INFINITI FMF TESTİ Kullanim Talimatı

INFINITI FMF TESTİ Kullanim Talimatı In Vitro Diagnostik Kullanım için SADECE İHRACAT İÇİN Üretim Yeri: AutoGenomics, Inc., 2980 Scott Street, Vista, CA USA 92081 Yetkili AB temsilci : BÜHLMANN Laboratories AG Baselstrasse 55 CH-4124, Schönenbuch, Switzerland 1 of 10

KULLANIM AMACI INFINITI FMF Testi MEFV geninde allelik varyantlarının tespiti ve tanımlanması için in vitro teşhis testidir. INFINITI FMF Testi tam kan örneklerinden bu mutasyonların tespit etmek için tasarlanmıştır. INFINITI FMF Testi doktorun klinik bulgularına dayalı olarak klink laboratuvarlar tarafından kullanılmak üzere oluşturulan kalitatif bir testtir. TEMEL BİLGİLER Ailesel Akdeniz Ateşi (FMF) karın, göğüs veya eklemlerde ağrı ve erizipel benzeri eritem ile birlikte ateş kısa, tekrarlayan ataklar ile karakterize otozomal resesif geçişli, inflamatuar bir hastalıktır.en ciddi komplikasyonu son dönem böbrek yetmezliğine yol açan, ilerleyici amiloidozdur. FMF ağırlıklı olarak Türkler, Araplar, Ermeniler ve Sefarad Yahudileri, arasında 1:5 oranında bildirilen n yüksek taşıyıcılık oranına sahiptir. FMF Akdeniz bölge genelinde, düşük frekanslarda, gözlenmiştir. FMF marenostrin / pirin-kodlayan MEFV geninde oluşan mutasyonları sonucu oluşur. Beş ana mutasyon, V726, M694V, M694I, M680I ve E148Q, FMF olgularının % 74 ünü oluşturur. (Ermeniler, Araplar, Yahudiler ve Türkler). MEFV gen mutasyonları çeşitli kombinasyonları hafif ve ciddi genotipler olarak tanımlanabilir. Çünkü spesifik olmayan klinik semptomlardan dolayı, moleküler genetik analiz FMF için anlamlı erken ve doğru tanı geliştirir ve kolşisin ile etkilenen bireylerin yaşam boyu profilaktik tedaviye başlamasına olanak verir. TEST PRENSIBI /TESTE BAKIŞ INFINITI FMF Testi MEFV geninde allel türevlerini algılamak ve tanımlamak için tasarlanmıştır.infiniti FMF Testi tam kan örneklerinde bu mutasyonları tespit etmek için tasarlanmıştır. Gen Polimorfizm MEFV E148Q, R202Q, P369S, F479L, M680I (G>C), M680I (G>A), I692del, M694V, M694I, K695R, V726A, A744S, R761H (a) Saflaştırılmış DNA ın PCR amplifikasyonu (b) Analit spesifik primer uzantı (ASPE) kullanarak Floresans işaretleme (c) Yıkamanın ardından bir microarray için ASPE primerlerinin hibridizasyonu (d) Mikroarray ın taranması (e) Signal ile tespit ve analiz (b) den (e) e kadar adımlar INFINITI Analizörü ile otomatik yapılır. 2 of 10

Testin şematik bir özeti aşağıdaki gibidir: CIHAZ TANIMI The INFINITI FMF Assay utilizes AutoGenomics proprietary film-based microarray technology combined with process automation, reagent management and software technology for multiplex detection of the allelic variants in the MEFV gene. INFINITI FMF Testi reaktif yönetimi ve proses otomasyonu ile birleşik AutoGenomics in patentli film tabanlı mikroarray teknolojisini kullanarak MEFV Geni alalik varyantlarını mültipleks tanısını yapar.. INFINITI MTHFR Test, BioFilmChip Mikroarray, Intellipac Reaktif Modülü ve Qmatic İşletim Yazılımı ile INFINITI Analizörden oluşur BioFilmChip Microarray DNA analizi için tasarlanmış özel çok katmanlı bileşenler ile kaplı bir polyester filmi içerir. Katmanlar test performansını artırmak için çok yönlü bir yüzey sağlamak için tasarlanmıştır. Mikroarray'ler spesifik testler için tasarlanmıştır. INFINITI FMF Testi capture probe ile kaplı film teknolojisini kullanır. Bir mikroaray ile 2 test çalışılabilir. Bir magazin içerisinde 12 mikroarray bulunur. Bir iletişim bağlantısı olarak davranan Intellipac Reagent Modül test reaktifleri kısmında dört rezervuar içerir ve entegre bir bellek çipine sahiptir. Lot numarası, son kullanım tarihi ve kullanılan hacim gibi reaktif bilgisi çip hafızasında arşivlenir ve iş listesinde görünür (test raporu). Intellipac Reagent Modül 48 testlik reaktif sağlar. PCR Karışım assay of PCR amplifikasyonu adımı için gerekli reaktifler oluşur.pcr Mix Her kutu PCR 4 x 475μl şişeleri sağlar. The INFINITI Analyzer automates the INFINITI FMF Assay and integrates all the discrete processes of sample (PCR amplification product) handling, reagent management, hybridization, detection, and results analysis. The assays are processed automatically and read by the built-in confocal microscope. Results are analyzed and presented as MEFV genotype calls, indicating each allelic genotype detected as W (Wild type), H (Heterozygous), or M (Mutant). INFINITI Analizör, klinik örnekten gelen çoklu sinyalleri ölçmek ve sınıflandırmayı sağlayacak klinik olarak çoklu sistemler için kullanılan bir cihazdır. INFINITI Analizörü BioFilmChip mikroarrayler için hybridize olmuş işaretli DNA hedefin floresan sinyallerini ölçmek için tasarlanmıştır. INFINITI Analizör FMF testini otomatikleştirir ve örneğin işlenmesi (PCR amplikon), reaktif yönetimi, hibridizasyon, tespit ve sonuç analizinin hepsini ayrı proseslerde birleştirir. Testler otomatik olarak çalışır ve spotlar yerleşik konfokal mikroskop ile okunur. Sonuçlar analiz edilir ve sayısal ve grafiksel bir şekilde görünür. Sonuçlar W (Yabani tip), H (Heterozigot) veya M (Mutant) olarak tespit Her alel genotipi gösteren, MEFV genotip aramaları olarak analiz edilerek sunulmuştur. 3 of 10

INFINITI Analyzer nasıl kullanılacağı hakkında talimatlar INFINITI Analyzer Operatör Kılavuzu verilmektedir. The INFINITI Analizör CE-İşaretlidir. UYARILAR VE ÖNLEMLER Gereksinimler In vitro diagnostik kullanım için. Eğitimli laboratuar personeli tarafından kullanılmalıdır. Bu test, EDTA içinde toplanan tam kan ile sadece kullanılacaktır. Kan örneklerini dondurma/çözündürmeden kaçının. Örnekler en kısa sürede test edilmelidir. Bu prosedür ile Heparin kullanmayın; Heparin PCR etkileyebilir. Çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için, numune hazırlama, PCR kurmak ve PCR ürün analizi CLSI gibi onaylanan talimatlara göre yapılmalıdır(molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases: Approved Guideline). Tüm hasta numuneleri potansiyel tehlikelidir ve insan kaynaklı materyaller çok dikkatli alınmalıdır. Hiçbir test yöntemi HCV, HIV veya diğer bulaşıcı ajanların bulunmadığına dair tam bir güvence vermez. CLSI talimatlarını takip edin (Molecular Diagnostics Methods for Infectious Diseases; Approved Guidelines; MM3-A). Farklı lotlardan reaktifleri karıştırmayın/havuz yapmayın. Son kullanım tarihi geçmiş kit veya reaktifleri kullanmayın. Ürün etiketine yazan koşullara göre reaktifleri ve kitleri saklayın Laboratuar İşlemler Laboratuar kullanımı için normal önlemleri izleyin. Ayrı kaplarda veya farklı lotlardaki reaktifleri karıştırmayın. Güvenli laboratuar prosedürlerini izleyin: ağız ile pipetleme yapmayın; koruyucu giysiler (örneğin, tek kullanımlık eldiven, laboratuar önlüğü gibi) ve koruyucu gözlük takın; yemeyin, içmeyin veya laboratuarda çalışma alanlarında sigara içmeyin; numuneler ve reaktiflere dokunduktan sonar iyice ellerinizi yıkayın. Atıkların İşlenmesi Bulunduğu ülkeye, federal, eyalet ve yerel yönetmeliklere göre kullanılmayan reaktifleri, örnekleri ve atıkları imha edin. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) AutoGenomics Müşteri Hizmetleri tarafından istek üzerine gönderilebilir. Örnek Hazırlama Kullanılan DNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen prospektüste güvenlik talimatlarına bakın. PCR ürünü mikroarray üzerine yüklemeden önce saklanamaz. Hemen kullanın. INFINITI Analizörü Cihazı kullanmadan önce INFINTI Analizör Operatör Kılavuzunu okuyun. "Notlar" a özellikle dikkat edin. Operatör Manuelinde Güvenlik Uyarını ve Dikkat edilmesi gereken şeyleri izleyin. Cihazı kurarken Kurulum Gereksinimleri bölümüne bakınız. Cihaz çalışırken hatalar karşılaşıldığında Hatalar Bölümüne bakın. Karşılaşılan sorunları olduğunda Yardım Bölümüne bakın. 4 of 10

SAKLAMA/STABILITE BioFilmChip Microarray: Intellipac Reaktifi: Amplifikasyon Mix: 12 ay Oda Sıcaklığında (15 C ila 30 C) 12 ay Buzdolabı (2 C ila 8 C) Not: Açıldıktan 30 gün sonra Intellipac kullanmayın. 18 ay Dondurucu (-30 C ila -15 C) SAĞLANAN MATERYALLER (HER PAKET 96 TESTLİKTİR) Katalog No 01-1120-02 INFINITI FMF BioFilmChip Microarray Magazine Katalog No 01-2120-02 INFINITI FMF Intellipac Reagent Module Her modül için 48 tess 2 x 1.1 ml ASPE Master Mix içerir: dntps Labeled-dCTP Allele Spesifik Primerler Extension Reaksiyon Bufer Katalog No 01-3120-02 INFINITI FMF Amplifikasyon Mix 4 x 475µl PCR reaksiyon master mix içeren vial içerisinde dntps PCR Primer Mix MgCl 2 PCR Reaction Buffer GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN REAKTİFLER DNA Ekstraksiyon Kitleri - INFINITI FMF Testte yeterli saflığa sahip (A 260 /A 280 1.60) kandan izole edilen genomik DNA kullanılarak FMF mutasyonları tespit edebilir. Bu özellikleri sağlayacak herhangi bir DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılabilir. INFINITI FMF Test birçok ticari test kitleri ile test edilmiştir ve kullanıcılar daha fazla bilgi için AutoGenomics firması ile irtibata geçebilirsiniz. Titanium Taq DNA Polymerase (Clontech, Catalog No: 639209 ) Buffer Solution BF1 (AutoGenomics, Catalog No. 12-0020-00) Buffer Solution BF2 (AutoGenomics, Catalog No. 12-0030-00) Distile su (DNAse and RNAse free) EKİPMANLAR Aşağıdaki ekipman gereklidir fakat test reaktifleri ile birlikte sağlanmamaktadır. AutoGenomics Ürün Kodu 10-0010-99 INFINITI Analizör AutoGenomics Ürün Kodu 11-0020-00 INFINITI Atık treyleri AutoGenomics Ürün Kodu 11-0030-00 INFINITI 24 kuyulu pleyt plate AutoGenomics Ürün Kodu 11-0050-00 INFINITI Temp Cycle Plate AutoGenomics Ürün Kodu 11-0060-00 INFINITI Atık trey / Stir Bars AutoGenomics Ürün Kodu 11-0080-00 INFINITI Pipe uçları 8-kuyucuk Düz Strip Kap (Genesee Scientific, Catalog No. 22-623) Pipetler Mini Santifüj Microfuge Tup Rak Thermocycler Vortex 1.5 ml Microcentrifuge Tup 5 of 10

TAVSİYE EDİLEN DNA KONTROLLERİ Bilinen pozitif kontrol (heterozigot ve / veya homozigot örnekleri) her teste dahil edilmesi önerilir. Ayrıca, negatif kontrol (yani, vahşi tip numune) ve bir şablon kontrol yok (Boş - sadece Amp karışımını içeren bir iyi) ayrıca her test çalışması dahil edilmelidir. TEST PROSEDÜRÜ DNA Ekstraksiyonu Kullanılan DNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen talimatları izleyin. PCR Reaksiyonu Not: Titanyum Taq DNA polimeraz buz üstünde tutunuz Reaktifler tamamen buz üzerinde çözünüz. Taze hazırlanmış% 0.5 sodyum hipoklorit ile pipet ve tüm çalışma yüzeyleri dezenfekte ediniz (çamaşır suyu) deiyonize veya distile su Örnekleri ve kontroller işlerken Filtre ipuçları ve eldiven kullanılmalıdır. 1. Amp miksini buz üzerinde çözünüz, kısa santrifüj yapınız, 2-5 saniye vorteksleyip kısa santrifüj yapınız. 2. PCR master miks hazırlayınız. Reaktif Örnek başına hacim Amp miks 17.6 µl Titanium Taq polymerase 0.4 µl Total PCR Master Miks hacmi 18.0 µl Not: Reaksiyonların sayısını göre gerekli olan her bir reaktifin miktarını hesaplayın. Örneklerin sayısı her zaman iki katları olarak çalıştırılmalıdır. Örnekler ardışık sırayla yer almalıdır.. 3. PCR Master miksini yavaşça vorteksleyin ve 18 µl master miksi e 24-well plate kuyucuklarına dağıtınız. 4. 2 µl örnek DNA (30 ng/µl) her kuyucuk içerisinde ekleyiniz. PCR master miks 18.0 µl Örnek DNA 2.0 µl Amplifikasyon reaksiyon total hacmi 20.0 µl 5. 24-kuyucuklu pleyti, termal cycler içerisine koyarak aşağıdaki programı uygulayınız. 6 of 10

Adım No. Sıcaklık C Zaman Döngü No 1 94 3 dak. 1 2 10x 3 94 65-60 (-0.5 C/ cycle) 72 94 60 72 4 4 tutunuz 1 Not: Her döngü sonrasında sıcaklık döngü başına 0.5 C iner. Eppendorf Mastercycler EP (aluminyum blok) kullanıldığında ramp rate kurulumu %100 olduğunda (Isıtma 4 C/sn, soğutma 3 C/sn. ) total döngü için geçen zaman 1 saat 40 dak. dır. Diğer Termal Cycler lar kullanıldığında eş zamanı elde edecek şekilde ramp ayarı yapınız.. 30x Örnek Yükleme - INFINITI Analizör Lütfen INFINITI Analizör Kullanıcı Manueline bakın (Kısım kodu: EM 34000) Numuneler iki katları ve ardışık sırayla çalıştırılması gerekir. Plate içerisinde kuyucuk atlamayınız. 24-wel pleyti INFINITI Analizöre yükleyiniz. Test spesifik magazine, Intellipack pipet uçları ve yıkama solusüsyonlarını cihaza yükleyiniz. Tampon Çözüm 1 ve 2 INFINITI şişe tutucular içerisine konulmalıdır. Solüsyon 1 soldaki tutucuya, Solüsyon2 sağdaki tutucuya konur INFINITI Analizörünün çalışması Lütfen INFINITI Analizör Kullanıcı Manueline bakın (Kısım kodu: EM 34000) KALİTE KONTROL Kullanılan termal döngü düzenli laboratuar düzenleyici ve QC gereksinimlerine göre, bakımı ve harici sıcaklık standardı ile kalibre edilmelidir. AutoGenomics 'özelliklerine göre INFINITI Analyzer kalibrasyonunu koruyun. LIMITLER INFINITI FMF Testinden elde edilen sonuçlar sadece genel klinik tanı bağlamında yorumlanmalıdır. AutoGenomics alınan herhangi bir klinik karardan sorumlu değildir. 7 of 10

SONUÇLARIN YORUMLANMASI Sonuçlar, MEFV genotipleri analiz edilerek sunulmuştur. W (Yabani tip), H (Heterozigot) veya M (Mutant) olarak tespit edilen ve her alel genotipini gösterir şekilde analiz edilir. Örnek olarak: E148Q için bir alelik genotip olarak kullanılan W, referans alel için pozitif mutant alel için negative olarak tespit edildiğini gösterir. M680I için bir alelik genotip olarak kullanılan H (G/C), yabanıl tip için e (G) ne mutant tip için (C) alelleri her iki analitinde pozitif sonuç verdiğini gösterir. M680I için bir alelik genotip olarak kullanılan M (C), mutant için (C) nin pozitif olduğunu yabanıl tip için kullanılan (G) nin negative tespit edildiğini gösterir. M680I için bir alelik genotip olarak kullanılan M (C/A), her iki mutant alelin (C ve A) nın pozitif tespit edildiğini gösterir. Test tamamlanmaz ve hiçbir genotip belirlemesi yapılamaz ise (tip yok), çalışma tekrarı gerekecektir. Rapor mesajında neden genotipleme yapılamadığını gösterir hatalar test sırasında meydana gelirse, "Test Error" iletisi (örneğin, "düşük DNA") gösterilir. Bir Error Log dosyası sorunu tanımlamak için oluşturulur. Hata mesajı / probleme bağlı olarak, testin tekrar edilmesi gerekebilir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik Spesifite Özgüllük ile ilgili çalışmalar analiz gelişimi sırasında yapılmıştır. Tayininde gerekli özgüllük üç seviyesi vardır PCR primerleri ASP thedef bağlanma bölgesi ASP çip bağlanma bölgesi Spesifite ile ilgili olarak yapılan çalışmalar testi geliştirme sırasında yapılmıştır. PCR primer spesifitesi bir jel üzerinde amplikon boyutuna göre belirlendi ve amplikon sıralaması yapıldı. ASP primer spesifisitesi bilinen genomik örnekleri kullanılarak test tarafından gönderilen doğru genotipler ile tespit edildi. Prob un yakalama spesifitesi farklı oligoların hibridizasyonu ile tespit edilir ve bilinen noktaya doğru oligo hibridleşmesini gösterir. Deteksiyon Limiti(LoD) Deteksiyon limit çalıması INFINITI FMF testninin optimum deteksiyon aralıklarını belirlemek için yapılmıştır. 2 bilinen DNA örneğio 60ng, 30ng ve 15ng a dilüe edildi. Bu test başına 120, 60 ve 30ng a denk gelir. Hedef olarak önerilen başlangıç DNA miktarı test başına 60ng dır. Her dilüsyonun Sekiz (8) tekrarı test edildi. Bir örnek Het R202Q, diğer örnek Mut E148Q/Het R202Q. 48 toplam test çalışıldı. 47 Doğru sonuç verdi. Bir test (120ng başlangıç miktar) operator hatası yüzünden tamlanmadı. error. Doğruluk oranı 97.9% idi. Bu çalışma optimum başlangıç DNA miktarının INFINITI FMF testi için 30-120ng arasında olduğunu gösterdi. 8 of 10

Tekrarlanabilirlik Bu çalışma INFINITI FMF Testi lotlar arası tekrarlanabilirliği göstermek için yapıldı. 3 farklı lot reaktifç çok çalışma sırasında değerlendirildi. 3 bilinen DNA örneği kullanıldı. Her örnek için 8 tekrarlı çalışma yapıldı. Her lot total 72 test için değerlendirildi. Test edilen örnekler için bulunan sonuçlar (genotipler ile ) % 100 uyumlu ve tekrarlanabilir sonuçlar Verdi. Aşağıdaki DNA lar tekrarlanabilirlik çalışması sırasında kullanıldı. Lot 1 2 3 Örnek Örnek Genotip Tekrar sayısı 1 R202Q Het 8 2 E148Q Mut R202Q Het 8 3 Wild Type 8 1 R202Q Het 8 2 E148Q Mut R202Q Het 8 3 Wild Type 8 1 R202Q Het 8 2 E148Q Mut R202Q Het 8 3 Wild Type 8 Örnek Taşıma ( Carry-over) Örnek bulaşma çalışması 3 bilinen DNA örneği kullanılarak ( Coriell örnekleri) örnek (R202Q Het; E148Q Mut/R202Q Het; Wild Type). Örnekler değişik konsantrasyonlarında çalışıldı. Sonuçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir. Sonuçlar örnekler arası blaşma olmadığını göstermiştir. Potansiyel Uyuşturucu / Kimyasal etkileşimi Madde etkileşimi çalışmasıtam kan ile yapılmış, aşağıdaki konsantrasyonlarda herhangi bir etkileşimi olmadığını göstermiştir.. Madde Bilirubin (conjugated) Bilirubin (unconjugated) Triglycerides Human albumin Konsantrasyon 60mg/dl 60mg/dl 3000mg/dl 6g/dl Hiçbir çalışma Oral antikoagülan ilaçlar ile yapılmamıştır. Bu nedenle hiçbir hak iddia edilemez.. 9 of 10

Klinik Çallışmalar Karşılaştırma Metodu Klinik değerlendirme çalışmalarında INFINITI FMF Testi doğrulamak için üç klinik laboratuarlarda yapıldı. Tüm kan örnekleri INFINITI FMF Testi ve sonuçları kullanılarak test edildi sekans sonuçlarıla elde edilen sonuçlar karşılaştırıldı. Klinik çalışmalarda kullanılan numunelerin toplam sayısının 141 örnekleri idi. INFINITI FMF Test laboratuvarları tarafından ilk sıralama dayalı çelişkili olan örnekleri tekrarlandı Tekrar sekansı çelişkili örnekleri çözmek için yapıldı. Sonuçta ; Sekans ile karşılaştırıldığında 91.5%% (129/141) aynı sonuç, 7.8% yanlış sonuç, ortaya çıktı. s one (0.7%) herhangi bir sonuç alınamadı. REFERANSLAR 1. Eisenberg S et al "Diagnosis of Familial Mediterranean Fever by a Molecular Genetics Method" Ann Intern Med. 1998;129:539-542 2. Grateau G et al "Clinical versus genetic diagnosis of familial Mediterranean fever" Q J Med 2000; 93:223-229 3. Touitou I. "The spectrum of Familial Mediterranean Fever (FMF) mutations" European Journal of Human Genetics (2001) 9, 473-483 4. Touitou I. "Familial Mediterranean fever (FMF)" Orphanet encyclopedia, May 2003 5. Oberkanins A, et al " Genetic Testing for Familial Mediterranean Fever in Austria by Means of Reverse-Hybridization Teststrips" DOI: 10.1373/clinchem, 2003.021683 6. Aldea A et al "The West Side Story: MEFV Haplotype in Spanish FMF Patients and Controls, and Evidence of High LD and a recombination 'Hot-Sopt' at the MEFV Locus" Mutation in brief # 700 (2004) 7. Rossou E et al "Multiplex Molecular Diagnosis of MEFV Mutations in Patients with Familial Mediterranean Fever by Light-Cycler Real-Time PCR" Clinical Chemistry 51, No.9, 2005 8. Lidar M, Livneh A. "Familial Mediterranean fever: clinical molecular and management advancements" The Journal of Medicine October 2007, vol. 65, No. 9: 318-324 9. Yepiskoposyan L, Harutyunyan A. "Population genetics of familial Mediterranean fever: a review" European Journal of Human Genetics (2007) 15, 911-916 10. Ozturk A et al "Is MEFV Gene Arg202Gln (605 G>A) a Disease-Causing Mutation?" Turk J Med Sci 2008; 38 (3): 2050298 11. Gunel-Ozcan A et al "The spectrum of FMF mutations and genotypes in the referrals to molecular genetic laboratory at Kirikkale University in Turkey" Mol Bio Rep (2009) 36:757-760 10 of 10