Clostridium botulinum 1

Clostridium botulinum 1 Hilal B. DOĞAN, İbrahim ÇAKIR, A. Kadir HALKMAN Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü 01. Genel Bilgiler 01. Analizi; Genel Bilgiler 02. İzolasyon 03. İdentifikasyon 04. Botulin Toksinin Belirlenmesi 01. Genel Bilgiler Clostridium botulinum, Bacillaceae familyasının üyesi olup, Gram pozitif, çubuk şeklinde, sporlu, anaerob bir bakteridir. Genel bir yaklaşım ile botulinum nörotoksini olarak adlandırılan karakteristik proteini üreten tüm organizmalar C. botulinum olarak tanımlanır, bir diğer deyiş ile bu türün sınıflandırılmasındaki temel ilke botulinum nörotoksinidir. Üretilen nörotoksinler serolojik olarak A 'dan G 'ye kadar olmak üzere 7 gruba ya da C grubu C 1 ve C 2 şeklinde 2 alt grup olmak üzere 8 gruba ayrılır. Bunlardan A, B, E ve çok nadir olmak üzere F tipleri insanlarda, C ve D tipleri memeli hayvanlarda ve kanatlılarda botulizm olarak adlandırılan hastalığa neden olur. C 1 nörotoksin olmakla beraber C 2 nörotoksin olmayıp vaskülar geçirgenliğin artmasına neden olur. G tipinin insan veya hayvanlarda hastalık yaptığı belirlenmemiştir. C. botulinum, birbirlerinden fizyolojik olarak ayrılabilen, DNA homolojisi ve 16S ile 23S gen sekans analizleri ile kendi içlerinde yüksek düzeyde ilişkide, ancak diğer gruplar ile uzak ilişki içinde olan ve I, II, III, IV olarak adlandırılan 4 gruba da ayrılabilir. Bu ayrıma göre bütün A tipi ile B ve F gruplarının proteolitik olan suşları I, bütün E tipi ile B ve F gruplarının proteolitik olmayan suşları II, C ve D suşları III, G tipi ile yeni bir bakteri olan C. arjentinense IV nolu grupta toplanır. Bu grupların karakteristik özellikleri çizelge 1 'de verilmiştir. Buna göre grup III ve IV insanlarda botulizme neden olmayan gruplardır. Her ne kadar grup II, proteolitik enzimlerden yoksun olan suşları içermekte ise de, kültürlerin tripsin ile muamelesi ile toksisite artar. Bu durumda insanlarda hastalık yapması açısından sadece I ve II. gruplar önemlidir. C. butyricum ve C. barati 'nin nörotoksin oluşturan suşları varsa da bunlar nadir olarak bulunmakta ve dolayısı ile bu bölümde esas olarak I ve II olarak tanımlanan gruplar incelenmiştir. Çizelge 1 'den de görüldüğü gibi grup I 'e giren suşlar grup II suşlarından daha yüksek NaCl direnci, daha düşük ph ve daha düşük su aktivitesi değerlerinde gelişebilmekte, sporlarının ısıl işleme çok daha yüksek direnci ile ayrılmaktadır. Grup II suşları ise sadece daha düşük minimum gelişme sıcaklığı ile optimum gelişme sıcaklığında hem daha düşük hem de daha geniş bir sınırda gelişebilme özellikleri ile grup I 'e üstünlük sağlamaktadır. İlk kez 1800 'lü yılların sonunda belirlendikten sonra C. botulinum, gıda mikrobiyolojisinin en önemli bakterilerinden birisi olmuştur. Neden olduğu botulizm, diğer patojenlerin neden 1 Kaynak : Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları, 2000. Genişletilmiş 2. Baskı; Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü yayını. Sim Matbaası, Ankara 522 s 23. Bölüm 1

olduğu hastalıklara oranla oldukça nadir görülmekle beraber, ölüm oranı diğer patojenler ile kıyaslanamayacak kadar yüksektir. 1899-1990 yılları arasını kapsayan 90 yıllık dönemde ABD 'de belirlenen 2320 vakanın 1036 'sı (%44,7) ölüm ile sonuçlanmıştır. Bugün düşük asitli (ph 'sı 4,5 ve üzeri) olarak tanımlanan gıdaların ısıl işlem ile korunmasında temel olarak C. botulinum sporlarının imhası esas alınmakta ve buna uygun olacak şekilde ısıl işlem uygulanmaktadır. Çizelge 1. C. botulinum Suşlarının Gruplandırılması Özellik Grup I Grup II Grup III Grup IV Nörotoksin tipi A, B, F B, E, F C, D G Gelişme Sıcaklığı Minimum ( o C) 10 3,3 15? Optimum ( o C) 35-40 18-25 40 37 Minimum ph 4,6 5,0?? NaCl inhibisyonu (%) 10 5?? Minimum As 0,94 0,97?? D100 o C (spor) 25 <0,1 0,1-0,9 0,8-1,2 D121 o C (spor) 0,1-0,2 <0,001???: Bilinmiyor C. botulinum tarafından oluşturulan hastalık fark edilemeyecek kadar yumuşak geçen bir hastalıktan, 24 saat içinde ölüme neden olabilecek kadar sert geçen hastalığa kadar çok geniş bir dağılım gösterir. Genel olarak nörotoksin içeren gıdanın tüketiminden 12-36 saat sonra semptomlar görülmekle beraber, semptomların birkaç saat içinde görülmesi ya da 14 saat içinde görülmemesi de mümkündür. Genellikle ilk semptom mide bulantısı ve kusma olup, bunu takiben görme bozuklukları (çift görme, net görememe, genişlemiş göz bebeği), ağız ve gırtlak fonksiyonlarında kayıp (konuşma ve yutkunmada zorluk, ağız, boğaz ve dilde kuruma), genel bitkinlik ve kas koordinasyon kaybı ile solunumda zayıflama görülür. Karın ağrısı, ishal ya da kabızlık şeklinde diğer gastrointestinal semptomlar da görülebilir. Mide bulantısı ve kusma A tipine oranla B ve E tipi toksinlerde daha fazla yaygın iken, yutkunma güçlüğü ve kas zayıflamaları tip E 'ye göre A ve B tiplerinde daha yaygındır. Ağız, dil ve gırtlakta kuruma ise B tipi vakalarda daha yaygındır. Solunum yetersizliği ve solunum yolları tıkanması botulizmden kaynaklanan ölümlerin başlıca nedenidir. Bu nedenle ölüm oranı 20. Yüzyılın ilk yarısında yaklaşık %50 (bazı kaynaklara göre 1910-1919 yılları arası %70) iken, antiserum ve solunum destek sistemlerindeki gelişmelere bağlı olarak bu oran yaklaşık %10 'a (bazı kaynaklara göre 1980 'li yıllarda %9 'a ve 1993 'de %2 'ye) kadar düşmüştür. Botulizm, karbon monoksit zehirlenmesi ve özellikle Campylobacter jejuni 'nin de etmeni olduğu Guillain-Barré sendromu ile karıştırılabilmektedir. C. botulinum nörotoksinlerinin minimum toksik dozu hakkında kesin değerler bulunmamaktadır. Genel gıda güvenliği açısından bu toksinlerin gıdalarda bulunmaması gerekir. Farelerde saptanan LD 50 dozu 0,1 ng/kg 'dır. Hastalık, tipik olarak C. botulinum sporlarının gıdanın üretimi sırasında canlı kalması, zamanla bunların germinasyonu, gelişmeye bağlı olarak nörotoksinlerin salgılanması ve bunların tüketimi ile hastalığın ortaya çıkışı ile tipik bir intoksikasyon tipi zehirlenme olarak bilinmekle beraber, gıda maddesindeki sporların vejetatif hale geçmeden bağırsağa ulaşması, burada vejetatif forma geçmesi ve burada toksin oluşturması şeklindeki zehirlenmelere 2

bebeklerde ve bazı erginlerde de rastlanmaktadır. Bu iki şekilden çok daha nadir olmak üzere açık bir yaradan vücuda giren sporların zehirlenmelere yol açtığı da bilinmektedir. C. botulinum toksinlerinden korunmanın en emin yolu gıdalarda C. botulinum 'un tümüyle imhası ya da işlem sırasında canlı kalabilmiş olan sporlarının çimlenerek nörotoksin oluşumunun engellenmesidir. C. botulinum 'u öldürmek orta ve büyük ölçekli gıda işletmelerinde temel hedef olmakla beraber, öldürülemese dahi toksin oluşturmasının engellenmesi özellikle yaygın sorun yaratan geleneksel ve basit ölçekli küçük aile işletmeleri için gıda korumadaki temel hedeftir. Buna göre C. botulinum 'u öldürmek amacı ile gıdalar ısıl işlem ve ışınlama uygulamasına maruz bırakılırken, toksin oluşmasının engellenmesi için su aktivitesi, redoks potansiyeli, prezervatiflerin kullanımı, diğer mikroorganizmaların antagonistik etkisi, tuzlama gibi geleneksel koruma yöntemleri uygulanmaktadır. Toksin üretiminin engellenmesi üzerine yapılan çalışmalar bu faktörlerin nadiren tek başlarına etkili olduğunu, buna karşın sinerjetik etkileri ile C. botulinum sporlarının çimlenmesini ve/veya vejetasyon sonrası nörotoksin üretimini engelleyebildiğini ortaya koymuştur. Gıda maddelerine C. botulinum kontaminasyonu öncelikle mevcut bulaşma kaynaklarına bağlıdır. Bu çerçevede C. botulinum 'un topraklarda ve sedimentlerde bol olarak bulunduğu, coğrafi dağılımın bu konuda etkili olduğu gözden uzak tutulmamalıdır. Gerek C. botulinum 'un öldürülmesi gerek mevcut hücrelerin toksin yapmalarının engellenmesi ve sonuç olarak her iki koşulda da gıda zehirlenmeleri açısından en yüksek risk taşıyan gıda maddeleri düşük asitli olanlardır. Bu durumda sebze konserveleri, et ve balık konserveleri öncelikle ele alınması gereken gıdalardır. Bu tip konserve türlerinde yetersiz ısıl işlem sonucu C. botulinum 'un sporları canlı kalabilmekte, buna karşın öncelikle asit oluşturarak C. botulinum sporlarının germinasyonu ve nörotoksin oluşturmak üzere çoğalmasına izin verecek refakatçı floranın inhibe olmasını sağlamakta ve sonuçta gıda nörotoksijenik enterotoksin içeren bir duruma gelmektedir. C. botulinum tarafından oluşturulan toksinlerin ısıl işleme son derece dayanıksız oldukları ve genel olarak 80 o C 'da 6 dakika veya 72 o C 'da 12 dakikada tümüyle inaktif hale geçtikleri dikkate alınırsa, tüketilmeden önce son bir kez ısıl işlem görmeyen gıdaların botulizm zehirlenmelerindeki önemi ortaya çıkar. Bu çerçevede, özellikle salata yapımında kullanılan bezelye gibi sebze konserveleri ile mantar konservesi, balık ve diğer su ürünleri konserveleri, çeşitli salata ve makarna sosları ile doğrudan tüketilen sosisler (yaygın olarak adlandırıldığı şekli ile sosis ve salamlar) C. botulinum açısından daha yüksek risk taşımaktadır. ABD 'de ev tipi sebze konserveleri, Avrupa ülkelerinde ise et ürünleri daha ağırlıklı olarak botulizme neden olmaktadır. C. botulinum toprak kökenli bir bakteri olduğu için, özellikle A ve B tipi toksin oluşturan C. botulinum suşları kuşkonmaz, fasulye, kabak, havuç, kereviz, mısır, mantar, soğan, patates, turp, zeytin, kayısı, çilek ve domates gibi pek çok meyve ve sebzede doğal olarak bulunmaktadır. Özellikle bebek beslenmesinde kullanılan ballar ise bebeklerde görülen botulizmin etkeni olması nedeni ile ayrı bir sorundur. Yapılan araştırmalar ballarda 1-10 spor/kg düzeyinde C. botulinum sporu olduğunu göstermekte, ancak bebeklerde botulizme neden olan ballarda bu sayının 10 4 /kg olduğunu belirtmektedir. Buna bağlı olarak bebeklerde bal ile meydana gelen botulin zehirlenmelerine karşı ABD hastalık önleme merkezi (CDC), 1 yaş altındaki bebeklere bal verilmemesini önermektedir. Mısır şurubu ve pirinç içeren bebek mamalarında da C. botulinum 'a rastlanmakla beraber, bunlardaki C. botulinum sayısı baldaki sayıya göre çok daha düşük olduğu için bu tip gıdalara balda olduğu gibi potansiyel tehlike olarak bakılmamaktadır. C. botulinum sporlarının havadaki toz ile solunup, tükürükle 3

karışarak mideye ve bağırsaklara ulaştığında burada çimlenip geliştikten sonra özellikle bebeklerde zehirlenmelere yol açabildiği de belirtilmektedir. Botulin, bugün için bilinen en tehlikeli toksinlerden birisi olmakla beraber, bazı kas hastalıklarının tedavisinde A tipi botulin kullanılmaktadır. Özellikle aşırı kas kasılması nedeni ile göz kapaklarının açılmaması olarak tanımlanan blephospazm hastalığında kasa çok düşük dozda botulin injekte edilmekte, burada tipik botulizmde olduğu gibi toksin sinir uçlarına bağlanmakta ve aşırı kas kasılmasına neden olan asetilkolinin salgılanmasını bloke etmektedir. Böylece injekte edildiği kasta kasılmaya neden olmakla beraber, önceden kasılmalar nedeni ile doğru çalışmayan diğer kasların düzgün çalışmasını sağlamaktadır. Bunun dışında, çeşitli kramplar ve kas kasılmaları, diş sıkmak gibi hastalıkların da tedavisinde kullanılması üzerinde çalışılmaktadır. Yüz kaslarında zayıflama sağlayarak kırışıklıkların önlenmesi ise FDA tarafından yasaklanmıştır. 02. Analizi; Genel Bilgiler Gıdalarda C. botulinum analizi var/yok testi ile yapılır. Bu amaçla zenginleştirme, selektif katı besiyerine sürme ve izolasyon ile identifikasyon aşamaları uygulanır. Tipik kolonilere biyokimyasal identifikasyon yerine toksin testleri uygulanarak C. botulinum olup olmadıkları belirlenir. Toksin testleri fare denemeleri ile yapılmaktadır. Toksinin hangi tipe girdiği ise serolojik yöntemlerle belirlenmektedir. C. botulinum analizi standart bir mikrobiyolojik kalite kontrol laboratuvarında yapılmamalıdır. Gelişmiş ülkelerde bu bakterinin analizinin yapılabilmesi için özel güvenlik önlemlerinin alındığının belgelendirilmesi gereklidir. Bu kısıtlamanın nedeni gıdaların C. botulinum açısından analizinde pozitif sonuç koşulunda laboratuvarda, botulin içeren bir gıdanın içerdiği toksine oranla binlerce kat daha fazla miktarda toksin olmasıdır. Bu analizin yapıldığı laboratuvarlarda en azından belirli antitoksinlerin sürekli ve taze olarak bulundurulması, nasıl kullanıldığı tatbikat yapılarak personele öğretilmiş ve acil olarak kullanılması gereken portatif solunum destek cihazlarının el altında ve işler halde tutulması, analiz sonrası kullanılan besiyerlerinin ve çalışma ortamının sterilizasyonu/dezenfeksiyonu, laboratuvar kapısına botulin ile çalışıldığını uyaran levhalar asılması, tercihen bağımsız bir laboratuvarın ya da laboratuvarda özel bir bölmede bu analizlerin yapılması, hafta sonları ve/veya çalışma saatleri dışında yalnız çalışılmaması gibi ayrıntılar sadece iyi ve doğru laboratuvar uygulama (GLP; good laboratory practice) kurallarının sağlanması değil, bunun ötesinde özel olarak yasal denetlemeleri de gerektirmektedir. 03. İzolasyon C. botulinum analizinde ön zenginleştirme için 15 ml olarak hazırlanmış cooked meat medium (CMM), trypticase peptone glucose yeast extract (TPGY) broth ya da bu besiyerinin tripsin ilave edilmiş şekli olan TPGY tripsin (TPGYT) broth kullanılır. Besiyerleri inokülasyondan önce 10-15 dakika süre ile kaynar su banyosunda tutularak oksijenin çıkması sağlanır ve sarsılmamasına dikkat edilerek hızla soğutulur. Analizlerde temel olarak CMM ve TPGY besiyerleri kullanılır. Eğer proteolitik olmayan B, E veya F tipi toksin oluşturan bir bakterinin varlığından kuvvetle şüphe ediliyor ise TPGY yerine TPGYT broth kullanılır. 4

Sıvı gıdalardan doğrudan 1-2 ml, katı gıdalardan da aynı şekilde 1-2 g alınıp her iki besiyerinin 2 'şer tüpüne ayrı ayrı aktarılır. Katı gıda küçük parçacıklardan oluşuyor ise doğrudan steril pens ile besiyerine aktarılabilir. Büyük parçalar ise önceden soğutulmuş kum ile aynı miktarda olmak üzere ph 'sı 6,2 olan jel fosfat tampon ile havanda ezilir ve böylece homojen hale getirilmiş gıda ön zenginleştirme amacı ile kullanılır. Homojenizasyon için havan yerine stomacher de kullanılabilir. CMM 35 o C 'da, TPGY (veya TPGYT) broth ise 28 o C 'da 5 gün süre ile inkübe edilir. Bu sürenin sonunda besiyerlerinde bulanıklık, gaz oluşumu ve CMM besiyerinde et parçacıklarının parçalanması kontrol edilir. Yeterli gelişme görülmüyor ise hasar görmüş olan sporların geciken çimlenmesinin kontrolü için inkübasyona 10 gün daha devam edilir ve ancak toplam 15 gün sonra gelişme olmayan örnekler steril kabul edilir. Genel olarak 5 günlük süre aktif gelişme ve toksin oluşumu için yeterlidir. Gelişme olan tüpler asılı damla yöntemi ile faz kontrast mikroskopta, ya da kristal viyole veya metilen mavisi ile boyanarak normal ışık mikroskobunda incelenir. C. botulinum tipik olarak tenis raketi şeklinde spor oluşturur. C. botulinum, gerek ön zenginleştirme kültürlerinden gerek doğrudan gıda maddesinden kolaylıkla izole edilebilir. Vejetatif hücrelerin öldürülmesi için 1-2 ml ön zenginleştirme kültürü aynı hacimde filtre ile sterilize edilmiş absolü alkol ile karıştırılıp vida kapaklı tüpte oda sıcaklığında 1 saat bekletilir. Alternatif olarak 1-2 ml örnek alınıp 80 o C 'da 10-15 dakika ısıtılır. Eğer proteolitik olmayan tiplerin varlığından şüphe ediliyor ise ısıl işlem uygulanmamalıdır. Gıda maddesinde C. botulinum sporlarının yoğun olduğu tahmin ediliyor ise sıvı kısımdan alınacak örnek önce yukarıda açıklanan şekilde mikroskobik olarak incelenir, tipik sporların görülmesi halinde ön zenginleştirmeye gerek duyulmadan doğrudan ısıl işlem veya alkol uygulamasına geçilebilir. Selektif izolasyon için ısıl işlem veya alkol uygulaması yapılarak vejetatif hücreleri öldürülmüş kültürden yüzeyi yeterince kurutulmuş olan liver veal egg yolk (LVE) agar ve anaerobic egg yolk (AEY) agar besiyerlerine öze ile sürme yapılır. Bunların dışında blood agar, McClung Toabe agar besiyerleri de izolasyon amacı ile kullanılmaktadır. Anaerob kavanozda 35 oc 'da 48 saat inkübasyon sonunda tipik koloniler seçilir. İzolatların saf olduğunun belirlenmesi için her izolat 2 adet egg yolk agara sürülür. Petri kutularından birisi anaerob, diğeri anaerob ortamda 35 o C 'da 48 saat inkübe edilir. Aerob inkübasyonda gelişme olmaması, anaerob inkübasyonda ise koloni gelişimi kültürün saf olduğunu gösterir. AEY besiyerinde C. botulinum lipaz aktivitesi nedeniyle koloniler etrafında zonlar oluşturmaktadır. C. botulinum 'un C, D ve E tipleri lesitinaz aktivitesi sonucu kolonilerin etrafında genellikle 2-4 mm çapında sarı renkli presipitasyon halkası oluştururken, A ve B tipleri daha küçük halka oluşturmaktadır. Toksin oluşturmayan diğer Clostridium türleri de bu besiyerlerinde C. botulinum 'a benzer koloni morfolojisi gösterirler. 04. İdentifikasyon Kavram olarak botulin nörotoksini üreten bakteriler C. botulinum olarak tanımlanırlar. Buna göre izolatın bu toksini oluşturup oluşturmadığının saptanması ile identifikasyon bir anlamda 5

tamamlanmış olur. Bununla beraber çeşitli biyokimyasal testlerden oluşan minyatürize API Rapid ID 32 A (biomérieux) test kiti C. botulinum identifikasyonunda kullanılmaktadır. Selektif katı besiyerinden en az 10 tipik koloni izole edilerek bunlara biyokimyasal identifikasyon ve/veya toksin testleri uygulanmalıdır. Cooked Meat Medium ticari olarak sağlanabilmektedir. TPGY besiyeri, trypticase 50 g ; pepton 5 g ; yeast extract 20 g ; dextrose 4 g ; sodyum thioglycollate 1 g ; destile su 1 litre bileşimi ile hazırlanır. Bileşenler çözülüp 121 o C 'da 10 dakika sterilize edilir. TPGYT besiyeri hazırlamak için TPGY besiyerine tripsin ilave edilir. Bu amaçla 1:250 olarak tanımlanan tripsinden 1,5 g alınıp 100 ml destile suda çözülür. Bir süre beklenip erimeyen parçacıklar dibe çöktükten sonra üstte kalan kısım 0,45 μ porlu filitreden geçirilerek sterilize edilir. TPGY besiyerine kullanmadan hemen önce ilave edilir. Tripsin çözeltisi önce kaynar su banyosunda tutularak oksijen çıkartılır, sonra 15 ml TPGY besiyerine 1 ml olarak ilave edilir. LVE agar besiyeri hazırlanması için ticari preparat olan liver veal agar besiyeri 48,5 g alınıp 500 ml destile suda çözülür, sterilizasyondan sonra 45 o C 'a soğutulup 40 ml yine ticari olarak sağlanabilen %50 yumurta sarısı emülsiyonu 500 ml bazal besiyerine eklenir ve Petri kutularına dökülür. AEY agar, yeast extract 5 g ; trypticase 5 g ; protease peptone 20 g ; NaCl 5 g ; agar 20 g ; destile su 1 litre bileşimi ile hazırlanır. Sterilizasyondan sonra 45 o C 'a soğutulup 80 ml ticari olarak sağlanabilen %50 yumurta sarısı emülsiyonu 1 litre bazal besiyerine eklenir ve Petri kutularına dökülür. 05. Botulin Toksinin Belirlenmesi Bir gıdada canlı C. botulinum 'a rastlanılmış olması o gıdanın botulizm açısından mutlak tehlikeli olacağını göstermez. Zehirlenme için bakterinin gelişmesi ve toksin oluşturması gerekir. Bu nedenle gıdanın botulizm açısından gerçek kontrolü canlı hücre aranması/ sayılması yerine toksin varlığının belirlenmesi şeklinde olmaktadır. Bu analiz izolata uygulanabileceği gibi, gıda maddesinde önceden oluşmuş toksin olduğu tahmin ediliyor ise izolasyon aşaması atlanarak doğrudan gıda maddesine de uygulanabilmektedir. Botulin analizi izolatlara uygulanıyor ise izolat öncelikle TPGY besiyerinde 26-28 o C 'da 5 gün inkübe edilerek toksin oluşması sağlanmalıdır. Kültürün proteolitik olmayan B, E veya F tipi toksin üreten bir suş olduğu tahmin ediliyor ise toksini aktive etmek için TPGYT besiyeri kullanılmalıdır. TPGYT besiyerinde bulunan tripsin proteolitik olmayan toksini aktive eder. Bununla beraber proteolitik olan bir bakterinin TPGYT besiyerinde geliştirilmesi sonunda aşırı aktivasyona bağlı olarak sahte negatif sonuçlar alınabilir. Tercihen bakteri TPGY besiyerinde geliştirilip daha sonra bir kısmına tripsin uygulamalı ve her iki kültür ayrı olarak denenmelidir. Tripsin uygulamasında 0,5 g 1:250 tripsin 10 ml suda hafifçe ısıtılarak tripsin çözeltisi elde edilir. Kültürden 1,8 ml alınıp, üzerine 0,2 ml tripsin çözeltisi ilave edilir ve ara sıra hafifçe karıştırılarak 35-37 o C 'da 1 saat inkübe edilir. 6

Gıdada botulin testi yapılıyor ise katı gıdalara öncelikle homojenizasyon işlemi uygulanır. Bu amaçla yukarıda anlatıldığı şekilde havan ya da stomacher kullanılarak gıda homojenize edilir ve homojenizat soğutmalı santrifüjde gıdanın özelliğine göre seçilecek hız ile santrifüjlenir ve süpernatant analizlerde kullanılır. Gerekiyor ise süpernatant ph 'sı 1 N HCl veya NaOH ile 6,2 'ye ayarlanır. Sıvı gıdalar için homojenizasyon ve santrifüjleme aşamalarına gerek yoktur. Gıdanın (ya da katı gıdada olduğu gibi gıda ekstraktının) yukarıda açıklandığı şekilde bir kısmına tripsin uygulanmalıdır. Katı gıdalarda süpernatantın 0,45 μ porlu filitreden geçirilmesi ile farelerin spesifik olmayan ölümleri önlenebilir ya da azaltılabilir. Bu şekilde elde edilen kültür ya da gıda örneğine aşağıda açıklandığı şekilde fare denemesi uygulanır. Her deneme için 20-25 g ağırlığında 2 fare kullanılmalıdır. Bunların birisi tripsin uygulanmış, diğeri tripsin uygulanmamış örnek için kullanılır. - Tripsin uygulanmış ve uygulanmamış örnekler jel fosfat tampon ile 1:5 ; 1:10 ve 1:100 oranında seyreltilir. Seyreltme yapılmamış örnek de dahil olmak üzere 4 örnek 0,5 'er ml intraperitonal (karın altı)olarak farelere ayrı ayrı steril şırınga ile verilir. - Tripsin uygulanmamış örnekten 1,5 ml alınıp, 100 o C 'da 10 dakika ısıtılır ve buradan yine 0,5 ml alınarak aynı şekilde fareye aşılanır. Bir anlamda kontrol olan bu fare deneme sonunda canlı kalmalıdır. - 48 saat süresince farelerde botulizm belirtileri izlenerek belirtiler ve ölümler kaydedilir. Botulizmin tipik belirtileri ilk 24 saatte fare derisinin buruşmasıyla başlar. Solunum güçlüğü, kol ve bacaklarda güçsüzlük, felç ve son olarak solunum yetersizliği ve ölüm gerçekleşir. Botulizmin klinik belirtileri olmadan ölen fareler enjekte edilen örneğin botulin toksini içerdiğini göstermeye yeterli değildir. Nadiren ölüm enjekte edilen sıvıdaki diğer kimyasallardan meydana gelebilir. Eğer 48 saat sonra ısıl işlem görmüş preparat ile aşılanan kontrol faresi dışındaki tüm fareler ölmüş ise toksisite testinin daha yüksek dilüsyonlar kullanılarak tekrarlanması ile minimum öldürücü doz (minimum lethal dose ; MLD) belirlenir ve bu şekilde özellikle gıda örneğindeki toksin miktarı tahmin edilebilir. - Toksin varlığı belirlendikten sonraki aşama toksinin hangi tip olduğunun saptanmasıdır. Bunun için A, B, E, F monovalent antitoksinleri ayrı ayrı steril serum fizyolojik ile 1 IU/0,5 ml olacak şekilde rehidre edilir. Her antitoksin için biri tripsin uygulanmış, diğeri tripsin uygulanmamış olmak üzere birer çift fare MLD konsantrasyonunda olacak şekilde botulin içeren örnek ile yine 0,5 'er ml olarak aşılanır. Antitoksinler farelere toksinlerin enjeksiyonundan 30-60 dakika önce 0,5 ml olacak şekilde aşılanmalıdır. Bu aşamada toksin enjekte edilmiş ancak antitoksin enjekte edilmemiş 1 'er çift ve antitoksin enjekte edilmiş ancak toksin enjekte edilmemiş 4 fare kontrol olarak kullanılır. - Tripsin uygulanmış ve uygulanmamış örnekler ile antitoksin verilmiş farelerdeki ölümler izlenerek toksinin hangi tipe girdiği belirlenebilir. Toksin tipinin belirlenmesi için ilk aşamada sadece antitoksin enjekte edilmiş farelerin durumu incelenir. Bu 4 farenin de deneme sonunda canlı kalmış olması gerekmektedir. İkinci aşamada ise yapılması gereken antitoksin verilmemiş, ancak tripsin uygulanmış ve uygulanmamış örneklerin enjekte edildiği 2 farenin canlılıkları incelenir. Bu aşamada proteolitik olan ya da olmayan bir toksinin varlığı belirlenmiştir. Son olarak hangi antitoksin grubunda canlılık olduğu kontrol edilerek toksin tipi belirlenir. A, B, E, F antitoksinlerinden hangisi farelerin canlı kalmasını sağlıyor ise toksinin o tipe girdiği saptanır. 7

C. botulinum toksin analizinin bu şekilde yapılması pahalı ve zaman alıcıdır. Süreyi kısaltmak için önzenginleştirme aşamasında elde edilen kültürlerin doğrudan farelere verilmesi ile toksin oluşturan bakteri varlığı anlaşılmış olur. Bu denemede elde edilen verilere göre toksinin proteolitik olup olmadığı belirlenebileceği için ileri aşamalarda buna göre tripsin uygulaması yapılır ya da yapılmayarak daha az sayıda fare kullanılmış olur. Ancak bu koşulda hem tripsin uygulanmış hem de uygulanmamış farelerin ölümü görülür ise analiz edilen gıdada proteolitik olan ve olmayan toksinleri üreten en az 2 farklı bakteri olduğu anlaşılır. Tripsin uygulanmış ve uygulanmamış örneklerin farelere verilmesi sonunda her iki fare de canlı kalır ise örnekte C. botulinum ve botulin toksini olmadığı anlaşılır ve denemeye bu aşamada son verilir. Botulin toksinlerinin belirlenmesinde PCR tekniklerinden ve DNA problarından da yararlanılmakta olup bu amaç için spesifik olarak geliştirilmiş primerler kullanılmaktadır. 8