INFINITI CFTR-31 Testi Kullanım Talimatı

Transkript

1 INFINITI CFTR-31 Testi Kullanım Talimatı In Vıtro Diagnostik Kullanım İçin SADECE İHRACAT İÇİN Üreti Yeri: AutoGenomics, Inc., 2980 Scott Street, Vista, CA USA Yetkili AB Temsilcisi: BÜHLMANN Laboratories AG Baselstrasse 55 CH-4124, Schönenbuch, Switzerland 1 of 9

2 KULLANIM AMACI INFINITI CFTR-31 testi, insan periferal tam kanından izole edilen genomik DNA da kistik fibrozis transmembran düzenleyici (CFTR)geninin eş zamanlı tesbit ve tanımlanmasında kullanılan in vitro diagnostik bir metottur. INFINITI CFTR-31 testi yetkili hekimin reçetesi üzerine klinik laboratuvarlarda çalışılan kalitatif bir testtir. Mevcut klinik ve laboratuvar bilgileri ile birlikte, INFINITI CFTR-31 Testi üreme çağındaki yetişkinler için kistik fibrozis taşıyıcılığı taramasında kullanılmak üzere ve yenidoğanda kistik fibrozis taramasına yardımcı olarak tasarlanmıştır ve aynı zamanda çocuklar ve yeni doğanda kistik fibrozis tanısını onaylamak için kabul edilmiş diagnostik bir testtir. INFINITI CFTR-31 Testi fetal tanı veya pre-implantasyon testlerinde kullanım için uygun değildir. TEMEL BİLGİLER Kistik fibrozis (KF), otozomal resesif geçişli bir hastalık olup, klor kanalı / regülatörü (kistik fibrozis transmembran regülatör veya CFTR) ile ilişkilendirilen mutasyonlar ile ortak bir kalıtsal bozukluktur. Etkilenen çocuklar mekonyum ileus ile doğmuş olabilir veya bebeklik döneminde yetersiz beslenme ve pnömoniden mustarip olabilirler. CFTR geninde 'den fazla mutasyon bulunmuştur, ancak bu mutasyonların çoğu çok nadirdir. En sık görülen mutasyon CFTR proteinin 508 pozisyonunda fenilalan eksikliğidir ve Avrupa Kafkasyalılarının yaklaşık% 70i CFTR'nin bu allelline sahiptir. Etkilenen Kafkasyalılar yaklaşık% 50'sinde bu gen mutasyonunun iki kopyası vardır. Kafkasyalılar, Afrika kökenli Amerikalılar ve Asyalılar'da tekrar oranı yaklaşık olarak sırasıyla 1:2,500, 1:15,000 ve 1:30,000'dır. (1) TEST PRENSİBİ /TESTE BAKIŞ INFINITI CFTR-31 testi, aşağıdaki CFTR gen mutasyonlarını tespit etmek için tasarlanmıştır; G85E DelF delC R117H G>A kbC>T I148T G542X R1162X R334W G551D W1282X R347P R553X N1303K G>T R560T IVS8-5T/7T/9T G>T G>A I506V A455E 2184delA I507V 1078delT G>A F508C DelI G>A INFINITI CFTR-31 Test protokolü 5 temel proses üzerine kuruludur: (a) İnsan kanından DNA izolasyonu (b) Saflaştırılmış DNA ın PCR amplifikasyonu (c) Analit spesifik primer ekstansiyon (ASPE) kullanarak Floresans işaretleme (d) Yıkamanın ardından bir microarray için ASPE primerlerinin hibridizasyonu (e) Sinyal tespit ve analizi (c) den (e) e kadar basamaklar CE onaylı INFINITI Analizörü ile otomatik yapılmaktadır. Testin şematik özeti aşağıdadır; 2 of 9

3 METOT TANIMI INFINITI CFTR-31 testi, insanda EDTA lı tam perifer kan örneğinden elde edilen DNA dan kistik fibrozis transmembran düzenleyici (CFTR)geninin tespit edilmesi ve genotiplenmesinde kullanılan AutoGenomics tescilli, film- temelli microarray teknolojisini proses otomasyonu, reaktif yönetimi ve yazılım teknolojisi ile kombinleyen in vitro diagnostik bir yöntemdir INFINITI CFTR-31 testi, BioFilmChip Microarray, Intellipac Reaktif Modülü, ve Qmatic İşletim Yazılımı içeren INFINITI Analizörden oluşmaktadır. BioFilmChip Microarray DNA analizleri için tasarlanmış tescilli çoklu tabaka komponent ile kaplı polyester filmlerden meydana gelmiştir. Tabakalar, test performansını arttırmak için çok amaçlı bir yüzey sağlamak üzere tasarlanmıştır. Microarrayler teste spesifik olarak tasarlanmıştır. INFINITICFTR-31 kullanılmamış Yakalama Probları içeren, herhangi spesifik bir testin uygulanabileceği microarray çipleri (Q çip) kullanmaktadır. Bu sebeple, aynı microarray kullanılarak çoklu testler geliştirilebilir. Intellipac Reaktif Modülü, test reaktiflerinin yerleştirildiği ve bütünleşmiş hafıza çipinin bulunduğu bir iletişim hattıdır. Lot numarası, son kullanma tarihi, miktar kullanımı gibi reaktif bilgileri hafıza çipinde arşivlenmekte ve çalışma raporunda görüntülenmektedir. Amplifikasyon Mix testin PCR amplifikasyonu basamağı için gerekli reaktiflerden oluşmaktadır. Her kutu PCR Amplifikasyon Mixi 4 vial 250 µl lik Amplifikasyon Mixi içerir. INFINITI Analizörü klinik çoklu sistemlerinde, klinik bir örnekten gelen çoklu sinyalleri ölçmek ve ayrıştırmak amacıyla kullanılan bir cihazdır. INFINITI Analizörü işaretlenmiş hedef DNA nın BioFilmChip microarraylerde hibritleşmesiyle oluşan florasansı ölçmek üzere tasarlanmıştır. INFINITI Analizör; CFTR testini otomatikleştirmiş ve örneklerin(pcr ürünü) dağıtımı, reaktif yönetimi, hibridizasyon, tespit ve sonuç analizi gibi farklı proseslerin 3 of 9

4 entegrasyonunu sağlamıştır. Test otomatik olarak tamamlanır ve noktalar aynı odaklı dahili bir mikroskop tarafından okunmaktadır. Sonuçlar genotip çağrıları olarak analiz edilmekte ve sunulmaktadır. INFINITI Analizörü nün kullanma talimatları, INFINITI Analizörü Kullanıcı El Kitabı nda bulunmaktadır. INFINITI Analizörü CE onaylıdır. UYARILAR VE ÖNLEMLER Gereksinimler In vitro diagnostik kullanım için. Eğitimli laboratuar personeli tarafından kullanılmalıdır. Bu test, EDTA içinde toplanan tam kan ile sadece kullanılmalıdır. Kan örneklerini dondurma/çözündürmekten kaçının. Örnekler en kısa sürede test edilmelidir. Tüm hasta numuneleri potansiyel tehlikelidir ve insan kaynaklı materyaller çok dikkatli alınmalıdır. Hiçbir test yöntemi HCV, HIV veya diğer bulaşıcı ajanların bulunmadığına dair tam bir güvence vermez. CLSI talimatlarını takip ediniz (Molecular Diagnostics Methods for Infectious Diseases; Approved Guidelines; MM3- A). Örneğin durumunu görsel olarak takip edin. Özellikle, yapısal bütünlüğünde bozulma olup olmadığına dair anormal işaretlere (buğulanma, hacimde azalma, çökelme, renk bozukluğu, sedimentasyon, ayrışma, bulanıklık) bakılmalıdır. Eğer örneklerde bir anormallik gözler veya bundan şüphelenirseniz hiçbir test çalışmayın. Kontaminasyonu, örneklerin karışmasını ve dökülmesini engellemek için çok dikkatli olunmalıdır. Örneklerin karışmasını önlemek için örnek tüpleri açık bir şekilde etiketlenmelidir. Örnekler kendi spesifik koşullarında saklanmalıdır. Çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için, numune hazırlama, PCR kurma ve PCR ürün analizi gibi işlemler CLSI de onaylanan talimatlara göre yapılmalıdır (Molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases: Approved Guideline). Reaktifleri karıştırmayın ve farklı lotlarda biriktirmeyin. Son kullanma tarihi geçmiş kit ve reaktifleri kullanmayın. Kit ve reaktifleri ürün etiketinde belirtilen koşullarda saklayın. Laboratuar İşlemleri Laboratuar kullanımı için normal önlemleri izleyin. Güvenli laboratuar prosedürlerini izleyin: ağız ile pipetleme yapmayın; koruyucu giysiler (örneğin, tek kullanımlık eldiven, laboratuar önlüğü gibi) ve koruyucu gözlük takın; laboratuarda çalışma alanlarında yemek yemeyin, içecek ve sigara içmeyin. Numunelere ve reaktiflere dokunduktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Atıkların İşlenmesi Kullanılmayan reaktif, örnek ve atıkları bulunduğu ülke, federal, eyalet ve yerel yönetmeliklere göre imha edin. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) AutoGenomics Müşteri Hizmetleri tarafından istek üzerine gönderilebilir. Örnek Hazırlama Kullanılan DNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen prospektüste güvenlik talimatlarına bakın. PCR ürünü mikroarray üzerine yüklemeden önce saklanamaz. Hemen kullanın. INFINITI Analizörü Cihazı kullanmadan önce INFINTI Analizör Kullanıcı El Kitabı nı okuyun. "Notlar" a özellikle dikkat edin. Operatör Manuelinde Güvenlik Uyarını ve Dikkat Edilmesi Gerekenler i izleyin. 4 of 9

5 Cihazı kurarken Kurulum Gereksinimleri Bölümü ne bakın. AutoGenomics Cihaz çalışırken hatalar karşılaşıldığında Hatalar Bölümü ne bakın. Sorunla karşılaşıldığında Yardım Bölümü ne bakın. SAKLAMA/STABILITE BioFilmChip Microarray: 12 ay Oda Sıcaklığında (15 C ila 30 C) Intellipac Reaktifi: 12 ay Buzdolabında (2 C ila 8 C) Not: Açıldıktan 30 gün sonra Intellipac kullanmayın. Amplifikasyon Mix: 18 ay Dondurucuda (-30 C ila -15 C) Not: Ürünlerin son kullanma tarihi ürün üzerindeki etiketlerde bulunmaktadır. NUMUNE TOPLAMA VE STABILITE Periferik kan EDTA lı (Mor kapak) tüpte toplanmalıdır. Örnekler dondurulup - çözülmemelidir. Örnekler mümkün olan en kısa sürede çalışılmalıdır. SAĞLANAN MATERYALLER (Her paket 48 test içermektedir.) Ürün Kodu INFINITI CFTR-31 BioFilmChip Microarray Magazin Her pakette 4 magazin mevcuttur. Ürün Kodu INFINITI CFTR-31 Intellipac Reagent Module Her modülde 24 test, her pakette 2 modül mevcuttur. Intellipac modülü içeriği; 1.1ml ASPE Master Mix, içeriği: dntps İşaretlenmiş-dCTP Allele Spesifik Primerler Ekstansiyon Tamponu 2.6ml Hibridizasyon Tamponu SSC Hibridizasyon Pozitif Kontrol Sodyum Azid koruyucu 0.08% Ürün Kodu INFINITI CFTR-31 Amplification Mix 4 x 250μl vial PCR reaksiyonu master mix, içeriği: dntp ler PCR Primer Mix MgCl 2 PCR Reaksiyon Tamponu Ürün Kodu : Yıkama Tamponu GEREKEN VE AUTOGENOMICS TARAFINDAN SAĞLANMAYAN REAKTİFLER DNA Ektraksiyon Kiti - INFINITI CFTR-31 testi kandan başarıyla saflaştırılmış genomik DNA kullanarak CFTR-31 genini tespit edebilmektedir. Absorbans aralığı: nm, DNA saflığı 1.60 olmalıdır. Bu şartname ile uyumlu herhangi bir DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılabilir INFINITI CFTR-31 ticari olarak mevcut çeşitli kitlerle test edilmiştir ve kullanıcılar daha fazla bilgi için AutoGenomics ile bağlantı kurulabilir. 5 of 9

6 Distile su (DNAaz ve RNAaz sız) Titanyum Taq DNA Polimeraz ( Önerilen Titanyum Taq DNA Polimeraz ve sağlayıcısını öğrenmek için AutoGenemics Ürün Katalog una bakınız.) EKİPMANLAR Aşağıdaki ekipmanlar gereklidir fakat test ile beraber sağlanmamaktadır: AutoGenomics Ürün Kodu : INFINITI Analizör AutoGenomics Ürün Kodu : INFINITI Atık treyleri AutoGenomics Ürün Kodu : INFINITI 24 kuyucuklu plate/lids AutoGenomics Ürün Kodu : INFINITI Temp Cycle Plate AutoGenomics Ürün Kodu : INFINITI Atık trey / Stir Bars AutoGenomics Ürün Kodu : INFINITI Pipe uçları 8-kuyucuk Düz Strip Kap (Genesee Scientific, Catalog No ) Pipetler Mini santrifüj Mikrofüj tüp rakları Termocycler Vortex 1,5 ml mikro santrifüj tüpleri 0.2 ml PCR tüpleri TEST PROSEDÜRÜ DNA Ekstraksiyonu Kullanılan DNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen talimatları izleyin. Tavsiye Edilen DNA Kontrolleri Pozitif kontrollerin(heterozigot ve/veya homozigot örnekler) çalışılan her teste dahil edilmesi önerilmektedir. Ek olarak bir negatif kontrol ( vahşi tip) ve no template kontrol (moleküler su) de her teste dahil edilmelidir. Coriell DNA örnekleri ( tesbit edilmiş pek çok genotip için uygun kontrollerdir. Coriell DNA kullanımıyla ilgili tavsiyeler için lütfen AutoGenomics ile irtibata geçiniz. PCR Reaksiyonu Not: Platin Taq DNA polimeraz buz üstünde tutunuz. Reaktifleri buzun içinde çözünüz. Amplifikasyon Mix tüpünü 2 5 sn santrifüj ediniz. Kontaminasyondan kaçınmak için taze hazırlanmış% 0.5 sodyum hipoklorit (deiyonize veya distile su ile seyreltilmiş çamaşır suyu) ile tüm çalışma yüzeyleri dezenfekte ediniz. Örnekleri ve kontrolleri çalışırken değişik filtre ipuçları ve eldiven kullanılmalıdır. PCR ürünleri microarraylere yüklenmeden önce depolanamaz. Süratle kullanınız. 6 of 9

7 1.PCR Master Mix i hazırlayınız. AutoGenomics Amplifikasyon mix Titanyum Taq Polimeraz 17.5 μl 0.5 μl PCR Master mixin toplam hacmi 18.0 μl Not: Gereken reaktif miktarını uygulanan testin sayısına göre hesaplayınız. 2. PCR maste mixi hafifçe vorteksleyiniz, 18 μl PCR master mixi 24lük kuyucuklu plate deki kuyucuklarına ekleyiniz μl örnek DNA (25 ng/μl ) ekleyiniz. PCR master mix 18.0 μl Örnek DNA 2.0 μl Amplifikasyon reaksiyonun toplam hacmi 20.0 μl kuyucuklu-plate i 8-kuyucuklu flat strip kapaklarıyla kapatın termocycler a yerleştirin ve aşağıdaki programı kullanarak amplifikasyon reaksiyonunu başlatınız. Basamak Sıcaklık C Süre Döngü Sayısı Dak n/a Sn 30 Sn 30 Sn 40x 2 dak Bekle Not:. Eppendorf Mastercycler EP (aluminyum blok) kullanıldığında ramp rate kurulumu %75 olduğunda total döngü için geçen zaman 1 saat 37 dak. dır. (+ 5 dak) Diğer Termal Cycler lar kullanıldığında eş zamanı elde edecek şekilde ramp ayarı yapınız. n/a Örnek Yükleme Lütfen INFINITI Analizör Kullanıcı El Kitabı na bakın (Kısım kodu: EM 34000). 20 μl PCR ürününü 24 kuyucuklu plate e ekleyin. Test spesifik magazin, Intellipack, pipet uçları ve yıkama solüsyonlarını cihaza yükleyin. INFINITI Analizör ün İşleyişi Lütfen INFINITI Analizör Kullanıcı El Kitabı na bakın (Kısım kodu: EM 34000) KALİTE KONTROL Termal cyclerın üreticinin talimatlarına uygun şekilde düzenli olarak bakımı yapılmalı ve kalibre edilmelidir. 7 of 9

8 KISITLAMALAR AutoGenomics INFINITI CFTR-31 Testinden elde edilen sonuçlar sadece genel klinik tanı bağlamında yorumlanmalıdır. AutoGenomics alınan herhangi bir klinik karardan sorumlu değildir. SONUÇLARIN YORUMLANMASI INFINITI CFTR-31 Testi CFTR genini bulmak ve genotiplemek üzerine tasarlanmıştır. Test sonuçları, deneme sırasında tespit edilen gene bağlı olarak genotip çağrı şeklinde verilmektedir. Çağrının olmaması ulaşılabilir bir sonuç olmadığını gösterir. Çağrının olmaması cihazdan DNA örneğinin kalitesinden veya kullanıcı hatasından kaynaklanabilir. Hata mesajı görüntülendiğinde INFINITI Kullanıcı El Kitabı nın Sorun Giderme Bölümü ne başvurunuz. Çağrı olmaması halinde testin tekrarlanması gerekmektedir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik Spesifite Özgüllük ile ilgili çalışmalar analiz gelişimi sırasında yapılmıştır. PCR primer spesifitesi bir jel üzerinde amplikon boyutuna göre belirlenmiş ve amplikon sıralaması yapılmışır. ASP primer spesifisitesi bilinen genomik örnekleri kullanılarak test tarafından gönderilen doğru genotipler ile tespit edilmiştir. Prob un yakalama spesifitesi farklı oligoların hibridizasyonu ile tespit edilmiştir ve bilinen noktaya doğru oligo hibridleşmesini göstermektedir. Tespit Limiti (analitik duyarlılık) Çalışmalar INFINITI CFTR-31 Testinin en düşük 3ng DNA en yüksek 300ng DNA'yı tespit edebildiğini göstermiştir. En az 25ng DNA tavsiye edilen miktardır. Testin Hassasiyeti ve Tekrarlanabilirliği INFINITI CFTR-31 testinin tekrarlanabilirliğini araştırmak için üç konumlu laboratuvarlar arası bir tekrarlanabilirlik çalışması yapılmıştır. Çalışmada üç lot INFINITI CFTR-31 testi kullanılmıştır. Konumlar beş genomik DNA ve üç tam kan olmak üzere birbirinin aynısı örnekler kullanmıştır. Örneklerin kimlikleri gizlidir. Her konumda her örnek gün/operatör başına üç defa olmak üzere altı gün boyunca çalışılmıştır. Her konumda üç kullanıcı bulunmaktadır. Çalışmada üç cihaz kullanılmıştır. Cihazdan cihaza tekrarlanabilirlik #Test edilen Cihaz örnekler # Genotip çağrıları Doğru çağrı oranı* (ilk çalışmada) Doğru çağrı oranı** (Final) , % 100% , % 99.6% , % 99.7% Lottan lota tekrarlanabilirlik #Test edilen Lot örnekler # Genotip çağrıları Doğru çağrı oranı* (ilk çalışmada) Doğru çağrı oranı** (Final) A 132 3, % B 132 3, % C 132 3, % 8 of 9

9 Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik #Test edilen Site örnekler # Genotip çağrıları Doğru çağrı oranı* (ilk çalışmada) AutoGenomics Doğru çağrı oranı** (Final) , % 100% , % 99.7% , % 99.6% Total , % 99.8% * Doğru çağrı oranı = # doğru genotip çağrı / toplam # genotipler ** Tekrar edilen testlerle beraber doğru çağrı oranı. İlaç İnterferansı İnterferans etki göstermesi muhtemel maddelerin etkisi değerlendirilmiştir. Bilirubin (8mg/dl ve 0.08mg/ml), kolesterol (70mg/dl ve 7mg/dl), ve Heparin (1333U/dl ve 133/Udl) içeren örneklerde interferans gözlenmemiştir. Çalışmalarda oral anti-pıhtılaştırıcı kullanılmıştır. Örnek Taşınması Değişen DNA konsantrasyonlarının (tek çalışmada) sırayla ölçüldüğü çalışmada numune taşınmasını gözlenmemiştir. 9 of 9

10 Metot Karşılaştırılması INFINITI CFTR-31 testi, ticari olarak ulaşılabilir CFTR testi (Tag-It ) ile karşılaştırılmıştır. Karşılaştırma çalışması üç laboratuvarda yürütülmüştür ve her laboratuvar kendi CFTR örneklerinin kullanmıştır. % İlk çalışmadaki uyum % Final uyum** CF Mutasyonları* # Örnekler delta F % 100% G542X 8 100% 100% W1282X % 100% G551D % 100% 621+1G>T % 100% N1303K 5 100% 100% R553X 2 100% 100% delta I % 100% kbC>T 8 75% 100% G>A 3 100% 100% R117H % 100% G>A 4 100% 100% G>A 2 100% 100% R347P 1 100% 100% 711+1G>T 1 100% 100% % İlk çalışmadaki uyum % Final uyum** CF Mutasyonları* # Örnekler R334W 2 50% 100% R560T 2 100% 100% R1162X 5 100% 100% 3659delC 2 100% 100% A455E 2 100% 100% G85E 2 100% 100% 2184delA 1 100% 100% G>A 3 100% 100% 1078delT 0 n/a 100% I148T 4 75% 100% IVS8-7T 1 100% 100% Total % 100% * Tag-It ile belirlenen mutasyonlar (Referans karşılaştırma metodu) ** Bir tekrardan sonra KAYNAKÇA 1. ACCE review of CF/Prenatal Clinical Validity 10 of

11 ival.htm AutoGenomics 11 of