Antifungal Duyarlılık Testleri:

2. Ulusal Klinik Mikrobiyoloji Kongresi 9-13 Kasım 2013 Belek-Antalya Antifungal Duyarlılık Testleri: Ne zaman? Hangi Yöntemler? Prof. Dr. Sevtap ARIKAN AKDAĞLI Hacettepe Üniversitesi Tıp Fak. Tıbbi Mikrobiyoloji AD

Temel bilgiler, referans yöntemler ve uygulama endikasyonları

İnvazif Fungal Enfeksiyonlarda Tedavi Başarısızlığının Nedenleri IN VITRO DİRENÇ DİĞER FAKTÖRLER KLİNİK YANITSIZLIK

DİRENÇ KLİNİK IN VITRO MOLEKÜLER AFDT

Antifungal duyarlılık testlerine (AFDT) neden ihtiyaç var? İMMÜN SİSTEMİ BASKILANMIŞ KONAK sayısında artış İnvazif fungal infeksiyon (İFİ) insidansında artış Nadir MANTAR cinsleri ve türleri Yeni ANTİFUNGAL İLAÇLAR Antifungal ilaçlara primer ve sekonder DİRENÇ Nucci et al. CID 2005, 41: 521

AFDT klinik yanıtı ne ölçüde tahmin edebilir? 48% 91% Dirençli Candida -flukonazol Candida - itrakonazol Candida - ketokonazol C. neoformans - flukonazol Histoplasma - flukonazol Rex et al. CID 2002; 35: 982

Candida-AFDT için ESCMID-Candida İzolasyon yeri kılavuzu önerileri ESCMID guideline for the diagnosis and management of Candida diseases: Diagnostic procedures. CMI 2012; 18 (Suppl. 7): 9 RUTİN Amaçlı Öneriler EPİDEMİYOLOJİK Amaçlı Öneriler Kan ve diğer steril bölgeler Tüm izolatlar, özellikle: 1.Antifungal ilaç kullanmış olan olgulardan izole edilen suşlar 2.Klinik yanıtsızlık 3.Nadir ve yeni ortaya çıkan türler 4.Klinik kullanımdaki antifungal ilaç(lar)a dirençli veya daha az duyarlı oldukları bilinen türler Tüm izolatlar referans bir yöntem veya (geçerliliği kabul edilmiş ticari bir sistem) ile test edilmeli Yüzeyel bölgeler Tedaviye yanıt vermeyen veya tekrarlayan enfeksiyon Antifungal ilaç kullanmış hastalardan sürveyans kültürleri Periyodik epidemiyolojik çalışmalar yapılmalı Pfaller et al. Clin Microbiol Rev 2006; 19: 435; Reyes et al. Drug Resist Update 2000; 3: 14; Rex et al. CID 2002; 35: 982; Hospenthal et al. DMID 2004; 48: 153

Candida-AFDT için ECIL-2011 önerileri Hematolojik hastalarda kan veya steril vücut bölgelerinden izole edilen suşlarda AFDT şu amaçlarla yapılmalıdır: -klinik yanıtsızlık veya mikrobiyolojik eradikasyonun sağlanamaması durumunda olası nedenin değerlendirilmesi A II - başlanan antifungal tedavide değişiklik kararının desteklenmesi B II -IV antifungal ilaçtan oral azole geçiş kararının desteklenmesi A II ECIL-4 Update 2011 Antifungal Therapy

Referans Antifungal Duyarlılık Testi Yöntemleri -I CLSI M27-A3 Candida, Cryptococcus CLSI M38-A2 Aspergillus, Rhizopus, Fusarium, P. boydii, S. schenckii-küf formu, dermatofitler, dematisiyöz küfler CLSI M44-A2 Candida CLSI M51-A Dermatofit dışı küfler

CLSI- Supplement =Ek Dökümanlar 1 M27-S4: Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; 4th Informational Supplement M27-A3 için güncellenmiş tablolar Yayınlanma tarihi: 28/12/2012

M27-S4

CLSI- Supplement =Ek Dökümanlar 2 M44-S3: Zone Diameter Interpretive Standards, Corresponding Minimal Inhibitory Concentration (MIC) Interpretive Breakpoints, and Quality Control Limits for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts; Informational Supplement M44-A2 yöntemi için kalite kontrol değerleri Yayınlanma tarihi: 28/08/2009

CLSI- Supplement =Ek Dökümanlar 3 M51-S1: Performance Standards for Antifungal Disk Diffusion SusceptibilityTesting of Filamentous Fungi; Informational Supplement M51-A yöntemi için kalite kontrol ve ECOFF değerleri Yayınlanma tarihi: Mayıs 2010

Referans Antifungal Duyarlılık Testi Yöntemleri -II EUCAST E.Dis 7.2 Candida, Cryptococcus EUCAST E.Dis 9.1 Konidyum oluşturan küfler Alman referans yöntemi, DIN-58940-84

EUCAST- Diğer Dökümanlar Rationale documents for antifungal agents Amphotericin B vs. Candida v 1.0 Amphotericin B vs. Aspergillus v 1.0 Anidulafungin vs. Candida v 2.0 Fluconazole vs. Candida v 2.0 Itraconazole vs. Aspergillus v 1.1 Micafungin vs. Candida v 1.0 Posaconazole vs. Candida v 1.0 Posaconazole vs. Aspergillus v 1.0 Voriconazole vs. Candida v 2.0 Voriconazole vs. Aspergillus v 1.0 http://www.eucast.org/antifungal_susceptibility_testing_afst/rationale_documents_for_antifungals/

CLSI M27-A3 ve EUCAST E.Dis 7.2 mikrodilüsyon test parametreleri Besiyeri İnokulum yoğunluğu Mikrodilüsyon plakları MİK okuma zamanı CLSI M27-A3 EUCAST E.Dis 7.2 RPMI-1640 (L-glutaminli, bikarbonatsız, glu: %0.2 RPMI-1640 (L-glutaminli, bikarbonatsız, glu: % 2) 0.5-2.5 x 10 3 cfu / ml 1-5 x 10 5 cfu / ml 96 U-tabanlı 96 düz tabanlı 48 saat 24 saat 24 saat MİK okuma yöntemi Görsel Spektrofotometrik (530 nm)

M27-A3 MİK okuma zamanı ile ilgili ek ve ayrıntılı öneriler Antifungal İlaç MİK OKUMA ZAMANI (Yeterli üreme olduğunda!) 24 saat 48 saat Amfoterisin B EVET EVET Ekinokandinler EVET HAYIR Flukonazol EVET EVET Flusitozin HAYIR EVET Itrakonazol HAYIR EVET Posakonazol HAYIR EVET Ravukonazol HAYIR EVET Vorikonazol HAYIR EVET Ref.: CLSI M27-A3

CLSI M38-A2 ve EUCAST E.Dis 9.1 mikrodilüsyon test parametreleri CLSI M38-A2 EUCAST E.Dis 9.1 Besiyeri Inokulum yoğunluğu RPMI-1640 (L-glutaminli, bikarbonatsız, glu: %0.2 Dermatofit dışı küfler: 0.4-5 x 10 4 cfu/ml Dermatofitler: 1-3x10 3 cfu / ml RPMI-1640 (L-glutaminli, bikarbonatsız, glu: % 2) 1-2.5 x 10 5 cfu / ml Mikrodilüsyon plakları MİK okuma zamanı MİK okuma yöntemi 96 U-tabanlı 96 düz tabanlı 24-72sa (cinse ve üreme yeterliliğine göre değişir) Görsel 24-72sa (cinse ve üreme yeterliliğine göre değişir) Görsel

Önerilen MİK okuma değerleri ( MIC endpoint ) Amfoterisin B: Flukonazol: Itra, Posa, Vori: Ekinokandinler: Siklopiroks: Grizeofulvin: Terbinafin: MİK-0 MİK-2 (Candida) MİK-0 (Aspergillus) MİK-1 (dermatofitler) MİK-2 (Candida) MİK-2 (Candida) MEK (Aspergillus) MİK-1 (dermatofitler) MİK-1 (dermatofitler) MİK-1 (dermatofitler)

MEK tanımı Üreme kontrol çukurunda gözlenen, hifal üremeyle kıyaslandığında küçük, yuvarlak, hif formlarının oluşmasına neden olan en düşük ekinokandin konsantrasyonu Ekinokandinler, küf Ref.: CLSI M38-A2

CLSI ve EUCAST mikrodilüsyon yöntemleri arasındaki uyum

Candida-Flukonazol MİK leri: CLSI ve EUCAST ın uyumu EUCAST İki yöntemle genelde benzer sonuçlar EUCAST ile MİK değerleri biraz daha düşük CLSI 24 saatte CLSI ve EUCAST MİK leri aynı Rodriguez-Tudela et al. JCM 2007; 45: 109

Aspergillus için CLSI-EUCAST uyumu % Uyum ( +2 dilüsyon ) CLSI-EUCAST Vori Posa 98.8 86.3 Uyumsuz suşlarda, EUCAST MİK leri daha yüksek Chryssanthou et al. CMI 2006; 12: 901; Lass-Florl et al. Med Mycol 2006; 44 Suppl.: 319

Mevcut MİK direnç Sınır Değerleri ve Epidemiyolojik Eşik Değerler (ECV/ECOFF) - Candida - Aspergillus

C. glabrata-flukonazol: yeni duyarlılık kategorileri C. glabrata, Flukonazol MİK < 32 =S-DD Flukonazol tedavisi maksimum dozdan verilmeli Ref.: CLSI M27-A3

Direnç Sınır Değerleri; Yeni düzeltmeler ve eklemeler: EUCAST web sitesi

www.eucast.org/fileadmin/src/media/pdfs/eucast_files/afst/antifungal_breakp oints_v_6.1.pdf AMB, Azoles, Candins - Candida EUCAST AFST for Candida

AMB, Azoles, Candins - Candida EUCAST www.eucast.org/fileadmin/src/media/pdfs/eucast_files/afst/antifungal_breakpoints_v_6.1.pdf IE: Insufficient evidence IE: In preparation

CLSI& EUCAST combined data AMB-Asp EUCAST, CLSI CLSI EUCAST

AMB & Azoles -Asp EUCAST AFST for Aspergillus www.eucast.org/fileadmin/src/media/pdfs/eucast_files/afst/antifungal_breakpoints_v_6.1.pdf

AMB & Azoles -Asp EUCAST www.eucast.org/fileadmin/src/media/pdfs/eucast_files/afst/antifungal_breakp oints_v_6.1.pdf IE: Insufficient evidence

Yeni direnç sınır değerlerinin pratikte kullanımı JCM 2013; 51: 2571 34 ülkeden 98 merkezden toplam 3418 mantar suşu (2010-2011 yılları) GENEL SONUÇ ve UYARI: Düşük oranda triazol ve ekinokandin direnci. C. glabrata suşlarında flukonazol ve ekinokandin direnci yönünden yakın izlem gerekli.

Referans dermatofit duyarlılık testleri: M38-A2 kapsamında

Dermatofitler için AFDT Bir modifiye CLSI M38-A yöntemi M38-A2 dökümanına dahil edildi. Test parametreleri T. menta izolasyon besiyeri: PDA, 30 C, 4-5 gün T. rubrum izolasyon besiyeri: oatmeal cereal agar Hemositometrik sayım:1-3 x 10 3 cfu/ml RPMI-1640 2003 den beri devam eden çok merkezli bir çalışma sonucunda İlaçlar Sikloproks Flukonazol Grizeofulvin Itrakonazol Posakonazol Terbinafin Vorikonazol Referans suşlar T. rubrum MRL666 (ATCC MYA 4438) T. mentagrophytes MRL1957 (ATCC MYA 4439) 35 C, 4 gün ya da üreme kontrolda iyi üreme sağlayan süre Hacettepe Üniv., Mikoloji Lab. MIC-1, CLSI MIC-2 M38-A2,Ghannoum et al. JCM 2006; 44: 4353; Ghannoum et al. JCM 2004; 42: 2977

Mikrodilüsyon referans AFDT nin dezavantajları MİK??? S S-DD R Sonuçlar 24-72 saatte çıkar. Başlangıçta seçilecek antifungal tedaviye katkısı sınırlıdır. S MİK direnç sınır değerleri??? (Tüm ilaç ve türler için henüz belirlenmiş değil. ECOFF lar yardımcı ) S-DD R Heavy trailer Candida-azoller In vitro amfoterisin B direnci?

Disk difüzyon

Disk difüzyon-candida CLSI, M44-A2 Hacettepe Üniv., Mikoloji Lab. RPMI- % 2 glu, Flu, 24sa. Suş no. 317 Hacettepe Üniv., Mikoloji Lab. MHMB- % 2 glu, Flu, 24sa. Suş no. 317

CLSI M51-A: Dermatofit dışı küf mantarları -disk difüzyon M51-P Haziran 2009 M51-A Mayıs 2010

CLSI M51-A yöntemi ile test edilebilecek küf cinsleri ve türleri İnvazif hastalık etkeni küfleri kapsar. Alternaria Aspergillus Bipolaris Fusarium Paecilomyces Mucorales takımı Pseudallescheria boydii Scedosporium prolificans Endemik dimorfik mantarların maya ya da küf formlarını ve dermatofitleri kapsamaz. Ref.: CLSI M51-A

CLSI M51-A yöntemi RUTİN uygulamada kullanılabilir mi? Klinik önemi ve klinik direnç sınır değerleri henüz saptanmamıştır. RUTİN AMAÇLI KULLANILMASI ÖNERİLMEZ. Ref.: CLSI M51-A

CLSI M51-A Test parametreleri %2 glukoz ve %0.5 metilen mavisi EKLENMEMİŞ Mueller Hinton agar (ph: 7.2-7.4) Mantarın üretilmesi: PDA da 35 + 2 C de 7 gün ya da iyi sporülasyon oluşana kadar (M38 dökümanındaki gibi) İnokulum hazırlanması: 0.4-5 x 10 6 cfu/ml, spektrofotometrik (M38 dökümanındaki gibi) İnkübasyon: 35 + 2 C de 16-24 sa. (Mucorales), 24 sa. (A. flavus, A. fumigatus, A. niger), 48 sa. (diğer Aspergillus spp.), 48-72 sa. (Alternaria, Bipolaris, Fusarium, Paecilomyces, P. boydii, S. prolificans) Okuma değeri: Triazol ve kandinler için trailing yok sayılarak okuma yapılır. Diğer ilaçlarda (örn. AMB) trailing direnci işaret eder! Ref.: CLSI M51-A

Referans yöntem dışındaki yöntemler

Etest Kolorimetrik mikrodilüsyon Flow sitometre Ergosterol miktarının tayini İzotermal mikrokalorimetre Arikan et al. DMID 2002; 43: 107; Pina-Vaz et al. JCM 2005; 43: 4674; Arthington-Skaggs et al. AAC 2002; 46: 2477 Arthington-Skaggs et al. AAC 2000; 44: 2081, Vale-Silva et al. Mycoses 2006; 49: 261 ; Tafin et al. AAC 2013; 57: 5704

Etest: Mueller-Hinton metilen mavisi- % 2 glukoz by. ve RPMI 1640- % 2 glukoz by. Flu, 24sa Flu, 48sa Hacettepe Hacettepe Univ., Üniv., Mycology Mikoloji Lab. Lab. Hacettepe Üniv., Mikoloji Lab. MHMB Suş no. 4715 C. tropicalis RPMI MHMB Suş no. 5542 C. albicans RPMI Sims et al. JCM 2006; 44: 2105; Pfaller et al. JCM 2003; 41: 1875

ESKİ direnç sınır değerleri ile Etest ve CLSI yöntemi arasındaki uyum (%) Etest için MİK direnç sınır değerleri???? CLSI MİK direnç sınır değerleri Etest için de kullanılırsa: C. glabrata Flukonazol Vorikonazol Duyarlılık kategorisi uyumu (%) Vorikonazol 95-96 Flukonazol 52-62 MİK değerleri direnç sınır değerlerine yakın olan suşlarda uyumsuz sonuçlar Pfaller et al. JCM 2003; 41: 1875 Çok büyük hata 0% Büyük hata 2% Küçük hata Etest MİK leri 37-46% biraz daha yüksek

ESKİ direnç sınır değerleri ile Etest ve Sensititre YeastOne ile CLSI M27-A3 karşılaştırması Hataların çoğu minör Etest / Sensititre ile elde edilen azol C. glabrata sonuçları dikkatle değerlendirilmeli Alexander et al. JCM 2007; 45: 698

C. norvegensis Etest ve CLSI M27-A3 n=19 MİK okuma zamanı Yöntem Etest ve CLSI yöntemlerinin uyumsuzluğu (hata oranları) Küçük hata Büyük hata Çok büyük hata n % n % n % 24sa. Etest-RPMI 11 57.9 1 5.3 0 0 Etest-MHMB 9 47.4 0 0 0 0 48sa. Etest-RPMI 12 63.2 1 5.3 0 0 Etest-MHMB 6 31.6 0 0 0 0 Arikan et al. 46th ICAAC 2006, M-1576 Influence of Test Medium on Etest Fluconazole (FLU) MICs Against Clinical Candida norvegensis Strains

VITEK 2: Otomatize AFDT sistemleri ile referans yöntem arasındaki uyum Vitek 2 Yeast Susceptibility Test (biomerieux, Inc.) CLSI M27-A3: 48h Vitek 2: 24h max. Genelde yüksek düzeyde korelasyon Eski direnç sınır değerleri ile Posteraro et al. JCM 2009; 47: 1927; Pfaller et al. JCM 2007; 45: 796

YENİ direnç sınır değerleri ile

XTT yöntemi: Candida, C.neoformans, Aspergillus ve Mucorales için Tetrazolyum tuzunun indirgenmesi Metabolizma ölçümü ile mantar üreme miktarının tesbiti Optik dansitenin spektrofotometrik olarak saptanması CLSI yöntemi ile uyum (Aspergillus için): % 97 (AMB) % 83 (Itra) Mucorales takımı için hızlı MİK tayini: CLSI ile uyum: % 93 (AMB), % 76 (Posa), % 67 (Vori) Yöntemin standardize edilmesi gerekli Antachopoulos et al. JCM 2006; 44: 553; Meletiadis et al. JCM 2001; 39: 3402; Meletiadis et al. JCM 2001; 39: 4256; Hawser et al. JCM 2001; 39:2738

Flow sitometre Mean channel flourescence, propidyum iyodür AMB Flukonazol Kaspofungin Flusitozin AMB Itrakonazol Vorikonazol Referans yöntemle uyum: % 88-99 Candida Aspergillus SONUÇ: ort. 4-6 saatte Chaturvedi et al. JCM 2004; 42: 2249 Ramani et al. AAC 2000; 44: 2752; Mitchell et al. JCM 2005; 43: 2586; Chaturvedi et al. JCM 2004; 42: 2249; Pina-Vaz et al. Clin Microbiol Infect 2001; 7: 609; Ramani et al. AAC 2003; 47: 3627; Chaturvedi et al. JCM 2004; 42: 2252; Joung et al. J Infect 2007; 54: 504

Arthington-Skaggs et al. AAC 2002; 46: 2477 Özellikle 48 sa. MİK değerinin zor okunduğu suşlarda yardımcı olabilir. Ergosterol miktarının tayini TRAILER Flu, Itra C. albicans C. tropicalis Ergosterol miktarı ile en iyi korelasyon gösteren okuma değerleri Görsel 24 sa. Spektrofotometrik, %50 inhibisyon, 24sa. Spektrofotometrik, %50 inhibisyon, 48sa.

İzotermal mikrokalorimetre -I MHIC = Minimal heat inhibitory concentration

İzotermal mikrokalorimetre -II Vorikonazol varlığında ısı üretiminin ölçümü Sonuç: 8 saate Tüm dirençli ve duyarlı suşları doğru tanımlayabildi

İzotermal mikrokalorimetre -III Vori-S strain Vori-R strain Detection Limit

İzotermal mikrokalorimetre -IV 0.5 µg/ml vori konsantrasyonunda, S ve R suşların ayrılabildiği minimum süre= 8 saat

İzotermal mikrokalorimetre -V AMB CLSI ile uyum (%) 67 Vori 92 Posa 75 Kaspo 83

İzotermal mikrokalorimetre -VI Suni idrar örneğinde ve değişen glukoz konsantrasyonları varlığında, C. albicans ın idrarda üremesinin ve antifungal ilaçlara duyarlılığının metabolik ısı üretimi saptanarak araştırılması

Referans dışı Yöntemler Özet-I- Etest, Sensititre YO, VITEK-2 Veriler, daha çok maya (çoğunluğu Candida) için mevcut Genelde referans yöntemlerle uyum iyi Etest, Sensititre YO ANCAK, direnç sınır değerine yakın MİK sonucu olan suşlarda uyumsuz sonuçlar olabilmekte (özellikle eski direnç sınır değerleriyle; çoğunluğu küçük hata). Yeni direnç sınır değerleri ile ayrıntılı değerlendirmeler yapılmalı Etest, Sensititre YO - Mucorales (16saat Posa MİK leri dışında) referans yöntemle uyum oranları ÇOK DÜŞÜK

Referans dışı Yöntemler Özet-II- XTT Yöntemi (Candida, C. neoformans, Aspergillus, Mucorales) Genelde referans yöntemlerle uyum iyi ANCAK, XTT yöntemi standardize edilmiş değil Flow sitometre (Candida, Aspergillus) Genelde referans yöntemlerle uyum iyi ANCAK, flow sitometre her merkezde mevcut değil

Referans dışı Yöntemler Özet-III- Ergosterol miktarının tesbiti, Candida Yoğun trailing gösteren suşlarda azol MİK lerinin belirlenmesinde yardımcı ANCAK pratik değil Etest, Sensititre YO, VITEK-2 MİK direnç sınır değerleri?? (Direnç sınır değerleri yönteme özgüdür!)

Sonuçlar

REFERANS Yöntemler CLSI ve EUCAST referans yöntemleri AFDT için sıklıkla kullanılmaktadır. CLSI ve EUCAST direnç sınır değerlerinin uyumunun sağlanması ve daha fazla cins/ilaç kombinasyonu için ECOFF değerlerinin belirlenmesi, gelecek için başlıca hedeflerdir.

DİĞER" Yöntemler Diğer yöntemler, referans yöntemler ile genellikle uyumlu sonuçlar vermektedir. Ancak, özellikle sınırda MİK değerleri olan suşlarda, referans yöntemlerle uyumlu olmayan sonuçlar elde edilebilir. Referans yöntemler dışındaki yöntemlerin rutin kullanımı, mevcut ECOFF ve klinik eşik değerler in referans yöntemler için saptanmış olması nedeniyle sınırlıdır. Ayrıca diğer yöntemlerin bazıları standart

Tür tanımlaması AFDT