yükseklik, hipotiroidizm, tıkanma sarılığı, nefrotik sendromu, dysproteinaemias veya kötü kontrollü insulinopaenic diyabet gibi metabolik bozukluklar için birincil veya ikincil olarak belirlenmelidir. Birincil lipidaemia, beslenme, alkol ve uyuşturucu, özellikle de östrojen ya da steroid hormones gibi genetik olarak tespit edilmiş faktörlerden veya bilinmeyen mekanizmanın çevresel faktörlerinden kaynaklanmaktadır 12. Ayrıca, birincil olarak nitelendirilen bu lipoproteinaemia Ketozis-dayanıklı diyabet, pankreatit ve obezite ile ilişkilidir. Hiperlipoproteinemi mi yoksa hastalık etken faktör mü olduğunu anlamak genellikle zor olduğu için diabetes mellitus ve pankreatit kafa karıştırıcı olabilir. Kriterleri açıklamaları ile Lipoprotein fenotipin tam bir makalesi için, Fredrickson, D.S. ve Lees, R,S1 8 bakınız. Alfa lipoproteinlerde belirgin artışı obstrüktif karaciğer hastalığı ve sirozda görülür. Belirgin düşüşler parankimal karaciğer hastalığında görülür. Tangier in hastalığı normal alfa lipoproteinlerin toplam yokluğu ile nadir bir genetik bozukluğu karakterize edilir. Heterozigotlar alfa lipoproteinlerin düşüş düzeylerini gösterirler 8. Hİperoestrogenaemia (gebelik ve oral kontraseptif kullanımı) alfa lipoproteinlerde orta yüksekliğe neden olabileceği unutulmamalıdır 12. Abetalipoproteinaemia yoğunluğu 1,063 den daha az yoğun tüm lipoproteinlerin ciddi bir eksikliği tarafından birincil kalıtsal kusur özelliğidir (tüm ancak alfa lipoproteinler). Çok sayıda klinik belirtiler ve yaşam beklentisi ile birlikte sınırlıdır. Ailesel hypobetalipoproteinaemia birkaç vakası rapor edilmiştir. Mutasyonun abetalipoproteinaemia üretiminden farklı bazı kanıtları vardır 8. Lipoprotein-X obstrüktif karaciğer hastalığı olan hastalarda çoğunlukla anormal bir lipoprotein görülür. Ester olmayan(serbest) kolesterol, fosfolipitler, ve VLDL proteinleri
oluşturur. LDL den daha yavaş yer değiştirir. Özel yağ içeriği nedeniyle, normal yağ boyası ile ya hiç boyanmaz veya kötü boyanır ve bu nedenle genellikle standart lipoprotein elektroforezi ile tespit edilemez. Lipoprotein-X spesifik-kolesterol enzimatik boyama yöntemleri kullanıldığında açıkça görünür. KALİTE KONTROL Lipotrol Kontrolü (Cat. No 5069) prosedürün tüm aşamalarında kontrol etmek için kullanılabilir ve her plaka çalışmasında kullanılmalıdır. Kabul edilen test değerlerinin kontrolü ile sağlanan ek pakete bakın. SINIRLAMALAR Sudan yağ boyaları yanı sıra Yağlı Kırmızı 7B trigliserit ve kolesterol esterleri için serbest kolesterol ve fosfolipitlerden çok daha büyük bir yakınlığa sahiptir. Bu boya ile boyanma sonrası görünen bantlar toplam plazma lipitlerinin gerçek bir kantitasyonunu yansıtmamaktadır 10. Her lipoprotein fraksiyonunun lipid kompozisyonu kararsız olduğu için bir patern sınıflandırmasına başlamadan önce total kolesterol ve trigliserit düzeylerini belirlemek için esastır 8,9. Tip III hiperlipoproteinemi teşhis veya reddedildiğinde, ultrasentrifuj 4 yada SAYFA elektroforez 11 gibi lipoproteinlerin daha kesin kantitasyonu esastır. REFERANS DEĞERLERİ Jellerin herhangi bir değerlendirmesinin, her bir laboratuarda test için üretilen normal değerlere karşı yapılması önerilir. Normal bir aralık çalışma görünüşte sağlıklı 12 erkek ve kadın gönüllülerden alınan numuneler kullanılarak yapıldı: Fraksiyon Aralık Alfa Lipoproteins 13.4-44.2% Pre-Beta Lipoproteins 6.9-42.5% Beta Lipoproteins 30.3-62.7% PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Çalışma içinde duyarlılık: Tek bir jel üzerinde 6 kez aynı numune tekrarlanır. Fraksiyon Ortalama(%) CV (%) Alfa Lipoprotein 23.1 6.3 Beta Lipoprotein 47.8 4.1
Çalışma arası duyarlılık: 3 farklı jel üzerine tek bir numune işlemi Fraksiyon Ortalama(%) CV (%) Alfa Lipoprotein 23.7 9.3 Beta Lipoprotein 48.4 10.9 BİBLİYOGRAFİ 1. Fredrickson, D.S and Lees, R.S. A System For Phenotyping Hyperlipoproteinemias, Circulation, 1965; 31(3) : 321-327. 2. Henry, R.J. Ed., Clinical Diagnosis and Management of Laboratory Methods, 17th Ed., W.B. Saunders & Co., New York, 194-201, 1984. 3. Lewis, L.A. and Oppet, J.J. Ed., CRC Handbook of Electrophoresis Vol II Lipoproteins in Disease, CRC Press Inc., Florida, 63-239, 1980. 4. Levy, R.I. and Fredrickson, D.S. Diagnosis and Management of Hyperlipoproteinemia, Am. J. Cardiol., 1968; 22(4) : 576-583. 5. Houstmuller, A.J., Agarose-gel Electrophoresis of Lipoproteins: A Clinical Screening Test, Koninklijke Van Gorcum and Comp., The Netherlands, p5, 1969. 6. Stonde, N.J. and Levy, R.I. The Hyperlipidemias and Coronary Artery Disease, Disease-AMonth, 1972. 7. Dahlen, G. The Pre-Beta Lipoprotein Phenomenon in Relation to Serum Cholesterol and Triglyceride Levels: The Lp(a) Lipoprotein and Coronary Heart Disease, Umea University Medical Dissertations, Sweden, No. 20, 1974. 8. Fredrickson, D.S., Levy, R.I. and Lees, R.S., Fat Transport in Lipoproteins - An Integrated Approach To Mechanisms and Disorders N. Eng. J. Med., 1967; 276 : 34-42, 94-103, 148-156, 215-226, 273-281. 9. Fredrickson, D.S. When To Worry About Hyperlipidemia, Consultant, December 1974.