Bölüm 2 LAKTİK ASİT BAKTERİLERİ Laktik asit bakterileri fermentasyon sonucu temel ürün olarak laktik asit oluşturan mikroorganizmalardır. Bu bakteriler, genellikle spor oluşturmayan ve gıda fermentasyonlarında güvenli bir şekilde kullanılan mikroorganizmaları kapsamakla birlikte, patojen olanlarına ya da spor oluşturanlarına da rastlanmaktadır. Diğer taraftan, metabolizması bakımından farklılık gösteren bifidobakteriler gibi mikroorganizmalar da bu bakteriler içerisinde yer almaktadır. Bu nedenle, laktik asit bakterilerinin tanımlanmasında evrensel olarak kabul gören bir terim mevcut değildir. Klasifikasyonları Mikroorganizmaların isimlendirilmesi ve klasifikasyonu, Uluslararası Mikrobiyoloji Toplulukları Birliği (International Union of Microbiological Societies) nin gözetiminde faaliyet gösteren taksonomi komitelerinin önerileri doğrultusunda yürütülmektedir. Bakteriler arasındaki genetik akrabalıkları doğru bir şekilde yansıtan yeni ve güçlü kanıtlar elde edildikçe bakterinin dahil edildiği tür ve resmi tanımlamalar değişikliğe uğramaktadır. Bakterilerin teşhisi ve sınıflandırılması, uzunca bir süre fenotip olarak ifade edilen gözlemlenebilir özelliklerine (morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özellikler) göre yapılabilmiştir. Buna göre, birbirine çok benzer özellikler gösteren bakterilerin aynı türden olduğu kabul edilmekte, benzer özellikler gösteren türler de aynı cins içerisinde toplanmaktadır. Bazı durumlarda, türler alt türlere (kısaca subsp. veya ssp.) bölünmektedir. Türlerin resmi olarak isimlendirilmesi, esasen bitkiler ve hayvanların isimlendirilmesi için geliştirilen Latin binomiyal sistemine göre yapılmaktadır. Örneğin, Lactococcus lactis, Lactococcus cinsine ait bir tür, Lactococcus lactis subsp cremoris ise Lactococcus lactis in alt türüdür. Fenotipik çalışmaların moleküler düzeye (hücre duvarının kompozisyonu, serolojik teknikler, elektroforetik teknikler) yayılması ve DNA analiz tekniklerinin geliştirilmesi (DNA hibridizasyonu ve DNA sekansının karşılaştırılması), mikroorganizmalar arasındaki benzerlik ve farklılıkların daha güvenilir biçimde ortaya konulmasını mümkün kılmıştır. Günümüzde, DNA hibridizasyon çalışmaları iki bakterinin aynı türe ait olup olmadığına dair en fazla kabul gören bir ölçüt sayılmaktadır. Fenotipik özellikler konusu önemini korumakla birlikte, bu özelliklere göre genetik akrabalıklar her zaman doğru bir şekilde ortaya konulamamaktadır.
Günümüzde canlı organizmalar 3 üst alem içerisinde toplanmıştır: - Ökarya (Eucarya) - Arkaya (Archaea) - Öbakteri veya bakteri (Eubacteria) Hücre nükleusu içerisinde kromozom taşıyan, bitkiler, hayvanlar ve fungusları içine alan canlılar (ökaryotlar) ökarya olarak sınıflandırılmıştır. Topluca bakteri olarak ifade edilen prokaryot organizmalar da arkaya ve öbakteri olmak üzere iki bölüme ayrılmıştır. Filogenetik (Bir türün veya yüksek taksonomik grupların soy gelişimi ve evrim geçmişi) ifadeyle, laktik asit bakterileri olarak adlandırılabilecek belirli bir bakteri grubu mevcut değildir. Laktik asit bakterileri, gram-pozitif öbakterilerin (Firmicute) G + C (Guanin + Sitozin) yüzdesi düşük olan alt bölümünde yer alırlar. Bunların DNA moleküllerinde, Guanin ve Sitozin bazlarının toplamı yaklaşık %53 ün altındadır. Bu alt bölüm, bazen, klostridiyal alt bölüm olarak da ifade edilmekte olup, burada yer alan bakterilerin hepsi laktik asit bakterileri değildir. Bacillus, Listeria, Staphylococcus cinsi bakteriler de bu alt bölümde yer alırlar. Bifidobacterium, Brevibacterium, Micrococcus ve Propionibacterium cinsi mikroorganizmalar da süt fermentasyonlarında yer alan diğer gram-pozitif bakterilerdir. Ancak, biyokimyasal özellikleri yönünden laktik asit bakterileri arasında sayılmazlar, ayrıca filogenetik olarak da laktik asit bakterileri ile yakınlıkları yoktur. Bu bakteriler aktinobakteri (actinomycete) alt bölümü içerisinde yüksek G + C oranına sahip bakterilerdir. Laktik asit bakterileri, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Streptococcus ve Pediococcus cinslerini içine almaktadır. 2.1.1. Lactobacillus cinsi süt asidi bakterileri Laktobasiller gram-pozitif, katalaz-negatif, spor oluşturmayan çubuk biçimli bakterilerdir. Çubuklar çok uzun ve çok narin incelikte olabileceği gibi, çok kısa, kokobasil şeklinde de olabilir. Zincir formlarına genellikle logaritmik gelişme döneminin geç evresinde rastlanır. Süt asidi bakterilerinin büyük bir kısmı bu cinse dahildir. Günümüze kadar, 80 den fazla tür ve alt türün tanımlaması yapılmış olup, yeni bilgiler doğrultusunda taksonomileri gözden geçirilmektedir. Laktobasiller, toprak, bitki ve hayvanların dahil olduğu geniş bir çevrede bulunan bakterilerdir. Fermente olabilen şekerler, vitaminler, hidrolize protein ürünleri, kofaktörler ve oksijen içeriği düşük ortamlar bu cinse dahil mikroorganizmaların doğal yaşam alanlarıdır. İnsanlar ve hayvanlarda, ağız
boşluğu, bağırsak ve vajinada; gübrede; toprakta ve bitkilerde bu mikroorganizmalara rastlanır. Fermentasyon teknolojisinde (örn., silaj yemi, et, yoğurt, peynir, turşu, unlu mamüller) istenen, ancak gıdalarda bozulmaya neden olan mikroorganizmalardır. Süt endüstrisinde yalnızca birkaç türü starter kültür olarak kullanılmaktadır. Beslenme istekleri karmaşıktır. Amino asitlerine, peptitlere, vitaminlere, fermente olabilir karbonhidratlara, yağ asitlerine ve esterlerine, çeşitli tuzlara, nükleik asitlere ve türevlerine gereksinim duyarlar. Lactobacillus cinsi laktik asit bakterileri, çok heterojen bir cins olma özelliği taşımaktadır. DNA baz kompozisyonunda G+C % mol oranı % 32-55 gibi geniş bir aralıkta değişim göstermektedir. Teşhislerinde yararlanılan fenotipik özelliklerine göre iki, üç ya da dört grup altında toplanmışlardır. Fermentasyon özelliklerine göre, aşağıdaki üç alt gruba bölünmüşlerdir: Homofermentatif laktobasiller: Bu grupta yer alan türler, hegsoz şekerlerini Embden-Meyerhof glikolitik yoluna göre parçalar ve yalnızca ya da baskın olarak laktik asit oluştururlar. Pentozları ve glukonatı fermente etmezler. Türlerden bazıları peynir, yoğurt ve probiyotik içeceklerde starter külütü olarak kullanılan önemli bakterilerdir. Fakültatif heterofermentatif laktobasiller: Hegsozları Embden-Meyerhof yoluna göre, pentozlar ve diğer bazı substratları ise fosfoketolaz enzim aktivitesine dayalı metabolik yola göre parçalarlar. Sonuçta, laktik asitin yanı sıra tipik olarak asetik asit ve etanol oluştururlar. Birkaç türü, geleneksel fermente ürünlerin ve silaj yemlerinin üretiminde kullanılır. Obligat heterofermentatif laktobasiller: Bunlar, şekerleri yalnızca fosfoketolaza dayalı metabolik yola göre parçalar, laktik asit ve önemli miktarda asetik asit ve/veya etanol ve CO 2 oluştururlar. Bozukluk etmeni bakteriler olarak kabul edilirler. Gastrointestinal sistemde bulunurlar. Ayrıca, olgun peynirin de dahil olduğu değişik gıdalarda bu mikroorganizmalara rastlanabilir. Aşağıdaki çizelgede fermentasyon yollarına göre süt ürünlerinde rastlanan laktobasiller gösterilmiştir.
Çizelge. Fermentasyon yollarına göre laktobasil sınıfları Homofermentatif Heterofermentatif Lb. acidophilus Lb. helveticus Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus Lb. delbrueckii subsp. lactis Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii Kaynak: Curry and Crow, 2010. Fakültatif Lb. casei Lb. paracasei Lb. plantarum Lb. rhamnosus Lb. coryneformis Lb. curvatum Obligat Lb. brevis Lb. reuteri Lb. fermentum Lb. bifermentans Lb. kefiri Lb. buchneri Filogenetik olarak, Lactobacillus cinsi bakterilerin, aşağıda gösterilen genellikle 3 büyük grubu olduğu kabul edilmektedir: a) Lactobacillus casei Pediococcus grubu. Homofermentatif, fakültatif heterofermentatif ve obligat heterofermentatif türleri içine almaktadır. Homofermentatif Fakültatif heterofermentatif Obligat heterofermentatif Lb.salivarius Pc.damnosus Lb.casei Lb.paracasei Lb.plantarum Lb.rhamnosus Lb.sake Pc.acidilactici Lb.fermentum Lb.kefiri Lb.sanfranciscens Lb.hilgardii b) Lactobacillus delbrueckii grubu. Bu gruptaki tüm türler homofermentatiftir. Önceden Lb.acidophilus un alt türleri olan Lb.johnsonii, Lb.amylovorus, Lb.crispatus, Lb.gallinarum ve Lb.gasseri günümüzde ayrı tür statüsü kazanmıştır. Grubun tipik üyeleri aşağıda verilmiştir. Lb.delbrueckii Lb.delbrueckii subsp delbrueckii Lb.delbrueckii subsp bulgaricus Lb.helveticus Lb.acidophilus c) Leuconostoc grubu. Lactobacillus cinsi içerisinde bir iki türün filogenetik olarak, laktobasillerden ziyade Leuconostoc cinsine daha fazla benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Bu grupta yer alan laktobasiller obligat heterofermentatif (örn.; Lb. fructosus) özellikte olup, karışık hücre morfolojisi sergileyen filogenetik gruba diğer bir örnektir. - Laktobasillerin starter kültür olarak kullanımı
Laktobasiller, laktozun hızlı bir şekilde laktik asite dönüşmesi için süte yüksek oranda aşılanırlar. Bunun sonucu, ortamın ph değerini düşürerek istenmeyen bakterilerin gelişimini baskılar ya da onları öldürürler. Ayrıca, fermente ürünlerde jel oluşumu sağlarlar. Süt ürünlerinde starter kültür olarak kullanılacak Lactobacillus cinsi bakterilerin seçiminde dikkate alınan faktörler şunlardır: - Bakterinin türü ve suşu - İnokülüm miktarı - Diğer bakterilerin varlığı ve sayısı - Süt türü - Sütün bileşimi - Sütün ısıl işleme tabi tutulması - Katkı maddelerinin varlığı - Fermentasyon koşulları Bazı durumlarda, laktobasillerin gelişimi ve son üründe asit oluşumu engellenebilir. Starter kültür aktivitesini olumsuz yönde etkileyen bu faktörler aşağıdaki gibidir: Bakteriyofajlar. Laktobasillere özgü bakteriyofajlar sütün fermentasyonu sırasında pıhtılaşmayı yavaşlatırlar. Sütün doğal inhibitörleri (örneğin laktoperoksidaz sistemi). Yüksek somatik hücre sayısı. Antibiyotik ve temizlik maddesi kalıntıları. Mikroorganizmalar tarafından üretilen ya da süte dışarıdan ilave edilen hidrojen peroksit. Isıl işlem uygulamasının tetiklediği inhibitörler. Starter kültür kombinasyonları oluşturulurken, laktobasillerle diğer bakteriler arasındaki rekabetin göz önüne alınması önemli bir husustur, çünkü farklı bakteri türlerine ait birkaç suş diğer starter bakterilerinin faaliyetini engelleyen bakteriyosinler üretebilir. Fermente ürünlerde, esasen Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus starter kültür olarak Streptococcus thermophilus ile birlikte kullanılır. İnokülüm miktarı üretilecek ürüne göre değişebilir. Bulk starter kültürün %3 oranında aşılanması ile 40-45 C de 3 saat içerisinde ph değeri 4-4.5 e düşebilir. Her iki mikroorganizma ürettikleri bileşikler yardımıyla birbirlerinin gelişimine katkıda bulunurlar. Fermente ürünlerde starter kültür olarak yararlanılan diğer laktobasiller şunlardır:
Lb. paracasei subsp. paracasei Lb.acidophilus Lb.rhamnosus Lb. plantarum Lb.reuteri Lb. paracasei biovar shirota Bu bakterilerin fermente ürünlerdeki işlevleri şunlardır: Yavaş hızda asitlik gelişimi sağlamak, Asetaldehit, diasetil gibi aroma maddelerini üretmek, Sağlık açısından yarayışlı özellikler sergilemek, Ekzopolisakkarit üretim yeteneğine bağlı olarak tekstür geliştirici madde işlevi görmek, Bakteriyosin üretim yeteneğine bağlı olarak koruyucu katkı maddesi gibi davranmak. Peynirde starter kültür olarak kullanılan başlıca laktobasil türleri Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. lactis ve Lb.helveticus dur. Bu bakteriler Mozzarella, Parmigiano ve İsviçre peynirleri gibi pıhtısı haşlanan (45-60 C de) peynirlerde asitlik gelişimi sağlamak amacıyla, genellikle Sc.thermophilus ile bir arada kullanılmaktadır. Termofilik özellikteki bu laktobasiller haşlama sıcaklıklarında canlılıklarını korur ve soğumakta olan pıhtıda asit üretmeye devam ederler. Termofilik laktobasilin türü ve suşu, inokülasyon oranı ve starter kültür içerisindeki oranı, sütün peynir mayası ile pıhtılaşma döneminde ph değerinin kontrolü açısından önemli noktalardır. Starter kültür içerisinde yer alan Sc.thermophilus tarafından üretilen galaktoz, bu mikroorganizma tarafından fermente edilemediği için, peynir kitlesinde birikerek esmerleşmeye yol açabilir. Bu tip peynirlerde Lb.helveticus suşları ile Lb.delbrueckii subsp. lactis in bazı suşları, galaktozu kullanmak suretiyle bu kusurun önlenmesini sağlarlar. Laktobasillerin birçoğu peynirde, özellikle olgunlaşma döneminde aroma oluşumuna katkıda bulunurlar. Termofilik laktobasillerin belirli suşları pıhtının asidifikasyonu sırasında ekzopolisakkarit üretir ve pıhtıda tutulan nem oranını artırarak peynir tekstürünü etkilerler. Laktobasiller, peynir üretiminde yardımcı kültür (adjunct culture) olarak da ortama ilave edilirler. Bu durumda, asit üretimi ortama aşılanan diğer bakteri kültürleri tarafından gerçekleştirilir. Laktobasillerin yardımcı kültür olarak kullanımının nedeni, peynirde olgunlaşmaya katkıda bulunmaktır. - Laktobasillerin asitlik ve tat gelişimine ilişkin rolleri
Sütteki laktoz, laktobasillerin hızlı bir gelişme göstermesi ve asit üretmesi açısından yararlanabilecekleri tek karbonhidrat kaynağıdır. Laktozun laktobasiller tarafından fermentasyonu sonucu oluşan laktik asit, asetik asit, etanol gibi temel ürünler, asetaldehit, diasetil gibi minör bileşiklerle birlikte süt ürünlerinin tadına katkıda bulunurlar. Laktobasiller tarafından laktozun hangi yola göre kullanılacağı konusunda belirleyici faktörler şunlardır: - Bakterinin türü ya da suşu - Bakterinin transport sistemi - Bakterinin β-galaktozidaz ve β-fosfogalaktozidaz enzim aktivitesi - Sütün galaktoz içeriği Laktozun fermentasyonunda esas olarak 3 muhtemel yol mevcuttur: 1. Laktozun hücre içine taşınması laktobasillerin birçoğunda permeaz enzimi yardımıyla gerçekleşir, daha sonra laktoz β-galaktozidaz enzimiyle glikoz ve galaktoza parçalar. Parçalanma ürünleri olan glikoz ve galaktoz, ya Embden-Meyerhof yoluna (glikolitik yol) göre kullanılıp başlıca fermentasyon ürünü olarak laktik asit üretilir, ya da 6- fosfoglukonat yoluna göre laktik asit, karbondioksit, asetat ve/veya etanol oluşturulur. 2. Bazı laktobasiller (örneğin, Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus suşları) Sc.thermophilus unkine benzer transport sistemine sahiptir. Bu bakterilerde, laktoz hücre içerisine antiport sistemi yoluyla taşınır ve β-galaktozidaz enzimi tarafından parçalanır, fakat oluşan parçalanma ürünlerinden sadece glikoz metabolizmada kullanılır, galaktoz ise hücre dışına atılır. 3. Lb.paracasei suşlarından bazılarında laktoz hücre içerisine laktoz-6- fosfat halinde taşınır. Laktoz-6-fosfat, β-galaktozidaz enzimi tarafından glikoz ve galaktoz-6-fosfata parçalanır. Galaktoz-6-fosfat, tagatoz-6- fosfat yoluna göre metabolizmada kullanılır ve Embden-Meyerhof yolunun ortasındaki bir basamakta glikozla birleşerek laktik asit üretilir. Laktobasiller süt yağı, kazein, amino asitler, serbest yağ asitleri ve sitrat gibi süt bileşenlerini kullanmak suretiyle de tat oluşturabilirler. Süt ürünlerinde laktobasillerin faaliyeti sonucu tat oluşumu sağlayan reaksiyonlar aşağıdaki gibidir: Kazeinin modifikasyonu: Laktobasiller, tür ve suşlara göre değişmek üzere, proteinaz ve peptidaz enzim enzim aktivitesine sahip bulunmaktadır. Proteinaz ve peptidaz enzimlerinin ortak etkisiyle oluşan bileşikler peynirde ve fermente ürünlerde tat oluşumuna katkıda bulunmaktadır. Amino asit fermentasyonları: Laktobasiller amino asitleri kullanarak süt
ürünlerinde tat değişimlerine katkıda bulunabilmektedir. Örneğin, treonin amino asidi Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus tarafından kullanılarak yoğurtta asetaldehit oluşmaktadır. Arjinin, aspartik asit, glutamik asit, serin, kükürtlü ve uzun zincirli amino asitler ve aromatik amino asitler laktobasiller tarafından metabolik faaliyetlerde kullanılan diğer amino asitlerdir. Aromatik amino asitlerin laktobasiller tarafından katabolize edilmesiyle parakresol, indol ve skatol gibi istenmeyen tat bileşikleri ile triptamin ve tiramin gibi zararlı biyojenik aminler oluşmaktadır. Yağın modifikasyonu: Laktobasiller, sütteki digliseridleri ve monogliseridleri parçalayabilen esteraz enzimlerine sahiptir. Laktobasillerin lipolitik aktivitesine bağlı olarak serbest yağ asitleri düzeyindeki artış, bazı süt ürünlerinde tat gelişimine katkıda bulunmaktadır. Laktobasiller yağ asitleri ve alkolden esterler oluşturabilmektedir.