T Ü KAL TE S STEM BELGEL K - Q TSE-ISO-EN 9000 R R K YE DE LK LABORATU V A TANDEM KÜTLE SPEKTROMETR S (TANDEM - MS) Dünyada yenido an tarama programlar Robert Guthrie nin 1962 y l nda fenilalanin için bakteriyel inhibisyon metodunu gelifltirmesiyle birlikte fenilketonüri hastal n n taranmas yla bafllam flt r. Son otuz y l boyunca yenido an taramalar konjenital hipotiroidi ve konjenital adrenal hiperplazi gibi di er metabolik da içine alacak biçimde gelifltirilmifltir. Y llar içerisinde ayr ayr hastal klar tek tek taramak yerine bir testle birden fazla hastal tarama fikri ortaya at lm flt r. Buradan yola ç karak gelifltirilen Tandem Kütle Spektrometrisi (Tandem-MS) h zl, kesin ve az miktarda kan örne i ile çal fl labilen bir yöntemdir. En önemli avantaj oldukça az miktarda fizyolojik s v veya kuru kan örne inde birbiriyle ba lant s z çok say da farkl metabolit ve bilefli i ayn anda ölçebilmesidir. Tandem-MS çok özgül ve duyarl bir teknoloji olup, genifl bir hastal k grubunun de erlendirilmesini mümkün k lar. Tandem-MS ile taranabilen hastal klar özet olarak Tablo 1 de gösterilmektedir. Tandem-MS kullan larak tek bir kan örne i ile 25 den fazla yenido an metabolik hastal n n taranmas mümkündür. Böylece tek test-tek hastal k kavram ndan tek test-birden çok hastal k kavram na geçilmifltir. Tarama için Guthrie kartlar üzerine al nm fl ve kurutulmufl kan örneklerinden al nacak küçük diskler yeterlidir. Taranan hastal k say s yüksek olmas na ra men yalanc pozitiflik oran düflüktür (%0.26). Oysa klasik bakteriyel inhibisyon yöntemlerinde bu oran %1.5 dur. Yenido anlarda ilk 24 saat içinde al nan kan örneklerinde de Tandem-MS yöntemi kullan lmaktad r. Guthrie ka tlar üzerine al nm fl ve kurutulmufl kan örneklerinden metanol ile elde edilen k s m, soft iyonizasyon veya elektrospray yöntemi ile cihaza yüklenir. lk filtreleme k sm nda iyonize olan ve iyonize olmayan moleküller ayr l r. yonize ana moleküller daha sonra cihaz n çarp flma ünitesi denilen bölümüne gelirler. Burada inert gazlar n (argon gaz,vb) etkisi ile ana moleküller elektron yüklü daha küçük parçalara parçalan rlar
(fragmantasyon). Ana molekülden ayr lan daha küçük iyonlar ikinci bir filtrede kütlelerine göre ayr flt r l r. Cihazda bulunan iki MS (kütle spektrometrisi) arac l yla belli bir ana molekülün öncüsü olan küçük iyonize moleküller ile ana moleküller taran r ve grupland r l rlar. Ana molekülden ayr lan küçük moleküllerin oluflturdu u spektrum, bu ana molekül için karakteristiktir (fiekil 1). Cihazda iki adet kütle spektrometrisi bulundu undan MS-MM, MS/MS veya MS 2 olarak gösterilir. Döteryum iflaretli internal bir standart ile karfl laflt r larak miktar tayini yap l r. Tablo 1. Tandem MS ile taranabilen metabolik hastal klar Amino asit metabolizmas Fenilketonüri Di er hiperfenilalaninemiler Tirozinemi tip 1, 2, 3 Homosistinüri Maple Syrup Urine hastal Hiperprolinemi tip 2 Nonketotik hiperglisinemi Ya asidi oksidasyonu K sa zincirli açil-koa Orta zincirli açil-koa Çok uzun zincirli açil-koa K sa zincirli 3-hidroksi açil-koa Uzun zincirli 3-hidroksi açil-koa Uzun zincirli 2,4-dienoil-KoA redüktaz eksikli i Trifonksiyonel protein (TFP) eksikli i Primer karnitin eksikli i Karnitin palmitoiltransferaz I eksikli i Karnitin palmitoiltransferaz II eksikli i Karnitin açilkarnitin translokaz eksikli i Çoklu açil KoA Organik asit metabolizmas Metilmalonik asidemi Propiyonik asidemi zovalerik asidemi Glutarik asidemi tip I Glutarik asidemi tip II Malonik asidüri Mevalonik asidüri HMG-KoA liyaz eksikli i 2-Metilbütiril-KoA zobütiril-koa 2-metil-3-hidroksi-bütiril-KoA 3-metilglutakonil-KoA hidrataz eksikli i 3-metilkrotonil-KoA karboksilaz eksikli i 3-ketotiyolaz eksikli i Üre siklüsü enzim Sitrülinemi tip 1 ve 2 Argininosüksinik asidüri ve argininemi Ornitin transkarbamilaz eksikli i
100 172.1 188.1 191.2 145.9 249.4 260.4 227.3 222.2 % 150.0 238.3 246.4 265.5 174.1 182.2 209.2 212.2 206.2 217.2 0 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 m/z fiekil 1. Kurutulmufl kan örne inden elde edilmifl amino asit ve açilkarnitinlerin spektrumu. Her bir analit için kontrol düzeyi I ile birlikte izotop ile iflaretlenmifl internal standart yer almaktad r. Tüm analitlerin konsantrasyonlar cut-off s n r ndad r. Kal tsal Metabolik Hastal klar n Tan s nda Tandem Kütle Spektrometrisi Kal tsal Metabolik Hastal klar (KMH), metabolik yollardaki kilit enzimlerin sentezi ya da membrandan tafl mada görevli proteinlerin sentezini düzenleyen genlerdeki mutasyonlara ba l olarak geliflen hastal klard r. Bu hastal klar n büyük ço unlu u amino asit, organik asitler ve ya asidi metabolizmas n n kal tsal kusurlar olup, akut ve fliddetli metabolik krizler ile seyretmekte, uygun tedavi görmeyen olgularda s kl kla erken yaflta ölümle sonuçlanmaktad r (fiekil 2). Bu hastal klar n tan s nda temel amaç, klinik önemi olan hastal klar n erken evrede tan konularak tedavi edilmesiyle zihinsel ve bedensel sekellerin önlenmesi ve ölüm oran n n en alt düzeye indirilmesidir. Erken ve do ru tan, zeka gerili inin, fliddetli nörolojik bulgular n, fiziksel kusurlar n önlenmesinde büyük önem tafl makta, hem yaflam kalitesi hem de yaflam süresinin art r lmas na katk da bulunmaktad r. Tandem-MS, 1982 y l nda metabolik tarama amac yla kullan lmaya bafllanm fl, daha sonra açilkarnitinlerin yan s ra amino asit metabolizma kusurlar da taramalara dahil edilmifltir. Tandem-MS, KMH nin tan s nda birinci basama oluflturur ve kesin tan için di er biyokimyasal ve genetik testler de yap lmal d r. Glutarik asidemi tip I ve karnitin palmitoiltransferaz I eksikli i gibi metabolik bozukluklarda, örne in al nd anda anormal metabolitler henüz oluflmad ndan dolay tan atlanabilir ve normal sonuç bulunabilir. Bu nedenle daha ileriki zamanlarda yeni örnek al n p, analiz tekrar edilmelidir. Ayr ca amino asit, organik asit ve ya asidi metabolizmas ile ilgili baz kal tsal hastal klar amino
100 222.2 % 191.1 172.0 227.2 242.3 145.9 188.1 182.1 209.1 162.0 260.4 238.2 0 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 m/z fiekil 2. Fenilketonürili bir olguda fenilalanin art fl. asitlerin ve açilkarnitinlerin MS/MS analizi ile saptanamad ndan, klinik bulgular olan bir olguda Tandem-MS ile yenido an taramas nda herhangi bir patoloji saptanmam fl olmas, kal tsal bir hastal ekarte etmek için yeterli de ildir. Örneklerin Toplama Koflullar ve Test Sonuçlar n Etkileyen Durumlar Akut semptomlar, özellikle de karaci er fonksiyonlar n etkileyen durumlar, ilaçlar ve diyet uygulamalar yan lt c olabilecek metabolitlerin oluflmas na yol açabilir. Açilkarnitinler oda s cakl nda en az 24 saat stabildir. Serbest ve total karnitin ile ilgili do ru sonuçlar n elde edilebilmesi için plazma/serum örneklerinin ayr ld ktan sonra dondurulmalar, kuru buz üzerinde laboratuvara ulaflt r lmalar ve analiz aflamas na kadar -20 C de saklanmalar gerekmektedir. Kurutma ka d na emdirilen örnekler ise oda s cakl nda 4 saat kadar kurutulduktan sonra ka t bir zarfa konularak gönderilmelidir. Örneklerin al nd ka d n laboratuvarda kullan lan ka t ile ayn olmas sonuçlar n do rulu u aç s ndan büyük önem tafl maktad r. Do ru bir sonucun elde edilebilmesi için kan örne inin filtre ka d na homojen olarak emdirilmesi, ayn bölgeye defalarca kan n emdirilmemesi çok önemlidir. Örnek olarak 3mm çap nda bir kan damlas kullan lmakta ve bu miktar 3.1 µl olarak kabul edilmektedir. Tüm hesaplamalar bu de ere göre yap ld ndan hatal emdirilen örnekler yalanc düflük ya da yüksek de erlere yol açabilir. Yenido an taramalar nda kabul edilecek kesin s n r de erler henüz belirlenmifl oldu undan her laboratuvar kendi referans aral n oluflturmal d r. MS/MS bir tarama testi oldu undan herhangi bir patoloji saptanmamas, ilgili olgunun taramas yap lan hastal klardan hiçbirine sahip olmad anlam na gelmemektedir. Bir tarama testi olan MS/MS, tan koydurucu metabolitlerin normal de erlerin üzerine ç kmad durumlarda yanl fl negatif sonuçlar verebilir. laçlara ba l olarak
geliflti i bilinen do rudan etkileflimler ise çok az say dad r. drar yolu enfeksiyonlar nda kullan lan, pivaloil grubu içeren antibiyotikler bebe e uterus içinde veya anne sütü yoluyla geçerek, C5 açilkarnitin de erlerinin yükselmesine yol açabilir. Valproat gibi epilepsi tedavisinde kullan lan ilaçlar ve çeflitli analjezikler ise ya asidi beta oksidasyon yola gibi mitokondriyal enzim sistemleri ile etkileflime girerek, ara ürünlerin anormal derecede yükselmesine neden olabilirler. Çeflitli bebek mamalar nda yer alan orta zincirli trigliseritler C8, C10 gibi orta zincirli karnitinleri art rabilirler. Karnitin deste i alan olgularda s kl kla C3 ile birlikte C2 art fl da bulunur. Özellikle infüzyon yolu ile yüksek dozlarda karnitin deste i alan olgularda karnitin ve açil karnitin düzeylerinde çok yüksek art fllar görülebilir. Uzam fl açl k dönemi C2, C4- OH, C12:1, C14:1 gibi ya asitlerinin düzeylerinde art fla neden olabilir. Laktik asidoz da C3 düzeylerinde art fla yol açabilir. Özellikle uzun zincirli ya asitlerinin tüketilmesi (ayçiçek ya, zeytinya ) C14:2 de art fla neden olabilir. Ketojenik diyet alan olgularda C2 ve C4- OH düzeyleri yüksek olarak saptanabilir. Üre döngüsü kusurlar nda, tedavi amac ile uygulanan benzoat ve/veya fenilasetat Tandem-MS de benzoilkarnitin ile fenilasetilglutamata benzer pikler gösterebilir. Tandem-MS Yönteminin Uygulama Alanlar Geliflmifl ülkelerde Tandem-MS in yenido an tarama testleri d fl nda uygulama alanlar terapötik ilaç dozlar n n izlenmesi (özellikle immünosüpresifler ve yeni nesil antikonvülzanlar ile antipsikotikler) ile farmakoloji, endokrinoloji ve toksikoloji alanlar ndad r. Birçok laboratuvarda immünosüpresiflerin yan s ra, yeni antiepileptik ve antiviral ilaçlar n takibi de Tandem Kütle Spektrometrisi ile yap lmaktad r. Tandem- MS in bu uygulamalardaki avantaj maliyetler ve immünoassay duyarl l aç s ndan in vitro tan dan ba ms z olarak yüksek özgüllük ve duyarl l a sahip olmas d r. Ancak bu yöntemde bir testin çal fl lma süresi otomatize immünoassay sistemlerden daha uzun olup, özel teknik bilgiye gereksinim göstermektedir. Son y llarda çeflitli hormonlara iliflkin analizler de immünoassay yerine Tandem- MS kullan larak çal fl lmaktad r. Tandem Kütle Spektrometrisi biyolojik de iflkenlikleri ve çok düflük düzeylerde bulunmalar nedeniyle peptid hormonlar n ölçümü için tercih edilmemektedir; ancak bu tür hormonlar n tayini için gelecekte kullan lacak potansiyel yöntemler aras nda yer alabilir. Tiroid hormonlar n n yan s ra kortizol, progesteron ve estradiol gibi küçük moleküllü hormonlar n tayininde immünoassay yöntemlerinin performans daha iyi olmakla birlikte, heterofilik antikorlardan kaynaklanan etkileflimleri önlemek amac yla Tandem-MS bu analizlerde de kullan labilir. Tandem-MS ile çok k sa bir sürede, kurutulmufl kan damlas ndan amino asitler ve açil karnitinler dahil 40 kadar metabolitin analiz edilmesi mümkündür. Fenilketonüri tan s n n daha duyarl bir flekilde konulmas n n yan s ra, ender görülen baz kal tsal hastal klar n do umdan sonraki ilk haftada, henüz klinik bulgular geliflmeden, Tandem- MS ile teflhis edilmesi mümkün olabilmektedir. Sistemin otomatize edilmesi ile günde 500 ün üzerinde örnek analiz edilerek, yirminin üzerinde hastal n taramas yap labilmektedir.
Kaynaklar 1. Chace DH. Mass spectrometry in newborn and metabolic screening: historical perspective and future directions. Journal of mass spectrometry 2009; 44(2):163-170. 2. Burghardt S. Tandem mass spectrometry for neonatal screening. Clinical Laboratory International 2007; 31(6):14-16. 3. Schulze A, Lindner M, Kohlmüller D et al. Expanded newborn screening for inborn errors of metabolism by electrospray ionization-tandem mass spectrometry: results, outcome, and implications. Pediatrics 2003; 111(6):1399-1406. 4. Zytkovicsz TH et al. Tandem mass spectrometric analysis for amino, organic and fatty acid idsorders in newborn dried blood spots: atwo year summary from the New England newborn screening program. Clinical Chemistry 2001; 47(11): 1945-1955. 5. Millinton DS et al. Tandem mass spectrometry: a new method for acylcarnitine profiling with potential for neonatal screening for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic disease 1990; 13(3):321-324. 6. Guthrie R, Susi A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics 1963; 32:338-343. MEC D YEKÖY Büyükdere Cad. Gökfiliz fl Merkezi No: 11 Kat: 3 34387 Mecidiyeköy - stanbul Tel. : (212) 217 41 41 Faks : (212) 217 41 10 KADIKÖY Cemil Topuzlu Cad. Fazilet Sitesi No: 44 Kat: 2 34726 Çiftehavuzlar - Kad köy - stanbul Tel. : (216) 369 17 67 Faks : (216) 369 01 61 BAKIRKÖY ncirli Cad. Santral Ç kmaz Toprak Bloklar A-Blok 1-2 34147 Bak rköy - stanbul Tel. : (212) 570 88 60 Faks : (212) 570 93 00 ET LER Tepecik Yolu No: 28/A 34337 Etiler - stanbul Tel. : (212) 358 51 00 Faks : (212) 358 50 56 N fiantafii Valikona Cad. Çam Apt. No: 161 Kat: 1 34363 Niflantafl - stanbul Tel. : (212) 233 22 95 Faks : (212) 233 38 42 ULUS Etiler Adnan Saygun Cad. Uydu Sok. Gündefl Apt. No: 2/B Kat: 1 34340 Ulus - stanbul Tel. : (212) 287 43 00 Faks : (212) 287 33 83 ERENKÖY fiemsettin Günaltay Cad. No: 184/B 34738 Erenköy - stanbul Tel. : (216) 411 31 66 Faks : (216) 411 20 61 FINDIKZADE Millet Cad. Emir Han No: 55 Kat: 2 34096 F nd kzade - stanbul Tel. : (212) 633 41 42 Faks : (212) 633 49 05 ACIBADEM Ac badem Cad. Ayd n Apt. No: 109 Kat: 2 34718 Ac badem - stanbul Tel. : (216) 545 72 72 Faks : (216) 545 74 77 YEfi LKÖY stasyon Cad. No: 21 Kat: 1 34149 Yeflilköy - stanbul Tel. : (212) 662 99 77 Faks : (212) 662 68 00 ÇEKMEKÖY Ayd n Menderes Cad. Carpe-Diem fl Merkezi Kat: 1 34782 Çekmeköy - stanbul Tel. : (216) 642 43 00 Faks : (216) 642 54 84 KEMERBURGAZ stanbul Cad. Artell Forum Çarfl No: 38/14 34075 Göktürk - Kemerburgaz - stanbul Tel. : (212) 322 68 22 Faks : (212) 322 68 28