Değişik Ekstrak Ortamlarında Zeytin ve İncir yapraklarının Antioksidan Kapasiteleri 1. Cansu ARSLAN a *, 2. Güler GÜÇÜK a, 3. Evren ALTIOK a 4. Rukiye ÇİFTÇİOĞLU a a İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü Mühendislik Fakültesi Kimya Mühendisliği Bölümü,İzmir, 3543 e-posta: cansuarslan@std.iyte.edu.tr ÖZET Bu çalışmada aşılı ve yabani zeytin yaprakları ile incir yapraklarının farklı ekstraksiyon ortamlarındaki aktioksidan kapasiteleri incelendi. Kurutulup öğütülen belirli miktarda zeytin ve incir yapraklarını %7 etil alkol %3 su karışımında, sıcak su (çay olarak) ve simüle mide sıvısında (SMS) ekstrakte edilerek antioksidan kapasiteleri ABTS yöntemi kullanılarak belirlendi. Etil alkol ekstraksiyonunda çözgen uzaklaştırıldıktan sonra zeytin yapraklarının antioksidan değerleri (TEAK değeri 2.81 mg troloks/mg örnek) birbirine yakın olup incir nınkinden yaklaşık 3.5 kat fazladır. Sıcak su kullanılarak yapılan deney sonuçlarına göre antioksidan kapasiteleri 3.8-5.8 mg troloks/mg örnek arasındadır. İncir nın SMS ekstraktı antioksidan kapasitesi alkol ekstraktına göre yaklaşık 3 kat fazla olduğu görüldü. Zeytin yaprakları değerlerinde ise önemli bir değişiklik belirlenmedi. 5 ay sonra tekrar yapılan yabani zeytin etil alkol çözeltisi ekstraksiyonun antioksidan kapasitesinde önemli bir değişiklik olmamıştır. %7 etil alkol %3 su karışımı ekstraksiyonundan sonra etil alkol uzaklaştırılmadan yapılan analizlerde antioksidan kapasiteleri 6.13-1.85 mg troloks/mg örnek arasındadır. Ayrıca tane büyüklüğünün antioksidan kapasitesi üzerindeki etkisi incelenmiştir. Anahtar Kelimeler: Zeytin, incir, antioksidan, ekstraksiyon GİRİŞ Zeytin ağacının yüzyıllarca yaşayabilme özelliği ve geçmişte insanlar tarafından zeytinin nın kendisi veya çay olarak enfeksiyonların ve daha birçok hastalıkların tedavisinde kullanılması araştırmacıların dikkatini çekmiştir. Zeytin yaprakları virüse, mantara ve enflamasyona karşı etkili olduğu birçok çalışmalarda gözlenmiştir. Zeytin ağaçları üzerinde yapılan son çalışmalar özellikle yapraklarının polifeneolik bileşiklerce zengin olduğunu göstermiştir. Zeytin ndaki en önemli bileşikler oleuropein ve hidroksiterosoldür. Bu bileşikler doğal bitkisel antibiyotik ve antioksidan olması nedeniyle hastalıklardan korunma ve hastalıkların tedavisinde etkin rol oynayabilir [1]. Zeytin biyoaktif bileşiklerinin gösterdiği yüksek antioksidan kapasitesi sonucu vücutta oluşan serbest radikalleri nötralize ederek vücudun yenilenmesinde ve yaşlanmayı geciktirmede önemli bir rol oynadığı saptanmıştır. Ayrıca gıda tüketiminde tüketicilerin gün geçtikçe bilinçlenerek doğal olana yönelmeleri, bitkisel antioksidanların sentetik koruyucuların yerine gıdaların raf ömrünün uzatılması amaçlı kullanımını yaygınlaştırmaktadır. İncir nın antioksidan kapasitesi ve fenolik bileşikleri hakkında ise detaylı çalışmalar yapılmamıştır. Ancak geçmişte incir cilt hastalıklarında yüksek kan şekeri tedavisinde kullanılmıştır. Bu çalışmada aşılı, yabani zeytin yaprakları ve incir yapraklarının özütlerinin kapsüllenerek kullanımı, direkt kullanımı ve demleme çay olarak kullanımı ile antioksidan kapasiteleri üzerine etkileri belirlenerek polifenollerin en etkili tüketim biçimi ortaya konulmaya çalışılmıştır. DENEYSEL ÇALIŞMALAR İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü Kampüsü nden Ekim ayında toplanan aşılı, yabani zeytin yaprakları ve incir yaprakları yıkandıktan sonra 37 C ye ayarlanan etüvde (Memmert) kurutuldu ve öğütüldü. Parçacık boyutunun özütlemede etkisini gözlemlemek amacıyla aşılı zeytin yaprakları iri parçalar halinde de öğütüldü. 2 gram öğütülmüş zeytin ve incir 4 ml %7 etanol
çözeltisine eklendikten sonra 25 C ye ayarlanan Barnstead Lab Line çalkalamalı inkübatörde 15 devir/dakika 24 saat karıştırıldı. Hettich Rotina 38R santrifüjle santrifüj edildi ve Heidolph Laboroto 41 dönerli kurutucuda 4 C de çözgen uzaklaştırıldıktan sonra ham özütler buzdolabında analiz edilene kadar 4 C de saklandı. Ekstrasyon metodlarının antioksidan kapasite üzerine etkisini belirlemek amacıyla sıcak suda da özütleme yapıldı. Bu amaçla 1.5 g öğütülmüş aşılı, yabani zeytin, incir ve iri öğütülen aşılı zeytin ayrı ayrı 15 ml kaynar suda 3 dakika bekletildikten sonra santrifüj edildi. Yaprakların özütlenmeden direk tüketimi halinde göstereceği antioksidan etki simüle mide sıvısında yaprakların tutulması ile incelemiştir. Bunun için.5 gram NaCl 5 ml suda cözülerek, bu çözeltiye 7 ml HCl eklendi ve suyla 1 ml ye tamamlanarak ph ı 1.5 olan simüle mide sıvısı hazırlandı. 1 gram öğütülmüş zeytin ve incir ayrı ayrı 5 ml mide sıvısına eklendi ve 37 C ye ayarlanan çalkalamalı inkübatörde 15 devir/dakika da yarım saat karıştırıldı. İnkübatörden alındıktan sonra santrifüj edildi. Yaprakların antioksidan kapasitelerinde zamanla değişiklik olup olmadığına bakmak için Mart ayında yapraklar tekrar öğütüldü ve %7 etanol çözeltisi ile aynı işlemler yapıldı. Ayrıca dönerli kurutucuda alkolü uzaklaştırmadan da örneklerin antioksidan kapsiteleri inclendi. Bütün ekstreler ABTS radikalini 2 ile 8 % inhibe edecek şekilde çeşitli oranlarda seyreltilerek antioksidan kapasitesi troloks eşdeğeri antioksidan kapasitesi (TEAK) metodu ile belirlendi [2]. Örneklerin TEAK değerleri bir E-vitamini türevi olan troloks ile hazırlanan standart eğri ile kıyaslanarak hesaplandı. Metodda, absorbansı.7 ( ±.3) e ayarlanmış olan reaktif ABTS radikal çözeltisine örnek eklendi. Radikalin inhibisyonu sonucu absorbansda neden olduğu azalmanın UV-görünür spektrofotometre ile (Thermo Corporation Multiskan Spectrum) 734nm. dalgaboyunda kinetik olarak ölçülmesi ile örneklerin antioksidan kapasiteleri belirlendi. Hesaplamalarda kullanılmak üzere % inhibisyon hesaplandı. % İnhibisyon = (( A i - A f )/ A i )*1 (1) A i = Ekstre koymadan önce radikalin absorbansı. A f = Ekstre koyduktan 15 saniye sonra radikalin absorbansı. Sonuçlar ve Tartışma Antioksidan kapasitesi tayini için önce UV- görünür spektrofotometre ile ABTS radikal çözeltisine ekstreler eklenerek absorbansın zamanla azalımı ölçüldü. Bütün ekstreler radikale eklendiğinde Absorbansı.7-.2 aralığnda olacak şekilde belirli oranlarda seyreltildi. Şekil 1 de farklı hacimlerde aşılı zeytin alkol ekstrelerinin radikal çözeltisine eklenmesiyle 15 saniyede absorbansındaki azalma görülmektedir. Absorbansdaki azalmanın tamamı neredeyse ilk 3 saniye içinde gerçekleşmektedir. 3 saniyeden sonra absorbansta önemli bir değişiklik olmaması radikallerin polifenolik antioksidanlarla çok hızlı reaksiyona girip kararlı hale gelmeleri ile açıklanabilir. Diğer ekstreler için de benzer durum elde edilmiştir (Her örnek için absorbans-zaman grafikleri verilmemiştir). Aşılı zeytin alkol ekstrelerinin % inhibisyon grafiği Şekil 2 de verilmektedir. Analizlerde yüksek regresyon değeri ( >.98) elde edilmeye çalışılmıştır.
Absorbans.8.7.6.5.4.3.2.1 3 6 9 12 15 18 zaman (sn.) 2 ul 3uL 4 ul % inhibisyon 9 8 7 6 5 4 3 2 1 y = 1.8531x R 2 =.9898. 1. 2. 3. 4. 5. örnek miktarı (μl) Şekil 1. Aşılı zeytin etanol ekstraksiyonundaki absorbans-zaman grafiği Şekil 2. Aşılı zeytin etanol ekstraksiyonundaki % inhibisyonu TEAK antioksidan kapasitesi aşağıda verilen eşitlik ile hesaplanmıştır. TEAK (mg troloks/mg örnek) = [m örnek *DF] / [.12182* C örnek (mg/ml)] ( 2) Eşitlik 2 de; m örnek = % inhibisyon-örnek miktarı grafiğinin eğimini, DF = seyreltme katsayısını, C örnek (mg/ml) = katı madde miktarı / solvent miktarı oranını,.12182 standart olarak kullanılan troloksun % inhibisyon-troloks miktarı grafiğinin eğiminden elde edilen sabit çarpanı belirtmektedir. Bütün ekstreler için % inhibisyon grafiği çizildikten sonra TEAK değerleri hesaplandı. Aşılı ve yabani zeytin yaprakları ile incir yapraklarının etanol ekstraksiyonundaki antioksidan kapasiteleri kıyaslandığında zeytin yapraklarının TEAK değerlerinin birbirine yakın olduğu, incir nın TEAK değerinin bunlardan yaklaşık olarak 3.5 kat düşük olduğu tespit edildi. Şekil 3 de zeytin ve incir yapraklarının etanol ekstraksiyonundaki antioksidan kapasiteleri verilmektedir. Ekim ayında toplanan yabani zeytin Mart ayında (5 ay sonra) tekrar öğütülerek etanol ekstraksiyonundaki TEAK değerine bakıldı. TEAK değeri 2.62 olan Mart ayı değeri Ekim ayı değerine (2.77 mg troloks/mg yabani zeytin) yakın olması, geçen 5 ay içinde antioksidan değerinde fazla kayıp olmadığını göstermektedir. TEAK DEĞERİ (mg troloks/ mg örnek) 3 2.5 2 1.5 1.5 aşılı zeytin yabani zeytin incir etanol ekstresi Şekil 3. Zeytin ve incir yapraklarının etanol ekstraksiyonundaki antioksidan kapasiteleri. Sıcak suda hazırlanan (çay amaçlı) ekstrelerin TEAK değerleri etanol ve SMS ekstraksiyonundakinden daha fazladır. İri parçacıklarla yapılan aşılı zeytin çayının TEAK
değeri oldukça düşüktür (.65 mg troloks/mg aşılı zeytin). Parçacık boyutunun ekstraksiyonda önemli bir etkiye sahip olduğu anlaşılmaktadır. Yaprakların ince toz haline getirilmesi dokularda bulunan polifenolik bileşiklerin ekstraksiyonunu kolaylaştırmaktadır. Çay olarak hazırlanan ekstrelerin TEAK değerlerinin daha yüksek olması katı sıvı oranının farklı olması ile açıklanabilir (1.5 g yaprak /15 ml su). Ayrıca sıcaklığın çok yüksek olması da polifenollerin ekstraksiyonunu etkileyerek arttırmış olabilir. İncir çayı TEAK değeri etanol ekstraksiyonunun TEAK değerinin 5 kat daha fazlasıdır. Çizelge 1 de çay ekstrelerinin TEAK değerleri verilmektedir. Çizelge 1. Çay Ekstrelerinin TEAK değerleri TEAK (mg troloks/mg örnek) Aşılı zeytin Yabani zeytin İncir 4.5 5.87 3.82 İri öğütülmüş aşılı zeytin.65 Öğütülmüş yaprakların SMS de (ph=1.5) 37 C de yarım saat bekletildikten sonra antioksidan özelliklerini kaybetmediği görüldü. Zeytin yaprakları SMS ekstrelerinin TEAK değerleri alkol ekstraksiyonu ile elde edilenlerin TEAK değerlerine yakın olduğu belirlenmiştir. Diğer yandan, incir nın SMS ekstresinin antioksidan kapasitesi 2.37 mg troloks/mg toz yaprak olarak bulunmuştur. Bu değer alkol ekstraksiyonu ile elde edilen ekstrenin değerine oranla 3 kat fazladır. En yüksek antioksidan değeri 3.12 mg troloks/mg değeri ile aşılı zeytin SMS ekstresinde bulundu (Şekil 4). Asidik ortamda polifenolik bileşiklerde bozulma veya asit hidrolizi ile daha düşük moleküler yapıda başka bileşenlere dönüşme beklenmektedir. Bouaziz ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada [3] alkol ekstraksiyonu ile elde edilen ekstre asitle muamale edildiğinde kompleks bileşenlerin parçalandığı veya hidroliz olduğu, ürünlerin HPLC ile karakterize edilmesi ile tespit edilmiştir. Özellikle oleuropeinin parçalanarak glikozid türevlerinden hidroksitirosole dönüştüğü ve daha yüksek antioksidan aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Herhangibir toksik bileşen bulunmadığının tespiti halinde yapraklar direk kullanılabilir. TEAK DEĞERİ (mg troloks/mg örnek) 3.5 3 2.5 2 1.5 1.5 aşılı zeytin yabani zeytin incir simüle mide sıvısında Şekil 4. Simüle mide sıvısında yaprakların antioksidan değerleri.
Yüksek antioksidan aktivite gösteren polifenoller polaritesine göre ayrılabilir. Bu amaçla 7 % etanol ile ekstarksiyondan elde edilen ekstrenin antioksidan kapasitesi, alkolün uzaklaştırılması ile elde edilen fraksiyonun antioksidan kapasitesi kıyaslandı. Alkolsüz fraksiyonda antioksidan kapasitesi yabani zeytin için 2.77 TEAK iken 7% alkollü fraksiyonda 6.13 olarak bulunmuştur. Diğer kıyaslamalar Çizelge 2 de verilmektedir. Görüldüğü üzere alkollü fraksiyonlarda antioksidan kapasiteleri her örnek için daha yüksektir. Bu da ekstrakte edilen polifenolik maddelerin çeşitliliği ve kimyasal özelliklerinin farklılığı ile açıklanabilir. Sonuç olarak polifenoller farklı çözgen ortamlarında birbirlerinden ayrılabilir. Çizelge 2. Örneklerin farklı fraksiyonlarda TEAK değerleri Fraksiyonlar Aşılı zeytin Yabani zeytin İncir 7% etil alkol 4.5 6.13 1.85 Su 2.81 2.77.76 ÖNERİLER Yapılan deney sonuçları göstermiştir ki zeytin yapraklarının antioksidan kapasiteleri incir ndan yüksektir. Zeytin 5 ay boyunca antioksidan kapasitesinde değişiklik olmadan oda sıcaklığında saklanabilir. Ayrıca elde edilen sonuçlara göre mide sıvısında etanol ekstresine kıyasla antioksidan kapasiteleri daha yüksektir. Bu nedenle yaprakların kapsüllenerek alınması etanol ekstresine göre daha yüksek bir verim sağlar. Polifenolik bileşenlerin kromatografik tekniklerle detaylı olarak incelenmesi önerilmektedir. Bununla birlikte polifenollerin yapılarının farklı ortamlardaki değişimleri de incelenerek antioksidan kapasite üzerine etkileri açıklanabilir. Ülkemiz zeytin ve incir üretimi açısından önemli bir yere sahipken, polifenollerce zengin olan ve bundan dolayı sağlık üzerine önemli etkiler gösteren yapraklarının değerlendirilmesi ülkemiz ekonomisine katkı sağlayacaktır. SEMBOLLER SMS : Simüle Mide Sıvısı TEAK: Troloks eşdeğeri antioksidan kapasitesi (mg Troloks/mg örnek) ABTS (2,2'-Azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), Kimyasal formülü = C 18 H 18 N 4 O 6 S 4 A i : Ekstre koymadan önce radikalin absorbansı A f : Ekstre koyduktan 15 saniye sonra radikalin absorbansı m örnek : % inhibisyon-örnek miktarı grafiğinin eğimi DF : seyreltme katsayısı, C örnek : katı madde miktarı / solvent miktarı oranı (mg/ml),.12182 : standart olarak kullanılan troloksun % inhibisyon-troloks miktarı grafiğinin eğiminden elde edilen sabit çarpanı belirtmektedir.
KAYNAKLAR 1. Hansen, M. ve Verity, A., Olive Leaf Extracts, Goldgolf Pty. Ltd., Australia, 22 2. Bayçın, D., Altıok, E., Ülkü, S. ve Bayraktar O., Adsorption of Olive Leaf (Olea europaea L.) Antioxidants on Silk Fibroin, Separation and Purification Technology, 62, 342 348, 28. 3. Bouaziz, M., Hammami, H., Bouallagui, Z., Jemai, H. ve Sayadi, S., Productıon of Antioxidants from Olive Processing By-products, EJEAFChe, 7 (8), 3231-3236, 28.