MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRME Can AYDOĞAN Klinik Pazarlama Müdürü Kasım 2011, Antalya 1
İÇERİK Mikrobiyal Genotiplendirme Diversilab çalışma adımları Sonuç değerlendirmesi Kütle Spektrometresi VITEK MS Sistem tanıtımı (demo) 2
Moleküler Tiplendirme Bir çok farklı yöntem mevcut Tüm yöntemlerin avantaj ve dezavantajları var Yöntem Yöntemseçimi seçimi Ayırım gücü ve tekrarlanabilirlik Yöntemin kullanılabilirliği ve sonuçların değerlendirilmesi Kurulum ve çalışma maliyetleri İhtiyaç ve gerekli olan beceri seviyesi Klinik laboratuarında kullanım için uygunluk ve otomasyon 3
Bacterial Barcodes Bacterial Barcodes - Athens, Georgia / ABD Ekim 2006 da biomérieux tarafından satın alındı Nisan 2007 ECCMID / Munih te Diversilab lansmanı yapıldı Komple Enfeksiyon Kontrol Çözümü 4
Diversilab Ne işe yarar? Bakteri, küf ve mayaların genotiplendirmesini yapar - Köken tayini - Parmakizi tayini Neden suş genotiplendirmesi yapılır? Organizmaların gelişim ve yayılımlarının takibi amacı ile organizmaların genetik benzerliklerini ve değişimlerini ortaya koymak için 5 5
Moleküler Tiplendirme Yöntemleri Kromo romoz zomal DNA Anal nalizi izi PCR REA PFGE REA-Prob RAPD AP-PCR DAF ERIC-PCR BOX-PCR RFLP Ribotyping AFLP Dizi Analizi MLST SLST REP REP--PCR (GTG)5 MLVA & VNTR ARDRA ITS (trna-pcr) SSCP TGGE & DGGE 6 DiversiLab 6
Filogenetik Sınıflandırma Vitek, API MicroSeq Riboprinting Riboprinter PFGE AFLP DiversiLab Genetik Farklılıklar: FAZLA AZ Teknik Ayırım: YÜKSEK DÜŞÜK 7
Sağlık Bakımı İlişkili Enfeksiyonlar Bilgi Yönetimi Sürveyans Önlem Müdahale HAI Tarama Çevre Kontrolü HAI Tanı Yapı, Organizasyon, süreç Salgın Yönetimi İletişim Eğitimi Düzenleyici Eylem Planı 8 8
Sağlık Bakımı İlişkili Enfeksiyonlar Bilgi Yönetimi Myla DiversiLab Sürveyans Önlem Müdahale HKE chromid MRSA, ESBL,VRE Hasta Tarama Hava: air IDEAL+ media Çevre Kontrolü HKE Tanı Yüzey: Count-tact Su: GVPC, BCYE, Slidex Legionella DiversiLab VITEK MS, VT2 (ID/AST), API, Media, Slidex, Etest BacT-Alert Vidas CDAB, Rota Yapı, Organizasyon, süreç Salgın Yönetimi İletişim Eğitim Eylem Planları Vikia Rota Adeno Nuclisens MRSA, KPC, RSV, bionexia, RSV Direct IF identification DiversiLab 9 9
DiversiLab bu adımları otomatize eder Bean, P., et al J Clin Micro 1999 Vol 37 10 10
Çalışma Prensibi Tekrarlayan diziler : Organizmaların DNA sında fonksiyonları bilinmeyen kısa DNA dizileri (35-40 bp) belirli bir düzende tekrarlanır. 1. rep-pcr primerleri genom boyunca aralara yayılmış olan spesifik tekrarlayan dizilere bağlanırlar. Çeşitli uzunluklarda bir çok parça amplifiye edilir. 2. Parçalar boyut ve yük olarak ayrılabilerler. Çeşitli boyutlarda bir çok banttan oluşan rep-pcr parmakizi profili oluşturulur. 3. Mikrobiyal klonların profilleri suşlara spesifiktir. Bu parmakizleri daha sonra mikroorganizmalar arasındaki ilişkileri göstermede kullanılabilir. 11 11
Çalışma Adımları II. I. İzole kültürden manuel DNA ekstraksiyonu yapılır. III. Thermalcycler da DiversiLab Parmakizi kitleri kullanılarak rep-pcr yapılır. IV. Biyoanalizör kullanılarak otomatik microfluidic elektroforez yapılır. İnternet tabanlı yorumlama yazılım programı ile kolay ve hızlı değerlendirme yapılır. Sonuç süresi = izole organizmadan ~4 saat 12 12
DiversiLab LabChip LabChip microfluidic elektroforez Elektroferogram Jel 13 13
Standardizasyon Standardize Parmakizi Kitleri Valide test protokolleri Kitlerde + / - kontrol lik ambalaj Uzun son kullanım tarihi Dondurma/çözme imkanı Teknik destek 14 14
Test Menüsü 410946 DiversiLab Acinetobacter Kit 410983 DiversiLab Listeria Kit 410948 DiversiLab Archaebacteria Kit 410984 DiversiLab Mycobacterium Kit 410949 DiversiLab Aspergillus Kit 410985 DiversiLab Mycoplasma Kit 410962 DiversiLab Bacillus Kit 410986 DiversiLab M. tuberculosis Kit 410963 DiversiLab Bifidobacterium Kit 410987 DiversiLab Propionibacterium Kit 410964 DiversiLab Campylobacter Kit 410988 DiversiLab Pseudomonas Kit 410965 DiversiLab Candida Kit 410989 DiversiLab Salmonella Kit 410966 DiversiLab Clostridium Kit 410991 DiversiLab Staphylococcus Kit 410967 DiversiLab C. perfringens Kit 410992 DiversiLab Streptococcus Kit 410968 DiversiLab Enterobacter Kit 411007 DiversiLab Bacterial Kit 410969 DiversiLab Enterococcus Kit 411008 DiversiLab Fungal Kit 410980 DiversiLab Escherichia Kit 410990 DiversiLab Serratia Kit 410981 DiversiLab Klebsiella Kit 410993 DiversiLab Francisella Kit 410982 DiversiLab Lactobacillus Kit 410994 DiversiLab Saccharomyces Kit 15 15
Yazılım Web tabanlı kullanıcı yazılımı Otomatik değerlendirme Kullanıcılara özel şifre Her an verilere erişim imkanı Veri kaybetme riski yok İstendiğinde farklı üniteler ile veri paylaşma imkanı Standart bmx kütüphaneleri ile hızlı identifikasyon imkanı Her zaman en güncel sürüm kullanımı Ücretsiz yazılım güncellemeleri 16 16
17 17
Sonuçlar 18 18
Sonuçlar 19 19
Sonuçlar Liste Dağılım 20 20
Standardize Kütüphaneler Mevcut kütüphaneler MRSA C. difficile Mycobacterium Küf Maya Candida Francisella E.coli Salmonella Gram + Gram - Geliştirilen kütüphaneler Acinetobacter VRE Non-Fermenter Coag-Neg Staph M. chelonae M. abscessus, M. avium M. intercellulare, tuberculosis M. Bovis, M. peregrinum M. septicum Candida glabrata Candida albicans Salmonella typhimurium Salmonella enterditis E. coli O157 O155 M. 21 21
Mycobacterium Mycobacterium 22 22
Maya Maya 23 23
Escherichia coli 24 24
Yüksek tekrarlanabilirlik 30 günde 10 defa 2 E.coli O157H7 suşunun subkültürü yapıldı 70 C de 5 defa donduruldu Petriler 4 C de 7 ve 14 gün bekletildi Toplam 100 DNA ekstraksiyonu Altı farklı Biyoanalizör Üç farklı teknisyen Üç gün %1 den az varyasyon %99 200bp 4Kb Healy, et al. JCM Jan 2005 25 25
Yüksek tekrarlanabilirlik %98 Üç farklı mikroorganizma Üç farklı teknisyen tarafından Üçer farklı DiversiLab Parmakizi kiti lotu ile çalışıldı ve < %2 varyasyon bulundu Healy, et al. JCM Jan 2005 26 26
Yenidoğan Yoğun Bakım Ünitesi MRSA kronik otitli sağlık çalışanı 27 27
Erciyes Üniversitesi Moleküler Kongresi, 2010 28 28
Erciyes Üniversitesi XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, 2010 29 29
GATA 30 30
GATA 31 31
Erciyes Üniversitesi XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, 2010 32 32
DiversiLab PFGE 24 Numune: 6 saat 33 33
Diversilab İzole kültürden ~4 saatte hızlı sonuç Web tabanlı arayüzü ile kolay kullanım Standardizasyon & Yüksek Tekrarlanabilirlik Otomatik Değerlendirme & Yorumlama Teknik Destek 34 34
Klinik Laboratuarı nda Genotiplendirme Türkiye de Diversilab Erciyes Üniversitesi Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi Marmara Üni. Pendik Eği. Ve Araş. Hastanesi Çukurova Ü. Veterinerlik Fakültesi Mersin Üniversitesi Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Gaziantep Üniversitesi Koç Üniversitesi / Amerikan Hastanesi Hacettepe Ü., Süleyman Demirel Ü. (proje bazında) 35 35
FMLA ( Full Microbiology Lab Automation) Hastane Kaynaklı Enfeksiyonların Yönetimi Diversilab Numunenin Ekimi Kültür İdentifikasyon Antibiyogram Gram Boyama 36 36
KÜTLE SPEKTROMETRE 37
Kütle Spektrometresi Nedir? Kütle Spektrometresi numunenin temel içeriğinin belirlenmesinde kullanılan analitik bir tekniktir. MS prensibi yüklü moleküller oluşturup onların kütle yük oranını ölçerek kimyasal bileşiğin iyonizasyonu esasına dayanır. Doğrudan koloniden MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight) ile bakteri/maya/mantarların hızlı tanımlanması. MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight) Matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi 38
Modern Mikrobiyal Taksonomi: Proteomikler & Genomikler protein bacterial cell DNA genome proteome Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,1.0)=>NF0.7[BP = 4423.9, 2117] mass fingerprint 9000 2117.3 11000 DNA fingerprint 12271.4 10975.2 10493.9 10110.8 9611.5 9075.2 8903.3 8383.8 8054.3 7000 8610.6 7424.9 6786.7 6271.2 5897.8 5000 6533.3 6629.0 4026.9 10 0 3000 4535.6 20 3491.4 30 3132.3 40 4738.6 4765.4 50 6137.3 60 3311.8 % Intensity 70 6984.6 80 7209.8 90 8823.5 4861.0 100 9476.2 4424.2 species definition & determination 13000 Mass (m/z) 39
Günümüzde Kullanım 24 saatlik kültür Manuel Ön-seçim VITEK 2 Sistemi API - Sistemi Manuel Ön-seçim yok Direnç Testleri Serolojik Testler Görsel Metodlar PCR MALDI-TOF MS SARAMIS Sadece 2 dakika 4 72 saat Mikroorganizma tanımlaması 40
biomérieux Kütle Spektrometre Tarihçesi Mayıs 2010: biomérieux tarafından satın alındı * SARAMIS: Mikrobiyal ID veritabanı (patentli SuperSpectra ) ve algoritmaları Haziran 2010: ile anlaşma yapıldı Mikrobiyoloji laboratuvarları için ortak kütle spektrometre geliştirilmesi MALDI-TOF teknolojisi Shimadzu tarafından bulunmuştur *SARAMIS = Spectral ARchive And Microbial Identification System 41
MALDI-TOF MS: Temel Prensip tespit ayırım İyon dedektörü + + + Hareket alanı + elektrot hızlanma Hızlanma alanı iyonizasyon + + desorpsiyon matriks / analit kristallerii kuyucuk 42
İş akışı: Numune Hazırlığı (Adım 1) 48 pozisyonlu plak 0.3 µl Matriks solüsyonu eklenmesi Tek koloni veya süspansiyondan seçim ve transfer 43
İş akışı: Ölçüm (Adım 2) Otomatik spektrum eldesi ~60 sn. Sağlam protein iyonizasyonu ve moleküler ağırlık ölçümü P ow er 7075 0 3000 5000 7000 9000 11000 11906 11572 10939 9994 10347 10608 10226 9453 9330 8450 10 9654 8744 7980 7863 7367 20 7092 30 6837 5015 40 5931 70 3581 % Intensity 80 50 N egative 1648.1 8074 90 60 V acuum <<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3 3775 100 Ionising 13000 Mass (m/z) 44
İş akışı: Analiz (Adım 3) Mikroorganizma tanımlaması Algoritma hesaplaması Veritabanı ile karşılaştırma 45
Tam bakteri hücresindeki kütle spektrometresine göre farklı peak paternlerinin oluşması Pantoea agglomerans Acinetobacter lwoffi Burkholderia cepacia Raoultella ornithinolytica Staphylococcus aureus Escherichia coli 4000 m/z 8000 46
Sonuç Süresi İş akışı adımları Süre (dakika) n=5 n = 24 n = 96 izolat izolat izolat Plak 1 5 16 Matriks Kurutma Okuma Sonuç süresi Toplam 1 2 3 2 10 7 5 12 43 9 22 76 47
Myla : Kullanım arayüzü MS-ID sonuç görüntülenmesi VITEK MS sonuçları 48
Çok hızlı tanımlama Kolay kullanım Maliyet etkin Kullanıcı dostu Sürekli genişleyen veritabanı ve geliştirmeler ile mükemmel performans LIS ve diğer laboratuvar sistemleri ile entegrasyon P ow er Ionising V acuum N egative 49
Türkiye de VITEK MS Marmara Ü. Pendik Eğit. ve Araş. Hastanesi 50
Sorularınız? 51
52