PERİODONTAL DOKU MÜHENDİSLİĞİNDE NANOFİBRİLER VE MAKROPÖRÖZ SÜNGERİMSİ DOKU İSKELELERİNİN İN VİTRO KARŞILAŞTIRILMASI

T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PERİODONTAL DOKU MÜHENDİSLİĞİNDE NANOFİBRİLER VE MAKROPÖRÖZ SÜNGERİMSİ DOKU İSKELELERİNİN İN VİTRO KARŞILAŞTIRILMASI Dt. Kemal Burak ŞAHBAZOĞLU Periodontoloji Programı DOKTORA TEZİ ANKARA 2016

T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PERİODONTAL DOKU MÜHENDİSLİĞİNDE NANOFİBRİLER VE MAKROPÖRÖZ SÜNGERİMSİ DOKU İSKELELERİNİN İN VİTRO KARŞILAŞTIRILMASI Dt. Kemal Burak ŞAHBAZOĞLU Periodontoloji Programı DOKTORA TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Ferda Alev AKALIN ANKARA 2016

ONAY SAYFASI iii

iv TEŞEKKÜR Doktora eğitimim boyunca her konuda desteğini yanımda hissettiğim, hoşgörüsü ve güler yüzünü benden esirgemeyen değerli danışman hocam Prof. Dr. Ferda Alev Akalın a, Klinik ve akademik tecrübelerini bizimle sonuna kadar paylaşan ve özverilerinden ötürü kendilerine minnettar olduğum çok değerli hocalarım Prof. Dr. Gürhan Çağlayan, Prof. Dr. Kenan Eratalay, Prof. Dr. Feriha Çağlayan, Prof. Dr. Dilek İlhan, Prof. Dr. Ezel Berker, Prof. Dr. Rahime Nohutcu, Prof. Dr. Nermin Yamalık a ve aynı zamanda rehberlikleriyle hayata dair ufkumu genişleten kıymetli hocalarım Prof. Dr. Burak Demiralp ve Prof. Dr. Tolga Tözüm e, Doktora eğitimim süresince bilgi, tecrübe ve özverilerini esirgemeyen ve bir ağabey-abla gibi yanımda olan Doç. Dr. Güliz Güncü, Doç. Dr. Abdullah Cevdet Akman, Yrd. Doç. Dr. Hüseyin Gencay Keçeli, Yrd. Doç. Dr. Erhan Dursun, Yrd. Doç. Dr. Burak Kutlu, Dr. Sevim Günday, Dr. Erkan Şüküroğlu ve Dr. Sezen Aşkın a, Araştırmamın laboratuvar aşamalarının tamamlanmasında büyük emekleri olan Dr. Murat Demirbilek, Prof. Dr. Sevgi Bayarı, Prof. Dr. Emir Baki Denkbaş, Doç. Dr. Mustafa Türk, ve Selçuk Toklucu ya, İstatistiksel değerlendirmelerdeki yardımlarından dolayı Doç. Dr. Erdem Karabulut a, Kendi alanındaki bilgi ve tecrübelerini paylaşmaktan çekinmeyerek mesleki açıdan gelişmeme çok önemli katkılarda bulunan başta Dr. Emine Koştur olmak üzere Protez Bölümü asistan arkadaşlarıma ve Endodonti Bölümü asistan arkadaşlarıma, Keyifli bir doktora süreci geçirmemi sağlayan ve hayat boyu dostluklarını yanımda hissedeceğim Dr. Yağmur Deniz İlarslan, Dr. Ceyda Dursun, Dr. Vuslat Arı, Dr. Tolga Genç, Dr. Hatice Alpay ve kardeşlerim Dr. Tuğba Duruel, Dr. Orkun Topcu ve Dr. Doğukan Yılmaz a, Birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum asistan arkadaşlarım, Dr. Rahşan Şentürk, Dr. Demet Şahin, Dr. Derya Kutsal, Dr. Ezgi Doğan, Dt. Buket Acar, Dt. Onurcem Duruel, Dt. Hazel Zeynep Kocabaş, Dt. Sahand Taheri, Dt. Bünyamin Çalışan, Dt. Hava Zakin, Dt. Samir Göyüşov, Dt. Hanife Merva Parlak ve Dt. Mehmet Özgür e, Bu günlere gelmemde şüphesiz en çok katkısı olan, sevgi ve desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen, her şeyimi borçlu olduğum ve onlara layık bir evlat olmaktan her zaman gurur duyduğum ve duyacağım çok değerli annem Füsun Şahbazoğlu ve babam Hakkı Şahbazoğlu na, Doktora süresince sabrı ve sevgisiyle her türlü zorluğun üstesinden gelmemi sağlayan ve hayatımı anlamlı kılan çok kıymetli ve sevgili eşim Damla Şahbazoğlu na, Sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

v ÖZET Şahbazoğlu, K.B., Periodontal doku mühendisliğinde nanofibriler ve makropöröz süngerimsi doku iskelelerinin in vitro karşılaştırılması, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Periodontoloji Programı Doktora Tezi, Ankara, 2016. Periodontitis; diş eti, periodontal ligament (PDL), sement ve alveol kemiğinden oluşan periodonsiyumda yıkım oluşturan enflamatuar bir hastalıktır. Periodontal tedavinin temel hedefi hastalığın ilerlemesini durdurmak ve kaybedilen dokuların rejenerasyonunu sağlamaktır. Periodontal doku mühendisliğinde hücre, doku iskelesi ve büyüme faktörleri, anahtar araçlardır. Son yıllarda, doku mühendisliği de dahil olmak üzere tıbbın çeşitli alanlarında nanoteknolojik uygulamalar büyük ilgi çekmeye başlamıştır. Özelleşmiş moleküler yapıları nedeniyle, nano malzemelerle daha başarılı sonuçlar elde edilebilir. Doku mühendisliği işlemleri için iskele malzemesi olarak çok çeşitli maddeler üzerinde çalışılmış, bunlar arasında doğal ve sentetik polimerler de kullanılmıştır. Son yıllarda, sentetik polimerler arasında yer alan polylactic-co-glycolic acid (PLGA), doku mühendisliği çalışmalarında kullanılan sentetik polimerlerden biri olmuştur. Bu çalışmanın temel amacı periodontal rejenerasyonu sağlama amacıyla periodontal doku mühendisliğine uygun bir nanofibriler doku iskelesi malzemesi oluşturmak ve nanofibriler ve makropöröz süngerimsi doku iskelelerini karşılaştırarak, periodontal rejenerasyonda kullanılmak üzere uygunluğunun test edilmesidir. Biyouyumluluk, doğal kemiğe benzerlik, dayanıklılık ve biyobozunum özellikleri nedeniyle, sentetik bir polimer olan PLGA ana malzeme olarak planlanmıştır. Bu malzemeye; periodontal dokularla uyumlu kollajen (K) ve hidroksiapatit (HA) katkısı düşünülmüş ve (PLGA/K/HA) kompozit yapı, doku iskelesi malzemesi olarak tasarlanmıştır. Bu kompozit (PLGA/K/HA); nano-fibriler ve makropöröz süngerimsi olarak iki farklı yapıda hazırlanmıştır. Ayrıca, HA ve Kemik morfojenitik protein 2 (BMP-2) sinyal molekülü içeren ve içermeyen alt gruplar oluşturulmuştur. Üretilen doku iskeleleri FTIR, SEM ve EDX analizleri ve mekanik testler ile karakterize edilmiş ve doku iskelelerinin mikro ve moleküler yapıları, Ca/PO 4 oranları ve elastisite modülleri saptanmıştır. Nano-fibriler ve makropöröz süngerimsi doku iskeleleri; in-vitro ortamda periodontal ligament (PDL) ve MC3T3-E1 preosteoblast hücrelerinin bu yapılara olan davranışları açısından karşılaştırılmış ve hücrelerin; SEM analizi değerlendirmesi ile adezyon, WST-1 ile proliferasyon, ALP testi ile farklılaşma ve Alizarin testi ile mineralizasyonları incelenmiştir. Ayrıca bu iskelelere in vitro ortamda; sinyal molekülü olarak hücre farklılaşması ve osteoindüksiyonu güçlendirici etkisi olduğu bilinen BMP-2 eklenerek etkileri incelenmiştir. Genel olarak nanofibriler doku iskeleleri makropöröz süngerimsi doku iskelelerine göre daha olumlu sonuçlar vermiştir. Üretilmiş olan süngerimsi ve nanofibriler doku iskelelerinin periodontal doku mühendisliği uygulamalarında kullanılabilir potansiyelde olduğu düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Periodontal rejenerasyon, nanoteknoloji, periodontal ligament hücresi, MC3T3-E1 hücresi, PLGA Bu araştırma 113S534 proje numarası ile TÜBİTAK tarafından desteklenmiştir.

vi ABSTRACT Şahbazoğlu, K.B., In vitro comparison of Nanofiber and Macroporous Sponge Scaffolds in Periodontal Tissue Engineering, Hacettepe University Institute of Health Sciences Ph.D. Thesis in Periodontology. Ankara, 2016 Periodontitis is an inflammatory disease which causes periodontal tissue breakdown consisted of gingiva, periodontal ligament (PDL), cementum and alveolar bone. The ultimate goal of periodontal treatment is to regenerate the lost tissue. Recently, periodontal tissue engineering have become a novel approach to regenerate the periodontium. Factors necessary for periodontal tissue engineering are; Tissue cells regulatory signals for the cells and convenient intercellular matrix (tissue scaffold). Nanotechnology defines the application area originated from the term nano that means parts per billion. In recent years nanotechnological applications have started to gain great interest in various fields of medicine including tissue engineering. More succesful results may be obtained with nano materials due to specialized structure of molecules. Various substances have been searched as scaffold materials in tissue engineering including synthetic and natural polymers. Synthetic polymers have become an alternative to natural polymers due to their manufacturing and physical properties. In recent years poly lactic-co-glycolic acid (PLGA) has become a synthetic scaffold material in tissue engineering. The main target of this study was to produce a nanofiber tissue scaffold for periodontal tissue engineering to obtain periodontal tissue regeneration and to analyse the benefits of nanomaterials in periodontal tissue engineering by comparing nanofiber and macroporous sponge tissue scaffolds. Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) was selected as scaffold material due to it s similarity to bone, biocompatibility and stability. Collagen (C) and hydroxyapatite (HA) was added and a composite scaffold material was produced (PLGA/C/HA) in nanofiber and macroporous spongious forms and were compared in vitro. Subgroups with and without HA and BMP-2 signal molecule were also created. The scaffolds were characterized by FTIR, SEM, EDX and mechanical tests. The micro and molecular structures, Ca/PO 4 ratios and elasticity modules were determined. The scaffolds were compared by analyzing the activities of PDL and MCT3-E1 cells. The adeshions by SEM, proliferation by WST- 1, differentiation by ALP and mineralization with Alizarin tests were determined. In general, nanofiber scaffolds showed more favorable results than macroporous spongious scaffolds. Both scaffolds seemed suitable and useful for periodontal tissue engineering. Keywords: Periodontal regeneration, nanotechnology, periodontal ligament cell, MC3T3E-1 cell, PLGA This research was supported by TÜBİTAK with project number: 113S53

vii İÇİNDEKİLER Sayfa No ONAY SAYFASI iii TEŞEKKÜR iv ÖZET v ABSTRACT vi İÇİNDEKİLER vii SİMGELER ve KISALTMALAR x ŞEKİLLER xi TABLOLAR xiii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 6 2.1. Periodontal Doku Mühendisliği 6 2.2. Hücreler 7 2.2.1. Periodontal Ligament Hücreleri 8 2.2.2. Sementoblast Hücreleri 8 2.2.3. Osteoblast Hücreleri 8 2.2.4. Kemik İliği Stroma Hücreleri 8 2.2.5. Periost Kaynaklı Hücreler 9 2.3. Büyüme ve Farklılaşma Faktörleri (Regülatör Sinyaller) 9 2.3.1. BMP-2 10 2.4. Doku İskelesi (Skaffold) 10 2.4.1. Kollajen 12 2.4.2. Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) 12 2.4.3. Hidroksiapatit 13 2.5. Nanoteknoloji 13 2.5.1. Nanomalzemelerin Üretim Yöntemleri 15 2.5.2. Nanomateryel Yapıları 16 2.5.3. Maksillofasiyal Cerrahide Nanomalzemeler 17 2.5.4. Kemik Doku Mühendisliğinde Nanomalzemeler 18 2.5.5. Nanoteknoloji ve Doku Mühendisliği 18

viii 2.5.6. Nanoteknoloji ve Periodontal Doku Mühendisliği 20 3. GEREÇLER ve YÖNTEM 26 3.1. Doku İskelelerinin Hazırlanması 27 3.1.1. Kollajen İçeren PLGA Nanofibriler Doku İskelelerinin (Nanofibriler-PLGA/K) Hazırlanması 27 3.1.2. Kollajen ve Sentetik Body Fluid (SBF) Çöktürülmüş Nanofibriler Doku İskelelerinin (Nanofibriler-PLGA/K/HA) Hazırlanması 27 3.1.3. Kollajen İçeren PLGA Süngerimsi Doku İskelelerinin (Sünger-PLGA/K) Hazırlanması 27 3.1.4. Nano-Hidroksiapatit (nha) ve Kollajen İçeren PLGA Süngerimsi Doku İskelelerinin (Sünger-PLGA/K/HA) Hazırlanması 28 3.2. Doku İskelelerinin Karakterizasyon Çalışmaları 28 3.2.1. Fourier Dönüşümlü İnfrared Spektroskopisi (FTIR) Analizi (Fourier Transformed Infrared Spectroscopy) 28 3.2.2. Taramalı Elektron Mikroskop (SEM) Analizi ve Energy- Dispersive X-Ray (EDX) Analizi 28 3.2.3. Mekanik Test 29 3.3. Hücre Kültürü Çalışmaları 30 3.3.1. Periodontal Ligament (PDL) Hücrelerinin Elde Edilmesi 30 3.3.2. PDL Hücre Kültürü Grupları 31 3.3.3. Doku İskelelerinin Sterilizasyonu ve BMP-2 ile Yüklenmesi 31 3.3.4. PDL Hücrelerinin Ekimi 32 3.3.5. PDL Hücreleri SEM Analizi 33 3.3.6. WST-1 testi - PDL hücreleri 33 3.3.7. ALP Testi - PDL Hücreleri 34 3.3.8. Alizarin Testi - PDL Hücreleri 34 3.3.9. MC3T3-E1 Hücrelerinin Elde Edilmesi 35 3.3.10. MC3T3-E1 Hücre Kültürü Grupları 35 3.3.11. Doku İskelelerinin Sterilizasyonu ve BMP-2 ile Yüklenmesi 35 3.3.12. MC3T3-E1 Hücrelerinin Ekimi 35 3.3.13. MC3T3-E1 Hücreleri SEM Analizi 36 3.3.14. WST-1 Testi - MC3T3-E1 Hücreleri 36

ix 3.3.15. ALP Testi - MC3T3-E1 Hücreleri 36 3.3.16. Alizarin Testi - MC3T3-E1 Hücreleri 36 3.4. İstatistiksel Değerlendirme 37 4. BULGULAR 38 4.1. İnfrared Spektrumlarının Analizi 38 4.1.1. Nanofibriler Doku İskelelerinin FTIR Analizleri 42 4.1.2. Süngerimsi Doku İskelelerinin FTIR Analizleri 44 4.2. Taramalı Elektron Mikroskop (SEM) Analizi ve Energy-Dispersive X-Ray (EDX) Analizi 45 4.2.1. Nanofibriler Doku İskelelerinin SEM Görüntüleri 45 4.2.2. Nanofibriler Doku İskelelerinin EDX Analizleri 47 4.2.3. Süngerimsi Doku İskelelerinin SEM Görüntüleri 49 4.2.4. Süngerimsi Doku İskelelerinin EDX Analizleri 50 4.3. Mekanik Test Sonuçları 50 4.4. Hücre Kültürü Çalışmaları 54 4.4.1. SEM Analizi- PDL Hücreleri 54 4.4.2. WST-1 Testi- PDL Hücreleri 59 4.4.3. ALP Testi - PDL Hücreleri 61 4.4.4. Alizarin Testi - PDL Hücreleri 62 4.4.5. SEM Analizi - MC3T3-E1 Hücreleri 65 4.4.6. WST-1 Testi - MC3T3-E1 Hücreleri 68 4.4.7. ALP Testi- MC3T3-E1 Hücreleri 70 4.4.8. Alizarin Testi- MC3T3-E1 Hücreleri 71 5. TARTIŞMA 74 6. SONUÇLAR ve ÖNERİLER 90 KAYNAKLAR 92 EKLER Ek 1. Etik Kurul Onayı Ek 2. Araştırma Amaçlı Çalışma İçin Aydınlatılmış Onam Formu

x SİMGELER ve KISALTMALAR ALP Alpha-MEM ATR bfgf BMP DMEM ECM EDTA EDX EMD FBS FGF FTIR HA IGF K MPa PBS PCL PDGF PDL PGA PHBV PLGA PLLA PMMA RPM SEM TCP TGFβ VEGF Alkalen Fosfataz Minimum Essential Medium Alpha Modification Attenuated total reflection Bazic fibroblast büyüme faktörü Kemik morfojenetik protein Dulbecco s Modified Eagle s Medium Ekstrasellüler Matriks Etilendiamintetraasetikasit Energy-Dispersive X-Ray Emdogain Fetal sığır serumu Fibroblast Büyüme Faktörü Fourier Dönüşümlü İnfrared Spektroskopisi Hidroksi Apatit İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü Kollajen Megapaskal Phosphate Buffered Saline Poli kaprolakton Trombosit Kökenli Büyüme Faktörü Periodontal Ligament Poli glikolik asit Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate Poly(laktik-co-glikolik asit) Poly l-lactic acid Polimetil metakrilat Round Per Minute Taramalı Elektron Mikroskobu Trikalsiyum fosfat Transforming Büyüme Faktörü Beta Vasküler Endotelial Büyüme Faktörü

xi ŞEKİLLER Şekil Sayfa No 3.1. Taramalı elektron mikroskop (SEM) 29 3.2. Micro tensile tester 30 3.3. Üretilen doku iskeleleri (10x10mm) ve (5x5mm) lik boyutlara kesilmesi 32 4.1. Hidroksiapatitin kristal yapısı 39 4.2. Hidroksiapatitin toz formunda FTIR spektrumu 39 4.3. PLGA ve monomerlerinin kimyasal yapısı 40 4.4. PLGA nın FTIR spektrumu 41 4.5. Kollajenin FTIR spektrumu 42 4.6. PLGA ve PLGA/K nanofibriler örneklerin FTIR spektrumlarının karşılaştırılması 43 4.7. Nanofibriler-PLGA/K ve Nanofibriler-PLGA/K/HA örneklerinin FTIR spektrumlarının karşılaştırılması 43 4.8. Sünger-PLGA/K ve Sünger-PLGA/K/HA doku iskelelerinin FTIR spektrumu 44 4.9. PLGA nanofibriler örneklerin farklı büyüttme ile SEM görüntüleri 45 4.10. PLGA-K nanofibriler örneklerin SEM görüntüsü 46 4.11. Farklı büyütmelerle Nanofibriler-PLGA/K/HA örneklerin SEM görüntüleri 46 4.12. Örneklerin X-ışın krınım desenleri 47 4.13. PLGA-kollajen-HA nanofibriler yapısının EDX spektrumu 48 4.14. Sünger-PLGA/K doku iskelesi örneklerinin SEM görüntüleri 49 4.15. Sünger-PLGA/K/HA doku iskelesi örneklerinin SEM görüntüleri 49 4.16. PLGA/K/HA süngerimsi yapının EDX spektrumu 50 4.17. Genel bir gerilim-uzama grafiği 52 4.18. Nanofibriler-PLGA/Kollajen örneğinin (n=3) kuvvet- uzama grafiği 52 4.19. Nanofibriler-PLGA/Kollajen/HA örneğinin (n=3) kuvvet- uzama grafiği 52 4.20. Sünger-PLGA/Kollajen örneğinin (n=3) kuvvet- uzama grafiği 53 4.21. Sünger-PLGA/K/HA örneğinin (n=3) kuvvet- uzama grafiği 53

xii 4.22. Örneklerin Young modülüslerinin karşılaştırılması 54 4.23. PDL hücre kültürü-morfoloji-sem 3.gün 56 4.24. PDL Hücre Kültürü-Morfoloji-SEM 14.Gün 58 4.25. PDL hücrelerinin WST-1 analizi 61 4.26. PDL Hücrelerinin ALP analizi 62 4.27. PDL hücrelerinin alizarin boyaması sonrası ters ışık mikroskobu görüntüleri 63 4.28. MC3T3-E1 hücre kültürü-morfoloji-sem 3.gün 66 4.29. MC3T3-E1 hücresi 7.GÜN Nanofibriler-PLGA-K + BMP-2 SEM 67 4.30. MC3T3-E1 7.GÜN Nanofibriler-PLGA-K SEM 67 4.31. MC3T3-E1 14.Gün Nanofibriler-PLGA/K/HA SEM 67 4.32. Nanofibriler-PLGA/K doku iskelesinin boş hali ve MC3T3-E1 hücrelerinin doku iskelesine 7.günde tutunmuş hali 68 4.33. MC3T3-E1 hücrelerinin WST-1 analizi 69 4.34. MC3T3-E1 hücrelerinin ALP analizi 71 4.35. MC3T3-E1 hücrelerinin alizarin boyaması sonrası ters ışık mikroskobu görüntüleri 72

xiii TABLOLAR Tablo Sayfa No 3.1. Çalışma Planı 26 3.2. Projede kullanılan doku iskeleleri 31 4.1. Hidroksiapatitin FTIR spektrumunda gözlenen band tanımları (işaretleme) 40 4.2. PLGA-K-HA nanofibriler yapının % CA-P ağırlıkları 48 4.3. PLGA/Kollajen/HA süngerimsi yapının % Ca-P ağırlıkları 50 4.4. Ortalama Young modülüsleri 53

1 1. GİRİŞ Periodontitis; diş eti, periodontal ligament (PDL), sement ve alveol kemiğinden oluşan periodonsiyumu etkileyen enflamatuar bir hastalıktır. İltihabi periodontal hastalık sonucunda bu dokuların yıkımıyla ortaya çıkan diş destek doku kaybı; çiğneme fonksiyonunun azalması, bozulmuş fonetik ve estetik ve sonuç olarak da diş kaybına neden olur. Tedavi edilmezse iltihabi periodontal hastalık sonucunda bu dokuların yıkımıyla ortaya çıkan diş destek doku kaybı ilerleyerek diş kaybına kadar gidebilir. İdeal bir periodontal tedavi için periodonsiyumun eksiksiz rejenerasyonu hedeflense de, öngörülebilir ve başarılı sonuçlar henüz elde edilememiş olup sözü edilen yöntemlerin kısıtlamaları mevcuttur (1-4). Son yıllarda periodonsiyumun yeniden oluşturulması için yönlendirilmiş doku rejenerasyonu (YDR) (5,6) ve daha yeni olarak periodontal doku mühendisliği uygulamaları gündeme gelmiştir. Yönlendirilmiş doku rejenerasyonu bariyer membranlardan yararlanarak periodontal rejenerasyonda spesifik hücrelerin yer alması prensibine dayanmaktadır. Literatürde, YDR ile elde edilen klinik gelişmelerin minör ve değişken olduğu rapor edilmiştir (7-9). Periodontal defektlerin rekonstrüksiyonunda yer alan bazı tedaviler büyük ölçüde sentetik ya da otojen greft kullanımına dayanmaktadır. Bununla birlikte biyouyumluluğun az olmasına, kemik rezorbsiyonuna, limitli greft miktarına ve donör bölge morbiditesine bağlı olarak tedavilerin sonuçları limitli olmaktadır (10). Bunların bir sonucu olarak periodontal rejenerasyonda güncel araştırma eğilimleri hücre temelli teknikleri geliştirme yönünde yapılmaktadır. Son yıllarda kaybedilen dokuların yeniden oluşturulmasına yönelik doku mühendisliği kavramı ve uygulama alanı ortaya çıkmıştır. Doku mühendisliğinin periodontal rejenerasyonda uygulanması bu açıdan ön plana çıkmış ve periodontal doku mühendisliği alanı gelişmeye başlamıştır (11). Doku mühendisliği hasar görmüş dokuların yerine getirilmesi amacıyla yeni yapılar üretilmesini sağlayan; hücre biyolojisi, gelişimsel biyoloji ve malzeme bilimini bir araya getiren bir bilim dalıdır (12). Doku mühendisliği, canlı ve fonksiyonel dental yapıları rejenere ederek konvansiyonel tedavi

2 seçeneklerinin kısıtlamalarını azaltmaya yardım edebileceği düşünülen, alternatif bir yaklaşım olarak kabul edilir (13). Doku mühendisliği, periodontoloji, endodonti ve maksillofasiyal cerrahiyi içerecek şekilde rejeneratif diş hekimliği uygulamalarına ve araştırmalarına, hasarlı ve kaybedilmiş periodonsiyum, dentin-pulpa kompleksi ve orofasiyal dokuların rejenerasyonu amacıyla entegre olmuştur (14-17). Doku mühendisliği uygulamaları için multipotansiyel projenitör hücreler, kondüktif ekstrasellüler matriks (ECM) görevi gören doku iskelesi ve sinyal molekülleri olmak üzere temel olarak gerekli olan 3 bileşen vardır (13,16,18). Ekstrasellüler matriks görevi gören doku iskelesi; sadece hücrelerin rejenerasyon sahasına iletilmesini sağlamaz, aynı zamanda hücre ataçmanında, boşluk oluşturulmasında, morfolojik özelliklerin belirlenmesinde, oksijen ve besinlerin taşınmasında da önemli bir rol oynar (16,18). Doku mühendisliğinde uygulanacağı alana göre pörözite, doku kondüktivitesi, biyouyumluluğu ve rezorbsiyon oranı açısından uygun bir doku iskelesi seçimi gibi faktörler çok büyük önem taşır (19,20). Periodontal doku mühendisliği ile elde edilecek rejenerasyon için gerekli olan faktörler; dokuya özel hücreler, bu hücrelerin büyümesi ve farklılaşması için kullanılacak olan regülatör sinyaller ve hücrelerin, üzerinde büyüyüp yeni bir doku oluşturması için hücrelerarası matriks yerine geçecek taşıyıcı bir yapıdır (doku iskelesi) (scaffold). Nanoteknoloji, yapısal özellikleri 0,1-100 nm aralığında olan nanomaddelerin, çeşitli fiziksel veya kimyasal yöntemlerle fonksiyonel nanomalzemeler halinde sentezlenmesi ile ilgili bir teknoloji alanıdır (21-24). Son yıllarda çok çeşitli alanlarda olduğu gibi, doku mühendisliğini de içeren çeşitli tıbbi alanlarda, nanoteknolojik uygulamalar büyük bir ivmeyle önem kazanmaya başlamıştır. Periodontal doku mühendisliğinde de nanoteknolojik uygulamalar ve malzeme arayışları yeni bir güncel kavram ve çalışma alanı olarak ortaya çıkmıştır. Nanoteknolojik malzemelerin; moleküllerin özelleşmiş yapıları nedeniyle, fiziksel, kimyasal ve biyolojik etkinliklerinin çok daha yüksek olması bu malzemelere üstünlük sağlama potansiyeline sahiptir.

3 Nanoteknolojik olarak üretilen doku iskeleleri kullanılarak yapılan periodontal doku mühendisliği uygulamalarında daha başarılı sonuçlar öngörülmektedir. Malzemelerin üretim yöntemleri düşünüldüğünde nanoteknolojinin doku mühendisliğinde malzeme üretimi aşamasında kullanıma başlamasıyla birlikte makropöröziteye sahip doku iskelelerine göre çeşitli avantajları olduğu düşünülen 1 mikrondan daha küçük, nano pürüzlülüğe sahip doku iskeleleri sıklıkla araştırılmaya başlanmıştır (25). Doku mühendisliğinin belki de en kritik öneme sahip bileşeni uygun hücre grubunun seçilmesidir. Kök hücre araştırmalarının önemli bir hedefi doku rejenerasyonunda kullanılabilmesi için ulaşılabilir dokulardan yüksek kalitede insan kök hücresi elde edebilmektir (12). Postnatal kök hücre biyolojisindeki son gelişmeler sonucunda PDL dokusunda çeşitli dokulara farklılaşma yeteneğine sahip multipotent kök hücrelerin varlığı gösterilmiştir ve PDL kök hücreleri tarafından indüklenen doku rejenerasyonunun periodontal hastalıklarda hücre tedavisinde güçlü bir potansiyele sahip olabileceği düşünülmektedir (26). Doku mühendisliği uygulamalarında gerekli olan üçüncü bileşen de büyüme faktörleridir. Doku mühendisliğinde hücreler arası iletişimde önemli rol oynayan biyolojik ajanların uygulanması doğal olarak rejenerasyon sürecinde olan olayları taklit edebilmek için hücrelerin farklılaşmasını sağlamak için gereklidir (27). Ne yazık ki periodontal rejenerasyonu aydınlatmak için tek bir büyüme faktörü ile ilişkili basit bir ilişki yoktur (28). Periodontal rejenerasyonda rol oynayan biyoloji, hücreler arasında gerçekleşen bütün olayları anlayabilmek için çok karmaşıktır, ancak periodontal rejenerasyona katkıda bulunduğu gösterilen bazı büyüme faktörleri vardır (14,29). Doku mühendisliği uygulamalarında; doku iskele malzemesi olarak doğal ve sentetik çok çeşitli malzemeler kullanılmakta ve araştırılmaktadır. Daha iyi hücre adezyonu, proliferasyonu ve farklılaşması elde etmek için doku iskelesi olarak çeşitli formlarda, farklı polimerler, mineraller ve bunların kombinasyonları kullanılmıştır. Polylactic-co-glycolic acid (PLGA), kollajen ve HA içeren kompozit bir yapının yeterli mekanik direncin yanında iyi bir

4 osteokondüktiviteye ve biyobozunurluğa sahip olması beklenebilir. Rezorbe olabilen polimer/biyoseramik kompozitlerin kullanımı hidroksiapatitin kırılgan olması, şekillendirilmesinin zor olması (30) ve rezorbsiyon süresinin aşırı yavaş olması gibi sorunları ortadan kaldırabilir. PLGA gibi polimerler bağlayıcı görevi görür ve HA, TCP gibi biyoseramiklerin kırılganlığı azalır (31,32). Kemik greftleri için rezorbe olabilen polimer/biyoseramik kompozitler önemli materyellerdir ve yoğun bir şekilde araştırılmıştır (33-36). Doku mühendisliğindeki temel prensipler, periodontal doku mühendisliği için de geçerlidir. Periodontal doku mühendisliği ile alveoler kemik, sement ve periodontal ligamentin rejenerasyonu hedeflenmektedir. Bu işlemle ilgili in vitro çalışmalarda periodontal ligament, sementoblast, periost kaynaklı hücreler ve kemik iliği stroma hücreleri kullanılmıştır (37). Bu çalışmalarda üretilmiş olan doku iskelelerine büyüme ve farklılaşma faktörleri yüklenerek ve kontrollü salımları gerçekleştirilmiştir ve bu çalışmaların sonucunda periodontal ligament, sement ve alveol kemiği rejenerasyonu sağlanmasına yönelik umut vaat eden başarılı sonuçlar elde edilmiştir (38). Bu çalışmanın temel hedefi; iltihabi periodontal hastalık sonucunda kaybedilen periodontal dokuları yeniden oluşturmak ve periodontal rejenerasyonu sağlamak amacıyla, periodontal doku mühendisliği işlemlerinde kullanılmak üzere uygun bir doku iskele malzemesi oluşturmaktır. Bu hedefe yönelik olarak çalışmanın amaçları; 1. Periodontal doku mühendisliği işlemlerinde kullanılmak üzere uygun bir malzeme geliştirmek, 2. Bunun için; periodontal doku mühendisliğine yeni bir yaklaşımla nanoteknolojiyi uygulamak ve uygun bir nano-doku iskelesi malzemesi oluşturmak, Ayrıca, nano-malzeme ile aynı içerikli makro-malzemeyi kıyaslamak suretiyle, periodontal doku mühendisliğinde nanoteknolojinin yararını irdelemek, Hücre kültür ortamına verilecek bir sinyal molekülünün etkilerini incelemektir.

5 Bu amaçla, çalışmamızda daha özel olarak; Doku yapısına uyum sağlama potansiyeli, doğal kemiğe benzerliği, dayanıklılık ve biyobozunum gibi özellikleri nedeniyle, sentetik bir polimer olan (PLGA) ana malzeme olarak planlandı. Bu malzemeye; doku yapısıyla uyumlu kollajen (K) ve hidroksi apatit (HA) katkısı düşünüldü ve (PLGA/K/HA) kompozit yapı, doku iskelesi malzemesi olarak tasarlandı. Bu kompozit yapının (PLGA/K/HA); nano-fibriler ve makropöröz süngerimsi olarak iki farklı yapıda hazırlandı. Doku iskele malzemesi esas olarak PLGA/K/HA olarak planlanmış olmakla beraber nano ve makro doku iskeleleri ayrıca HA eklenmeyen alt grup tiplerinde de hazırlanarak karşılaştırma yapıldı. Ayrıca bu alt gruplara BMP-2 eklenen ve eklenmeyen alt gruplar oluşturuldu. Çalışmamızda; doku yapısına uyum sağlama potansiyeli, doğal kemiğe benzerliği, dayanıklılık ve biyoyıkılım gibi özellikleri nedeniyle, sentetik bir polimer olan Poly (D,L-lactide-co-glycolide acid) (PLGA) ana malzeme olarak planlanmıştır. Bu malzemeye; doku yapısıyla uyumlu kollajen (K) ve doku iskelelerinde mineralizasyonu artırdığı önceki çalışmalarla (39,40) gösterilmiş olan hidroksi apatit (HA) katkısı düşünülmüş ve (PLGA/K/HA) kompozit yapı, doku iskelesi malzemesi olarak tasarlanmıştır. Bu malzemeden, nanofibriler ve makropöröz süngerimsi olmak üzere esas olarak iki farklı yapıda doku iskelesi oluşturulması planlanmıştır.

(41). Periodontal yara iyileşmesinin rejeneratif olaylarında, özelleşmiş 6 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Periodontal Doku Mühendisliği Doku mühendisliği, hasar gören dokuların yerine yeni dokular üretmek (rejenerasyon) üzere teknikler geliştirmek için ortaya çıkan bir bilim alanıdır rejeneratif hücrelere dönüşebilen progenitor hücrelerin bölgeye gelmesi gerekir. Bunu, hücrelerin proliferasyonu, tamir etmeye çalıştıkları bağ dokusunun özelleşmiş bileşenlerinin sentezlenmesi izler. Bu nedenle, periodontal rejenerasyon için doku mühendisliği stratejisi, periodonsiyumda bulunan hücrelerin rejenerasyon kapasitelerini işleten hücreleri içinde barındıran üç boyutlu bir yapı oluşturarak büyütmek ve ardından defekte implante etmektir. Uygun hücreler ve sinyallerle birlikte prefabrike üç boyutlu bir yapının sağlanmasıyla geleneksel regenaratif işlemlerdeki pek çok sınırlamanın üstesinden gelinebilir (22). Hücre, doku iskelesi ve büyüme faktörleri, doku mühendisliğinin anahtar araçlarıdır. Hücre yeni dokunun matriksini sentezlerken, doku iskelesi, hücreler için görevlerini yapabilecekleri uygun çevreyi sağlar. Büyüme faktörlerinin işlevi hücrelerin yeni doku rejenerasyonunu kolaylaştırmak ve artırmaktır (37). Büyüme faktörü biyolojisi ve biyobozunabilir polimer yapılardaki ilerlemeler kıkırdak, kemik ve periodonsiyum gibi ilgili dokuların mühendisliğinin başarılı bir şekilde yapılabileceği bir aşamaya gelmiştir (42). Başarılı bir periodontal rejenerasyon için dokuların en koronal kısmında, uzunluğu 2 mm den fazla olmayan fonksiyonel epitel örtüsü oluşturulmalıdır. Periodontal ligament ve dentogingival lif kompleksini yeniden oluşturmak için, yeni periodontal ligament lifleri (Sharpey lifleri), açığa çıkmış kök yüzeyi içerisine gömülmeli, açığa çıkmış kök yüzeyi üzerinde yeni hücresiz ekstrinsik lifli sement oluşturulmalı ve alveol kemik yüksekliği mine sement birleşimine 2 mm mesafede yeniden oluşturulmalıdır (42,43).

7 Son zamanlarda periodontal tedavideki bu kısıtlayıcı unsurlar, araştırmacıları periodontal doku mühendisliği yaklaşımlarında periodontal ligament (PDL) rejenerasyonu üzerinde çalışmaya itmiştir (44). Periodontal doku mühendisliği işlemlerinin aşamaları ana hatlarıyla şu şekilde özetlenebilir (2): Yapay doku iskelesi hazırlanması Periodontal doku hücrelerinin iskeleye ekilmesi Ekilen hücrelerin in vitro kültürünün yapılması, implante edilmeye uygun bir matriksin yeterli bir sürede hücrelerce sentezlenmesi İnşa edilen matriksin periodontal defekte implante edilmesi Periodontal defektin, implante edilen yapıdan tümüyle rejenerasyonu (2) Periodontal doku mühendisliği ile bu işlemlerin gerçekleştirilerek rejenerasyonun elde edilmesi için gerekli olan faktörler şu ana unsurları içerir; -Uygun bir şekilde seçilmiş hücreler, -Hücrelerin büyümesi ve farklılaşması için uygun miktarda regülatör sinyaller -Uygun bir hücreler arası matriks veya taşıyıcı bir yapıdır (doku iskelesi) (scaffold) (24). 2.2. Hücreler Periodontal rejenerasyonun tamamen sağlanması, periodonsiyumda kalan hücrelere bağlıdır. Kök yüzeyinin avasküler yapısı ve mikroorganizmaların periodontal iyileşmeyi engelleyici yerleşimi gibi faktörler hücrelerin ve hücre dışı bileşenlerin etkileşimini zorlaştıran engelleyici unsurlardır (43,45,46). Sonuç olarak periodontal defekt, periodonsiyumda kalan hücrelerin istenilen bir şekilde migrasyonu, diferansiasyonu ve kayıp dokuların rejenerasyonunun sağlanması için optimal koşullara çoğu zaman sahip değildir (22,47). Periodonsiyumun rejenerasyonu amacıyla doku mühendisliği işlemlerinde PDL hücreleri, sementoblastlar, kemik iliği stroma hücreleri ve

8 periost hücrelerinin kullanılması hayvan modellerinde umut verici sonuçlar ortaya koymuştur (10,37,48). 2.2.1. Periodontal Ligament Hücreleri PDL hücreleri; fibroblastlar, makrofajlar, farklılaşmamış ektomezenşimal hücreler, sementoblastlar ve sementoklastlar, osteoblastlar ve osteoklastlar, Malassez epitel artıkları, vasküler ve nöral elementleri içerir (49-51). PDL dokusunu temel olarak fibroblastik hücreler oluşturur. Ancak osteojenik diferansiasyonlarla ve alkalen fosfataz, osteokalsin ve kemik sialoproteini gibi mineralize doku oluşturulmasıyla ilişkili protein ifadeleri açısından dişeti fibroblastlarından farklıdırlar. PDL hücrelerinin sement ve alveoler kemiğini idame ettirecek ve rejenere edebilecek özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir (52,53). 2.2.2. Sementoblast Hücreleri Sementoblastlar sementin oluşturulmasından sorumlu temel hücrelerdir. Periodontal dokuların tamamen restorasyonu için daha önce hastalık nedeniyle etkilenen kök yüzeylerinde yeni sement formasyonu gereklidir (46). 2.2.3. Osteoblast Hücreleri Osteoblast serisini oluşturan hücreler kemik metabolizması ile ilgili temel hücrelerdir. Kemik organik matriksini sentezlerler ve mineralizasyonda görev alırlar. Ayrıca, dolaşımda bulunan hormon, büyüme faktörleri veya fiziksel uyarımlar etkisiyle salgılanan sitokinler ile yönlendirilen mekanizmalarla kemik dokusunun yapım, yıkım ve yeniden şekillendirilmesinde rol alırlar. Osteoblastlar, kemik yapım ve yıkım olaylarının düzenlenmesindeki rolleri ile kalsiyum, fosfat gibi minerallerin kan düzeylerinin homeostazında da görev alırlar (54). 2.2.4. Kemik İliği Stroma Hücreleri Kemik iliği stroma hücreleri, kemik iliği mononükleer hücrelerinin bir alt grubudur ve kemik iliği aspirasyon materyallerinden izole edilebilirler. Bu

9 hücreler fenotipik özellikleri ve fonksiyonları bakımından heterojen bir hücre grubundan oluştuklarından; kemik, kas, yağ ve diğer bağ dokusu yapılarının rejenerasyonunda rol oynamaktadırlar (55). Kemik iliği stroma hücrelerinin, düşük düzeyde immün yanıt oluşturdukları bildirilmiştir. Ancak, kemik iliğinden elde edilen yüzbin hücreden sadece bir tanesinin kök hücre olduğu belirtilmiştir. Bu nedenle söz konusu hücrelerin in vitro olarak uygun sitokin ya da diğer faktörlerle muamele edilerek hedef hücre sayısının artırılması gerekmektedir. Ayrıca yaşlı bireylerden elde edilen hücrelerin çoğalma ve farklılaşma potansiyellerinde azalma görülebilmektedir (56). 2.2.5. Periost Kaynaklı Hücreler Periost içerisinde yer alan hücreler, gelişim döneminde ve travmalarda kemik dokusunun oluşturulmasında rol almaktadırlar (57). Yapılan in vitro ve in vivo çalışmalarda periosteal hücrelerin ektopik alanlarda kıkırdak ve kemik oluşturabilme kapasitelerinin bulunduğu gösterilmiştir (58,59). Ayrıca periost hücrelerinin Kemik Morfogenetik Proteinler (BMP) ile uyarıldıklarında osteojenik belirteç düzeylerinde artış meydana geldiği bildirilmiştir (58,59). 2.3. Büyüme ve Farklılaşma Faktörleri (Regülatör Sinyaller) Büyüme faktörleri spesifik fonksiyonları yerine getirmek için uygun hedef hücreler üzerinde etkisi olan, hücreler tarafından salgılanan proteinler olarak tanımlanmaktadır (60). Bu faktörler, hücre bölünmesi, matriks sentezi ve doku farklılaşması gibi kritik fonksiyonları etkileyen çok muazzam büyüklükteki bir hücreler arası iletişim ağının parçalarıdır (61). Birçok çalışmada büyüme faktörlerinin kemik kırıklarının iyileşmesinde çok önemli role sahip oldukları belirlenmiştir. Bone morphogenic proteinler (BMP) (kemik morfogenik proteinleri), fibroblast growth factor (FGF) (fibroblast büyüme faktörü), basic fibroblast growth factor (bfgf) (baz fibroblast büyüme faktörü), vascular endothelial growth factor (VEGF) (vasküler endotelyal büyüme faktörü), insulin like growth factor (IGF) (insülin benzeri büyüme faktörü), platelet derived growth factor (PDGF) (trombosit kökenli büyüme faktörü), transforming growth factor

10 beta (TGFß) (transforme edici büyüme faktörü) gibi rejenerasyonu düzenleyen, hücrelerin farklılaşmasını sağlayan osteoindüktif özellikli büyüme ve farklılaşma faktörleri tanımlanmış ve pek çok çalışmada kullanılmıştır. En çok çalışılan büyüme faktörleri sırasıyla osteogenezde ve anjiyogenezde rol oynayan BMP-2 ve VEGF dir (62,63). 2.3.1. BMP-2 Kompleks kemik rejenerasyon fizyolojik sürecini düzenleyen bazı anahtar moleküller tanımlanmıştır ve bazıları kemik tamirini geliştirmesi amacıyla klinik kullanıma da girmiştir (60). Kritik boyuttaki defektlerde yeni kemik oluşumunu indükleyen büyüme faktörleri içerisinde en çok çalışılanı BMP-2 dir (64,65). BMP ler TGF-β protein ailesinin bir alt grubudur. BMP-2 klinik olarak hâlihazırda kullanılmaktadır. İn vivo çalışmalarda da BMP-2 nin dental pulpa kök hücrelerinden ve kemik hücrelerinden gelişen mineralize doku oluşumunu hızlandırdığı gösterilmiştir (66,67). BMP lerin kemik, kıkırdak gibi mineralize dokuların gelişiminin yanı sıra embriyonik ve fötal gelişimde, böbrek ve kalp gibi bazı organların oluşum süreci üzerinde de etkileri mevcuttur (38). BMP-2 lerin kullanımı kemik rejenerasyonu açısından avantajlı olabilir. Hatta kırık tedavilerinin süresini kısaltmak için normal kemik iyileşme hızını artırmak amacıyla kullanılabilirler (68,69). BMP-2 nin tek başına ya da kemik greftleriyle beraber kullanımı giderek yaygınlaşmaktadır (70). Yine de BMP- 2 nin klinik olarak kullanılmasıyla ilgili ektopik kemik oluşumuna sebep olabilmesi gibi güvenlik nedeniyle çeşitli kaygılar devam etmektedir (71). Periodontal açıdan BMP-2 PDL hücrelerinin osteoblastlara diferansiye olmasını ve mineralize doku belirteçlerinin ifadesini artırır (72,73). 2.4. Doku İskelesi (Skaffold) Periodontal doku mühendisliğinde gerekli olan üçüncü faktör de uygun bir taşıyıcı yapıdır. Doku mühendisliği işlemlerinin gerçekleştirilebilmesi için üzerinde hücrelerin toplanıp çoğalabileceği ve yeni doku oluşumunu sağlayabilecek 3 boyutlu bir yapının (doku iskelesi) olması gerekmektedir.

11 Bu iskelelerin, rejenerasyona katkıda bulunabilmesi için çeşitli biyomekanik ve biyolojik özelliklere sahip olması gerekir (74,75). Doku iskelesinin işlevini yerine getirmesi için gereken biyomekanik özellikler: - Çok hücre ekilebilmesi, bu hücrelerin iskele içine göç edebilmeleri, hücre sayısını artırabilmeleri ve yeterli ölçüde beslenebilmeleri için birbiriyle bağlantılı porların olması. - Optimal pöröziteyle yeterli yüzey alanı ve mekanik güce sahip olması - Absorbsiyon kinetikleri, yıkılma özelliği (kemik dokusu için kullanılanların yıkımı, doku rejenerasyonu tamamlanıncaya kadar mekanik gücünü koruması gerektiğinden yavaş olmalıdır) (76). Bu özellikler yanında doku iskelesinde olması gereken biyo-özellikler; - Biyobozunabilme; bu yıkım rejenerasyon hızı ile doğru orantılı olmalı; kemik dokusuna yönelik hazırlanan bir malzeme ise doku bölgesinde mekanik gücünü koruması gerektiğinden aynı şekilde yıkımı yavaş olmalı, - Biyouyumluluk - Dış yüzey istenmeyen dokuları dışlayıcı, iç yüzey istenen dokuların gelişimine yardımcı (conducive) olmalı, - Kolay şekil almalı - Yumuşak doku kollapsına/çökmesine karşı koyabilmek için yeterince rijid olmalı, - İn vitro hücre ataçmanı ve doku maturasyonu için uygun porozite ve por boyutuna sahip olmalı, - Doku iskelesi üzerine ekilen hücrelerin iskele boyunca göç edebilmeleri, çoğalabilmeleri ve yeterli ölçüde beslenebilmeleri için birbiriyle bağlantılı por yapısının ve yüzey alanının olması gerekmektedir (74). Doku mühendisliği işlemleri için bugüne kadar çok çeşitli malzemeler üzerinde çalışılmıştır. Biyobozunabilir özellikteki, sentetik ve doğal

12 maddelerden; pöröz süngerler, mesh ler, fiberler (lifler) ve hidrojeller gibi farklı yapıda ve formda malzemeler doku iskelesi yapımında kullanılmıştır (3). İskele malzemesi olarak doğal ve sentetik polimerler üzerinde çalışılmıştır. Kollajen, kitosan, aljinat ve ipek, doku mühendisliğinde kullanılan doğal polimerlerdendir. Bu malzemelerin kullanılmasındaki sorun mekanik özellikleridir. Üretilmesi daha kolay ve mekanik özellikleri daha iyi olan biyobozunabilir sentetik materyaller doğal polimerlerin alternatifleri olmuştur. Örneğin poliglikolik asit bugüne kadar tıpta rezorbe olabilen süturlarda kullanılmıştır. Ancak bu malzemenin bir dezavantajı da rezorbe olurken asidik biyoürünler açığa çıkarmasıdır (67,77). 2.4.1. Kollajen Kollajen ekstrasellüler matrikste yer alan, hücrelerin üzerine tutunmasını sağlayan doğal bir proteindir. Ancak kollajen tek başına doku iskelesi olarak kullanıldığında vücut tarafından hızlı bir şeklide parçalanır. Daha önce tip 1 kollajen şeritler üzerine nha çöktürülerek nha/kollajen kompozit doku iskelesi üretilmiş ancak mekanik özellikleri vücutta kullanılabilecek kadar iyi bulunmamıştır (78,79). 2.4.2. Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) Sentetik polimerler arasında; Poli (α-hidroksi asitler) özellikle glikolid ve laktid polimerler iskele yapımında biyomateryal olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Genelde poli-glikolidler (PGA) ve -laktid-glikolid kopolimerleri (PLGA) (çabuk yıkılırlar), poli (L-laktid) (PLLA) (çok yavaş yıkılır: 3-6 yıl) günümüzde yönlenilen polimerler olmuştur. Bu yetersiz yıkılım özellikleri nedeniyle son yıllarda laktid-kaprolakton ko-polimerleri (LA-CL) tercih edilmektedir (21). Doğal olarak oluşan materyaller arasında; kollajen, hyaluronik asit kitin, inorganik maddeler arasında; trikalsiyum fosfat hidroksi apatit iskelet yapımında kullanılan diğer materyallerdir (1,74).

13 2.4.3. Hidroksiapatit Hidroksiapatit (HA) dişlerin ve kemiklerin esas komponentini oluşturur. Sinterlenmiş HA kemik doku iskelesi olarak kullanıldığında yüksek biyouyumluluğa sahiptir ve mekanik özellikleri de yeteri kadar iyidir (80). Ancak HA içinde oluşan yeni kemiğin yeniden biçimlendirilmesi (remodeling) için mekanik dayanıklılığını devam ettiremeyebilir (30). Biyouyumlu olmasının nedeni doğal kemiğin mineral fazına kimyasal ve yapısal olarak benzemesi olarak düşünülmüştür (81). En önemli özelliği osteokondüktif olmasıdır. Osteojenik hücrelerle biyoseramiklerin etkileşimi kemik rejenerasyonu için önemlidir. Biyoaktif seramiklerin osteoblastların proliferasyonunu artırdığı gibi farklılaşmasını da artırdığı bilinmektedir (39,40). Biyoaktif seramikler dental ve ortopedik cerrahilerde kemik defektlerini doldurmak için ve metalik implantların yüzeyini kaplamak için kullanılmıştır. Ancak kırılgan olması, şekillendirilmesinin zor olması(30) ve hidroksiapatitin rezorbsiyon süresinin aşırı yavaş olması nedeniyle klinik olarak tek başına kullanımı sınırlı kalmıştır (30). 2.5. Nanoteknoloji Nano terimi, milyarda bir anlamına gelmektedir. Nanometre, 1 metrenin milyarda biri, 1 mikrometrenin ise binde biri büyüklüğünde bir ölçüdür. Aynı zamanda moleküler nanoteknoloji veya moleküler mühendislik olarak da bilinen nanoteknoloji, yapısal özellikleri 0,1-100 nm aralığında olan nanomaddelerin, çeşitli fiziksel veya kimyasal yöntemlerle fonksiyonel nanomalzemeler halinde sentezlenmesidir.(82,83) Bir perspektif olarak, bir hidrojen atomu 0,1-0.2 nm ve küçük bir bakteri 1 µm (1000 nm) civarında boyutlardadır. Madde içerisinde her özellik, kritik bir uzunluk ölçeğine sahiptir ve nanopartiküller (nanoparçacıklar) gibi kritik uzunluktan daha küçük yapı blokları kullanmak yoluyla maddenin (özelliğin) olağan davranışı etkilenir. Örneğin; bir tanecik, büzülerek, görünür bir ışık dalga boyundan (ör. 0.4-0,8 µm) daha küçük bir parça haline gelirse o ışığı dağıtmayacak ve tanecik

14 insan gözü tarafından görülemeyecektir. Bu olay, maddenin optik özellikleri üzerinde dehşetli etkiler ve sonuçlar yaratır (84). Mikroyapıları, nanometre boyutlarında, istenen özellikleri içerecek şekilde inşa edilen (mühendislikle düzenlenen) yeni maddeler, özellikle son 30 yıldır çok popüler olmuştur. Bu nanoyapılı maddeler, geleneksel mikro veya daha büyük ölçekli makro eşlerine göre, artırılmış mekanik, elektriksel, manyetik, kimyasal, optik ve biyolojik özellikler gösterirler. Nanoyapılı malzemeler, geniş özgül yüzey alanı gösterirler ve defektin %50 sinden daha büyük hacim içerirler. Ör. zerre veya yüzeyler arası sınırlar, yer değiştirmeler bu maddelerin kimyasal ve fiziksel özelliklerini güçlü bir şekilde etkiler (85). Maddelerin nano ölçeklerde sentezlenmesi ve kontrol edilmesi, daha önceleri ulaşılamaz olan yeni düzeylerde özellikler sağlar. Nanoyapılı malzemeler toz, eriyik, kaplama veya yığın şeklindeki maddeler halinde olabilirler (84). Bileşenleri, en az bir boyutuyla 100 nm den az olan atom kümeleri, boyutu 100 nm den az olan tanecikler, çapı 100 nm den az olan lifler, kalınlığı 100 nm den az olan filmler, nanoboşluklar ve bunların kombinasyonları olan kompozitleri içeren maddeler nanomalzemelerdir (84). Nanoparçacıklar önemli yüzey, boyut ve kuantum etkilerine sahip olduğundan, nanokompozitler, geleneksel malzemelerden çok daha iyi performans etkilerine sahiptir. Geliştirilmiş ilgili özellikler; artırılmış sertlik, katılık, geliştirilmiş saydamlık, artmış abrazyon, çözücü ve ısıya dayanıklılık ve azaltılmış gaz geçirgenliğini içerir. Nanoparçacıkların bu önemli özellikleri, hem organik hem inorganik maddelerin özelliklerini taşıyan multifonksiyonel nanokompozit filmlerin dizayn edilmesi talebini karşılar ve ışık yayan diotlar, çizgisel olmayan optik aygıtlar, rezistörler, sensörler, elektrikli kondüktif filmler ve gaz ayrıştıran membranların geliştirilmesi için çok geniş imkanlar sağlar (85). Nano yapılı malzemelerin bir diğer önemli unsuru self-assembly özelliğinin gelişimidir. Bu özellik; bileşenlerin kalıp ve yapılara, insan müdahalesi olmadan otonom organizasyonudur. Tüm süreç, koşulların doğru düzenlenmesiyle yönetilebilir. Self-assembly oluşturmak için kullanılan yönlendirici kuvvetler; pozitif ve negatif yükler arasındaki elektrostatik çekim

(86). Plasma arcing (gaz elektrolizi) 15 etkileşimleri, hidrofobik etkileşimler, yük transfer etkileşimleri, H-bağları, koordinasyon bağları ve kovalent bağlarıdır (41). 2.5.1. Nanomalzemelerin Üretim Yöntemleri Bu malzemeler çok çeşitli fiziksel veya kimyasal yöntemlerle üretilirler: Ball milling (Bilye kesimi) Mekanik kırma yöntemidir. İnce tozlar üretilir. Maddeyi nanokristallere indirgeyerek kırar ve çeşitli yeni tipte maddeler sentezlemek için kullanılır Plazma gazının elektronlarını bırakarak iyonize olma esasına dayanır. Yeni katı yapılar oluşturmaktan çok, yüzeyler üzerinde birikintiler oluşturmak için kullanılır (implantlar gibi) (86,87). Chemical vapour deposition (Kimyasal gaz-buhar tortusu). Nanoparçacıklı maddenin gaz aşamasında çökeltilmesidir. İlgili madde ionize haldedir. İlk biriken atom veya molekül tabalakarı yüzeyle etkileşebilir ve maddenin, üzerinde büyüdüğü bir şablon gibi davranabilir (86). Pulsed laser deposition (Aralıklı lazer uygulaması). Külçelenmiş/preslenmiş halde, laser demetiyle bombardımana uğratılan bir kaplama maddesini içinde barındıran bir vakum chamber ve içinde katı bir diskin döndüğü ve bir solüsyon bulunan bir blender vardır. Disk aralıklı laser akımına uğratılır ve yüzeyinde sıcak noktalar ve nanotanecikler oluşur (85). Elektrodeposizyon. Yüksek kontrollü bir yolla bir yüzey üzerine tek bir molekül tabakası ile bir kaplama yapılır. Yayılmış/düz yüzey nanomalzemeler yapılır. Membranların içine stratejik olarak nanoboşluklar yerleştirilir. Polimer membranların içindeki nano boyutlu boşlukların değişik kombinasyonlardaki

(86). Sol-gel. Sürekli likid fazda çözünmemiş süspansiyon ve jelin metal 16 metallerle doldurulması değişik kullanımları olan nanokompozitleri oluşturur iyonlarından oluşturulmasıdır (86). Presipitasyon. Bir solüsyondan katı bir maddenin çökeltilmesi nanotaneciklerin üretiminde sık kullanılan bir yöntemdir. Çeşitli elementlerin tuzları istenen oranlarda alınarak su veya uygun çözücülerde çözülerek atomik ölçekte bir karışım elde edilir (88). 2.5.2. Nanomateryel Yapıları Küresel nanoparçacıklar Polimerik/inorganik nanokompozitler Nüve-kabuk (core-shell) maddeler İnorganik silika İnorganik hibrid küreler Silika nanoparçacık SiO2-polimer multitabaka Polystyrene lateks parçacıklar Hollow sphere ler TiO2 ZrO2(41) Nüve-kabuk (core-shell) nanoyapılar Kalsiyum hidroksi apatit-polialilaminhidroklorid/polistyrenesulfonat polielektrolit kapsülleri gibi yapılar elde edilir. Bu kapsül kabuklu yapıların avantajları; Nanoparçacık morfolojisi ve geniş yüzey alanına bağlı yüksek katalitik aktivite Agregasyona karşı yüksek stabilite Nanomalzemeyi bozulmaktan koruyan mikroreaktör kabuk Çok basamaklı sentez ve hyerarşik olarak yapılanmış kompozit nanomalzeme sağlama imkânı(41)

17 Polivinil alkol/silika kompozitleri Kat kat self-assembly yöntemi polivinil alkol/ silikaya uygulanarak yeni bir nanokompozit elde edilmiştir (41). Nanoçubuk/nanofiber/nanotüpler Biyomedikal ve biyoteknolojik uygulamalarda ilaç verimi, enzim immobilizasyonu, DNA transferi gibi işlemlerde kullanılır. Küresel nanotaneciklerin yapılması diğer şekillerin yapılmasından daha kolay olduğundan bu işlemlerde tipik olarak kullanılır. Çapı 100 nanometreden daha az olan nanolifler, nanoçubuklar, nanotüpler, nanolevhalar, kuantum teller, asıl hedef periodontal tedavi olmak üzere çeşitli uygulamalarda kullanılan diğer majör nanomateryallerdir (41). 2.5.3. Maksillofasiyal Cerrahide Nanomalzemeler Biyoseramikler: İnert (durgun) Biyoaktif Rezorbe olmayan Rezorbe olabilen(89) İnert Alümina (Al2O3) Titania (TiO2) Zirkonia (ZrO2) Karbonlar (C) (ortopedi ve anjioloji alanlarında) (89). Biyoaktif Rezorbe olmayan Kalsiyum fosfat seramikler (CPC) Hidroksiapatit (Ti dental implantlarda yüzey kaplama, periodontal tedavi/doku mühendisliği (skafold), alveoler kret artırımı, sinüs artırımı, maksillofasiyal cerrahi) Biyoaktif camlar (diş soketlerinin immediat doldurulması) (89)

18 Rezorbe olabilen ß-trikalsiyum fosfat Mercan (coral) (deniz omurgasızları, ana bileşeni CaCO3) Kalsiyum sülfat (periodontal defektler, kemik kontur artırımı, periodontal rejenerasyon, kemik implantları, ortopedi, kemik defekt düzeltmeleri, travmatize kemik tamiri, hastalıklı kemik replasmanı Kalsiyum titanyum oksit (CaTiO3) (implant yüzey kaplama)(89) 2.5.4. Kemik Doku Mühendisliğinde Nanomalzemeler Hidroksiapatit (HA) Kompozitler HA/ kollagen kompozit HA/ kollagen/alginat kompozit HA/kollagen/polilaktik asit (PLA) kompozit Florapatit/ kollagen kompozit CPC/SiO2 kompozit ZrO2/ Al2O3 kompozit Polilaktik glikolik asit (PLGA)/TiO2 kompozit Nanoseramik/polimer kompozitler PLA veya polimetil metakrilat (PMMA)/ Al2O3, TiO2, HA kompozitler Nanofaz karbon ( C) PLA/C nanotüpler C nanolifler PLGA/C lifler C/ polikarbonat üretan nano lif kompozitler(89) 2.5.5. Nanoteknoloji ve Doku Mühendisliği Hücre çalışmalarında nanoteknolojinin çeşitli avantajları vardır. Dokulardaki fibriler proteinler (kollajen, elastin) nanofibriler boyuttadır (50-500nm). Yani nanomalzemeler hücrelerin doğal ortamına uygundur. Nano

19 ölçek malzemelerde yüzey alanı çok geniştir. Özellikle büyüme faktörü, ilaç gibi aktif maddeler çok daha yoğun bir şekilde malzemeye immobilize edilebilir. Bütün reaksiyonlar moleküler seviyede gerçekleşmektedir. Nano ölçekli yapılar ile daha reaktif malzemeler yapmak mümkündür (41). Çeşitli dokuların rejenerasyonu amacıyla hücrelerin, gelişimine daha uygun mikroçevreler oluşturması açısından biyomateryal ve doku rejenerasyonu alanlarında çeşitli gelişmeler olmaktadır. Doku iskelelerinin üretilmesi amacıyla çeşitli doğal ve sentetik materyaller üretilmektedir. Polimer doku iskelelerin mekanik stabilitesi, biyouyumluluğu, biyobozunabilirliği kontrol edilebilmektedir. Bu nedenle son zamanlarda polimer iskelelerin üretimi artmaktadır. Bu özellikler polimer doku iskelelerin ekstrasellüler matriksteki doğal hücre ortamını taklit edebilmesini sağlar. Ekstrasellüler matriks bütün dokularda çeşitli fonksiyonları yerine getirmesi amacıyla hücreleri destekleyen nanofibriler bir protein ağıdır ve bu ortam nanofibriler doku iskeleleriyle taklit edilebilir (90). Nanofibriler doku iskeleleri hücrelerin adezyon, proliferasyon, diferansiasyon ve yeni doku oluşumu gibi özelliklerini artırma amacıyla üretilebilirler (91). Hücrelerin doku iskelesi içine entegre olması amacıyla birbiriyle ilişkili porları da olmalıdır. Hatta nanofibriler doku iskeleleri doku rejenerasyonunu yönlendirmesi amacıyla büyüme faktörü salımı da yapabilirler (92). Üç boyutlu pöröz nanofibriler doku iskeleleri çeşitli kök hücreleri desteklemesi ve yumuşak veya sert doku rejenerasyonu amacıyla kullanılmışlardır. Son zamanlarda kemik doku mühendisliğinde çok sayıda in vitro çalışmada, sentetik veya doğal olarak üretilen polimer nanofibriler doku iskelerinin kondrositlerin (93,94), osteoblastlaın (94) ve mezenşimal kök hücrelerinin (94,95) canlılığını ve fonksiyonel özelliklerini destekleyecek nitelikte olduğu gösterilmiştir. Nanofibriler doku iskeleleri doğal ekstrasellüler matriksi taklit etmesi amacıyla temel olarak 3 yöntemle üretilirler: 1-Elektrospin 2-Self assembly 3- Faz seperasyonu. Doğal ekstrasellüler matriks; kollajen, fibronektin, vitronektin gibi nano ölçekte çeşitli proteinler içerir. Hücre-ekstrasellüler matriks arası etkileşim