helena www.helena-biosciences.com BioSciences Europe Kullanım Talimatları SAS-1 Acid Hb-12 Katalog No: 201000
KULLANIM AMACI SAS-1 Asit Hb-12 kit agaroz jel elekroforez ile insan hemoglobinlerini ayırmak için tasarlanmıştır. Baş fonksiyonlara sahip bir protein grubu olan hemoglobinler(hb) ters yönde karaciğerde karbon dioksit ve dokudan oksijen taşımaktadır. Hemoglobinler peptit zincirlerleri oluşturur ve buna globin ve demir protoporfirin Heam denir. Dört polipeptid zincirlerin her biri spesifik bir amino asit sırası oluşturur. Her normal hemoglobin molekülü alfa olmayan bir zincir çifti ve bir alfa zinciri çifti içerir. Normal yetişkin hemoglobininde (HBA), alfa olmayan zincirlere beta denir. Fetal hemoglobinin alfa olmayan zincirine gama denir. Minör (% 3) bir hemoglobin fraksiyonuna HbA2 denir ve bu alfa ve delta zincirleri içerir. Diğer iki zincir embriyo içinde oluşur. Normal yetişkin eritrositleri içinde majör hemoglobin HbA dir ve eritrosit içinde HbA2 ve HbF küçük miktarlarda bulunmaktadır. Ayrıca, günümüzde 400'den fazla mutant hemoglobin bilinir özellikle diğer anormal hemoglobin ile kombinasyonunda veya homozigot durumunda bazı hemoglobinler ciddi klinik etkilere neden olabilir. Wintrobe1 de hemoglobin sentezinin anormallikleri üç grupta ayrılır. 1. Anormal protein molekülünün üretimi (orak hücreli anemi gibi). 2. Normal protein sentezinin miktarında azalma (e.g. thalassaemia). 3. Gelişimsel anormallikler (hereditary persistence of foetal haemoglobin (HPFH) gibi ). En sık rastlanan iki mutant hemoglobin HBS ve HBC dir. Hb Lepore, HBE, HbGPhiladelphia, HBD-Los Angeles ve HBO-Arap genellikle daha az görülebilir 2. Elektroforez genellikle hemoglobinopatiyi tanımlamak ve ayırmak için kullanılan en iyi yöntem olarak kabul edilir. Hemoglobin elektroforezin protokolu iki sistemin adım adım kullanımını içerir 3-8. İlk elektroforez alkali tampon ile yapılmaktadır. Ancak, birçok yapısal olarak farklı haemoglobinin elektroforetik benzerliği nedeniyle, değerlendirme elektrik yükü dışında bir özellikle ölçülen asit tampon elektroforez ile desteklenmelidir. Bu yöntem, bir alkalin elektroforetik tampon ve agaroz desteği ile hemoglobinin kompleks etkileşimine dayalıdır. SAS-1 Asit Hb-12 prosedürü çeşitli diğer anormal hemoglobinlerin yanı sıra HbS, HbC ve Hbf varlığında tamamlayıcı ispatını (SAS-1 Alkalin Hb-12 analizinden gelen sonuçları ile birlikte) sağlamak için hemolizatin dakikalık miktarını gerektiren basit bir prosedür. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun. BİLEŞENLER 1. SAS-1 Asit Hb Jel Koruyucu olarak sodyum azid ile bir Sitrat/Maleate buffer agaroz içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. Konsantre Mor Asit Boya
Konsantre mor asit boya içerir. Şişe içeriği 700ml saf su ile dilüe edilir. Kullanım öncesi karıştırılır ve filtre edilir. İyi kapatılmış bir şişede saklanır. 3. Hemoglobin Lizin faktörü Koruyucu olarak potasyum siyanür, ve tiyomersal ile saf suda Triton X-100 içerir. Paket içindeki Eritme Faktörü kullanım için hazırdır. 4. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda kurutma kağıdı C ve Soak-away kurutucular içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. SAS-1 Asit Hb Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulmasını belirtebilir,1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3)bakteriyal ya da fungal kaynaklı agarozun görülür kontaminasyonunu belirtir. 2. Mor Asit Boya Konsantre boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solusyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir. Boya kapasitesinin azalmasını önlemek için derhal kullanılan boyanın çıkarılması tavsiye edilir. Zayıf boyama performansı, boya solusyonunun bozulduğunun göstergesidir. 3.Hemoglobin Lizin Faktörü Lizin Faktörü 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Partikül kirlenme veya bulanıklık bozulma göstergesidir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katalog No.210200 Numune Aplikatör Ucu (1 x 10) Katalog No.210300 Numune Aplikatör Ucu (5 x 10) Katalog No.210100 Tek kullanımlık numune kapları (100) Katalog No. 310907 SP100 Numune Tepsisi Katalog No.3100 REP Prep Katalog No.5328 AA2 Hemo Kontrol Katalog No.5329 ASA2 Hemo Kontrol Katalog No.5330 AFSA2 Hemo Kontrol Katalog No.5331 AFSC Hemo Kontrol 60-70 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını Fiksatif /Boya arındırıcı solüsyon: 950 ml saf su ve 50 ml glasial asetik asit karıştırın. İyi kapatılmış bir şişede saklanır. Tuz solüsyonu (%0.85 NaCl) Saf su
NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanmış EDTA yada heparin antikoagulant edilmiş kandır. Numuneler1 haftaya kadar 2-6 derecede buzdolabında saklanabilir. Optimal sonuçlar için, salinle yıkanan kırmızı hücreler lizin hazırlamak için kullanılır. Bu plazma proteinlerinin olası girişimini engeller. a) 1000μL saline solüsyonu ile iyi karışmış 200μL tam kanı karıştırın. b) Kırmızı hücrelerin sedimenti için santrifüjleyin. c) 1000μL süzüntü ve atığı uzaklaştırın. d) İlaveten 1000μL saline solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın. e) b-d x2 adımları tekrar edin. f)son santrifüjün ardından 1000μL süzüntüyü uzaklaştırın ve tam kan gibi kalan numuneyi işleyin veya tüm süzüntüyü uzaklaştırın ve yıkanan paketlenmiş hücreler gibi kalan numuneyi işleyin. Hemoglobin Lizis Faktörlü 0.5-1.5 g/dl hemoglobin konsantrasyonuna her bir hasta numune/kontrolunü dilüe edin. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Numune tepsisi veya tek kullanımlık numune kaplarının uygun kuyusuna numunenin 35μl pipetleyin. İ) SAS-1 & SAS- I Plus kullanıcıları: SAS-1 numune tepsisini kullanın. Aplikatör çekmecesinde numune tepsisi dikkatlice yerleştirilir. Tepisinin pozisyonuna kuvvetlice itilmesi sağlanır. İİ) SAS-3 kullanıcıları: SP100 numune tepsisini kullanın. Kullanılan numune dikkatlice numune tepsisine yerleştirilir. Poziyonlandırılan tepsinin güvenilirliği sağlanır. 2. Jeli paketinden çıkarın ve: İ)SAS-1 kullanıcıları: Jel SAS-1 e yerleştirilir, agaroz toplanır, uygun elektrot kolları ile negatif ve pozitif uçları ayarlanır. İİ) SAS-1 Plus kullanıcıları: Sıcak havuza 400μL REP Prep boşaltılır. Sıcak havuza jel yerleştirilir, agaroz toplanır, uygun elektrot kolları ile pozitif ve negatif uçları ayarlanır, jelin altında hava kabarcığı oluşumunu önlemeye dikkat edin. İİİ)SAS-3 kullanıcıları: Havuza ayarlama kılavuzunu yerleştirin ve 400μL REP prep tankın merkezine boşaltın. Jeli agarozun toplandığı kuyuya yerleştirin, kılavuzu kullanın, uygun elektrot kolları ile negatif ve pozitif uçları ayarlayın, jelin altında hava kabarcığını oluşumunu önlemeye dikkat edin. Katot ve anot elektrotların dış kısımlarına birer soak-away kurutucuyu yerleştirin. Soak-away ların jel ile temasta olup olmadığından emin olun. 3.Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdını atın. 4. İ)SAS-1 kullanıcıları: Elektrot kollarının üst tarafına elektrotlar eklenir böylece jel blokları ile temasa gelirler. İİ)SAS-1 Plus kullanıcıları:(yukarıdaki gibi) Jelin ve elektrodların üzerine kapak yerleştirilir ve teması sağlamak için 5 saniye kuvvetlice bastırılır. İİİ)SAS-3 kullanıcıları: Elektrot kollarına elektrotlar eklenir böylece jel blokları ile temasa gelirler.
5.Cihaz üzerindeki pozisyonda bir aplikatör ucu bir araya getirilerek yerleştirilir.(sas-3 kullanıcıları: delik 9) 6. Asit Hemoglobin elektroforezi yapılır: İ)SAS-1 kullanıcıları:60 volt, 22 dakika, 2 aplikasyon İİ)SAS-1 plus kullanıcıları: Elektroforez: 60 volt, 22 dakika, 18 C, 2 aplikasyon İİİ)SAS-3 kullanıcıları: Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık( C) Voltaj Diğer Numune Yükleme 00:30 18 Hız 6 Numune Uygulama 00:30 18 Hız 6* 2 aplikasyon için numune yükleme,numune uygulama adımlarını tekrar edin Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık( C) Voltaj Diğer Elektroforez 14:00 18 100 Kurutma 08:00 62 * Yerleştirme 2 kullanılır Not:Kuruta öncesi jel bloklarını alın. 7. Elektroforezin ardından: İ)SAS-1 kullanıcıları: kapağı alın. İİ)SAS-3 kullanıcıları: soak-away kurutucuları alın. İİİ)SAS-1 ve SAS-1 Plus kullanıcıları: Jel Blok Kaldırıcı kullanılarak her iki jel bloklarını çıkarın. 8.Boyama tank tutucusuna jeli ekleyin. 9.Boyama biriminde Asit Hemoglobin test programı seçilir ve Fiks,Boya,Boya arındırma ve jel kurutma aşağıdadır. a)sas-2(oto-boyayıcı) Adım Solüsyon Zaman(dk:sn) Kapı Sıcaklık( C) Fiks Fiksatif/Boya 05:00 4 arındırıcı solüsyon Boya Mor Asit 15:00 5 Boya arındırma Fiksatif/Boya arındırıcı solüsyon 00:10 4 Kurutma - 15:00 65 Boya arındırma Boya arındırma Fiksatif/Boya arındırıcı solüsyon Fiksatif/Boya arındırıcı solüsyon 02:00 4 02:00 4
Yıkama Saf su 01:00 1 Kurutma - 15:00 65 b) SAS-3 kullanıcıları(manuel) Fiks, boyama, Boya arındırma ve yıkama adımları için bir boyama banyosu ve kurutma adımları için 60...70 C de üfleme kapasiteli bir kurutma fırını kullanarak SAS-2 Oto-boyayıcı için listelenen adımları izleyin. 10. Boyama dönüşümünün sonunda, boyama alanından jeli alın. Jel şimdi incelenmek için hazırdır. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Kalitatif Değerlendirme: Numunelerde bulunan hemoglobin tiplerinin olası tanımlanması tamamlanmış jelin görünür değerlendirmesi ile tespit edilebilir. Hemo kontrolleri bant tanımlanması için bir işaretleyicidir. Şekil 1 en sık rastlanan hemoglobin türlerinin mümkün tanımlanmasını gösterir. Hemoglobin değişkenleri klinik semptomlarla ayırt edilmezler bundan dolayı araştırmacıların öncelikli ilgisini çekmezler. Talasemi sendromlar, yaşam boyu siyanoz, hemolitik anemi eritrositler veya orak bozukluğuna neden olan değişkenlerin varlığında veya eğer heterozigot genetik görüş için yeterli olarak yaygınsa klinik olarak önemlidir. HbS-S, HbS-D-Los Angeles, and HbS-O Arab ın kombinasyonları ciddi orak bozukluklara neden olurlar. HBH, E-Fort Worth ve Lepore dahil olan çeşitli değişkenler talasemik bir kan resmine neden olur. 2 Patoloji ve frekans açısından en önemli iki değişken hemoglobin Hbs and HbC2 dir. Orak hücreli anemi (HbSS) acı verici ve ölümcül bir hastalıktır. Yaklaşık olarak 5-6 aylarda ortaya çıkar. Klinik seyri vücudun neredeyse tüm organlarında enfarktüs, halsizlik, letarji ve anemi ile sıcaklık yükselmesi ve ağrı çekilmesidir. Homozigot HbCC tek tek eritrosit içinde HbC in kristalleşmesi ya da çökelmesine neden olan hafif
hemolitik anemiye maruz kalır. HbSC hastalık vakalarında orak-hücreli anemi daha hafif bir hemolitik anemi ile karakterize edilmektedir. Diğer zincirler normal olarak sentezlenirken globin(α veya β) zincirinin azalmış sentezinden dolayı hipokromi ve mikrositoz ile hemoglobin bozukluklarının bir grubunu olan talasamialar karakterize edilir. 9, 10 Kararsız globin zincirleri bu dengesiz sentezin sonuçlarıdır. Kırmızı hücre içinde bu çözelti, hücrenin kısa ömürlü organlarının dahil edilmesi ile oluşturur. a-talasemide, bir zincir azalır veya hiç bulunmaz ve β-talasemide b zincirleri etkilenir. Hbf in devam eden yüksek yüzdesinin sonucu olan doğumdan sonra yaklaşık dört ayda gama zinciri sentezinde son bulan mekanizmaların genetik bir hatası hemoglobin kantitatif bozukluğu sentezi ve kalıtsal persistan fetal hemoglobini (HPFH) gösterir. En sık hemoglobin anormallikleri: Orak Hücre özelliği HbA2 in normal bir miktarını ve HbA ve HbS gösteren bir heterozigot durumdur. Sitrat agar sonuçları HbA ve HBS göçmen pozisyonlarında (bölge) hemoglobin gösterir. Orak Hücre Anemi Ancak HbF in küçük bir miktarında var olmasına rağmen, bu bir homozigot durumdur ve neredeyse sadece HbS gösterir. Orak-C Hastalığı Bu bir heterozigot durumudur, HbS ve HbC gösterir. Orak Hücre -Talasemi Hastaligi Bu durum HbA, HbF, HbS ve HbA2 gösterir. Orak Hücre βo-talasemi HbA içinde yoktur. Orak Hücre β +-talasemi HbA içinde azaltılmış miktarda bulunur. Talasemi-C Hastalığı Bu durum HbA, HbF ve HbC gösterir. C Hastalığı Bu homozigot durumdur ve neredeyse sadece HbC gösterir. Talasemi Major Bu durum Hbf, HbA ve HbA2 gösterir. SINIRLAMALAR Bazı anormal hemoglobinler benzer elektroforetik mobilite ve diğer metodolojiler tarafından farklı olmalıdır. Testler için gerekli olanlar: 1. Globin zincir analizi (hem asit ve hem de alkali) ve yapısal çalışmalar nadiren bazı haemoglobinleri olumlu olarak tanımlamak için gerekli olabilir. 2.Anyon değişimli kolon kromatografisi HbA2 miktarının belirlenmesi için en doğru yöntemdir. HbS in varlığında HbA2 in kantitasyonu için Helena Biyoteknoloji Orak-Thal Quik Sütun Yöntemi (Kat. No 5334) veya Helena Biyoteknoloji Beta-Thal HbA2 Quik Sütun Prosedürü (Kat. No 5341) tavsiye edilir. HbA2 kantitasyonu, b-talasemi özelliğinin teşhisinde en önemli tanısal testlerden biridir.
3.HbF (1-10%) in düşük seviyelerinde Helena Biyoteknoloji HbF-QuiPlate prosedürü (Kat. No 9.325) kullanarak radyal immunodiffuzyon tarafından doğru şekilde miktarı belirlenebilir. REFERANS DEĞERLERİ Doğumda, normal bir bireyin eritrositinde hemoglobin çoğunlukla fetal hemoglobindir, HbF. Çoğu yetişkin hemoglobinlerin bazıları, HbA ve HbA2 in küçük bir miktarı da bulunur. Yetişkinlik yoluda ve hayatın ilk yılının sonunda çoğunlukla hemoglobin % 2 HbF den daha az ve 3.7% HbA2 kadar olan HbA bulunur. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ a)tekrarlanabilirlik SAS-1 Asit Hb jel hemoglobin bantlarının tanımlanması için kalitatif bir sistemdir. Aynı bant paternleri, Hb s A, S ve A2 içeren bir kontrol materyali kullanarak farklı jeller arasında ve tek bir jel içinde görünür. Bantlar eksik değildir ve ek bantlar uygulamalar arasında gözlenmez. b) Hassasiyet Tamamlanan jelde bir ayrık bant gibi görünen hemoglobinin en düşük konsantrasyonu olarak bant başına 0,08 g/dl belirlenmiştir. c)doğrusallık Hemoglobinin maksimum konsantrasyonu bant başına 4 g/dl dir ve bu bantlar protein yüklenmesi olmadan birbirlerinde yeterli şekilde çözünerek ayrılma bantlarını verir. Bu prosedür densitometrik tarama için tasarlanmamıştır. BİBLİYOGRAFİ 1. Wintrobe, Maxwell M., Clinical Hematology, 6th Edition, Lea and Febiger, Philadelphia, 1967. pages 145-167. 2. Fairbanks, V.F., The Nomenclature and Taxonomy of Hemoglobin Variants, Diagnostic Medicine, Nov/Dec., 53-58, 1980. 3. Schneider, R.G., Hightower, B.J. and Barwick, R.C., Laboratory Identification of the Hemoglobins, Lab Management, 1981; August: 29-43. 4. Center for Disease Control, Laboratory Methods for Detecting Hemoglobinopathies, U.S. Department of Health and Human Services/Public Health Service, 1984. 5. Schneider, R.G.,Methods for Detection of Hemoglobin Variants and Hemoglobinopathies in the Routine Clinical Laboratory, CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, 1978. 6. Schneider, R.G., Hightower, B., Hosty, T.S., Ryder, H., Tomlin, G., Atkins, R., Brimhall, B., and Jones, R.T., Abnormal Hemoglobins in a Quarter Million People, Blood, 1976; 48(5) : 629-637. 7. Huisman, T.H.J. and Schroeder, W.A., New Aspects of the Structure, Function and Synthesis of Hemoglobins. CRC Press, Cleveland, 1971. 8. Schmidt, R.M., Huisman, T.H.J., and Lehmann, H., The Detection of Hemoglobinopathies. CRC Press, Cleveland, 1974. 9. Weatherall, D.J. and Clegg, J.B., The Thalassemia Syndromes, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1972. 10. Lehman, H. and Huntsman, R.G., Man s Haemoglobins, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1974.