Kullanım Talimatları Transferrin-IEF REF: 103100 (Çift Antikor)
KULLANIM AMACI Transferrin-IEF kiti izoelektrik fokusing ve immunoblotting kombinasyonu ile insan serumunda transferin izoformlarının belirlenmesi için tasarlanmıştır. Transferin, glikozilasyon ve demir doygunluk derecesi varvasyonlarının bir sonucu olarak mikroheterojenite gösteren demir taşıyıcı bir proteindir 1. Kanda transferinin izoformları arasındaki çoğu prevalent iki oligosakkarit kollarına bağlı dört sialik asit artıklarını içerir 1,2. Bu sialik asit artıkları transferin molekülünün elektroforetik hareketliliğini etkiler, öyle ki sıralı çıkarılmaları en az 6 olası yük durumuna yol açar 1-3. Transferrin in çeşitli izoformlarının anormal dağılımlarının, özellikle sialik asit kalıntılarının daha fazla sayıda oluşması, hemokromotazis, artrit ve kanser gibi patolojik durumlarla ilişkili olduğu düşünülmektedir 4-5. Karbonhidrat-eksikliği transferrin (CDT) olarak bilinen sialik asit kalıntıları (disialo-transferrin ve daha düşük) ile izoformlarının düzeylerindeki artış az sayıda hastalık vakası ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Tüm türlerin bu yöntemle tespit edilememesine rağmen IEF serum transferin CDG (Congenital Disorders of Glycosylation) için en güçlü tarama testi olarak kabul edilir. Bir tip 1 IEF patern (CDG-I de gözlenen) di-ve asialo-transferin artışı ve tetrasialo-transferin in azalması ile karakterizedir, tip 2 patern (CDG-II de gözlenen) ise ek olarak triand monosialotransferin in artışını göstermektedir 6. CDT izoformlarında artış alkoliklerin serumunda tespit edilmiştir özellikle disialo-transferrin molekülünde ve toplam transferrin ile disialo-transferin oranında artış aşırı alkol tüketimi durumlarında artar ve alkolü bırakma alkolden uzak durularak 2-3 hafta sonunda disialo-transferrin varyantının yavaş yavaş yok olmasına neden olmaktadır 8,9. Travma (surgery, skull base fracture, rise in intracranial pressure) sonucunda burun veya kulak da oluşan BOS akıntısı agaroz kullanılarak asialo-transferrin (tau protein) varlığı ile teyit edilebilir. Transferrin-IEF kiti agaroz IEF jelde, ph5-6, izoelektrik noktaya göre transferrin izoformlarını ayırır. Transferrin moleküllerin In-vitro doygunluğu Fe2-transferrinde farklı sialik asit ve demir içeriğe sahip fakat aynı isoelektrik noktada varyantların minimum ko-fokusing ve mikroheterogen izoformlarının azaltılarak serum örneğinde mevcut olmasını sağlar. Proteinler daha sonra nitroselüloza aktarılır ve nitroselüloz transferin spesifik bantları görselleştirmek için immunofiksasyon yapar. Paternler, belirli sialated transferrin izoformlarının yokluğu ya da varlığı karşılaştırarak kalitatif olarak yorumlanır. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına başvurun. BİLEŞENLER 1. Transferrin-IEF Jel (x10) Koruyucu olarak ph 5-6 sahip thimersal agaroz ve ayırıcı içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. IEF Anot Solüsyon (1x25) 0.3M asetik asit içerir. Paket içindeki solüsyon kullanım için hazırdır. 3. IEF Katot Solüsyon (1x25) 1M NaOH içerir. Paket içindeki solüsyon kullanım için hazırdır. 4. IEF Bloklama ajanı (1x10g) İnek sütünden elde edilmiş katı protein içerir. IgG-IEF Bloklama Ajanı için 2 solüsyon hazırlanır: Bloklama solüsyonu A: 50ml serum fizyolojik içinde 1g toz çözünür. Bloklama solüsyonu B: 50ml serum fizyolojikte 5 ml blok solüsyonu A çözünür. 1
5. IEF Asetat Buffer Konsantre (1x25ml) ph 5.1 de 0.2M asetat buffer içerir. Kullanımdan önce 25 ml saf su ile 2.5ml Asetat buffer konsantrasyonu dilue edin ve hemen kullanın. 6. IEF Kromajen (1x0.05g) 3-Amino-9-etil-karbazole tozu içerir. 50ml saf metanol içinde şişenin içeriğini çözün. 5ml lik porsiyonlara bölerek karanlıkta -20 C'de saklayın. Kromajeni, protein kontaminasyonu olmayacak şekilde özel hazırlanmış cam tüplerde muhafaza ediniz. 7. Ferrik klorür Solüsyonu (1x 3ml) 22mM Ferrik klorür içerir. Solüsyon pakette kullanıma hazırdır. 8. Sodyum Bikarbonat Solüsyonu (1x 3ml) 1.2M Sodyum Bikarbonat içerir. Solüsyon pakette kullanıma hazırdır. 9. 103100 Kit için antikorlar: Transferrin-IEF Birincil Antikor (1x 240μl) Tavşan anti-insan transferin antiserum içerir. Transferrin-IEF İkincil Antikor (1x 200μl) Keçi anti-tavşan IgG peroksidaz konjugat içerir. 10. Diğer Kit Bileşenleri Her kitte kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli kurutucu membranlar, kurutucular A, C ve D, elektrot fitiller, soak-away kurutma kağıdı içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1.Transferin IEF Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulması: 1) kristal görünüm jelin dondurulduğunu gösterir. 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3)bakteriyal ya da fungal kaynaklı görünüm agarozun kontaminasyonunu belirtir. 2. IEF Anot Solüsyonu Anot solüsyonu 15-30 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. 3.IEF Katot Solüsyonu Katot solüsyonu 15-30 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. 4. IEF Bloklama Ajanı Toz 15-30 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. IgG-IEF bloklama ajanı kendiliğinden akan beyaz veya kirli beyaz topaklı bir toz, bu görünümün değişikliği veya olağandışı renklenme bozulmayı gösterebilir. 5. IEF Asetat Buffer Konsantrasyonu Buffer konsantrasyonu 15-30 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. 6. IEF Kromajen Toz 2-6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Dondurulmuş eşit olarak ayrılmış numuneler 6 ay boyunca stabildir. Kromajen solüsyonu testte kromajenin eksikliği veya bu görüntüsünden gelen değişiklik kırmızı-kahverengi bir renkli bozulmayı gösterebilir. 7. Ferrik klorür Solüsyonu Solüsyon 2-6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. 8. Sodyum Bikarbonat Solüsyonu Solüsyon 2-6 C de saklanmalıdır ve şişe etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Eğer kristaller oluşursa, solüsyon açılana kadar oda sıcaklığında solüsyonu karıştırın. 9. 103100 Kit için antikorlar: Transferrin-IEF Birincil Antikor Antikor solüsyonu 2-6 C de saklanmalıdır ve şişe etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. 2
Transferrin-IEF İkincil Antikor Antikor solüsyonu 2-6 C de saklanmalıdır ve şişe etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Partikül kombinasyonu ve bulanıklılık bozulmayı gösterebilir. GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN ÖĞELER 30 hacimde hidrojen peroksit Serum fizyolojik (0.85% NaCI) Kat. No. 3100 REP Prep Kat. No. 5014 Development Weight Vorteks Metanol Saf su IEF için uygun tank ve güç kaynağı NUMUNE TOPLAMA VE HAZIRLAMA Tercih edilen numune taze toplanan CFS ya da serumdur. Numuneler -20 C de 2 haftaya kadar yada buzdolabında 2-6 C de 3 güne kadar stabildir. Örneğin Demir Doygunluğu (sadece serum). 100μl serum için, 22mM Ferik Klorür solüsyondan 25μl ve of 1.2M Sodyum Bikarbonat solüsyonundan 12μl ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin (15...30 C). Örnekleri vorteksleyin ve jele aplike etmeden önce hemen 10 + 50 oranında 50μl saline içinde 10μl ile dilüe edin. Not: CSF direk uygulanmalıdır. Genetik veya glikasyon varyantları (demir içeriği ne olursa olsun) katotik olarak proteini çalıştırmak için bulunamadığı için BOS örneklerinin demir saturasyonuna gerek yoktur. Bu şüpheli CSF sızıntısı sonucu kısa sürede elde edilebilir demektir. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Paketten jeli çıkarın ve kağıt havlu üzerine yerleştirin. Jelin yüzeyini kurutma kağıdı C ile kurutun ve kurutma kağıdını atın. 2. Jelin kenarındaki oklar ile örnek aplikasyon templaytını ayarlayın. Templaytın başına bir kurutucu A koyun ve iyi temas ettiğinden emin olmak için yarıkların arasını parmağınızla ovarak düzeltin. Kurutma kağıdı A alın ve Adım 5 için saklayın. 3. Her bir yarığa 5μl örnek uygulayın ve 10 dakika boyunca emmesi için bırakın. 4. Örnekler absorblanana kadar, anot solüsyonunda 1 elektrot fitilini ıslatın ve iki fitil kurutucuları arasında iyice kurutun. Jelin anot (-) köşesi boyunca bu fitili yerleştirin. Anot ve katot solüsyonlarını birbirine karıştırmayın. 5. Örnek absorblanmasından sonra adım 2 den kalan kurutucu A ile templeyti hafifçe kurutun ve hem kurutucuyu hem de templaytı alın. Elektroforez adımı Örnek Aplikasyon Templayti alınarak 5 dakika içinde başlamalıdır. 6. Katot solüsyonunda 1 elektrot fitilini ıslatın ve iki fitil kurutucuları arasında iyice kurutun. Jelin katot (-) köşesi boyunca bu fitili yerleştirin. NOT: Cihaza göre prosedürü izleyin. 7a. Bir REP biriminde Çalışma: i. Tank zemini ve jelin arkasına 0.5 ml REP Prep kullanarak REP tankına jeli yerleştirin. Ağız ile REP Prep pipetlemeyin. Dış katot elektrotun altında katot fitili ve REP IEF elektrotun merkezi anot elektrotu altında anot fitili konumuna jeli yerleştirin. Katot elektrotun dışına bir kurutucu yerleştirin ve aşırı sıvı kurutucu gibi davranan anot elektrotu dışına bir kurutucu yerleştirin. Soak-aways jel ile temasını sağlayın. ii. REP aşağıdakileri programlayın (programın diğer tüm bölümleri bırakarak): 3
Elektroforez Voltaj 600 volts Elektroforez Zaman 45:00 mm:ss Elektroforez Sıcaklık 10-20 C Bekleme Sıcaklık 16 C iii. Çalışmaya başlamak için F1 tuşuna basın. 7b. Bir SPIFE / SAS-3 biriminde çalışma: i. Bir SPIFE/SAS-3 IEF elektrot montajı kullanın. 4a (i) da açıklanan şekilde jeli yerleştirin. ii. SPIFE/ SAS-3 içine aşağıdaki parametreleri programlayın: Elektroforez 45:00 mm:ss 10 C 600 volt Test sonu iii. Tank kapağını kapatın ve START basın sonra elektroforezi başlatmak için TEST SELECT tuşuna basın. 7c. Konvensiyonel IEF sistemlerinde çalışma: i.eğer alternatif IEF sistemlerini kullanılırsa, aşağıdaki parametreler kullanılır: Güç Volts Limit Current Limit Run Time Run Temperature 10-20 watts 600-1200 volt 50mA 30:00 mm:ss 10...20 C 7d. Helena IEF tankında çalışma (Kat. No. 4065): i. Aşağıdaki parametreler Helena IEF tankı ile kullanılmalıdır: Elektroforez Voltaj Elektroforez Zamanı 400 volt 60 mm:ss 7e. SAS-1 Plus (Kat. No. 1531) da çalışma: i. SAS-1 Plus tabanına 0.5ml of REP Prep koyun. Ağız ile REP Prep pipetlemeyin. Jel altında hava kabarcıklarından kaçınarak taban üzerine jeli yerleştirin.bir mendil ile fazla REP Prep alın. ii. Aşağıdaki parametreler SAS-1 Plus ile kulllanılır: Teknik Not: Fokusing için seçilmiş voltaj, zaman ve sıcaklık gerekli patern uzunluğuna göre her bir laboratuvar tarafından belirlenmelidir. Paternlerin jel yüzeyinde iyi yürümeleri ve birbirinden düzgün ayrılmaları ve birbirine girmemeleri için sıcaklık minimum düzeyde tutulmalıdır. Yatay jel yüzeyinde kırılma ve birikmeleri engellemek için yüksek fokuslama yapılmamalıdır, yüksek 4
fokuslama proteinlerin sürüklenip katot bölgesine toplanmasına ve bant kaybına neden olur. Helena IEF tankı kullanıldığında soğutma cihazı kullanmadan önce 5 C soğutulmuş olmalıdır. IMMUNOFIKSASYON ADIMI 1. Fokuslamanın ardından, jeli bir kurutucu D kağıdının üzerine yerleştirin. Elektrot fitilleri kaldırın. 2. Saf su içinde transfer membranın bir sayfası ıslatılmalıdır. Membranı iki kağıt havlu arasına alın ve yavaşça fazla suyunu uzaklaştırın. Jel yüzeyi üzerine transfer membranını membranın üzerindeki kırmızı nokta jele temas edecek şekilde yerleştirin. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için jelin neminin memranla temas etmesini sağlayın. 10 saniye sonra membranı kaldırıp atın. 3.Saf su veya % 10 metanol solüsyonunda transfer membranını bir saniye önce ıslatın. Aşırı sıvıyı membrandan uzaklaştırmak için membranı dikey olarak tutarak fazla sıvının atılmasını sağlayın. Membranın kırmızı noktalı tarafı jel yüzeyine gelecek şekilde dikkatlice yerleştirin. Transfer membranını jeli zedelemeyecek ve hava kabarcığı kalmayacak dikkatlice hafifçe ovarak yayın. Üstüne bir kurutucu C, üç kurutucu D nin ve 2 kg yerleştirin. 30 dakika boyunca preslenmesini sağlayın. 4. Kurutma kağıtlarını kaldırın ve atın, membranı kırmızı noktalı yüzeyi yukarı gelecek şekilde boyama kabının içine atın. Membranın bütün yüzeyini kaplayacak şekilde 20 ml bloklama A solüsyonu ilave edin. 15 dakika boyunca yavaşça sallayın. 5. Saf su içinde bir kaç kez membranı yıkayın. 6. 15ml bloklama B solüsyonu 15μl primer antikor ilave edin, membranı bu solüsyonda 15 dakika boyunca hafifçe sallayınız. Saf su içinde bir kaç kez ve son olarak tuz solüsyonu içinde 5 dakika boyunca membranı yıkayın.15ml bloklama B solüsyonu 15μl sekonder antikor ilave edin, membranı bu solüsyonda 15 dakika boyunca hafifçe sallayınız. 7.Saf su içinde bir kaç kez ve son olarak serum fizyolojik içinde 5 dakika boyunca membranı yıkayın. Saf su içinde durulayın. 25ml asetat buffer (belirli şekilde diluent edilmiş) 5ml kromajen solüsyonu ve 25μl hidrojen peroksit solüsyonu içine membranı yerleştirin. Hafif sallayarak 20 dakika boyunca rengin oluşmasına izin verin. Bu adım sırasında kromajenin çökelmesinin ortaya çıkması normaldir. 8. Saf su içinde bir kaç kez membranı yıkayın ve kuru havada kurutun. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Tamamlanmış jel ilgili bandın varlığı veya yokluğu boyunca görsel olarak değerlendirilebilir ya da paternler düz tarayıcı ve Platinum yazılımı kullanılarak taranabilir. Moleküle bağlı sialik asit kalıntılarının sayısına dayalı transferinin 8 izoformu olmasına rağmen pentasialo (~% 10) ve trisialo-(~% 8) ardından en sık kullanılan (~80% toplam transferin) tetrasialo- izoformdur 11. Karbonhidrat eksikliği olan transferrin (CDT) molekülleri (disialo-monosialo ve asialo-) genellikle toplam transferinden % 2 oranında daha az bulunur 11. Elde edilen paternlerin yorumlanması hastanın klinik geçmişinin yardımı ile yapılmalıdır. KALİTE KONTROL Bilinen transferrin kantitasyonu ile örnek kullanımı, piyasada bulunan kontrolün yokluğunda prosedürünün tüm aşamalarını onaylamak için bir kontrol örneği gibi her bir jel üzerinde kullanılmalıdır. SORUN GİDERME İmmunoblotting ile takip edilerek izoelektrik fokusing ile ilgili en sık karşılaşılan sorunların bazıları için aşağıdaki tabloda ayrıntılı olası nedenler ve çözümleri verilmiştir. 5
Gözlenen sorunun Numune hatlarının boyanmaması Arka planın aşırı derecede ve aynı tarzda boyanması Dengesiz olarak arka planın aşırı derecede boyanması Soluk şekilde numune hatlarının boyanması Numune hatlarının yoğun boyanması Numune hattının bozulması/bulaşması Numune yarığında tümünün boyanması Olası nedenler ve çözümleri a) Numune uygulanmamış olabilir. b)birincil ve/veya ikincil antikor çıkartılmış olabilir. c) Hidrojen peroksit eklenmemiş olabilir. a) Engelleme adımı çıkartılmış olabilir. b)immunofiksaj ve renklenme adımları sırasında transfer membranının yetersiz yıkanmasından olabilir a) Çıkarılmış veya yetersiz ön-blot adımları olabilir a) Yetersiz numune uygulanmış olabilir b)boyanma zamanı yetersiz kalmış olabilir c)eski veya kirlenmiş hidrojen peroksit eklenmiş olabilir d)yanlış depolanmasından dolayı antikorlar bozulmuş olabilir e) Okside kromajen (siyah görünecek) olabilir. f) Asetat bufferın ph ı yanlış olabilir (5.0-5.2 olmalıdır) a) Aşırı numunenin uygulanan çözünmede kaybolması olabilir b)fazla gelişmiş(nadir) a) Soak-aways kullanılmaması olabilir b) Jelin aşırı soğuması nedeniyle jel yüzeyinde aşırı yoğunlaşma olabilir a) Elektroforez sırasında hiç bir gücün uygulanmamış olması Boyanmış numunede beyaz spotların görülmesi a) Pres aşamasında jel ve membran arasında hava kabarcığının olması b) Pre-ıslak membran kullanıldığına emin olunması ve bu kabarcıkların membran ve jel arasında kabarıklık yapması olması PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Tekrarlanabilirliği a. Jel içi Tek bir transferin örneği tek bir jelin 10 hattında test edildiğinde bantların aynı paternini gösterdi. b. Jeller arası Aynı numune 3 faklı jelde test edildi ve jelin her biri üzerinde bantların aynı paterni gösterdi. Özgüllük Kitte kullanılan antikorlar transferin için spesifik olarak gösterildi ve insan plazmasına karşı sadece transferin çökelmesi gösterdi. 6
BİBLİYOGRAFİ 1. De Jong, g. and van Eijk, H.G., Functional Properties of the carbohydrate Moiety of Human Transferrin, Int. J. Biochem., 1989; 21: 253-263. 2. Giblett, e.r., The Plasma Transferrins [Review], Prog. Med. genet. 1962; 2: 34-36. 3. van Noort, W.L. and van Eijk H.G., Seperation of Human Serum and Cerebrospinal Fluid Transferrins in Subfractions by Isoelectric Focusing with Phast System and Quantitations with Vetroscan XL Densitometer Sci. Tools, 1992; 36: 1-6. 4. van Eijk H.G., van Noort, W.L.., Dubelaar, M.L. and van der Heul, C., Clin. Chim. Acta, 1987; 165 : 141-145. 5. Stibler, H., Sydow, O. and van den Berg, S. Quantitative Estimation of Abnormal Microheterogenity of Serum Transferrin in Alcoholics, Pharmacol. Biochem. Behav., 1980; 13 (Suppl. 1) : 47-51. 6. Grunewald, S., Matthijs, G and Jaeken, J. Congenital Disorders of Glycosylation: A Review. Pediatric Research, 2002; 52: 618-624. 7. Stibler, H. Carbohyfrate-deficient Transferrin in Serum: A New Marker of Potentially Harmful Alcohol Consumption Reviwed. Clin. Chem., 1991; 37: 2029-2037. 8. Vesterberg, O., Petren, S. and Schmidt, D. Increased Concentrations of a Transferrin Variant After Alcohol Abuse Clin. Chim. Acta, 1984; 141: 33-39. 9. Kapur, A., Wild, G., Milford-Ward, A. and Triger, D.R. Carbohydrate-deficient Transferrin: A Marker for Alcohol Abuse British Medical Journal, 1989; 299: 427-431. 10. Keir, G., Zeman, A., Brookes, G., Porter, M and Thompson, EJ. Immunoblotting of Transferrin in the Identification of Cerebrospinal Fluid Otorrhea and Rhinorrhea. Ann. Clin. Biochem., 1992; 29: 210-213. 11. Planche, F., Mavadeix, B., Malet, L., Plane, L., Planche, R. and Reynaud, M. La transferine désialylée (CDT) en practique alcoologique quitidienne Alcoologie, 1998; 20(2) : 127-135. 7