T. C. SAĞLIK BAKANLIĞI VAKIF GUREBA EĞİTİM HASTANESİ PLASTİK, REKONSTRÜKTİF VE ESTETİK CERRAHİ KLİNİĞİ

T. C. SAĞLIK BAKANLIĞI VAKIF GUREBA EĞİTİM HASTANESİ PLASTİK, REKONSTRÜKTİF VE ESTETİK CERRAHİ KLİNİĞİ YAĞ DOKUSU KAYNAKLI STROMAL VASKÜLER FRAKSİYONUN RANDOM PATERNLİ CİLT FLEPLERİNİN YAŞAYABİLİRLİĞİ ÜZERİNE ETKİSİ DENEYSEL ÇALIŞMA (UZMANLIK TEZİ) Dr. Zekeriya KUL Şubat 2006

TEŞEKKÜR İhtisas yaptõğõm süre boyunca yetişmemde büyük emeği olan, bizlerden esirgemediği bilgi ve tecrübelerini ömrüm boyunca taşõyacağõm, değerli hocam Op. Dr. Zafer ÖZSOY a şükranlarõmõ sunarõm. Uzmanlõk eğitimimde kendilerinden çok istifade ettiğim Op. Dr. Aydõn GÖZÜ, Op. Dr. Hakan ÖZCAN, Op. Dr. Tayfun TÜRKASLAN, Op. Dr. Can İŞLER e, tez çalõşmamda verdiği katkõlardan ötürü, kök hücre konusunda ülkemizin önde gelen bilim adamlarõndan İ. Ü. İstanbul Tõp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji A.D. Öğretim Görevlisi Prof. Dr. Ayhan BİLİR e, hastanemiz Patoloji Kliniğinden Uzm. Dr. Adnan SOMAY a, birlikte fedakarca çalõşmaktan onur duyduğum asistan arkadaşlarõma ve tüm kliniğim çalõşanlarõna teşekkür ederim. 1

İÇİNDEKİLER 1. GİRİŞ VE TARİHÇE (3-14) 2. AMAÇ (14) 3. GEREÇ VE YÖNTEM(15-19) 4. BULGULAR(19-23) 5. TARTIŞMA ve SONUÇ(23-30) 6. ÖZET(31) 7. SUMMARY(32) 8. KAYNAKLAR(33-39) 2

GİRİŞ VE TARİHÇE Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahide cilt defektlerinin onarõmõ için random paternli cilt flepleri oldukça sõk kullanõlmaktadõr. Ancak flebin dolaşõmõnõn daha zayõf olduğu distal parçasõnda iskemiye bağlõ oluşan nekroz, defekt onarõmõnda gecikmelere neden olmakta ve sekonder girişimlere gereksinim doğurmaktadõr. Bu yüzden, bir flebin yaşayan uzunluğunun artõrõlmasõ veya flepteki nekroz miktarõnõn azaltõlmasõ, Plastik Cerrahinin başlõca araştõrma konularõ arasõna girmiştir. Tarihte deri fleplerini ilk kullanan Hindistan da Sushruta Samita(M.Ö. 600) olmuştur. 1500 lü yõllarda Taglicozzi tarafõndan bulunan ve burun rekonstrüksiyonu için koldan hazõrlanan random pediküllü cilt flebi, flep cerrahisinin tarihçesinde önemli bir dönemeçtir. 1900 lü yõllarõn başõnda Gilles ve Fillatov tüp pediküllü flebi tarif ettiler. Bu flepler boy/en olarak yüz bölgesi için 5:1, alt ekstremite için 1:1 oranõnda sõnõrlandõrõlmõştõ. Blair 1921 yõlõnda delay yöntemini tarif ederek flepte boy/en oranõnõ artõrõlabileceğini ortaya koydu. Bakamjian 1965 te deltopektoral flebi yayõnlamadan önce, gövde ve ekstremitelerden hazõrlanan fleplerin boylarõ enlerinden fazla olamõyordu (1). McGregor ve Morgan (2), 1972 de bu flebin longitudinal bir arteriovenöz aks ile 3

beslendiği görüşünden yola çõkarak, vücudun diğer bölgelerinde benzer arteriovenöz akslarõ araştõrdõlar ve inguinal flebi yayõnladõlar. Arteriovenöz aksõ olan flepleri diğer fleplerden ayõrmak için aksiyel patern ve random patern adlarõnõ kullandõlar (2). 1970 yõlõnda Manchot, flep yaşayabilirliğinin boy/en oranõndan ziyade flebe ait vasküler yatağa ve kan dolaşõmõna bağlõ olduğunu, 1973 te ise Daniel, flep dolaşõmõnõn hem muskülokütan hem de direkt kutaneöz damarlar ile olduğunu gösterdi (2). Fleplerin beslenme paternlerinin anlaşõlmasõ ile birlikte çalõşmalar flep yaşayabilirliğini artõracak yöntemleri bulmaya yöneldi. Bir flebin dolaşõmõnõ etkileyecek bir travma varlõğõnda ve/veya flep planlamasõnõn hatalõ yapõldõğõ durumlarda flep dolaşõmõ önemli derecede bozulmaktadõr. Bunun sonucunda oluşan iskemi, kõsmi veya tam flep kaybõna yol açabilmektedir. Flep yaşayabilirliğini arttõrmak için; kan dolaşõmõnõ arttõran sempatolitik ajan ve direkt vazodilatatör kullanõmõ, antitrombotik ve antikoagülan ajan kullanõmõ, antioksidan ilaç kullanõlmasõ, delay yöntemi gibi bazõ genel yaklaşõmlar mevcuttur (3,4,5). Delay fenomeni deri flep pediküllerinin iki veya daha fazla safhada ayrõldõğõnda, flebin kanlanmasõnda ve yaşam oranõnda artõş olmasõdõr (8). 4

Delay yöntemi flep yaşayabilirliğini artõran, iyi bir yöntem olmasõna rağmen ek cerrahi girişim gerektirmesi önemli bir dezavantajdõr (8). Hynes (6) 1950 de delay fenomeninin, hazõrlanan flebin distalinde gelişen sempatik kontrol kaybõna bağlõ olduğunu savundu. 1975 te Myers delay işlemininin flep dokusunu iskemik durumlara alõştõrdõğõnõ ve vasküleriteyi artõrdõğõnõ söyledi (7). Mcfarlane (8) hazõrladõğõ delay edilmiş fleplerde paradoks olarak fleplerin transfere uygun olmadõklarõ süre içerisinde vasküler yapõnõn, geçici olarak uzun eksene paralel yönde uyum sağladõğõnõ, pedikülün kesileceği zaman ise, damar yapõlarõnõn eski durumlara dönmüş olduklarõnõ saptadõ. Dhar, Shymal ve arkadaşlarõ yaptõklarõ bir çalõşmayla delay işlemi sonrasõ flebe ait özellikle şok anastomoz damarlarõnda dilatasyon meydana geldiğini ve bunun kalõcõ ve geri dönüşümsüz olduğunu gösterdiler (9). Ayrõca flep kaldõrõldõktan sonraki 48-72 saatte maksimum olmak üzere damar duvarõndaki hücrelerin hem sayõsõ hem de hacminde artõş olduğunu tespit ettiler. Flep cerrahisinde karşõlaşõlan en büyük poblemlerden biri, sadece iskemi sonrasõ oluşan hasar değil iskemi sonrasõ reoksijenizasyon ile de oluşan hasardõr. İskemi sonrasõ reperfüzyonun oluşturacağõ hasar daha şiddetlidir. Şu da bir gerçektir ki iskemi yeterince ağõr ve yeterince uzun sürerse tek başõna kesinlikle hasar 5

oluşturur (10). Ancak klinikte bu kadar şiddetli iskemilerden ziyade tam olmayan iskemilere daha sõk rastlanmaktadõr. İskemi sonrasõ, dokuda süperoksit radikallerinin büyük kõsmõnõn kaynağõ ksantin oksidaz enzim sistemidir (11). Doku oksijenizasyonunun azalmasõ ile birlikte düşen ATP üretimi enerji depolarõnõn azalmasõna neden olur ve hücre membranõnda bozulan iyon transportu hücre içi Ca +2 nin birikimine yol açar. Artan Ca +2 konsantrasyonu da ksantin dehidrogenazõ ksantin oksidaza dönüştürecek proteazlarõ aktive eder (12). Bu arada ATP miktarõnõn azalõp AMP miktarõnõn artmasõ ile birlikte hücre içinde adenozin, inozin hipoksantin dönüşümünün olduğu bir süreç belirir(şekil 1). Özetle, iskemik dokuda iki önemli değişiklik olur, birincisi yeni bir enzim aktivitesi yani ksantin oksidaz, ikincisi ise bu enzimin iki önemli substratõndan biri olan hipoksantin oluşumudur. Diğer substrat yani moleküler O 2 nin de reperfüzyon ile sağlanmasõyla dokuda ani ve çok miktarda superoksit radikali ve hidrojen peroksit oluşur (13-14). 6

Şekil1: İskemik dokularda ksantin oksidaz yolu ile serbest oksijen radikali üretimi. İskemi konusunda yapõlan çalõşmalar serbest O 2 radikallerinin önemini ortaya koymuştur. Çok reaktif ve sitotoksik olan bu moleküller kapiller geçirgenliği artõrarak doku ödemine, trombositlerin damar duvarõna yapõşma özelliğini artõrarak mikrodolaşõmõn bozulmasõna neden olurlar (15). Bu durum, flep kaldõrõlmasõnõ takiben doku hasarõna dolayõsõyla nekroz ve doku kaybõna neden olur. Serbest oksijen radikallerinin ve nötrofil birikiminin neden olduğu toksisiteyi önlemek için bu güne kadar bir çok çalõşma yapõlmõştõr. Günümüze kadar yapõlan çeşitli deneysel modellerde, süperoksit dismutaz(sod), katalaz, allopurinol, vitamin-c, deksametazon, heparin, deferroksamin ve hiperbarik oksijen kullanõmõnõn iskemi 7

reperfüzyon hasarõ olan fleplerde flep yaşayabilirliği üzerine etkileri araştõrõlmõştõr (16-22). Öte yandan flep kan dolaşõmõnõ artõrmaya yönelik, bazõ direkt neovaskülerizasyon yapõcõ ajanlarõn da denendiği bir çok çalõşma yapõlmõştõr (23-25). Günümüz tõbbõnõn en ilgi çekici konusu olan kök hücre teknolojisinin gelişmesi ile birlikte iskemik dokularda kök hücre enjeksiyonu çalõşmalarõna başlanmõştõr (26-27). Kök hücreler, uygun kimyasal sinyallerle spesifik hücrelere dönüşebilme özelliğine sahip farklõlaşmamõş hücrelerdir. Kök hücreler, farklõ hücrelere dönüşebilme kapasitelerine göre farklõ alt tiplere ayrõlõrlar; Totipotent kök hücre, Pluripotent kök hücre, Multipotent kök hücre ve Progenitör kök hücre. Totipotent hücreler master hücre olarak da adlandõrõlõr ve vücuttaki tüm hücrelere dönüşebilecek potansiyele sahip ilk embriyonel hücrelerdir. Pluripotent hücreler zigot oluşumunu takip eden 5. günden sonra oluşan ve plasental hücreler hariç her hücre türüne dönüşebilecek güce sahip hücrelerdir. Gerekli ortam sağlandõğõnda bu hücreler bilinen yaklaşõk 200 hücre türüne dönüşebiliyorlar. Hayvanlardan ilk olarak 1981 yõlõnda elde edilen bu tür kök hücreler yaklaşõk 15 yõl sonra insanlardan da elde edildi. Kök hücreler çok uzun sürelerle bölünerek kendilerini kopyalayabilirler. Daha sonraki gelişim aşamalarõnda hücreler biraz daha özelgörevlere sahip olup Multipotent kök hücrelere dönüşürler.bu kök hücreleri de 8

belirli hücre türlerini meydana getirebilir. Örneğin; multipotent hematopoetik kök hücreler kemik iliğinde bulunur ve gerektiğinde eritrosit, lökosit veya trombositlere dönüşebilir. Progenitör hücreler ise daha da kõsõtlõ farklõlaşabilme yeteneğine sahiptir. Örneğin eritroid progenitor hücreler sadece eritrositlere dönüşebilmektedir. Günümüze kadar kök hücrelerin vücudumuzdaki bütün dokularda var olduğu bilinse de en sõk kullanlan kök hücre kaynaklarõ fetal umblikal kan (embriyonik kök hücre), kemik iliği ve periferik kandõr. Embriyonik kök hücreler sahip olduklarõ potansiyeller açõsõndan çok iyi bir kaynak olsalar da bu konudaki politik ve etik tartõşmalar nedeniyle kemik iliği orjinli erişkin kök hücreler alternatif kaynak olarak sunulmuştur. Kemik iliğinde, kemik iliği stromasõnõn yeniden yapõlandõrõlmasõ ve dolaşõma kök hücrelerin salõnmasõnõ sağlayan "Mezenkimal kök hücre" olarak adlandõrõlan bir hücre grubunun varlõğõ bilinmektedir (27). Mezenkimal kök hücreler şu özelliklere sahiptir: 1. Kendini yenileyebilme kapasitesi, 2. Uzun yaşam süresi, 3. Bir çok hücre çeşidine farklõlaşabilme kapasitesi 9

Mezenkimal kök hücreler aynõ zamanda kondrosit, osteoblast ve myoblast gibi diğer mezenkimal organ sistemlerinin prekürsör hücreleridir (70). Mezenkimal kök hücrelerinin kemik, kõkõrdak, yağ, kas hücrelerine dönüşebilme kapasitesi olduğu hem invitro (28-33) ( Hauner et al., 1987; Grigoradis et al., 1988; Wakitani et al., 1995; Ferrari et al., 1998; Johnstone et al., 1998; Pittenger et al., 1999) hem de invivo (Benayahu et al., 1 989; Bruder et al., 1998) (34-35), bir çok çalõşma ile ortaya konulmuştur. Farklõ dokulara ait hücrelere farklõlaşabilme kapasiteleri nedeniyle kliniğe uyarlama çalõşmalarõ, araştõrmacõlarõ bu kök hücrelerininin daha kolay ve pratik elde edilebileceği farklõ bir kök hücre kaynağõnõ bulmaya zorlamõştõr. Yağ dokusunun olgun yağ hücrelerinin yanõ sõra öncü hücreler de içerdiği ile ilgili ilk kapsamlõ çalõşmayõ Poznanski ve arkadaşlarõ yapmõştõr (38). Yağ dokusu bağ dokusunun yağ depolayan hücrelerinden oluşan özel bir tipidir(şekil 2). Şekil 2: İnsan cilt altõ yağ dokusu histolojik incelemesi; Oldukça büyük bir stoplazmik yağ damlasõna, küçük bir nükleus eşlik ediyor. H&E ile boyama,x20 10

Bir bakõma vücudun en büyük organlarõndan biri olan yağ dokusu, elde edilmesi en kolay dokulardan da birisidir. Yağ aspirasyonu veya abdominoplasti operasyonlarõndan sonra bol miktarda elde edilebilen yağ dokusunun özellikle greft olarak kullanõmõ plastik cerrahide uzun yõllardõr popülerliğini korumaktadõr. Enjeksiyon yöntemi veya eksizyonel greft olarak transfer edilebilen yağ dokusu içindeki olgun yağ hücrelerinin travmaya olan hassasiyeti ve transfer sõrasõndaki önlenemeyen kayõplarõ, ilgiyi, travmaya daha dayanõklõ olan ve preadiposit denilen yağ hücre öncüllerine çekmiştir. Ailhaud ve arkadaşlarõ santrifüj ettikleri yağ dokusu süspansiyonunu fraksiyonlarõna ayõrmayõ başarmõş bu süspansiyonun, parçalanmõş olgun yağ hücrelerinden açõğa çõkan trigliserid, olgun yağ hücreleri ve stromal vasküler fraksiyondan (SVF)(preadipositler, fibroblastlar, endotelial hücreler, düz kas hücreleri, perisitler, kök hücreler) oluştuğunu göstermiştir (39) (Şekil 3). Yağ hücreleri bu hücre topluluğunda bulunan preadiposit lerden farklõlaşõr(şekil 4). Preadipositler, adipojenik progenitör hücrelerdir. Olgun yağ hücrelerinden farklõ olarak küçük hacime sahip olduklarõndan ve stoplazma içi yağ damlacõklarõ olmadõğõndan mekanik travma ve iskemiye olan toleranslarõ daha fazladõr (40). Birçok çalõşmada predipositlerin mikrovasküler endotelyal hücrelerle parakrin etkileşim gösterdiği ortaya konulmuştur (41-42). Örneğin az bilinen bir anjiogenik faktör olan monobutyrin preadipositler tarafõndan sentezlenir ve endotelyal hücre proliferasyonu yapar (43). 11

Claffey ve arkadaşlarõ adipogenez sõrasõnda, vasküler endotelyal hücreler üzerinde güçlü mitotik aktivite gösteren vasküler endotelyal büyüme faktörününün yüksek miktarda salõnõmõnõn olduğunu göstermişlerdir (44). Üst tabaka parçalanmõş yağ hücrelerinden açõğa çõkan trigliserid Orta tabaka %20-80 oranõnda değişen canlõ olgun yağ hücreleri ve bağ dokusu Alt tabaka(stromal VASKÜLER FRAKSİYON) Preadiposit, Fibroblast, endotelyal hücre,kök hücre. Şekil 3: İnsandan yağ emme yöntemi ile elde edilen yağ dokusu süspansiyonun santrifüj sonrasõ fraksiyonlara ayrõlmõş şekli (Referans: Ailhaud G, Grimaldi P, negrel R: cellular and Molecular aspects of adipose tisuue development. Ann Rev Nutr 12:209,213,1992) 12

Şekil 4: Yağ hücrelerinin mezenkimal hücreden farklõlaşma süreci. Son olarak Jalees Rehman ve arkadaşlarõ yaptõklarõ kapsamlõ bir çalõşmada yağ dokusundan elde ettikleri stromal vasküler fraksiyonun granülosit-makrofaj koloni uyarõcõ faktör(gm-csf), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), hepatosit büyüme faktörü (HGF), basic fibroblast büyüme faktörü (bfgf), ve transforming growth factor-ß (TGF- ß) gibi anjiogenik ve antiapoptotik faktör salgõlama potansiyeli olduğunu göstermişlerdir (45). Patricia A. Zuk ve arkadaşlarõ yaptõklarõ bir çalõşma ile stromal vasküler fraksiyonun aynõ zamanda, tõpkõ kemik iliği gibi mezenkimal kökenli olduğu ve iyi bir multipotent kök hücre kaynağõ da olduğunu göstermişlerdir (46). Kök hücrelerin daha önce terapötik angiogenezis yapõcõ etkileri bir çok çalõşmada ortaya konulmuş (25-27,36-37) ancak flep cerrahisinde kullanõmõna ait ilk çalõşma Shigeru ve arkadaşlarõ tarafõndan yapõlmõştõr (47). Çalõşmalarõnda, ratlarda 13

kemik iliği kaynaklõ kültüre edilmiş kök hücrelerin dorsal cilt fleplerindeki neovaskülerizasyon üzerine etkisini incelemiş ve vasküler dansitede iskemi reperfüzyon hasarõnõ azaltõcõ yönde belirgin artõş tespit etmişlerdir. Multipotent öncü hücrelerin vasküler endoteliyal hücrelere dönüştüğü ve bir çok büyüme faktörü sentez ettiğini ortaya koyan Shigeru ve arkadaşlarõ bu hücrelerin, neovaskülerizasyonu artõrmada da potansiyel etkileri olduğunu göstermişlerdir. AMAÇ Yağ emme yöntemi sõk uygulanan Plastik Cerrahi prosedürlerinden birisidir. Elde edilen yağ süspansüyonunun bu güne kadar, dondurulmuş formda saklanmasõ dõşõnda yeniden kullanõmõ söz konusu olmamõştõr. Hele de santrifüj sonrasõ en altta kalan kõsõm, yukarõda değinildiği şekiyle bu kadar zengin hücresel içeriğe sahip olmasõna rağmen deneysel veya klinik kullanõm sahasõ bulmamõştõr. Biz bu çalõşmada daha önce flep cerrahisinde kullanõlmamõş, içeriğinde kök hücre, endotelyal hücre ve preadipositleri barõndõran yağ dokusu kaynaklõ stromal vasküler fraksiyonun enjeksiyonunun, random paternli cilt fleplerinin yaşayabilirliği üzerine etkisini inceledik. Amacõmõz ileride klinik uygulamaya õşõk tutacağõna inandõğõmõz stromal vasküler fraksiyonun etkileri ile ilgili veri toplamaktõ. 14

GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalõşmada ortalama ağõrlõklarõ 300-350 gr olan 30 adet dişi Wistar cinsi sõçan kullanõldõ. Deney süresince, hayvanlar aynõ laboratuvar koşullarõnda (standart oda sõcaklõğõ ve normal gün õşõğõ), rat yemi ve çeşme suyu ile beslendiler. Çalõşma için İ.Ü. DETAM tarafõndan etik kurul izni alõndõ. Anestezi için tüm cerrahi girişimler genel anestezi altõnda yapõldõ. Anestezi, kas içi ketamine hidrokloride (65 mg/kg) + xylazine hidrokloride (0,65 mg/kg) enjeksiyonu ile sağlandõ. A- Stromal vasküler fraksiyon oluşturulmasõ: Her iki inguinal krize paralel olarak yapõlan insizyon ile girilerek inguinal yağ yastõkçõklarõndan 2 adet 1x1x1 cm büyüklüğünde yağ dokusu eksize edildi. Elde edilen yağ dokusu içerisinde 1 cc serum fizyolojik bulunan steril havan içine konuldu. Literatürde (48) daha önce belirtilen şekliyle, manuel ezme işlemi ile süspansiyon haline getirilen yağ dokusu santrifüj tüpüne alõndõ ve 1500 devirde 5 dk santrifüj edildi. Santrifüj sonrasõ en üst tabakada toplanan trigliserid ve orta tabakada toplanan olgun yağ hücreleri tüpten uzaklaştõrõldõktan sonra süspansiyonun en alt noktasõnda toplanan stromal vasküler fraksiyon 1 cc lik insülin enjektörlerine aspire edildi ve enjeksiyon için 30 G lõk iğne kullanõldõ. 15

B-Cerrahi Yöntem Hayvanlarõn sõrtõ elektrikli traş makinesi ile traş edilerek betadin solüsyon ile temizlendi. Bunu takiben, 3x10 cm boyutlarõnda, derinin tüm katmanlarõnõ ve panniculus carnosusu da içeren, Khouri nin modifiye ettiği McFarlane flebi (71), kaudal tabanlõ olarak kaldõrõldõ (Şekil 5). Flep kaldõrõldõktan sonra keskin iğneli 4/0 ipek sütür ile tekrar yerine sütüre edildi. Şekil 5: 3x10 cm boyutlarõnda kaudal tabanlõ olarak planlanan McFarlane flebi. C-Deney gruplarõ Hayvanlar basit rastgele örnekleme metodu ile toplam 3 gruba ayrõldõ (her grup için n=10). 1. grup: Flep kaldõrõlan ve subkütan SVF enjeksiyonu yapõlan grup(n:10). 2. grup: Flep operasyonu dõşõnda hiç bir uygulama yapõlmayan grup(n:10). 3. grup: Flep kaldõrõlan ve subkütan serum fizyolojik enjeksiyonu yapõlan grup(n:10). 16

Grup 1 e (n:10) ait fleplerin her birine 1 cc lik stromal vasküler fraksiyon içeren süspansiyon 6 kadranda olacak şekilde ciltaltõ planda enjekte edildi. Grup 2 e (n:10) ait flepler herhangi bir enjeksiyon yapõlmaksõzõn direkt kaldõrõldõklarõ alana sütüre edildiler Grup 3 e ait (n:10) fleplerin cilt altõ planõna 6 kadranda toplam 1 cc serum fizyolojik enjekte edildi(şekil 6). Operasyon bitiminde, hayvanlarõn birbirlerinin fleplerine zarar vermelerini önlemek için, herbiri hayvan ayrõ bir kafese yerleştirilerek 7 gün boyunca takibe alõndõ. D- Yaşayabilirlik değerlendirilmesi: Postoperatif 7. Günde, Sasaki nin papertemplate yöntemi kullanõlarak, flep yaşayabilirlik yüzdeleri hesaplandõ (72). Bunun için hayvanlar yeniden anestezi edilerek şeffaf asetat kağõdõna renkli asetat kalemi ile flep boyutlarõ ve nekroz hattõ kopye edildi. Elde edilen şekillerden önce tüm flebin alanõ, sonra da yalnõzca yaşayan deriyi gösteren alan hesaplanarak, bulunan değerler birbirine oralandõ ve % yaşayabilirlik olarak ifade edildi. Ayrõca tüm hayvanlarõn flep alanlarõ eşit mesafeden M-307 Hp-photosmart dijital fotoğraf makinasõ ile fotoğraflanõp Microsoft Paint, Versiyon 5.1 programõnda grafikleştirildi. 17

Dişi Vistar cinsi rat İnguinal yağ yastõkçõğõndan Manuel ezme işlemi Eksizyonel alõnmõş yağ dokusu sonrasõ yağ süspansüyonu Stromal vasküler fraksiyonun Fraksiyonlarõna ayrõlmõş Yağ süspansiyonunun aspirasyonu yağ dokusu santrifüje edilmesi 1 cc olarak hazõrlanmõş Flep üzerine 6 noktada Stromal vasküler fraksiyon enjeksiyonun yapõlmasõ Şekil 6: Deney aşamalarõnõn şematik özeti. 18

E- Kapiller dansitenin ölçülmesi: Postoperatif 10. günde her üç gruba ait fleplerin iskemik geçiş zonlarõndan 0.5x0.5 cm büyüklüğünde tam kat doku örnekleri alõndõ ve Hematoksilen Eozin ile boyama sonrasõ õşõk mikroskobunda 1 mm 2 lik alana ait kapiller sayõsõ tespit edildi. F- İstatistiksel değerlendirme: Gruplar arasõndaki istatistiksel karşõlaştõrmalar Kruskal Wallis non-parametrik ANOVA testi ile yapõldõ. Gruplar arsõndaki ikili karşõlaştõrmalar için ise Mann- Whitney U Testi kullanõldõ. Her iki test için de 0.05 değerinin altõndaki P değerleri istatistiksel olarak anlamlõ kabul edildi. SONUÇLAR Postoperatif 7. gün yapõlan yaşayabilirlik değerlendirmesinde Grup 2 fleplerindeki yaşayan flep alanõnõn tüm flep alanõna oranõ % 41 ± 5.9 olarak bulundu. Grup 3 e ait fleplerde ise bu oran %39.2 ± 2.7 olarak tespit edildi. Grup 1 e ait(tedavi grubu) fleplerde ise yaşayabilirlik yüzdesinin % 79.2 ± 4.9 a yükseldiği görüldü. Tedavi grubunun yaşayabilirlik yüzdesindeki bu artõş her iki kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlõ bulundu(p<0.01). Grup 2. ve 3. arasõnda ise flep yaşayabilirlik yüzdeleri açõsõndan anlamlõ fark tespit edilmedi(p>0.05). 19

Her üç gruba ait fleplerin vasküler dansiteleri ölçüldüğünde; 1 mm 2 dokudaki kapiller sayõsõ grup 1 için 29.8 ± 1.2(n:10), grup 2 için 8,4 ± 4.6(n:10) grup 3 için ise 9.3 ± 1.8(n:10) tespit edildi. İstatistiksel olarak Grup 1 e ait kapiller dansitenin grup 2 ve 3 e göre anlamlõ şekilde yüksek olduğu(p<0.01), grup 2. ve 3. arasõnda ise kapiller dansite açõsõndan anlamlõ fark olmadõğõ tespit edildi(p>0.05). Fleplerin flep yaşayabilirlik yüzdeleri ve kapiller dansite yönünden, tedavi grubunun kontrol gruplarõyla ve kontrol gruplarõnõn kendi aralarõndaki karşõlaştõrõlmalarõ ayrõntõlõ olarak Şekil 7, 8, 9, 10, 11 ve 12 de verilmiştir. Şekil 7: Grup 1(n:10), Grup 2(n:10) ve Grup 3(n.10) e ait Mc Farlane flep distallerinde görülen nekroz ve yaşayabilen flep kõsõmlarõ (yaşayabilirlik oranõ; % grup 1 için; % 79.2 ± 4.9, grup 2 için % 41 ± 5.9, grup 3 için %39.2 ± 2.7 tespit edildi.) 20

Şekil 8: Gruplarõn fleplerindeki nekroze ve yaşayan bölülerinin, eşit mesafeden çekilen dijital fotoğraflarõnõn(m307 HP photosmart) bilgisayar ortamõnda(microsoft Paint,Version 5.1) grafikleştirilmiş şekli. Şekil 9: Grup 1, 2 ve 3 e ait flep yaşayabilirlik oranlarõnõ gösteren tablo. 21

Şekil 10: Tedavi grubunun kontrol gruplarõyla, kontrol gruplarõnõn kendi aralarõnda flep yaşayabilirlik oranlarõ açõsõndan farklõlõklarõnõ gösteren grafik(kruskal Wallis non-parametrik ANOVA testi) Şekil 11: Grup 1,2 ve 3 e ait fleplerin iskemik geçiş zonlarõndan alõnan doku örneklerinin kapiller dansite açõsõndan mikroskopik incelenmesi(he,x100) 22

Şekil 12: Grup 1 in Grup 2 ve 3 ile, Grup 2 ile 3 ün kendi aralarõnda kapiller dansite miktarlarõ açõsõndan farklõlõklarõnõ gösteren grafik(kruskal Wallis nonparametrik ANOVA testi). TARTIŞMA Random paternli deri flepleri, plastik cerrahide oldukça yaygõn bir şekilde kullanõlmaktadõr. Ancak flep uzunluğu fazla olduğu zaman flep distalinde nekrozlar gelişebilmekte, bu durum hem hasta hem de cerrah açõsõndan önemli bir sorun oluşturmaktadõr. Bu tür fleplerin yaşayabilirliğinde en önemli etken flebin yeterli kan akõmõna sahip olmasõdõr. Flep dolaşõmõnõn bozulduğu durumlarda doku oksijen seviyesinin düşmesine bağlõ olarak, hücre içi metabolizma aerobikten-anaerobiğe döner. Bu, membran transport mekanizmasõnõ bozacak olan laktat birikimine, 23

hücredeki PH seviyesininin düşmesine ve iyonik pompalardaki ATP depolarõnõnõn boşalmasõna neden olur. Dolaşõm normale dönüp dokuya tekrar oksijen girmesi ile birlikte serbest oksijen oluşumu meydana gelir (50). Serbest oksijen radikallerinin protein, karbonhidrat ve yağ içeren bütün hücre yapõlarõna toksik etkileri vardõr. Daha da önemlisi, meydana gelecek endotelyal hasar trombosit ve nötrofillerin damar duvarõna yapõşmasõna yol açacak, bu da põhtõlaşma sürecini başlatacaktõr (51). Günümüze kadar, flep vasküleritesini bozan iskemi-reperfüzyon hasarõnõ azaltõcõ veya direkt vaskülerizasyonu artõrõcõ yönde bir çok çalõşma yapõlmõştõr (3,4,5). Bu çalõşmalarõn sonucunda vazokonstriksiyonun, ödem formasyonunun, lökosit aktivasyonu ve birikiminin, flep nekrozunda önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Bu faktörlerin ortadan kaldõrõlmasõ veya azaltõlmasõna yönelik te bir çok çalõşma yapõlmõştõr. Bu çalõşmalardan bazõlarõna bakacak olursak; Stewart ve arkadaşlarõ hiperbarik oksijenin random paternli cilt fleplerinde yaşayabilen flep miktarõnõ artõrdõğõnõ (52), Latifoğlu ve arkadaşlarõ nikotin etkisindeki cilt fleplerinde kalsiyum kanal blokerlerinin flep yaşayabilirliğini olumlu yönde etkilediğini (53), Zaccaria ve arkadaşlarõ C vitamininin iskemi-reperfüzyon hasarõnõ azalttõğõnõ (54), Axfort-Gately ve arkadaşlarõ yüksek doz E vitaminin iskemiyi azaltõcõ yönde olumlu rol oynadõğõnõ (55), göstermişlerdir. 24

Son yõllarda çalõşmalar, nötrofillerin serbest oksijen radikalleri oluşumundaki rolünü incelemeye yönelik olmuştur. Nötrofiller lizozomlarõnda yüklü miktarda oksijen türevleri barõndõrõrlar, iskemi reperfüzyon hasarõ gibi birçok inflamatuar olayda bu türevler hem karşõlaştõklarõ patojene hem de konağa(iskelet kasõ, cilt flebi, karaciğer, bağõrsak) zarar verirler. Bu yüzden nötrofil birikimini engelleyen ve flep yaşayabilirliğini artõran bazõ maddeler üzerinde de çalõşmalar yapõlmõştõr (56,57). Rohrich ve arkadaşlarõ flep yaşayabilirliğini artõrmaya yönelik kullanõlacak bir ilaç veya uygulama için ideal özellikleri şöyle sõralamõştõr; kolay uygulanabilir olmalõ, güvenilir olmalõ, etkili sonuçlarõ olmalõ, postoperatif olarak kullanõlabilmeli, ucuz olmalõ, etki mekanizmasõ tam olarak bilinmeli, elde edilmesi kolay olmalõ ve flep nekrozunda koruyucu olmalõ (58). Kök hücre teknolojisinin gelişimiyle beraber araştõrmalar, kök hücrelerinin farklõ hücrelere farklõlaşma yeteneklerinden faydalanarak, bu hücreleri doku rejenerasyonunda kullanmak yönünde yoğunlaşmõştõr. Bu çalõşmalarõn bir çoğunda, kök hücrelerin özellikle iskemik kalp kasõ dokusunda rejenerasyon yapõcõ etkisi incelenmiş ve bu yöntem klinik uygulamada büyük popülerite kazanmõştõr (49,59-62). 25

Yapõlan transmyokardial, intraendokardial veya intrakoroner enjeksiyonlar ile iskemik olan kalp kasõnda rejenerasyon elde edildiği ve kontraktilitenin yeniden elde edildiği görülmüştür. Çalõşmalarõnõ bir aşama daha ileriye taşõyan araştõrmacõlar vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) geni taşõyan kök hücrelerin iskemik modellerde anjiogenez üzerine daha potent etkileri olduğunu bildirmişlerdir (63). Elde edilen sonuçlar yüz güldürücü olsa da araştõrmacõlar, sonuçlarõn doz bağõmlõ olduğu gerçeğinden yola çõkarak kemik iliği gibi oldukça sõnõrlõ bir kaynak dõşõnda miktar olarak ve elde edilme kolaylõğõ yönünden avantajlõ bir doku bulma yoluna gitmişlerdir. 2002 de Patricia Zuk ve arkadaşlarõ yağ dokusunun tõpkõ kemik iliğindekiler gibi farklõ hücrelere farklõlaşabilme kabiliyeti olan oldukça yoğun miktarda kök hücre barõndõrdõğõnõ ve bunlarõn kemik iliği orjinli kök hücrlerle CD yüzey antijenleri ve gen ekspresyonlarõndaki farklõlõk dõşõnda benzer özelliklere sahip olduklarõnõ tespit ettiler (46). Zuk ve arkadaşlarõ aynõ çalõşmada immunofloresan ve flow-sitometri çalõşmalarõ ile yağ dokusu kaynaklõ kök hücrelerin mezodermal veya mezenkimal orjinli olduğunu, düşük miktarda perisit,endotelyal hücreler ve düz kas hücreleri ile birlikte bulunduğunu gösterdiler. Aslõnda bu çalõşma Ailhaud ve arkadaşlarõnõnõn bir çalõşmasõnõ destekler niteliktedir. Ailhaud 1992 de yağ 26

aspirasyonu ile elde ettiği yağ süspansiyonunu santrifüje ettikten sonra en alt tabakada çöken hücre topluluğuna stromal vasküler fraksiyon adõnõ vermiş bu hücrelerin öncü yağ hücrlerinden oluştuğunu göstermiş ayrõca bu fraksiyonun kök hücre içerebileceği öngörüşünde de bulunmuştur (64). SVF sadece içerdiği kök hücre yönüyle değil çeşitli büyüme faktörü sentezleme yeteneği olan preadiposit, adipoblast ve endotelyal hücreler açõsõndan da oldukça önemlidir. Geçmişteki yeni damar oluşumun embriyolojik süreçte sõnõrlõ kaldõğõ düşüncesinin aksine kemik iliği veya periferik dolaşõmdaki kök hücre/ endotelyal hücre öncüllerininin iskemik dokularda neovaskülerizasyon yaptõğõ, bir çok çalõşma ile gösterildi (65-66). Anjioblast olarak ta adlandõrõlan endotelyal öncü hücreler yağ dokusu orjinli stromal vasküler fraksiyon içinde oldukça yoğun olarak mevcuttur ve bu hücreler yeni kan damarõ oluşumu için prekürsördürler.yeni damar oluşumu sürecinde en önemli kofaktörün VEGF olduğu bilinmektedir. İnvitro modellerde iskemik deri fleplerinin yaşayabilirliği ile yeni endotelyal hücre oluşumunun direkt ilişkili olduğu ve bu süreçte vasküler endotelyal büyüme faktörünün primer mediatör olduğu tespit edilmiştir (68). Geçmişte endotelyal öncü hücrelerin intravenöz infüzyonu ile iskemik dokularda neovaskülerizasyon sağlanmõştõr (67), ancak lokal enjeksiyonun intravenöz 27

infüzyona göre bazõ avantajlarõ vardõr. Birincisi; hedef dokudaki endotelyal öncü hücrelerin lokal dansitesini artõrabiliriz, ikincisi ise hücrelerin sistemik yan etkilerinden (anjiogenik hastalõklardan diabetes mellitus, romatoid artrit hatta kanser gibi hastalõklarõn ortaya çõkmasõnõ kolaylaştõrõcõ etkilerinden) korunmuş oluruz. Biz de çalõşmamõzda lokal enjeksiyon yöntemini kullandõk. Bunun yanõsõra Jalees Rehman ve arkadaşlarõ yaptõklarõ bir çalõşmada insan ciltaltõ yağ dokusundan izole ettikleri her 10 6 stromal hücrenin 1203±254 pg vasküler endotelyal faktör (VEGF), 280±2944 pg Hapatosit büyüme faktörü, ve 1247±346 pg trasforming büyüme faktörü -ß sentezlediğini ve VEGF sentezinin iskemik koşullarda 5 kat arttõğõnõ göstermişlerdir (45). Çalõşmamõz bu literatür bilgilerinin õşõğõnda öncül hücrelerin flep yaşayabilirliği üzerine etkisini incelemeye yönelik yapõldõ. Nitekim elde ettiğimiz sonuçlar Shigeru tarafõndan yapõlan çalõşmanõn sonuçlarõ ile uyumluydu (47). Shigeru kõsõtlõ miktarda kök hücreyi kemik iliğinden elde etmiş ve flebe enjekte edilecek hücre sayõsõnõ artõrmak için ise atimik ratlarda allo-enjeksiyon yöntemini kullanmõştõr. Shigeru çalõşmasõnda histolojik incelemelerde enjeksiyon yapõlan fleplerdeki artmõş granülasyon dokusunun vasküler endotelyal öncül hücrelerin etksiyle yeni oluşmuş yoğun bir mikrodamar ağõ içerdiğini göstermiştir. 28

Kaynağõ ne olursa olsun, ister saf endotelyal öncü hücreler isterse çalõşmamõzda kullandõğõmõz kök hücre de içeren- stromal vasküler fraksiyon olsun enjeksiyon sonrasõ flep yaşayabilirliğinin artmasõnõn nedenleri şunlar olabilir: 1. Bu hücreler tarafõndan sentezlenen büyüme faktörlerinin direkt vazodilatasyon yaparak flep dolaşõmõ üzerine olumlu etkileri, 2. Büyüme faktörlerinin anjiogenik etkiyle yeni damar oluşmunu artõrmalarõ, 3. Endotelyal öncü hücrelerin direkt olarak yeni damar oluşumuna neden olmalarõ Günümüzde yeni damar oluşumu mekanizmasõ ile ilgili 2 teori vardõr. Birinci mekanizma anjiogenezis ikincisi ise vaskülogenezis olarak adlandõrõlõr (69). Anjiogenezis var olan kapiller ağõn uzantõsõ olarak yeni mikrodamarlarõn oluşumudur. Vaskülogenezis ise endotelyal öncü hücreler tarafõndan yeni damar oluşumudur. Shigeru kemik iliği kaynaklõ öncül hücre enjeksiyonu sonrasõ flep yaşayabilirliğinde artõş saptamõş, immunohistokimyasal yöntemle damar kesitlerinde enjekte ettiği öncü hücrelerin vasküler endotelyal hücreye dönüştüğünü göstermiştir (47). Çalõşmamõzda SVF enjeksiyonu yapõlmõş fleplerdeki vasküler dansitedeki kantitatif artõşõn bu çalõşma ile uyumlu olarak yeni kapiller oluşumundan kaynaklandõğõnõ düşünüyoruz. 29

Bu çalõşmanõn sonucunda Plastik ve Rekonstrüktif cerrahide oldukça sõk kullanõlan random paternli fleplerinin yaşayabilirliğinin artõrõlmasõnda yağ dokusu kaynaklõ stromal vasküler fraksiyonu enjeksiyonun faydalõ olduğu tespit edildi. Plastik cerrahide yağ emme yöntemi veya dermolipektomi gibi oldukça sõk yapõlan operasyonlardan sonra elde edilen yağ dokusunun gelecekte özelikle doku mühendisliği alanõnda büyük önem kazanacağõnõ düşünüyoruz. 30

ÖZET Plastik cerrahide deri defektlerinin rekonstrüksiyonu için random paternli cilt flepleri yaygõn olarak kullanõlmaktadõr. Fakat iskemiye bağlõ flep distalinde oluşan nekroz, hala ciddi bir problem olup tedavi ve hastanede kalma süresini ve dolayõsõyla hastane masraflarõnõ artõrmaktadõr. Bu deneysel çalõşmada yağ dokusu kaynaklõ stromal vasküler fraksiyonun sõçan dorsal random paternli cilt flebi yaşayabilirliği üzerindeki etkisi araştõrõldõ. 1. gruba ait fleplere (tedavi grubu)(n:10) 6 noktada toplam 1 cc lik stromal vasküler fraksiyon enjekte edildi. 2. gruba(1. kontrol)(n= 10) serum fizyolojik enjeksiyonu yapõldõ, 3. gruba (2. kontrol)(n:10) ise standart flep cerrahisi dõşõnda bir uygulama yapõlmadõ. Gruplar arasõnda cilt flebi nekroz ve yaşayablirlik oranlarõ planimetrik yöntemle ölçüldü. Ayrõca, histopatolojik olarak 1mm 2 lik dokudaki vasküler dansite ölçümü yapõldõ. Stromal vasküler fraksiyonunun flep yaşayabilirliğini kontrol grublarõna göre anlamlõ bir şekilde arttõrdõğõ görüldü. Tedavi grubundaki vasküler dansite kontrol gruplarõna gore daha yüksek bulundu. Bu çalõşma ile yağ dokusu kaynaklõ stromal vasküler fraksiyonun random pattern cilt fleplerinin yaşayabilirliğini artõrdõğõ tespit ettik. 31

SUMMARY Random pattern skin flaps are still widely used in plastic surgery. However, necrosis in distal flap sections resulting from ischemia is a serious problem, increasing the cost of treatment and hospitalization. The aim of this study was to test the effects of adipose tissue derived stromal vascular fraction on random pattern skin flaps in rats. Elevation of a cranially based random-pattern skin flap was performed in rats after which they were injected with 1 cc stromal vascular fraction for treatment group(group 1)(n:10) and saline for group 2(control group)(n:10). For group 3(control group 2)(n:10) no were peformed any procedure after flap elevation. Tissue necrosis and level of survival area was detected with planimetric method and histopathologic examination was performed for detect of level of vascular density. In this study flap survival area were found to be higher in the treatment group when compared to control groups. Increased vascular density were found in stromal vascular fraction injection group when compared to control groups. In this study we demonstrated that stromal vascular fraction injection increased random pattern skin flap survival. 32

KAYNAKLAR 1. Bakamjian, V.Y. : A two stage method for pharengoesaphageal reconstruction with a primary pectoral skin flap. Plast. Reconst. Surg. 36:173,1965 2. McGregor, I.A., Morgan, G.: Axial and random pattern flaps. Brit. J. Plast. Surg. 26:202,1973 3. Cherry G. The differing effects of isoxsuprine on muscle flap and skin flap survival in the pig. Plast Reconstr Surg 1979;64(5):670-2. 4. Nichter LS, Sobieski MV, Edgerton MT. Augmentation of critical skin flap survival following ibuprofen therapy. Ann Plast Surg 1986;16(4):305-12. 5. Karacaoglan N, Akbas H. Effect of parenteral pentoxifylline and topical nitroglycerin on skin flap survival. Otolaryngol Head Neck Surg 1999;120(2):272 6. Hynes, H.: The blood vessels in skin tubes and flaps. Brit. J. Plast. Surg. 3:165, 1950 7. Myers, M.B.: Attempts to augment survival in skin flaps, mechanism of the delay phenomenon, in skin flaps, edit.grabb, W.C.,Myesr, M.B. Little Brown Co. Boston, 1975 8. McFarlane, R.M., Heagy, F.C., Radin, S., Aust, J.C., Wermuth, R.E.: A study of delay phenomenon in experimental pedicle flaps. Plast. Reconstr. Surg. 35:245,1965 9. Dhar, Shymal C. M.D.; Taylor, G. Ian F.R.C.S,. The Delay Phenomenon: The Story Unfolds, Plastic & Reconstructive Surgery: Volume 104(7) December 1999 pp 2079-2091 \ 10. Coban YK, Kurutas EB, Ciralik H.Ischemia-reperfusion injury of adipofascial tissue: an experimental study evaluating early histologic and biochemical alterationsinrats. Mediators Inflamm. 2005 Oct 24;2005(5):304-8. 11. Tomur A, Etlik O, Gundogan NU. Hyperbaric oxygenation and antioxidant vitamin combination reduces ischemia-reperfusion injury in a rat epigastric island skin-flap model. J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2005;16(4):275-85. 12. Adanali G, Ozer K, Siemionow M. Early and late effects of ischemic preconditioning on microcirculation of skeletal muscle flaps.plast Reconstr Surg. 2002 Apr 1;109(4):1344-51. 33

13. Mowlavi A, Ghavami A, Song YH, Neumeister M.Limited use of cyclosporin A in skeletal muscle ischemia reperfusion injury.ann Plast Surg. 2001 Apr;46(4):426-30. 14. Hong JP, Kwon H, The effect of hyperbaric oxygen on ischemia-reperfusion injury: an experimental study in a rat musculocutaneous flap. Ann Plast Surg. 2003 Nov;51(5):478-87. 15. Portakal O, Inal-Erden M.Effects of pentoxifylline and coenzyme Q10 in hepatic ischemia/reperfusion injury. Clin Biochem. 1999 Aug;32(6):461-6. 16. Sagi A, Ferder M, Levens D, et al. Improved survival of island flaps after prolonged ischemia by perfusion with superoxide dismutase. Plast Reconstr Surg 1986; 77(4):639-44. 17. Hardy SC, Homer-Vanniasinkam S, Gough MJ. Effect of free radical scavenging on skeletal muscle blood flow during postischemic reperfusion. Br J Surg 1992; 79(12):1289-92. 18. Im MJ, Manson PN, Bulkley GB, Hoopes JE. Effects of superoxide dismutase and allopurinol on the survival of acute island skin flaps. Ann Surg 1985;201(3):357-9. 19. Zaccaria A, Weinzweig N, Yoshitake M, Matsuda T, Cohen M. Vitamin C reduces ischemia-reperfusion injury in a rat epigastric island skin flap model. Ann Plast Surg 1994;33(6):620-3. 20. Dolan RW, Kerr D, Schneiderman T, Arena S. Reducing ischemia-reperfusion injury in rat island groin flaps using dexamethasone. Ann Plast Surg 1995;35(3):285-9. 21. Wright JG, Kerr JC, Valeri CR, Hobson RW. Heparin decreases ischemiareperfusion injury in isolated canine gracilis model. Arch Surg 1988;123(4):470-2. 22. Morris SF, Pang CY, Lofchy NM, et al. Deferoxamine attenuates ischemiainduced reperfusion injury in the skin and muscle of my o Cutaneous flaps in the pig. Plast Reconstr Surg 1993;92(6):120-32. 23. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 2000;6:389-395. 34

24. Vailhe B, Vittet D, Feige JJ. In vitro models of vasculogenesis and angiogenesis.labinvest.2001;81:439-452 25. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997; 275: 964-967. 26. Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 2001; 103:634-637. 27. Sandmaier BM, Storb R, Kinley J et al. Evidence of allogeneic stromal engrafment in the bone marrow using canine mesenchymal stem cells. Blood 1998;92: 116a. 28. Hauner, H., Schmid, P., and Pfeiffer, E.F. (1987). Glucocorticoids and insulin promote the differentiation of human adipocyte precursor cells into fat cells. J. Clin. Endocrinol. Metabol. 64, 832-835 29. Grigoradis, A., Heersche, J.N.M., and Aubin, J. (1988). Differentiation of muscle fat, cartilage and bone from progenitor cells present in a bone-derived clonal cell population: effect of dexamethasone. J. Cell Biol. 106, 2139-2151 30. Wakitani, S., Saito, T., and Caplan, A.I. (1995). Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve 18, 1417-1426 31. Ferrari, G., Cusella-De Angelis, G., Coletta, M., Paolucci, E., Stornaiuolo, A., Cossu, G., and Mavilio, F. (1998). Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science 279, 1528-1530 32. Johnstone, B., Hering, T.M., Caplan, A.I., Goldberg, V.M., and Yoo, J.U. (1998). In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp. Cell Res. 238, 265-72 33. Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R.K., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman, M.A., Simonetti, D.W., Craig, S., and Marshak, D.R. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147 34. Bruder, S.P., Kurth, A.A., Shea, M., Hayes, W.C., Jaiswal, N., and Kadiyala, S. (1998a). Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells. J. Orthop. Res. 16, 155-162 35

35. Benayahu, D., Kletter, Y., Zipori, D., and Weintroub, S. (1989). Bone-marrow derived stromal cell line expressing osteoblast phenotype in vitro and osteogenic capacity in vivo. J. Cell Physiol. 140, 1-735. 36. A. Heinl-Green, P. W. Radke, F. M. Munkonge, O. Frass, J. Zhu, K. Vincent, D.M.Geddes,andE.W.F.W.Alton The efficacy of a 'master switch gene' HIF- 1{alpha} in a porcine model of chronic myocardial ischaemia,eur. Heart J., July 1, 2005; 26(13): 1327-1332. 37. P.Madeddu,Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for tissue regeneration, Exp. Physiol., May 1, 2005; 90(3): 315-326. 38. Poznanski WJ, Waheed I, Human fat cell precursors:morphologic and metabolic differantiation in culture. Lab invest 29:570-576,1973 39. Ailhaud G, grimaldi P,Negrel R: Cellular and molacular aspects of aipose tissue development.ann. Rev nutr 12:209,213, 1992 40. Patrick CW Jr,: Tissue enginered adipose tissue.in patrick CW Jr, Mikos AG, McIntre LV. Frontiers In Tõssue Engineering. Houston, Elsevier Science,1998, pp 369-382 41. Lau DC. Adipose tissue growth and differentiation: view from the chair. Int J Obes Relat Metab Disord. 2000 Nov;24 Suppl 4:S20-2 42. Lau DC. Paracrine interactions in adipose tissue development and growth. Int J Obes Relat Metab Disord. 1996 Mar;20 Suppl 3:S16-25. 43. Dabson DE, Kambe A,1-Butyryl-glycerol: a novel angiogenesis factor secreted by differentiating adipocytes. Cell. 1990 Apr 20;61(2):223-30. 44. Claffey KP, Wikison WO,Vascular endothelial growth factor. Regulation by cell differentiation and activated second messenger pathways. J Biol Chem. 1992 Aug 15;267(23):16317-22. 45. Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, Pell CL, Johnstone BH, Considine RV, March KL. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004 Mar 16;109(10):1292-8. Epub 2004 Mar 1. 46. Patricia A. Zuk, * Min Zhu, * Peter Ashjian, * Daniel A. De Ugarte, * Jerry I. Huang, * Hiroshi Mizuno, * Zeni C. Alfonso, John K. Fraser, Prosper Benhaim, * and 36

Marc H. Hedrick * Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells,Circulation, Vol. 13, Issue 12, 4279-4295, December 2002 47. Ichioka, Shigeru MD ; Kudo, Satoshi MD ; Shibata, Masahiro PhD ; Ando, Joji MD ; Sekiya, Naomi MT ; Nakatsuka, Takashi MD Bone Marrow Cell Implantation Improves Flap Viability After Ischemia-Reperfusion Injury.Annals of Plastic Surgery. 52(4):414-418, April 2004. 48. Adam J. Katz, Ramon Llull, Emerging Approaches to the tissue engineering of fat, Clinics in plastic surgery, vol 26 Number 4, Oct 1999 49. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997; 275: 964-967. 50. Knight KR. Review of postoperative pharmacological infusions in ischemic skin flaps. Microsurgery 1994; 15(10):675-84. 51. Russell RC, Roth AC, Kucan JO, Zook EG. Reperfusion injury and oxygen free radicals: A review. J Reconstr 52. Stewart RJ, Moore T, Bennett B, Easton M, Newton GW. Effects of free radical scavengers and hyperbaric oxygen on random-patern skin flaps. Arch Surg 1994; 129: 982-8. 53. Latifoğlu O, Atabay K, Çelebi C, Çenetoğlu S, Baran NK. Nikotin etkisi altõndaki deri fleplerinin yaşayan uzunluğuna nifedipinin etkisinin araştõrõlmasõ. Türk Plast Cer Derg 1995; 3(3):144-51. 54. Zaccaria A, Weinzweig N, Yoshitake M, Matsuda T, Cohen M. Vitamin C reduces ischemia-reperfusion injury in a rat epigastric island skin flap model. Ann Plast Surg 1994; 33:620-3. 55. Axfort-Gately RA, Wilson GJ. Myocardial infarct size reduction by single high dose or repeated loq dose vitamin E supplementation in rabbits. Can J Cardiol 1993; 9:94-8. 56. Kubes P, Hunter J, Granger DN. Effects of cyclosporin A and FK506 on ischemia/reperfusion-induced neutrophil infiltration in the cat. Dig Dis Sci 1991;36(10):1469-72. 57. Hira M, Tajima S, Sano S. Increased survival length of experimental flap by calcium antagonist nifedipine. Ann Plast Surg 1990;24(1):45-8. 37

58. Rohrich RJ, Cherry GW, Spira M. Enhancement of skin-flap survival using nitroglycerin ointment. Plast Reconstr Surg 1984;73(6):943-8. 59. Kawamoto A, Murayama T, Synergistic effect of bone marrow mobilization ans vscular endothelial growth factor-2 gene therapy in myocardial ischemia Circulation. 2004 sep 14, 110(11).1398-1405 60. J. S. Forrester, M. J. Price, and R. R. Makkar Stem Cell Repair of Infarcted Myocardium: An Overview for Clinicians Circulation, September 2, 2003; 108(9): 1139-1145. 61. P.Madeddu,Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for tissue regeneration, Exp. Physiol., May 1, 2005; 90(3): 315-326. 62. A. Heinl-Green, P. W. Radke, F. M. Munkonge, O. Frass, J. Zhu, K. Vincent, D.M.Geddes,andE.W.F.W.Alton The efficacy of a 'master switch gene' HIF- 1{alpha} in a porcine model of chronic myocardial ischaemia,eur. Heart J., July 1, 2005; 26(13): 1327-1332. 63. Iwaguro H, Yamaguchi J, Kalka C, et al. Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circulation. 2002; 105: 732 738. 64. Ailhaud G, grimaldi P,Negrel R: Cellular and molacular aspects of aipose tissue development.ann. Rev nutr 12:209,213, 1992 65. Shimada K, Kawamato A, Normal and abnormal aging of cardiovascular system, Nippon Ronen Igakkai Zasshi, 1991 May ; 28(3):302-7 66. Rafii S, Lyden D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med. 2003; 9: 702 712. 67. Asahara t, Murohara t, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogensis. Science 1997;75:1035 68. Zacchigna S, Papa G, Antonini A, Novati F, Moimas S, Carrer A, Arsic N, Zentilin L, Visintini V, Pascone M, Giacca M. Improved survival of ischemic cutaneous and musculocutaneous flaps after vascular endothelial growth factor gene transfer using adeno-associated virus vectors. Am J Pathol. 2005 Oct;167(4):981-91 69. Duttaroy S. Transplantation of autologous endothelial cells and endothelial progenitor cells for angiogenesis. Dan Med Bull. 2005 Dec;52(4):259. 38

70. Mais A, Klein T, Prostanoid pattern and inos expression during chondrogenic differantiation of human mesenchymal stem cells, J Cell Biochem. 2006 Jan 26, 121-22 71. Khouri RK, Angel MF, Edstrom LE. Standardizing the dorsal rat flap. Surg Forum 1986;37:590-4. 72. Nylander G, Lewis D, Nordstrom H, Larsson J. Reductionof postischemic edema with hyperbaric oxygen. Plast Reconstr Surg 1985; 76:596-601. 39