As. Fatma KAYA BOZKURT

T.C. Sağlık Bakanlığı Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği Şef: Doç. Dr. Paşa GÖKTAŞ NOZOKOMİYAL İNFEKSİYON ETKENİ OLAN VE STERİL VÜCUT SIVILARINDAN İZOLE EDİLEN KANDİDA TÜRLERİNİN TİPLENDİRİLMESİ VE ANTİFUNGAL DUYARLILIKLARININ E TEST YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ As. Fatma KAYA BOZKURT Uzmanlık Tezi İstanbul-2008

ÖNSÖZ Uzmanlık eğitimimi aldığım Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Başhekimi Sayın Doç.Dr. H.Mehmet SÖKMEN e, Uzmanlık eğitimim süresince, geniş bilgi ve tecrübesinden yararlandığım Klinik Şefimiz Sayın Doç. Dr. Paşa GÖKTAŞ a, Gerek eğitimim boyunca, gerekse tezimin planmasından sonuçlanmasına kadar her aşamada yol gösteren tez danışmanım Uz. Dr. Naz OĞUZOĞLU na, Uzmanlık eğitimim süresince bilgi ve deneyimleri ile yetişmemde büyük katkıları olan laboratuvarımızın tüm uzmanlarına, Çalışmalarım sırasında gösterdiği yakın ilgi ve yardımlarından dolayı İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği uzmanlarından Dr. Derya ÖZTÜRK ENGİN e Dört yıl boyunca birlikte çalışmaktan ve tanımaktan mutluluk duyduğum tüm asistan, teknisyen ve hizmetli arkadaşlara, Ayrıca beni bu günlere getiren anne ve babama, zor anlarımda sabır ve sevgisinden güç aldığım, manevi desteği ile her zaman yanımda olan sevgili eşim Ali Fethi BOZKURT a teşekkür ederim. As. Fatma KAYA BOZKURT İSTANBUL 2008

İÇİNDEKİLER 1. GİRİŞ VE AMAÇ.1 2. GENEL BİLGİLER.3 2.1. Tarihçe. 2.2. Sınıflandırma. 4 2.3. Morfoloji ve boyanma özellikleri.5 2.4. Kültür ve biyokimyasal özellikleri...7 2.5. Kandidalarda hücresel yapı 8 2.6. Kandidaların virülans faktörleri..9 2.7. Epidemiyoloji 13 2.8. Tıbbi bakımdan önemli kandida türleri.. 2.9. Patogenez 20 2.10. Kandida infeksiyonları 23 2.11. Kandidaların idantifikasyonu...29 2.11.1. Germ tüp testi...29 2.11.2. Hif, blastospor ve klamidospor yapımı...30 2.11.3. Karbonhidrat asm- ferm. testleri 2.11.4. Üreaz testi 2.11.5. Kromojenik besiyerinde tiplendirme 34 2.11.6. Serolojik testler.. 35 2.11.7. Kandidalarda moleküler tanı yöntemleri. 2.11.8. Hızlı tiplendirme kitleri. 2.12. Antifungal ajanlar 37 2.13. Antifungal duyarlılık testleri.46 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Test organizmaları 3.2. İzolasyon ve İdantifikasyon 3.2.1. Primer izolasyon 3.2.2. Germ tüp deneyi 3.2.3. CHROMagar Candida ya ekim 3.2.4. API 20C AUX ile idantifikasyon.. 3.3. Antifungal duyarlılık testi 3.3.1. Antifungal ajanlar 3.3.2. Besiyeri-tampon 3.3.3. Maya İnokülümünün Hazırlanması 3.3.4. İnokülasyon, İnkübasyon ve Değerlendirme 4. BULGULAR 5. TARTIŞMA VE SONUÇ 6. ÖZET 7. SUMMARY 8. KAYNAKLAR 2

1. GİRİŞ VE AMAÇ Kandida türleri doğada yaygın olarak bulunan, birçok hayvan ve insanların deri ve mukozalarında normal flora üyesi olarak yer alan, predispozan faktörlerin varlığında yüzeyel ve ciddi sistemik infeksiyonlar oluşturabilen, önemli morbidite ve mortalite nedeni olabilen fırsatçı patojen mikroorganizmalardır. Normal florada bulunmaları nedeniyle birçok klinik örnekte bu tür mantarların üretilmesi kavram karmaşasına ve zaman zaman da gereksiz tedavilere neden olmaktadır. Steril vücut sıvılarından (kan, BOS, plevral ve perikardial sıvılar v.s.), doku örneklerinden izolasyonları ve üretilmeleri ya da kültürde fazla sayıda olmalarının yanısıra hastanın durumu da invaziv kandidiyazis tanısı koymada önem arzetmektedir. Klinik belirtiler olmaksızın balgam, idrar, feçes ve vajenden az sayıda izole edilmeleri durumunda ise genelde tedavi edilmemektedirler.. Geniş spektrumlu ve birden fazla antibiyotik kullanımının artması, immünosupresyon, organ transplantasyonundaki gelişmeler, büyük cerrahi girişimlerin artması, yenidoğan ve erişkin yoğun bakım birimlerinde genel durumu bozuk hastaların daha fazla izlenmesi, yapay protezlerin kullanımının yaygınlaşması ve HIV ile infekte popülasyonun artması sonucu fungal infeksiyonların sıklığında son otuz yılda artış olmuş ve fırsatçı patojenler arasında en önemli yeri mantarlar almıştır. İnvaziv fungal infeksiyonların en önemli etkenleri arasında Candida albicans ve Aspergillus fumigatus gelmektedir. Önceleri bu iki türün neden olduğu infeksiyonların toplamı invaziv fungal infeksiyonların yaklaşık %80 ini oluştururken, son yıllarda invaziv fungal infeksiyonlarda non albicans kandida ve non fumigatus aspergillus sıklığında artış olmuş ve yeni küf mantarları da etken olarak saptanmaya başlamıştır. İnvaziv fungal infeksiyonların tanımlanmasında doku biyopsisi gibi invaziv girişimler dahil tanı yöntemlerinin artan sıklıkta uygulanması, yaygın Amfoterisin B kullanımı, yoğun kemoterapiler; invaziv fungal infeksiyonlarla ilgili bilgi birikiminin 3

artışına ve yeni etkenlerin saptanmasına da fayda sağlayan en önemli etmenler olarak düşünülmektedir. Mantar infeksiyonu sıklığının artışı ile birlikte patojen mantar türlerinin spektrumu ve direnç paternleri de değişmektedir. Nozokomiyal fungal infeksiyon etkeni olarak ilk sırayı C.albicans almakla birlikte, son yıllarda tiazol grubu antifungallerin profilaksi ve tedavide sık kullanımları sonucu, daha az patojen ama daha dirençli olan C. tropicalis, C.krusei, C.lusitaniae, C.glabrata, C.parapsilosis, C.guilliermondii, C.kefyr gibi kandida türleri ile kolonizasyon ve sistemik infeksiyonlar artmıştır. Ülkemizde en sık görülen non albicans kandida türleri sırasıyla C. tropicalis, C.glabrata, C.parapsilosis ve C.krusei olarak belirlenmiştir. Nozokomiyal infeksiyonlar başvuru anında inkübasyon döneminde olmayan, hastaneye yatıştan sonra gelişen veya hastanede gelişmesine rağmen, bazen taburcu olduktan sonra ortaya çıkabilen infeksiyonlar olarak tanımlanmaktadır. Bu infeksiyonlar ciddi morbidite ve mortaliteye yol açan ve aile, hastane ve ülkeye ekonomik zararlar getiren, sağlık sektörünün önemli sorunlarından biri olup modern tıptaki birçok gelişmelere rağmen giderek büyüyen sorunlar zinciridir. Tamamen önlenememekle beraber, ülke bazında tüm sağlık personelinin organize ve uyumlı çalışmaları ve eğitilmeleri sonucu en aza indirilmesi mümkündür. Nozokomiyal infeksiyon etkenleri içinde; kandida türleri hastane genelindeki nozokomiyal infeksiyon nedenleri arasında altıncı sıklık sırasında yer alırken, nozokomiyal kandidiyazis etkenleri arasında koagülaz negatif stafilokoklar, Staphylococcus aureus ve enterokoklardan sonra dördüncü sırada yer almaktadır. Hastanede kalış süresini otuz günden fazla uzatan nozokomiyal kandidiyazis olguları diğer patojenlerle gelişen septisemi olgularına göre daha yüksek mortaliteye sahiptir. Bu infeksiyonlar antimikrobiyal direncin artmasına katkıda bulunurken, büyük ekonomik kayıplara da neden olmaktadır. Günümüzde invaziv fungal infeksiyonların öneminin artışında; epidemiyolojik faktörler, risk faktörleri, mortalite, yeni etkenler, tanı zorluğu, 4

antifungal tedavideki gelişmeler (yeni antifungaller ve klinik kullanımları, tedavi maliyetleri, antifungal ajanlara direnç gelişimi, istenmeyen etkiler, kombine tedavi gereksinimlerinin otaya çıkışı) gibi pek çok faktörün katkısı vardır. Antifungal ilaçlara direnç gelişmesi ve fungal infeksiyonların önemli bir sağlık sorunu haline gelmesi, daha geniş spektrumlu ve farklı hedefleri etkileyen yeni ilaçlara ve tedavi rejimlerine ihtiyaç doğurmuştur. Bu gözlemler sonucunda, hem dirençli suşların saptanması hem de yeni antifungallerin klinik kullanım öncesi değerlendirilmesinde antifungal duyarlılık testlerinin önemi artmıştır. Bütün bunlar antifungal tedavi seçiminde in vitro duyarlılığı ölçen testlerin geliştirilmesine yönelik çalışmaları yoğunlaştırmıştır. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) tarafından 1992 de mayalar için standart makrodilusyon yönteminin önerilmesi ile bu konuda önemli bir gelişme kaydedilmiştir. Ancak standart makrodilusyon testinin uygulanması zor ve zaman alıcı olması nedeniyle alternatif yöntem arayışları devam etmiştir. Bu araştırmaların sonucunda, daha pratik olan mikrodilüsyon yöntemi geliştirilmiştir ve bugün bu amaçla kolorimetrik buyyon mikrodilüsyon, agar dilüsyon, disk difüzyon ve E test gibi yöntemler de kullanılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, hastanemiz kliniklerinde yatan hastalarda nozokomiyal infeksiyon etkeni olan ve başta kan olmak üzere steril vücut sıvılarından izole edilen invaziv kandida izolatlarının standart yöntemlerle tür düzeyinde tanımlanması ve Amfoterisin B ile yeni bir triazol grubu antifungal ajan olan Vorikonazolün antifungal etkilerini değerlendirmektir. Çalışmamızda duyarlılık testi olarak CLSI ın standart yöntem olarak belirlediği broth dilüsyon yöntemi ile ileri düzeyde uyum gösteren ve uygulama kolaylığı nedeniyle broth dilüsyon yöntemine alternatif olarak geliştirilen E test yöntemi kullanılmış ve hastanemiz genelinde antifungal terapiye yol gösterici olarak morbidite ve mortaliteyi azaltmaya katkı sağlaması amaçlanmıştır. 5

2. GENEL BİLGİLER 2.1. TARİHÇE Kandidalarla ilgili ilk bilgiler Hippocrates'e kadar uzanır, Galen ve Peppy 1665 de oral kandidiyazisi tanımladıktan sonra, 1771 de Rosen ve Rosenstein oral kandidiyazisin özellikle yenidoğanın bir hastalığı olduğunu açıklamışlar ve 1835 de Veron hastalığın doğum kanalından bulaştığını ortaya koymuştur. 1839 yılında ilk defa Langenbeck oral kandididyazisli bir hastadan maya hücrelerini izole etmiştir. Oral kandidiyazisin mantar niteliğinde bir etyolojiye bağlı olduğunu ilk olarak 1841 de Berg, 1844 de Bennet ortaya koymuşlardır. 1843 de Robin oral kandidiyazis etkeninin, sistemik infeksiyonlar da yapabileceğini gözlemiş ve etkene ilk olarak Oidium albicans adını vermiştir (1,2). 1849 da Wilkinson vajinal kandidiyazı ilk olarak tarif etmiş, 1875 de Hausmann vajinal kandidiyazis ile oral kandidiyazis ilişkisini ortaya koymuş ve ikisinin de aynı etkene bağlı olduğunu ispatlamıştır. Candida albicans ın adlandırılması uzun ve karışık evrelerden geçmiştir. İlk adlandırma Robin tarafından yapıldıktan sonra 1851 de Bonor aynı mantar için Monilia albicans adını kullanmıştır. O günden sonra birçok araştırmacı çeşitli isimler kullanmışlardır. Bu karmaşaya son vermek için 1923 de Berghout Candida cinsini yeniden oluşturmuş ve 1954 de oral kandidiyazis etkeni Candida albicans olarak belirlenmiştir. Böylece günümüzde C.albicans için 100'den fazla sinonim bulunmaktadır (3). 1940 lardan sonra antibiyotiklerin yaygın kullanımına bağlı olarak kandida infeksiyonlarında büyük artışlar görülmüş ve kandidaların fırsatçı patojenliği ortaya konmuştur. Bugün Amerika Birleşik Devletleri nde kandida infeksiyonları için Candidiasis, Kanada ve birçok Avrupa ülkesinde ise Candidosis deyimleri kullanılmaktadır (4, 5, 6). 6

2.2. SINIFLANDIRMA Kandida cinsi; tek hücreli, tomurcuklanarak çoğalan, gerçek/yalancı hifler oluşturabilen maya morfolojisinde mantarlardan oluşur. Kandida cinsindeki mayalar; mantarlar evreninin, Deuteromycota (fungi imperfecti) bölümünde, Blastomycetes sınıfında, Criptococcoceae ailesinde içinde sınıflandırılmaktadır. Kandida cinsi yaklaşık 200 civarında tür barındırır. Ancak bu yapay bir gruplamadır. Çeşitli kandida türlerinin telemorfları (seksüel formları) gösterildikçe aslında farklı cinsler olduğu görülmüştür (Clavispora, Debaryomyces, Issatchenkia gibi). Dolayısı ile kandida cinsi ilişkisiz türlerin bir karışımıdır (7). Sınıf: Blastomycetes Aile: Crytococcaceae Cinsler: Candida Crytococcus Torulopsis Trichosporon Rhodotorula Saccharomyces Hansenula Kluyveromyces Pichia Geotrichum Malessezia Kandida cinsinin patojen olabilen birçok türü vardır. İnsanda infeksiyon etkeni olabilen kandida türleri tablo 1 de verilmiştir. 7

Tablo 1. İnsanda infeksiyon oluşturan kandida türleri (8). Sık rastlanan türler Seyrek rastlanan türler C. albicans C. catenulata C. guilliermondii C. ciferrii C. krusei C. dubliniensis C. lusitaniae C. famata C. parapsilosis C. haemulonii C. tropicalis C. humicola C.glabrata C. inconspicua C. kefyr C. lamblica C. lypolitica C. norvegensis C. pelliculosa C. pintolopesii C. pulcherrima C. utilis C. zeylanoides 2.3. MORFOLOJİ VE BOYANMA ÖZELLİKLERİ Kandidalar ince duvarlı, oval veya yuvarlak, kapsülsüz, hareketsiz, 1-3x4-6 µm boyutlarında, multilateral tomurcuklanma (blastospor) ile aseksüel olarak üreyen fakültatif anaerop mayalardır (9). Maya formu dışında kültür ve dokularda pseudohif veya gerçek hif oluşturabilirler. Pseudohifler, tomurcuklanma sırasında meydana gelen uzantının ana hücreden ayrılmaması sonucu gelişir. Gerçek hifler ise apikal 8

uzantı tarzında, septalı ve düzgün kenarlıdır. Hif ve pseudohif maya formuna dönebilir ve her üç şekil kültür ve dokularda görülebilir (10, 11, 12). Şekil 1 de maya hücresi, pseudohif ve gerçek hif yapıları gösterilmiştir. Şekil 1. Maya hücresi Pseudohif Gerçek hif C.albicans ve daha nadir izole edilen C.dubliniensis ve C. norvegensis türleri gerçek hif oluşturma özelliğine sahiptir (17). Gram boyama ile tüm kandida türleri Gram olumlu boyanır (7). Maya elemanlarının klinik örnekler içinde aranmasında Potassium Hydroxide- Calcofluor White Fluorescent boyası kullanılır. Maya hücre duvarındaki kitin ve selüloza nonspesifik bağlanan Fluorescent boyası yeşilden maviye değişen renklerde floresan verir(7,13). Şekil 2 ve 3 de Gram ve Calcofluor White Fluorescent ile boyanmış C. albicans gösterilmiştir. Şekil 2. Gram (+) boyanan C. albicans Şekil 3. Calcofluor White Fluorescent ile boyanmış C.albicans 9

2.4. KÜLTÜR VE BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİ Kandida türleri Saboroud dekstroz agarda (SDA) ve kanlı agarda oda ısısında (22-26 C) ve 37 C'de kolayca üreyebilirler. Kültür için alınan örnekler hem 26 C hem de 37 C'de ayrı ayrı inkübe edildiğinde 37 C'de üreyememe saprofitliği ortaya koyan bir özelliktir. Patojen kandidaların çoğu hem 26 C hem de 37 C'de ürerler. Optimal üreme için kültür tüplerinin kapakları havalanmayı sağlamak üzere hafifçe gevşetilmeli ve inkübatör nemi %30-40'a ayarlanmalıdır. En iyi üreme ph 4,5-5 arasında olmakla birlikte, ph 3-7,5 arasında üreyebilen türler de vardır. Oda ısısında SDA'da 24-48 saatte krem renkli, opak, düzgün yüzeyli, 1-2 mm çapında, tipik maya kokusu olan S tipi koloniler oluştururlar. Kandidalar kendiliğinden S tipi koloniden R tipi koloniye dönüşebilir. R tipi kolonilerin oluşumu fazla miçel gelişimi ile ilgilidir. Bazan, örneklerden ilk izolasyonda C.albicans ın SDA'da buruşuk koloni oluşturduğu gözlenebilirse de bunlar subkültürlerinde düz kolonilere dönüşür. C.albicans'ın birçok izolatı kanlı agarda kısa düzensiz uzantılı koloniler oluştururlar (4,9,14). Kandida türlerinin üretilmesinde, bakterilerin ve hızlı üreyen küflerin üremelerini baskılayan besiyerlerinin seçilmesi kolaylık sağlar. Bu amaçla seçicilik sağlamak üzere primer izolasyon besiyerlerinin bileşimine penisilin, streptomisin, gentamisin, kloramfenikol gibi antibiyotikler ve sikloheksimid (actidione) eklenebilir. Pratikte çeşitli antibiyotikler eklenmiş Brain Heart İnfüzyon agar (BHI), Sabouraud-BHI agar (SABHI) ve İnhibitory Mold Agar (IMA) gibi besiyerleri primer izolasyon amacı ile kullanılmaktadır. Sikloheksimid bazı türlerin üremesini baskıladığı için sikloheksimid içermeyen besiyerine de ayrıca ekim yapılmalıdır. CHROM agar ve Pagano- Levine gibi kromojenik besiyerleri de primer izolasyon amacıyla kulanılabilir. Bu besiyerleri kandida türlerinin varlığını göstermesi ve özellikle başta C. albicans ve sık rastlanan diğer türlerin erken dönemde hızlı tanımlanmasını sağlama açısından yararlıdır (15,16). 10

Bütün kandida türleri glukozu fermente eder ancak nitratı asimile edemez. Kültürlerinde etanol, asetoin, asetik asit, laktik asit, formik asit, propiyonik asit, pirüvik asit, süksinik asit gibi organik asitlerden zengin metabolik son ürünler oluşur. Kandida türleri fakültatif anaerob olmakla birlikte aerobik ortamda çok daha iyi üreyebilir (17,18). Klinik örneklerden izole edilen C.krusei dışındaki kandida türlerinin üreaz enzimi yoktur. Bu özellik kandidaların maya formundaki diğer mantarlardan ayırımında önemlidir (18). 2.5. KANDİDALARDA HÜCRESEL YAPI Kandidalar, bakterilerden farklı olarak kompleks yapılı ökaryotik hücrelerdir. Hücre duvarının kimyasal ve antijenik yapısı, bakteri hücre duvarından belirgin farklılıklar gösterir. Kandidaların sitoplazmik zarı yapısal olarak insan hücresi sitoplazmik zarı ile benzerlik gösterir. Kandida infeksiyonlarının tedavisinde kullanılan ilaçlar, bu tip yapısal benzerliklerden dolayı insan hücresi üzerinde de toksik etkiler gösterir. Şekil 4 de kandidalardaki hücresel yapı gösterilmiştir. Şekil 4. Kandidalarda hücresel yapı 11

2.5.1. Hücre iskeleti Fungal iskelet turgor basıncına karşı koyan dinamik bir sistemdir. İskelet hücre duvarı ve hücre membranı ile bağlantılıdır. İskelet komponentlerinden olan mikrotübüller, membranın hareketliliğinde rol alırlar. İskeletin diğer bir bileşeni olan aktin, sitoplazmik akışkanlıktan sorumludur. Miyozin ise aktinle beraber organellerin hareketliliğini sağlar. İskelet komponentlerinin birbirleriyle ilişkisi açısında Ca ++, Mg ++ ve H + iyonlarının yoğunlukları önemlidir. Bu iyonların hücre içine giriş çıkışları ile organellerin hareketliliği ve hifal uzama düzenlenir. İyonlar ek olarak, mitoz, mayoz, tomurcuklanma, septum oluşumu yani morfogenezde ve protein kinaz gibi bazı enzimlerin regülasyonunda rol alırlar (18,19). 2.5.2. Hücre Duvarı ve Antijenik Yapı Hücre duvarı sert bir yapıda olup hücreye şekil vermekle birlikte, osmotik basınca bağlı lizise karşı koyar. Çeşitli moleküllerin iç ve dış ortama geçişlerinde rolü vardır ve maya hücresinin değişik yüzeylere adhezyonunu sağlar. Duvar yapısında bulunan bazı maddeler antifungal ajanlar için hedef oluştururken, bazıları aynı zamanda immünolojik determinantları taşır. Duvar komponentlerinin %80-90 ı karbonhidrat, %5-15 i protein ve %2-5 i lipitlerden oluşur. Karbonhidratların ise %20-30 u mannoprotein, %50-60 ı β- glukanlar ve %0,6-9 u kitin yapısındadır. Candida albicans ın maya ve hifal formlarında mannan ve glukan içeriği benzerdir fakat hifal hücrelerde kitin miktarı maya hücresine göre üç kat daha fazladır (19,20). Elektron mikroskobik çalışmalara göre, kandidaların hücre duvarı en az beş katmanlıdır. Maya-hif dönüşümü sırasında bu sayı ve kalınlık değişir. Ayrıca ortamda yüksek yoğunlukta şeker varlığında mannoprotein katman kalınlaşır ve fibriller oluşumlar artar (21). En dışta konak hücreye adezyonu sağlayan protein tabakası vardır. Bu tabaka N-asetilglukozaminidaz ve asit fosfataz gibi enzimler içerir. Yapılan çalışmalar mannanın ana kandidal antijen olduğunu göstermiştir Bu antijen farklı serolojik reaksiyonların 12

spesifitesinden sorumludur. Mannoproteinlerdeki farklılıklar, kandida türlerinin ayrımında kullanılır. Ancak, aralarında çapraz reaksiyonlar da görülebilmektedir. Kandidaların hücre duvarında bulunan lipitler ise sterol esterleri (zimosterol), serbest sterol (ergosterol), trigliseritler ve fosfolipitlerden oluşmaktadır (22). 2.5.3. Hücre Membranı Hücre membranı taşıdığı osmoenzimler aracılığıyla moleküllerin iç ve dış ortama geçişlerinde rol alır. Kitin sentetaz gibi duvar komponentlerinin sentezinde rolü olan enzimler de membranda bulunurlar. Ayrıca C. albicans ın morfogenezi (maya-hif dönüşümü ve hifal uçtan uzama) için gerekli olan sinyal iletiminde rol alan fosfolipaz C, adenilat siklaz, proteaz gibi enzimler de membranda yer alırlar. Kandidaların hücre membranında; fosfotidil kolin, fosfatidil etanolamin, fosfatidil serin ve fofatidil inozitol gibi fosfolipitler bulunur. Tüm mantarlarda olduğu gibi, kandidaların hücre membranında bulunan sterol, membran lipitlerinin %20 sini oluşturur. Sterolün %95 i ergosterol formundadır ve ergosterol antifungal ajanlar için en önemli hedeftir (19). 2.6. KANDİDALARIN VİRÜLANS FAKTÖRLERİ Kandidalar sahip olduğu bazı özellikler ile konağın savunma sistemini yenerek hastalık oluşumuna neden olur. Virulans faktörleri denilen bu özellikler ile konak hücre membranının bütünlüğünü ve işlevini bozarak konak dokuya invazyon yaparlar ve hücre ölümüne neden olurlar (23). Bu faktörler başlıca; adherens, dimorfizm, toksin ve enzim üretimi, fenotipik değişim ve hücre yüzey bileşimi olarak ele alınabilir (24). 2.6.1. Adherens (Yapışma): Kandidaların mukoza epitel ve endotel hücrelerine yapışması kolonizasyonun ilk aşamasıdır (25). Kandidaların hücre yüzeyi, konak ve mantar arasındaki temasın ilk noktasıdır ve ayrıca 13

antijenlerin kaynağı olması nedeniyle immünolojik konak yanıtının düzenlenmesi ve adezyonda kritik rol oynar. Dış hücre duvarı tabakası; mannoproteinler, β-1,3 ve β-1,6 bağlı glukan ve kitin içermekte olup bu tabaka kandidaların konak yüzeyine yapışmasını ve ardından da kolonizasyonunu sağlamaktadır (26). Candida albicans 'ta blastospordan filamentöz forma dimorfık dönüşüm, onların yapışma özelliklerini ve proteinaz sekresyonunu arttırmaktadır. Kandida hücrelerinin (özellikle hif formu) epitelyal mono ve disakkaritlere bağlanması lektin benzeri yüzey komponentleri sayesinde olmaktadır. Endotelyal tabakalara yapışmada ise protein-protein etkileşimi ön plandadır ve trombositlerin de katılımı gerekebilir (27). Kandida hücre duvarında memeli CR3 reseptörü ile homolog ve C3b parçasına bağlanabilen CR3 benzeri ve C3d parçasına bağlanabilen CR2 benzeri reseptörler gösterilmiştir. CR3 integrin ailesi ile homologdur ve epitelyal hücrelere bağlanmada da etkili olabilir. CR2 ise fıbrinojen, laminin ve plastik yüzeylere bağlanmada etkilidir (27). Kandida türleri medikal cihaz yüzeylerine (cam, plastik) kolaylıkla yapışabilir ve biyofilm oluşturabilir. Bu da kateter ilişkili kandidiyazis riski ve infeksiyonlarında en önemli etkendir. Slime faktörünün özellikle non albicans türler ile oluşan infeksiyonlarda daha önemli olduğu saptanmıştır. Patojen türler arasında en güçlü yapışma yeteneği olanlar C.albicans ve C.tropicalis tir (28). 2.6.2. Dimorfîzm: C.albicans, tomurcuklanan maya formu ve uzun mayamsı hücrelerden oluşan, multisellüler, invaziv flamentöz form arasında değişiklik yapabilme yeteneğine sahip dimorfik bir mayadır (25,29,30,31). Bu iki form arasında değişebilme özelliği C.albicans ın bir virulans faktörü olarak bilinir (30,31). C.albicans'ta bu değişimi uyaran çeşitli çevresel faktörler vardır; yüksek ısı (37-40 C), yüksek CO 2 / O 2 oranı, nötral ph ve besin düzeyi düşük ortam hifal üremeyi uyarırken, tersine durumlar maya hücrelerinin üremesini 14

arttırır (27,35,36,40). Ayrıca çeşitli kimyasallar, N-asetilglukozamin, aminoasitler, serum ve biotin de etkili olmaktadır (27). Konak hücrelerine invazyon ve konak fagositlerinden kaçış sırasında salgısal hidrolazlar ve salgısal aspartik proteinazlar C.albicans ın hifal hücrelerinin invazyonu için gerekli olabilir (39). Hifin maya hücresine göre dokuya daha kolay penetre olması, fagositik hücrelerce sindiriminin daha zor olması ve infekte lezyonlarda C.albicans ın genellikle hifli şeklinin gözlemlenmesi nedeniyle patojen morfotipin hif formu olduğu düşünülmüştür. Ancak infeksiyon geliştirebilme bakımından her iki şeklin farklı olduğu gösterilememiş ve bu mantarın patojenliği açısından her iki şeklin de önemli olduğu sonucuna varılmıştır (25). 2.6.3. Toksinler: Candida albicans ın maya fazında endotoksin yapısında maddeler ve hemolizin üretimi gösterilmiştir. C.albicans toksinleri yüksek molekül ağırlıklı ve düşük molekül ağırlıklı olarak iki grupta incelenir. Yüksek molekül ağırlıklı toksinleri; glikoprotein toksinler ve kanditoksindir. C.albicans glikoproteinlerinden özellikle mannoproteinler, toksik görevleri yanında adezyonda da rol oynarlar. Kanditoksin ise virulan bir C.albicans suşundan elde edilmiş yüksek molekül ağırlıklı bir toksindir. Düşük molekül ağırlıklı toksinler içinde; şok oluşturan ve/veya ölümcül etkinlikle yakından ilişkili altı farklı toksin saptanmış ve bunlardan sadece E substansı denilenin özellikleri belirlenmiştir. Toksinlerin patogenezdeki rolünü araştıran çalışmalar glikoproteinlerin ve kanditoksinin virulans faktörü olarak rolünü doğrulamıştır. Sistemik kandidiyazisli hastalardan elde edilen verilerin Gram negatif bakteri sepsisi ile benzer olması da toksinlerin kandida infeksiyonlarında önemli rol oynadığını göstermiştir (25). 2.6.4. Fenotipik Değişim: C.albicans kökenlerinde yüksek sıklıkta fenotipik değişim saptanmıştır. Bu değişim başlıca iki şekilde gelişebilir. 15

I) Kolonilerdeki White-Opaque (w-o) renk değişimi: 10-4 sıklıkta olur ve koloni düzeyinde olduğu kadar, mikroskobik olarak da hücrelerin küresel yada uzamış şekilde farklı görüntülerine yol açar. II) Koloni morfolojisinde smooth (s) tipinden, miçelyal forma (yıldız tipi, halka tipi) değişim: 10-2 - 10-3 sıklıkta olur ve in vivo koşullarda da gerçekleşen bu fenomenin, antifungal ilaçlara karşı direnç gelişiminde etkili olduğu belirtilmektedir (26,27). 2.6.5. Enzimler: Candida albicans, hücre dışı üç önemli hidrolitik enzim üretir. Bu enzimler konak hücre zarlarındaki protein ve lipitleri hedeflerler (25). I) Salgısal aspartil proteinazlar (Sap) II) Lipazlar (fosfolipaz B) III) Hemolizinler 2.6.5.1. Sap proteinleri: SAP gen ailesi tarafından kodlanmaktadır. C.albicans dışında birçok patojen kandida türünün SAP genlerine sahip olduğu gözlenmiş ve in vitro koşullarda aktif olarak C.dubliniensis, C.tropicalis ve C.parapsilosis'te proteinaz üretimi saptanmıştır (30,34). Sap'lar lezyon alanındaki çoğu konak proteinlerini (albümin, hemoglobin, keratin, salgısal IgA) yıkarak doku hasarı, invazyon, konak savunmasından kaçış gibi mekanizmalarla kandida patogenezinde rol oynayan virulans faktörleridir (34-35). 2.6.5.2. Fosfolipazlar: Gliserofosfolipitlerin bir veya daha fazla ester bağını hidrolize ederler. Kandida türlerinde, kommensal olanlara göre patojen olanlarda daha fazla fosfolipaz üretimi saptanmıştır. Maya ve hifal formdaki C.albicans kökenlerinin % 79 unda fosfolipaz aktivitesi saptanmıştır. Özellikle membran fosfolipitlerini parçalayarak epitelyal hücrelere tutunmada bu enzimlerin rolü olduğu ve dolayısıyla virülansa katkıda bulundukları belirtilmektedir (30). 2.6.5.3. Hemolizinler: Çeşitli hidrolitik enzimlerin yanısıra, birçok patojen kandida türünün hemolizin de ürettiği saptanmıştır. Hem alfa hem de beta 16

hemoliz, hif ve maya formlarının her ikisinde de gözlenmiş, ancak virulansa katkısı tam olarak anlaşılamamıştır (36). 2.7. EPİDEMİYOLOJİ Kandida türleri gerek altta yatan ciddi hastalığı olanlarda, gerekse immünsupresse hastalarda lokal yada sistemik bir çok infeksiyona neden olabilen ve insidansları giderek artan önemli nozokomiyal patojenlerdir. Son yılarda C.albicans dışı türlerin de etken olabilmesi ve antifungallere karşı dirençli suşların görülmeye başlanması potansiyel rezervuarlar ve bulaşma yolları konusundaki bilgileri genişletmeye ve kandidozları etkin olarak önleme yollarını aramaya ihtiyacı arttırmıştır. Bu konuda ilk adım, infeksiyonun endojen ya da eksojen kaynaklı olup olmadığını saptamaktır. Kandida infeksiyonları endojen ya da eksojen kaynaklı olabilir. Hematolojik maligniteli veya kemik iliği transplantasyonu geçiren hastalar daha çok tek kişilik izole odalarda bulundukları için, bu tür hasta gruplarında genellikle endojen kaynak daha fazla sorumlu tutulmaktadır. Çeşitli anatomik bölgelerde kolonize olan suşlarla infeksiyon etkeni olan suşların aynı olduğunu gösteren çalışmalar bulunmakta ve en önemli kolonizasyon bölgesi olarak da gastrointestinal sistem gösterilmektedir (37,38). Bu grup hastalarda esas önlem yolunun, kolonizasyonu önlemeye yönelik profilaktik antifungal tedavi olduğu gösterilmiştir. Ancak proflaktik tedavi sonucu dirençli suşların seleksiyona uğrayabilmesi ve daha sonra sorun oluşturabilmesi unutulmaması gereken önemli bir noktadır (37,38,12). İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile infekte bireylerde, diyabetik hastalarda, kanser nedeniyle kemoterapi uygulananlarda, protez dişe bağlı stomatitlerde ve çocuklarda oral taşıyıcılığa yüksek oranda rastlanır. Birden fazla vücut bölgesini kolonize eden suşlar incelendiğinde, anatomik olarak yakın olan bölgelerde aynı suşun izole edildiği, buna karşılık birbirinden uzak olan yerlerde farklı suşların bulunma olasılığının yüksek olduğu saptanmıştır (42). 17

Kandida türleri sıklıkla gastrointestinal sistemi kolonize eder, ayrıca vajina, üretra, deri ve tırnak altlarında da bulunur. Kandidalar normal şartlarda sağlıklı kişilerin %30-50 sinin gastrointestinal kanalında ve kadınların %20-30 nun genital florasında bulunur. C.albicans florada en fazla bulunan türdür; ağızdan izolasyonların %60-80 ni, genital yol izolasyonlarının ise %80-90 ını oluşturur(12). Vulvovajinitte endojen suşlar rol oynamakla birlikte, cinsel partnerden de bulaş olabilir. Damar içi uyuşturucu kullananlarda genellikle kontamine enjektör ile infeksiyon gelişmektedir (41). Normal endojen barsak florasının patojen mikroorganizmalarla kolonizasyonu engellediği bilinmektedir. Kolondaki anaerobik bakteriler en önemli savunma mekanizmasını oluşturur. Ancak antibiyotik tedavisiyle patojen suşların çoğalması, direnç gelişimi veya dirençli suşların seçilmesi, sonuçta kolonizasyon direncinin kırılmasına neden olur. İnsanlarda mayalar dahil bir çok mikroorganizmanın kan dolaşımına geçmesinde en önemli giriş kapısı gastrointestinal sistemdir. Kandidaların intrensek motilitesi olmamasına karşın; sağlıklı kişide oral yolla alındıktan bir süre sonra barsak lümeninden transloke olabileceği bilinmekte olup bir kez lamina propriaya ulaştıktan sonra maya hücreleri lenfatiklerde ve kan damarlarında serbest olarak ya da makrofaj içinde saptanabilmektedir (43). Kanserli hastalarda kemoterapi veya transplant sonrasında sistemik antifungal tedavi sırasında da kandidiyazis gelişebilir. Bu sorunu ele alan az sayıda çalışma mevcuttur. Antifungal tedavi altında kandidemi gelişenlerde mortalitenin çok daha yüksek olduğu (%75,5) gösterilmiştir (47). Hematojen kandidiyazisli hastalarda yapılan otopsi çalışmalarında akut lösemili hastaların hemen hepsinde gastrointestinal sistemde yaygın tutulum ve submukozal invazyon saptanmıştır (43). Nötropenik kanser hastalarını kapsayan bir çalışmada, birden fazla vücut bölgesinde kolonize olan hastaların %32 sinde dissemine kandidiyazis gelişirken, bu oran kolonize olmayan hastalarda %0,5 olarak belirlenmiştir (44). Nötropeni varlığı, süresi ve hastalığın ağırlığı tedavi altında gelişen kandidiyazis ve mortalite riskini arttırmaktadır. Bu hasta grubunda en çok 18

izole edilen patojenler C.glabrata (%24,5), C.parapsilosis (%20,4) ve C.albicans (%20) olmuştur. Transplant hastalarında gelişen hematojen kandidiyazis, özellikle karaciğer ve pankreas transplant alıcılarında önemlidir. Yapılan çalışmalarda karaciğer transplant alıcılarının %16-30 unda kandidiyazis geliştiği bildirilmiştir (48,49). Bununla beraber son zamanlarda birçok transplant merkezi antifungal proflaksi uygulamaması durumunda bile %10 un altında bir insidans bildirmektedir (50). Bu değişikliğin altındaki nedenler çok açık olmamakla birlikte yakın zamanlarda gerçekleştirilmiş çalışmalar bazı ipuçları sağlamıştır. Castro ve arkadaşları karaciğer transplant alıcılarında 1983-1992 yıları arasında %18 olan invaziv fungal infeksiyon insidansının 1993-1997 yılları arasında %9 a düştüğünü bildirmiştir (51).Risk faktörleri olarak böbrek yetmezliği, transfüzyon gereksinimi, yeniden transplantasyon, koledokokolejejunostomi ve fungal kolonizasyon saptanmıştır. 1992 yılı öncesi dönemde hastaların % 82 sinde bu risk faktörlerinden en az ikisi mevcut iken, daha sonra bu oran %10 düşmüştür. İmmünosupresyona daha tutucu bir yaklaşımın benimsenmesi, buna karşılık cerrahi tekniğin ilerlemesi ve teknolojik gelişmelerin bu düşüşte etkin olabileceği ileri sürülebilir (52,53). Kandida türleri eksojen yolla da bulaşabilir ve yapılan çalışmalarda kontamine materyale bağlı salgınlar bildirilmiştir (39,40). Yanık, hematoloji, yoğun bakım üniteleri ve geriatrik üniteler gibi kapalı yerleşimlerde hastadan hastaya geçiş olabilmektedir. Eksojen infeksiyonların gelişiminden en fazla sağlık personelinin elleri sorumlu tutulsa da kontamine sıvı ve materyaller ve hatta cansız ortam da rol oynayabilmektedir. Kandida türlerine bağlı nozokomiyal infeksiyonların ortaya çıkışında, hastane personelinin ve kontamine materyalin rolü moleküler tanı yöntemleri ile belirlenmiştir. Bu nedenle nozokomiyal kandidiyazislerin önlenmesindeki protokollerin, son gelişmeler ışığında tekrar gözden geçirilerek en etkin ve güvenilir şekilde uygulanması gerekmektedir (41). 19

Eksojen nozokomiyal geçiş ile yayılım yapan türler arasında başta C.albicans ve C.parapsilosis gelmektedir. Bunun yanı sıra C.tropicalis ve C.lusitaniae ye ait küçük epidemiler bulunsada bunlar ve C. glabrata ve C.krusei esas olarak endojen infeksiyonlara yol açan türler olarak göze çarpmaktadır (37). Kandida türleriyle gelişen invaziv infeksiyonların epidemiyolojisinde son yıllarda önemli değişiklikler meydana gelmiştir. Birçok hematopoietik kök hücre transplant merkezinde kandida türlerinin hastaların mortalite ve morbiditesindeki etkisi flukonazol proflaksisi ile dramatik bir düşüş göstermiş, ancak bu kez C.albicans dışındaki türlere bir kayma olmuştur. M.D.Andersen Kanser Merkezi nde 1988 ve 1992 yılları arasında C.albicans ve C.tropicalis ile gelişen kandidemilerde göreceli bir düşüş olmuş, buna karşılık C.krusei ve C.glabrata kandidemileri artmıştır (45). Flukonazol profilaksisinin C.tropicalis ve C. albicans infeksiyonuna karşı bağımsız olarak koruyucu olduğu, ancak profilaksi ile C.krusei infeksiyonlarında 27 kat, C.glabrata da ise 5 kat artış olduğu gösterilmiştir( 45). Öte yandan, flukonazol proflaksisinin rutin olarak uygulandığı merkezlerde de kandidemi gelişimi için risk faktörlerinde bir değişiklik olduğu gözlemlenmiştir. Yapılan çalışmalarda akut graft versus host hastalığı, nötropeni, kortikosteroid tedavisi ve total vücut ışınlamasının artık bir risk faktörü olmadığı; buna karşılık, bakteriyemi, florokinolon tedavisi ve sitomegalovirus (CMV) infeksiyonunun kandidemiyi anlamlı şekilde arttırdığı saptanmıştır( 46). 2.8. TIBBİ BAKIMDAN ÖNEMLİ KANDİDA TÜRLERİ 2.8.1. Candida albicans: En sık kandidiyazis nedeni olan kandida türüdür. Maya-hif dönüşümü göstermesi ve bazı hidrolitik enzimleri üretmesi nedeniyle virulansı en yüksek türdür. Antijenik yapılarına göre A ve B olmak üzere iki serotipe ayrılmıştır. Klinik izolatlar arasında serotip A, serotip B den daha fazladır. Ancak AIDS dahil, immün sistemi baskılanmış hastalarda serotip B nin insidansı giderek artmaktadır (17). Son yıllarda yapılan moleküler çalışmalarla klamidospor negatif C.stellatoidea, C.langeronii ve 20

germ tüp negatif C.claussenii gibi türlerin Candida albicans' ın sinonimleri olduğu gösterilmiştir (17,54). Kanlı agar ve EMB (eosin methylene blue) agar plaklarında yıldız şeklinde ayaksı çıkıntılar oluşturabilir. Tween 80 mısır unlu agarda yalancı hif, bazen de gerçek hif gözlenir. Serumda germ tüp oluşturması ve mısır unlu Tween 80 agarda klamidospor oluşumu Candida albicans 'ın karakteristik özelliğidir. Geniş spektrumlu antifungallerle tedavi edilen hastalardan izole edilen C.albicans kökenleri atipik olabilir ve şeker fermentasyonları zayıftır. Bu kökenler klinik örneklerde diğer türlerle karışabilir (12,55,56,57). Şekil 5 ve 6 da C.albicans a ait koloni morfolojisi ve klamidospor yapıları gösterilmiştir. Şekil 5 C.albicans ın SDA daki koloni Şekil 6. C.albicans ın mısır unlu tween morfolojisi 80 agardaki klamidospor yapıları 2.8.2. Candida tropicalis: C.albicans dan sonra en sık karşılaşılan fırsatçı patojendir. İnsanlarda solunum sistemi infeksiyonları, vajinit, endokardit, peritonit, keratit, osteomiyelit ve onikomikoza neden olduğu bildirilmiştir. Endojen infeksiyonların yanı sıra, yenidoğan yoğun bakım ünitelerinde görevli personelin elindeki kontaminasyon ile ilişkilendirilen fungemi olguları da bildirilmiştir. Özellikle hematolojik malignensili hastalarda önemli infeksiyon etkenlerdendir. C.tropicalis SDA da beyaz veya krem renkli, yüzeyi düz veya pürtüklü, S tipi koloniler yapar. Mısır unlu Tween 80 agarda yalancı hif ve 21

yalancı hif boyunca tek tek veya kümeler halinde dizilen blastosporlar oluştururlar. Çok nadir olarak az sayıda klamidospor da yapabilirler. Ancak bu klamidosporlar C.albicans a ait klamidosporlardan destek bir hücrenin bulunmasıyla ayrılır. C.tropicalis e ait klamidosporlar gözyaşı damlası veya armut şeklinde olup daha küçük çaplıdır ve tekrarlayan pasajlarla kaybolabilirler (2,17,55). Şekil 7 ve 8 de C.tropicalis e ait koloni morfolojisi ve klamidospor yapıları gösterilmiştir. Şekil 7 C.tropicalis in SDA daki koloni Şekil 8. C.tropicalis in mısır unlu tween morfolojisi 80 agardaki klamidospor yapıları 2.8.3. Candida dubliniensis: Candida albicans ile fenotipik olarak yakından ilişkilidir. Sağlıklı ve HIV infeksiyonlu kişilerden izole edilmesi nedeniyle normalağız florasının üyesi olduğu ve özellikle bağışıklık bozukluğu olanlarda ağızlezyonlarına yol açtığı düşünülmektedir. Koloni morfolojisi ve mikroskopikgörünümü C.albicans ile aynıdır ancak, C.dubliniensis 45 C'de üreyemez veklamidosporları çok daha boldur. C.dublinensis'in ksiloz kullanımı ve glukozidaz aktivitesi yoktur. C.albicans ile ayrımlarında moleküler çalışmaların yararlı olacağı bildirilmektedir. C.dubliniensis SDA da üç günde beyazdan kreme kadar değişen renklerde parlak, düz koloniler oluşturur. Mısır unlu Tween 80 agarda C. dubliniensis klamidosporlarının diğerininkilerden farklı olması önemli bir fenotipik özelliğidir. C. albicans 22

genellikle gerçek veya psödohiflerin ucunda tek tek klamidosporlar üretir. Buna karşın C. dubliniensis'inkiler çok daha bol ve ekseri çiftler halinde veya üçlü hatta bazen psödohifin ucundaki aynı bir taşıyıcı (süspansör) hücreye yapışmış kalın duvarlı birkaç klamidospordan oluşan kümeler veya salkımlar oluştururarak olağandışı düzen gösterirler (16,17,55). Şekil 9 ve 10 da C.dubliniensiss e ait koloni morfolojisi ve klamidospor yapıları gösterilmiştir. Şekil 9 C.dubliniensis in SDA daki koloni Şekil10.C.dubliniensis in mısır unlu morfolojisi tween80 agardaki klamidospor yapıları 2.8.4. Candida glabrata: C.albicans dışı kandidalar arasında en sık kandidemi nedenidir. Tüm vücut bölgelerinde infeksiyona neden olabilmekle birlikte, idrar yolu infeksiyonları, yenidoğan fungemileri ve immünsupresif konak infeksiyonlarında önemli patojenlerdendir. Ayrıca diğer kandida türlerine göre Flukonazol ve Amfoterisin B duyarlılığı doğal olarak daha azdır. Flukanozole direnç eğilimi, kandidal infeksiyonlarda etken olarak insidansının giderek artacağını göstermektedir. SDA da krem renkli, düz, yumuşak ve parlak koloniler oluştururlar. Gerçek ya da yalancı hif oluşturmayan, küçük, oval, tek tomurcuklu mayalardır (17,54,55). Şekil 11 ve 12 de C.glabrata ya ait koloni morfolojisi ve klamidospor yapıları gösterilmiştir. 23

Şekil11. C.glabrata nın SDA daki koloni Şekil12.C.glabrata nın mısır unlu morfolojisi tween 80 agardaki klamidospor yapıları 2.8.5. Candida guilliermondii: Yüzme havuzu, toprak, deniz suyu, kuşlar ve insan dahil diğer memelilerden izole edilmiştir. Damar içi madde bağımlılığı olanlarda endokardite yol açabilmektedir. Ayrıca yenidoğan yoğun bakım servisinde heparin solüsyonlarından kaynaklanan nozokomiyal infeksiyon etkeni olarak saptanmıştır (17,54). Tüm vücut bölgelerinde infeksiyona neden olabilir. SDA da kolonileri düz veya buruşuk,beyaz renkte görülür. Mısır unlu Tween 80 agarda yalancı hiflerin çevresinde küçük blastospor kümeleri oluşturur, yalancı hifler kısa ve az sayıdadır (12,17,54,56,58). Şekil 13 ve 14 de C.guilliermondiia ye ait koloni morfolojisi ve klamidospor yapıları gösterilmiştir. 24

Şekil13.C.guilliermondii nin SDA daki Şekil14.C.guilliermondii nin mısır unlu koloni morfolojisi tween 80 agardaki klamidospor yapıları 2.8.6. Candida kefyr (pseudotropicalis): Zaman zaman kulak, tırnak, gastrointestinal sistem, üriner sistem ve vajinal infeksiyonlardan izole edilebilirse de tıbbi öneme sahip türler arasında prevalans açısından son sıralarda yer almaktadır. SDA da krem renginde, yumuşak kıvamlı, S tipi koloniler oluşturur. Mısır unlu Tween 80 agarda yalancı hifler ve bunun etrafında uzun, genellikle hiften ayrılıp birbirine paralel dizilim gösteren blastokonidiyumlar gözlenir. Bu görünüm ırmakta yüzen kütüklere benzetilebilir. Vücudun her yerinde akut, subakut ve kronik infeksiyonlara neden olabilir (12,17,54,56,58). Şekil 15 ve 16 da C.kefyr e ait koloni morfolojisi ve klamidospor yapıları gösterilmiştir. 25

Şekil15.C.kefyr nin SDA daki koloni Şekil16.C.kefyr nin mısır unlu tween morfolojisi 80 agardaki klamidospor yapıları 2.8.7. Candida krusei: Değişik çevresel kaynaklardan izole edilmekle birlikte, sağlıklı taşıyıcıların mukozal yüzeylerinden de seyrek olarak izole edilebilir. Fırsatçı patojen olarak önemi giderek artan bir mayadır. Azol grubu antifungallere doğal olarak dirençli olması nedeniyle flukonazol profilaksisi alan immünsupressif hastalarda ağır seyreden fırsatçı infeksiyonlara sebep olmakla birlikte, süt çocuklarında diyareden sorumlu olabilir. Flukonazole doğal dirençli olması nedeniyle izolasyon sıklığında artış beklenmektedir. SDA da yassı, kuru görünümlü, mat, krem renginde, düzensiz kenarlı koloniler oluşturur. Mısır unlu Tween 80 agarda uzamış, dallanan yalancı hifler ve bu hiflerin septalarında ağaca benzer dizilim gösteren blastokonidiumlar gözlenir (12,17,54,55,56). Şekil 17 ve 18 de C.krusei ye ait koloni morfolojisi ve klamidospor yapıları gösterilmiştir. 26

Şekil17.C.krusei nin SDA daki koloni Şekil18.C.krusei nin mısır unlu tween morfolojisi 80 agardaki klamidospor yapıları 2.8.8. Candida lusitaniae: Tıbbi açıdan son yıllarda önem kazanan bir türdür. İmmünsupressif hastalarda sistemik kandidiyazise yol açmaktadır. Kan, balgam, üriner sistem ve gastrointestinal sistem örneklerinden izole edilebilir. C.lusitaniae'nın Amfoterisin B'ye karşı doğal direnç göstermesi önemini arttırmaktadır. SDA da krem renkli, yumuşak, mat koloniler oluşturur. Mısır unlu Tween 80 agarda az sayıda yalancı hif, bazen de gerçek hif ve kısa zincirler oluşturan uzun blastokonidiumlar gözlenebilir (12,17,54,55,56). Şekil 19 ve 20 de C.lusitaniae ye ait koloni morfolojisi ve klamidospor yapıları gösterilmiştir. Şekil19.C.lusitaniae nın SDA daki koloni morfolojisi Şekil 20.C.lusitaniae nın mısır unlu tween 80 agardaki klamidospor yapıları 27

2.8.9. Candida parapsilosis: Doğada yaygın bulunduğu gibi, özellikle subungual bölgelerde normal deri florasında bulunur. Yüksek konsantrastonda glukoz içeren çözeltilerde ve protezlerde kontaminant olarak varlığı dikkat çekmektedir. Yoğun bakım ünitelerindeki sepsis olgularından izole edilmektedir. Kateter uçlarında biyofilm oluşturma özelliğine nedeniyle intraparenteral beslenen hastalardan izolasyon sıklığı yüksektir. SDA da yumuşak kıvamlı, krem renginde, bazen dantela şeklinde koloniler oluşturur. Mısır unlu Tween 80 agarda yalancı hif boyunca tek tek veya bazen küçük kümeler halinde blastokonidiyumlar bulunur. En önemli mikroskopik özelliği arada iri hiflerin oluşturduğu dev hücrelerin bulunmasıdır (12,17,54,26,55,56). Şekil 21 ve 22 de C.parapisilosis e ait koloni morfolojisi ve klamidospor yapıları gösterilmiştir Şekil21.C.parapsilosis in SDA daki koloni Şekil 22.C.parapsilosis in mısır unlu morfolojisi tween 80 agardaki klamidospor yapıları 2.9. PATOGENEZ Genellikle kandidiyazis öncesinde florada bulunan mantarlar, sayıca artış gösterir ve bu kolonizasyonun sonrasında infeksiyon meydana gelir. Yerleşik floradaki bakteriler, besin maddelerini hızla tüketerek, çevre 28

koşullarını kandidalar için uygun olmayacak şekilde değiştirir veya toksik maddeler üreterek kandidaların çoğalmasını engeller (2,4). Yüzeyel kandidiyazislerde, kandidalar deri veya mukozanın bütünlüğünün bozulduğu bölgeden yalancı hifleri ile doku içerisine girer ve tomurcuklanma ile oluşan blastokonidyumları ile dokuya yayılır. Derin veya sistemik kandidiyazislerde çoğu kez önce gastrointestinal sistemde kolonizasyon meydana gelir ve bir süre sonra barsak lümeninden transloke olup lamina propriaya ulaştıktan sonra, maya hücreleri lenfatiklerde ve kan damarlarında serbest olarak ya da makrofaj içinde saptanabilir (43). Kana geçen kandidalar, fagositik etkinliği yetersiz olan hastalarda hemen hemen her organ ve sisteme yerleşebilirler (12). Kandidalar dermise veya kan dolaşımına geçtiğinde polimorfonükleer lökositler (PNL) savunmaya katılır. Nötrofillerden başka monosit ve eozinofiller de fagositozda yer alır. Doku makrofajlarının ve yerleşik retiküloendotelyal hücrelerin de kandidaları öldürme kapasiteleri vardır (4). Isıya duyarlı ve dirençli opsoninler, nötrofillerin kandidaları fagositozunu kolaylaştırır. Myeloperoksidaz, hidrojen peroksit ve süperoksit anyon sistemi fagositlerin kandidaları öldürmelerindeki başlıca mekanizmalardır. Ayrıca fagositler kimotripsin benzeri katyonik proteinler üretip membran geçirgenliğini arttırarak da etki ederler (4,26). Kandidalara karşı humoral ve hücresel bağışıklık gelişmekle beraber hücresel bağışıklığın rolü daha ön plandadır. Genel olarak yüzeyel deri infeksiyonlarında hücresel bağışıklığın, sistemik infeksiyonlarda ise doğal savunma mekanizmalarının yanı sıra humoral bağışıklığın öne çıktığı söylenebilir (26,37). Kandida infeksiyonlarının patogenezinde; konağın epitel ve endotel hücrelerine adhezyonu, maya-hif dimorfizmi, asit proteinaz ve fosfolipaz gibi enzimlerin üretimi majör virulans faktörleri olarak rol oynar. 29

2.9.1. Doğal Savunma Mekanizmaları: Kandidalara karşı savunmada ilk basamakta konağın doğal immünitesi yer alır. Yanık ya da travma gibi bir nedenle deri bütünlüğünün bozulması, sağlıklı bireylerde bile invazyon için duyarlı bir alan oluşturur. Solunum sistemi, sindirim sistemi ve genitoüriner sistem mukoza epitelleri mekanik, kimyasal ve biyolojik bariyer oluşturur. Mukoza yüzeyindeki flora bakterilerinin oluşturduğu mikrobiyal antagonizma kandidaların üremesini engelleyebilir. Ayrıca salgısal IgA, antilökoproteaz, intestinal peptit, defensinler, pulmoner sürfaktan gibi lokal enzim ve mediatörler de kandidaların mukozal ve sistemik yayılımını engelleyebilir. Epitel hücrelerindeki mantar reseptörlerinin blokajı, antifungal madde yapımı, ph değişimi, anaerop oksidasyon-redüksiyon potansiyelinin oluşması da doğal engeller arasında sayılabilir (26). Kandidalar deri veya mukoza engelini aştıklarında, kandidemi ve sistemik kandidiyazise karşı savunmada rol oynayan en önemli hücre tipi PNL dir. Klinik olarak, nötropenik hastaların özellikle sistemik kandida infeksiyonlarına duyarlılıklarının artması da bunu destekler (27). Çünkü PNL'ler, yalancı hiflerde hasar oluşturma ve blastosporları fagosite ederek öldürme yeteneğine sahiptir. Monositler in vitro ortamda kandidaları öldürmede PNL'lerden daha etkilidirler. Trombositler de anti-kandida aktiviteye sahip olup, ilk aşamada kandidaların trombositlere bağlandığı ve bu nedenle konak savunmasında trombositlerin de önemli rol oynadığı düşünülmektedir. C.albicans koagülaz üreterek trombogenezin etkisinden korunur. Bu olay onun fibronektine ve fibrin tabakasına sıkıca yapışmasını sağlar. Doğal öldürücü hücreler (NK) de doğal bağışıklıkta doğrudan rol oynarlar (26,27). Yapılan çalışmalarla tek başına serum ve plazmanın kompleman komponentleri ve antikorlarının kandidaları öldürmek için yeterli olmadığı saptanmıştır. (25,26). Kandidalar, komplemanı hem klasik hem de alternatif yolla aktive edebilirler.kompleman sisteminin aktive olması; mantarın opsonizasyonu, inflamatuar hücrelerin ortaya çıkarılması veya patojenin doğrudan öldürülmesi ile sonuçlanır. Komplemanın, antikora bağımlı olmaksızın, direkt mikroorganizma ile karşılaşması sonucu aktive olduğu 30

alternatif yol önemli bir doğal savunma mekanizmasıdır. Kandidalara karşı koymada komplemanın alternatif yol aktivasyonu oldukça duyarlıdır ve blastosporların opsonizasyonu için kompleman çok gereklidir. Mantar yüzeyinde C3b depolanması, patojenin tahrip edilmesi için fagositik hücrelere uyarıcı etki yapar. Kandida hücreleri, özellikle yalancı hifler, yüzeylerinde insan kompleman reseptörlerine (CR2 ve CR3) benzer moleküller bulundurur. CR3 integrin ailesi ile homologdur ve epitelyal hücrelere bağlanmada etkili olurken, CR2 ise fıbrinojen, laminin ve plastik yüzeylere bağlanmada etkilidir (26,27). 2.9.2. Özgül Savunma Mekanizmaları: T hücreleri ve hücre aracılı immünite kandida infeksiyonlarına karşı konak savunmasında daha etkilidir. Bu durum klinik olarak, lenfosit disfonksiyonu bulunan hastalarda kronik mukokütanöz kandidiyazise yatkınlığın artması ve AIDS'li hastalarda kutanöz kandidiyazise yüksek duyarlılık görülmesi ile açıklanabilir. Deneysel çalışmalar lenfosit yanıtını başlatan en önemli antijenin mannan olduğunu göstermiştir. Kandidalarda başlıca hücre duvar glikoprotein antijenlerine, mannoproteinlere ve ısı şok proteinlerine karşı oluşan antikor miktarı sağlıklı insanlarda düşük titrelerdedir. Bu antikorların koruyucu rolü tartışmalı olmakla birlikte, sadece erken dönemde gastrointestinal kolonizasyona immünolojik bir yanıtı da yansıtabilir. Antikorların koruyucu olmadıklarını savunan birkaç araştırmanın yanı sıra, deneysel olarak oluşturulmuş vaginal ya da sistemik C.albicans infeksiyonlarına karşı koruyucu spesifik antikorları gösteren çalışmalar da vardır. Klinik olarak B hücre eksikliği bulunan bireylerde kandida infeksiyonlarına duyarlılıkta artış olmadığı görülmüştür. Deneysel hayvan çalışmalarında da hiperimmün serumun in vitro oluşturulan infeksiyona karşı koruyucu etkisi gözlenmemiştir (24,25,26,). 31

2.10. KANDİDA İNFEKSİYONLARI Kandida infeksiyonları başlıca üç grupta incelenebilir; 1) Mukoza infeksiyonları 2) Cilt infeksiyonları 3) Sistemik infeksiyonlar 2.10.1. Mukoza İnfeksiyonları Oral kandidiyazis: Oral kandida infeksiyonları oldukça yaygındır. Pamukçuk, dil ve diğer ağız içi yüzeylerde krem gibi beyaz yamalarla karakterize, oral kandidiyazın spesifik bir formudur, ağrılıdır ve kaldırıldığında kanayabilir. Bu yamalar aslında, dökülen epitel hücreleri, lökositler, bakteriler, keratin, nekrotik doku ve yiyecek artıklarından oluşan yalancı membranlardır. En sık süt emen bebeklerde, kanserli hastalarda, AIDS'li hastalarda, inhale steroid kullananlarda görülür. Bu klasik lezyonlara ilave olarak; akut atrofik kandidiyazis, kronik atrofîk kandidiyazis, anguler cheilitis ve kandidal lökoplakiyi içeren diğer formlar da görülebilir (6,59). Kandida Özefajiti: Genellikle hematopoietik veya lenfatik sistem kanserlerinin tedavisi sırasında ve AIDS'li hastalarda görülür. Yüzeyel infeksiyondan derin invaziv infeksiyona kadar değişen formlarla ortaya çıkabilir. Hastalarda yutma güçlüğü, ağrılı yutma ve retrosternal ağrı gibi diğer infeksiyoz ve infeksiyoz olmayan özefajitlerden ayırdedilemeyen semptomlar bulunur. Endoskopide pamukçuk benzeri beyaz yamalar görülür (59,60). 32

Sindirim Kanalı Kandidiyazı: Kanserli hastalarda yaygın olarak görülen klinik bir durumdur. En sık görülen lezyonları, tabanında kandidaları bulunduran tek veya birden fazla ülserasyonlardır. Daha az oranda kronik mide ülseri, perforasyon ve malign mide ülseri ile birlikte görülür. İnce ve kalın barsakları tutabilir. Endoskopik incelemede, duodenumda diğer lezyonlardaki gibi beyaz plaklar, duodenum ve jejunumda mukozal katlantılarda kalınlaşma saptanabilir (59). Kandida Vajiniti: Hem normal hem de hücresel immün yetmezlikli kadınları etkileyen yaygın bir fungal infeksiyondur. Tüm kadınların yaklaşık %75'i hayatlarında bir kez kandida vajiniti atağı geçirirler ve bunların da %85-90'ın da C.albicans etkendir. Bu yaygın infeksiyon en sık kontrolsüz diyabet, antibiyotik tedavisi, gebelik, hormon replasman tedavisi, immünsüpressif tedavi durumlarında görülür. Semptomatik vajinal kandidiyazisde kaşıntı, yanma hissi, kesilmiş süt benzeri akıntı gibi yakınmalar, vajinal ve/veya vulvar eritem ve ödem gibi bulgular vardır (59,60). 2.10.2. Cilt İnfeksiyonları Kandidaların etken olduğu cilt infeksiyonları immünsupresif konaklarda olduğu gibi normal insanlarda da görülebilir. Normal konaklarda infeksiyonun oluşumu için risk faktörleri nemli veya kapalı alanlar, radyasyon uygulanan alanlar ve yanıktır. Yaygın olarak koltuk altı, inguinal bölge, perine, meme altı ve parmak aralarında görülür. Yaygın Cilt Kandidiyazı: Tüm vücutta yaygın erupsiyonla karakterize, nadir görülen bir cilt infeksiyonudur. İntertrigo: İnguinal bölge, meme altı gibi ılık, nemli ve kapalı bölgelerde veziküller ve püstüllerle başlayan ve genişleyip rüptüre olarak maserasyon ve fistül gelişen, cilt kandidiyazının bir varyantıdır. Diaper döküntüsü: Bebeklerde perianal bölgeden başlayıp bezle temas eden ve tüm perineye yayılan, muhtemelen gastrointestinal orijinli olduğu düşünülen bebek bezi dermatitidir. 33

Onikomikoz ve Paronişi: Tırnak infeksiyonlarının %5-10 unda etken kandidalardır. C.albicans ve C.parapsilosis en önemli etkenlerdir. Onikomikoz, tırnakta renk değişikliği ve şekil bozukluğu ile ortaya çıkar, paronişi ise tırnak yatağının ağrılı ve eritemli iltihabi hastalığıdır. Hem paronişi hem de onikomikoz elleri uzun süre suyla temas eden kişilerde görülür. Kronik mukokutanöz kandidiyaz: T hücre eksikliği olan hastalarda görülen, cilt, mukozalar, saç ve tırnakların kandida infeksiyonlarının heterojen bir grubunu tanımlar. Hastaların çoğu infant ya da çocukluk çağı grubudur. T lenfosit fonksiyon bozukluğuna ilave olarak, bazen B lenfosit, granülosit veya kompleman fonksiyon bozukluklarında da görülebilir. Bazı hastalarda multipl endokrin anomaliler, tekrarlayan viral ve bakteriyel pulmoner veya sinüs infeksiyonları ile ilişkili olduğu bulunmuştur (59,61). 2.10.3. Sistemik Kandida İnfeksiyonları Sistemik kandida infeksiyonlarının gelişimi ile ilgili risk faktörleri : Antimikrobik kemoterapi, antiasit ve/veya H 2 resptör blokörleri ile tedavi, ileus, diyare gibi nedenlerle gastrointestinal kolonizasyonun artması, parenteral hiperalimentasyon, kortikosteroid tedavisi, nötropeni, diyabetes mellitus, böbrek yetmezliği, malign hastalıklar, sitotoksik kemoterapi, immünsupressif tedavi, hasarlı mukozal bariyer ve HIV infeksiyonu gibi sistemik konak savunmasının bozulduğu durumlar, santal venöz kateter, uzun süren cerrahi girişimler, endotrekeal tüp, hemodiyaliz, kan ürünü transfüzyonu, yoğun bakım ünitesinde kalmak, azotemi, hiperglisemi gibi kan biyokimyasındaki değişiklikler, Graft Versus Host reaksiyonu varlığı, birlikte bulunan bakteriyemi veya diğer infeksiyonlar, önceki üç gün içerisinde antifungal profilaksi uygulanmasının yanı sıra yaş (ileri yaş veya prematürite) ve cinsiyet gibi hastaya bağlı faktörlerde sistemik kandida infeksiyonlarının gelişimi için risk faktörleri arasında sayılabilir (37,60,63,75). 34

Dissemine Kandidiyazis ve Kandidemi: Kandidemi; kanıtlanmış organ tutulumu olmaksızın bir yada daha fazla kan kültüründe bir kandida türünün izole edilmesi olarak tanımlanır ve sıklıkla nozokomiyal bir komplikasyon olarak ortaya çıkar. Organ tutulumlarıyla giden invaziv kandidiyazise yol açması ve mortalitesinin yüksek olması nedeniyle ayrı bir öneme sahiptir. Ancak kandideminin klinik belirti ve bulgularının oldukça nonspesifik olması ve her zaman kan kültüründe üreme olmayışı bazı öngörülerle tedaviye başlanmasını gerektirir. Yani kandidemi, tanısında ve tedavisinde güçlükler yaşanan klinik bir durumdur. Kan kültüründe kandida üremesi basite alınacak, kontaminasyon olarak değerlendirilecek bir durum eğildir. Bazı hastalarda dissemine kandidiyazisin bir bulgusudur, bazı hastalarda ise kateter kolonizasyonunu gösterir ve her durumda mutlaka dikkate alınması gerekir. Kandida ile gelişen hematojen infeksiyonlar akut veya kronik nitelikte olabilir. Bu iki tablo birbirinden bağımsız değildir ve konağın immun durumuna bağlı olarak birinden diğerine geçiş söz konusudur. Kandideminin en sık rastlanan belirtisi yüksek ateştir (>38 C). Önceleri kandidemi, kontamine kateterlerle ilişkili ve geçici bir durum olarak değerlendirilirken, kandidaya bağlı mortalitenin %40 civarında olduğunun belirlenmesi kandideminin önemini göstermiştir. Ayrıca ciddi organ tutulumu olanların yaklaşık %50 sinde kandidemi saptanamayabilir. Öte yandan kan kültürü (+) çıkanların hepsinde derin infeksiyon olduğu iddia edilemezse de kanında kandida saptanan hastalar, gerek infeksiyonun akut etkilerini gerekse uzun dönem sekellerini önlemek üzere tedavi edilmelidir (61). Yapılan çalışmalarda nozokomiyal infeksiyonlarda kandan izole edilen mikroorganizmalar arasında kandida türlerinin dördüncü sırada yer aldığı ve bu oranın giderek arttığı saptanmıştır. Son yıllarda mortalite ve antifungal direnç artışı ile birlikte C.albicans dışı türlerin görülme sıklığı da artmıştır (48). Kandidemilerin en az %90 ından sorumlu beş tür vardır. Bunlar sırasıyla C.albicans, C.glabrata, C.parapsilosis, C.tropicalis ve C.krusei dir. Ülkeler arasında tür dağılımı yönünden farklılık görülmektedir. ABD de kan kültürlerinden soyutlanan kandidaların %37 sini C.albicans oluştururken, Norveç te %70 ini bu tür oluşturmaktadır. C.glabrata ABD de ikinci en sık 35

kandidemi etkenidir. Avrupa ülkelerinde ve Türkiye de ise C.tropicalis ve C. parapsilosis, C.albicans tan sonra ikinci sırada yer alan türlerdir. Kandidemi gelişimi açısından risk taşıyan hasta grubu, yanık, cerrahi, onkoloji ve transplant hastalarıdır. Bu hastalardaki risk faktörleri ise, santral venöz kateter, parenteral beslenme, geniş spektrumlu antibakteriyel kullanımı, yoğun kemoterapi ve immünosupressif tedavi rejimleridir. Bu risk faktörleri kandidemi gelişme riski yüksek hastaların tanınmasını, dolayısıyla erken antifungal tedaviye başlanmasını sağlar. Fakat kandidemili hastalar benzer prognoz taşıyan homojen bir grup değildir. Genel olarak prognoz, predispozan faktörlerin sayısı ve derecesiyle ilişkilidir. Dissemine kandidiyazisde en sık tutulan organlar böbrek, beyin, miyokard ve gözdür. Kan kültürü pozitiflik oranı çok düşük (yaklaşık %40) ve bulgular nonspesifik olduğundan antemortem tanı oranı oldukça düşüktür (% 15-40) (62,63). Santral Sinir Sistemi Kandidiyazı: Kandida ile oluşan santral sinir sistemi infeksiyonları nadirdir ve genellikle dissemine kandidiyazisin bir komplikasyonu olarak ortaya çıkar. Ayrıca santral sinir sistemi cerrahisi, lomber ponksiyon, ventriküloperitoneal şant ve nadiren de bakteriyel menenjite sekonder olarak gelişebilir. En sık görülen şekli menenjit olmakla birlikte mikotik anevrizma ve beyin apseleri de görülebilir. Semptom ve bulgular, klasik menenjit tablosuna göre daha silik ve kronik seyreder. Tedavi edilmezse mortalitesi yüksektir (59,61). Solunum Sistemi Kandidiyazı: Kandida nedenli pnömoni iki şekilde gelişebilir. Endobronşiyal yerleşim sonucu gelişen lokal veya diffüz bronkopnömoni olabildiği gibi, hematojen kaynaklı, yaygın, ince nodüllü infiltratlar şeklinde de görülebilir ve bu durum erken dönemde konjestif kalp yetmezliği ile karışabilir. Diğer formları daha nadirdir. Ayrıca, bronşiyal infeksiyon, larenjit, epiglottite de neden olabilir (59,61). 36

Kardiyak Kandidiyaz: Kandidalar perikard, miyokard ve endokardda infeksiyon yapabilirler ve fungal endokarditlerin en sık nedenidirler. Endokardit için altta yatan risk faktörleri; kalp cerrahisi, protez kalp kapakları, santral venöz kateterler, intravenöz ilaç kullanımı, bakteriyel endokardit ve kalp kapağı yapısal bozukluklarıdır (59,61,64). Üriner Sistem İnfeksiyonları: Üriner sistem kandidozları alt ve üst üriner sistem ile böbreğin kandida infeksiyonlarını içerir. Semptomlar bakteriyel infeksiyonlarla aynıdır. Üst üriner sistem infeksiyonları ya primer olarak alt üriner sistemden asendan yolla ya da sekonder olarak hematojen yayılımla gerçekleşebilir. En önemli bulgusu idrarda kandida cinsi mantar elemanlarının görülmesidir. Ancak kandidüri yalnız idrar yolu infeksiyonu değil kontaminasyon, kolonizasyon veya dissemine kandidiyazisin bir belirtisi de olabilir. Bu durumda klinisyenin kararı tedavisiz bir yaklaşımdan, parenteral yüksek doz Amfoterisin B verilmesine kadar değişebilir. Bu nedenle kandida üreyen bir idrar kültürü kontaminasyon, kolonizasyon, sistit, pyelonefrit ve dissemine infeksiyon açısından irdelenmelidir. Özellikle diyabetli hastalarda perianal bölgenin ve mukozaların kandidalar ile kolonizasyonuna sık rastlanır. Kandidaların kolonize bölgelerden idrara kontaminasyonu dışında, vulvovaginit ve balanit gibi genital sistem infeksiyonu varlığında da idrara kontaminasyonu sıktır. Tekrarlanan uygun idrar örneklerinde kandidürinin görülmemesi bulaş kararını verdirebilir ve kontaminasyona bağlı kandidüri için tedavi gerekmez. Kandidüri tekrarlayan kültürlerde gösteriliyorsa bu bulgunun kolonizasyon mu yoksa infeksiyon mu olduğunu saptamak gerekir. Kolonizasyon sağlıklı kişilerde nadir görülür. En sık üriner kateterli hastalarda, gebelerde, yaşlılarda, diyabetik hastalarda, geniş spektrumlu antibiyotik kullananlarda, immünosupressif tedavi alanlarda, üriner sistem anomalileri ve obstrüksiyonlarında kolonizasyon olasılığı artar. Kandida türleri için üriner sistem kolonizasyonunu infeksiyondan ayıracak basit bir yöntem yoktur. Hastanın risk faktörlerini bulundurması, semptom ve fizik 37

muayenede bulgularının olmaması ve laboratuvar incelemesinde lökositozunun bulunmaması alt üriner sistem kolonizasyonunu düşündürür. Bakteriyel üriner sistem infeksiyonlarında piyüri varlığı ve kantitatif idrar analizi kolonizasyon ile infeksiyon arasındaki farkı ortaya koyabilmesine karşın, piyüri ve lökositoz gibi bulgular kandidürinin infeksiyon tanısında açık tanı kriterleri değildir. İdrar sedimentinde pseudohiflerin varlığı ya da yokluğu da problemi çözmede yararlı olamamıştır. İdrar kültüründe üreyen kandidaların koloni sayısı konusu da tartışmalıdır. Yapılan çalışmalar tek kateter örneğinde veya düzgün alınan orta akım idrarında 10 4 cfu/ml yi aşan kandida sayılarının böbrek infeksiyonlarında önemli olduğunu gösterirken, uzun süreli kateterli hastalardan alınan idrar kültürlerinde 10 4 cfu/ml kriteri uygulanamamıştır. Bu hastalarda yüksek oranlar alt üriner sistem veya kateterin zararsız kolonizasyonu olarak gösterilmiştir. İdrar sondasının kaldırılması veya değiştirilmesi ile kandidüri spontan olarak düzelebilir. Ayrıca risk faktörlerinin ortadan kaldırılması örneğin antibiyotiklerin kesilmesi, diyabetin kontrolü ile çoğu kandidüriler antifungal tedavi gerekmeksizin kaybolabilir. Ancak risk faktörleri arasında böbrek transplantı, nötropeni, immünsupresyon, ürolojik girişim yapılacak üriner sistem anomalisi veya obstrüksiyonu varsa üriner sistem kandidozu veya kandidiyazise yol açabilmesi nedeniyle antifungal tedavi düşünülebilir (59, 61 ). Oküler İnfeksiyonlar: C.albicans endojen oftalmitlerin en sık nedenlerindendir. Bundan başka ekzojen oftalmit, keratit gibi infeksiyonlara da neden olabilir. Genellikle diyabet, immünsupresyon gibi sistemik bir hastalık varlığında ortaya çıkar. Kandidemi, cerrahi girişimler, lokal steroid ya da antibakteriyel ajan kullanımı, göz anomalileri ve intravenöz kateterler infeksiyona zemin hazırlayan risk faktörleridir (59,61). Hepatosplenik Kandidiyaz: Akut lösemi için tedavi alan hastalar ya da uzun süre nötropenik kalan kemik iliği transplant alıcılarında görülen yaygın 38

kandida infeksiyonunun bir komplikasyonudur. Hastalarda multipl karaciğer ve dalak apseleri mevcuttur. Morbidite ve mortalitesi yüksektir (31,51). Ayrıca periton diyalizi, gastrointestinal cerrahi ve abdominal organların perforasyonu ve öncesinde antibiyotik kullanmış olmak periton, karaciğer, dalak ve mesane kandidiyazisi için predispozan faktörlerdir (61). Kemik ve Yumuşak Doku İnfeksiyonları: Oldukça nadir görülen infeksiyonlardır ve genellikle kandideminin geç komplikasyonudur. Vertebra ve intervertebral diskler, el bileği, femur, proksimal humerus, skapula ve kostakondral birleşim yerlerini tutabilir. Tanı ve tedavi güçtür (59). 2.11. KANDİDALARIN İDANTİFİKASYONU Geleneksel olarak kandidaların idantifikasyonu makroskopik ve mikroskopik olarak morfolojik karakterlerinin incelenmesi ve biyokimyasal özelliklerinin değerlendirilmesiyle yapılır. Morfolojik olarak koloni rengi ve görünümü, hif veya pseudohif üretimi, germ tüp veya klamidospor oluşturma yetenekleri gibi özellikleri değerlendirilir. Biyokimyasal olarak da karbonhidrat fermentasyon ve asimilasyonu, nitrat asimilasyonu ve üre hidrolizi değerlendirilir (65). 2.11.1 Germ Tüp Testi Kandidaların identifikasyonunda ilk adımdır. Hızlı sonuç veren, uygulaması kolay, C.albicans'ın diğer kandidalardan ayrılmasını sağlayan basit ve çok değerli bir testtir. Ancak C.albicans suşlarının hepsinde pozitif olmadığı gibi yalancı pozitiflik de olabilmektedir. C.albicans suşlarının %95-39

97'si germ tüp oluşturur. C.stellatoidea da germ tüp üretir, C.tropicalis, C.krusei, C.kefyr de pseudo germ tüp oluşumu görülebilir (65,66). Germ tüp, blastospordan orijin alan, başlangıç noktasında hiç daralma olmayan ve uzunluğu boyunca hiç kabarıklık yapmayan bir flament olarak gözlenir. Pseudo germ tüpte ise daha büyük bir blastospor vardır ve hif ile bağlantı bölgesinin daha belirgin olduğu gözlenir. Non albicans türlerde ise germinasyon maya formu ile büyüyen hifal hücre arasında bir darlık ile karakterizedir (67). Germ tüp testi için insan serumu, yumurta albumini, sığır serum albumini, koagüle tavşan plazması, koyun serumu, Doku Kültür Medium, Tripticase Soy Broth ve çeşitli peptonlu besiyerleri kullanılabilir. Rutinde en sık insan serumu tercih edilir (65,66,67). Germ tüp ile yapılan çalışmalarda karbonhidrat asimilasyon ve fermentasyon testleri ile uyumlu sonuçlar bulunmuştur (68,69). Steril seruma (0.5-1.0 ml. koyun, sığır veya insan serumu) incelenecek maya mantarının koyu olmayan bir süspansiyonu yapılır. 37 C de 2.5-3 saat inkübe edilir. Süspansiyondan bir damla alınıp lam-lamel arasında mikroskopta küçük büyütme ile incelenir, fasulye filizi gibi kısa uzantılar görülmesi testin pozitif olduğunu gösterir. Maya inokulumu çok yoğun olduğunda ise yanlış negatif sonuçlar görülebilir (12,70,71). Şekil 23 ve 24 te sırasıyla germ tüp pozitif ve negatif örnekler gösterilmiştir. Şekil 23. Germ Tüp Pozitif Şekil 24. Germ Tüp Negatif 40

2.11.2. Hif, Blastospor ve Klamidospor Yapımı Bu amaçla pirinç ekstresi-tween 80 agar, Mısır unlu (Cornmeal)-Tween 80 agar, Wolin Bevis agar, Oxgall agar veya Czapek Dox-Tween 80 agar besiyerlerinden birine test edilecek maya kolonisinden bir parça alınıp iğne öze ile birbirine parelel çizgiler şeklinde ekim yapılır. Ekim alanı steril bir lamelle kapatılarak besiyeri 26-27 C'de 24-72 saat inkübe edilir. Kapatılan lamelin ortamın oksijenini azaltması ve Tween 80'in yüzey gerilimini düşürmesi klamidospor ve pseudohif üretimini arttırır. Hiflerin içinde (ara klamidospor), kenarında (yan klamidospor) veya uçlarında (uç klamidospor) gelişebilen, büyük, yuvarlak, sitoplazması yoğunlaşmış ve kalın duvarlı klamidosporlar görülür. Bu yapılar, besin eksikliği ve diğer uygunsuz çevre koşullarına karşı kandidaların canlılığını korumasını sağlar. Mısır unlu agar gibi besin açısından fakir ortamlarda mayaların oluşturduğu blastospor, pseudohif, hif yapısı ve klamidospor varlığı mikroskopik olarak değerlendirilir ve kandidaların idantifikasyonunda kullanılır. Uzun yıllar sadece C.albicans'ın tanımlanmasında kullanılmış olan mısır unlu agarda diğer maya türleri de mikroskopik morfolojik özelliklerine göre tanımlanabilmektedir(11,14,15,16,17). Şekil 25 de C.albicans a ait hifal yapılar ve klamidosporlar gösterilmiştir. Şekil 25. C.albicans ın hifal yapıları ve klamidospor 41

C.albicans izolatlarının büyük bir çoğunluğu (>%90), mısır unlu agar, pirinçli- Tween 80 agar gibi besiyerlerine ekildiklerinde ve 25 C de 72 saat inkübe edildiklerinde karakteristik klamidospor oluştururlar. Bu özellik C.albicans için germ tüp oluşumu kadar tipiktir. C.tropicalis ise 25 C de 72 saat inkübe edildikten ve bir haftadan fazla süreyle +4 C de bırakıldıktan sonra klamidospor oluşturabilir. C.tropicalis in oluşturduğu klamidosporlar kalın bir duvarın olmaması ve sitoplazma içerisinde yansıma yapan globüllerin bulunmamasıyla C. albicans ın oluşturduğu klamidosporlardan ayrılır (70,71). Şekil 26,27,28 ve 29 da bazı kandida türlerinin mısırunu-tween 80 agardaki mikroskobik görünümleri gösterilmiştir. Şekil 26. C. albicans Şekil 27. C. krusei Şekil 28. C. glabrata Şekil 29. C. tropicalis 2.11.3. Karbonhidrat asimilasyon ve fermentasyon testleri: Asimilasyon, mayaların oksijen varlığında karbon kaynağı olarak spesifik bir karbonhidratı 42

kullanma yeteneklerini ortaya çıkarır. Fermentasyon ise karbonhidratların CO 2 ve etanol üretimiyle sonuçlanan anaerobik kullanımıdır (65,67). Mikroorganizmalar karbonhidratları fermentasyona uğrattıklarında oluşan asit, besiyerine ilave edilen fenol kırmızısı gibi ph indikatörleri yardımıyla ortaya çıkan renk değişimleri ile saptanır. Besiyerinin renginin sarı olması reaksiyonun pozitif olduğunu gösterirken, tüpteki besiyerinin kırmızı renkte kalması karbonhidratların fermente olmadığını gösterir (72). Sık idantifiye edilen kandida türlerinin karbonhidrat ve azot özümleme özellikleri aşağıda tablo 2 de verilmiştir (12). Tablo 2. Sık rastlanan kandida türlerinin fermentasyon ve asimilasyon özellikleri KANDİDA Fermantasyon Asimilasyon TÜRLERI G M S L G Gl L M R S C. albicans + + ± - + + - + - + C. stelloidea + + - - + + - + - - C. krusei + - - - + + - - - - C. kefyr + - + + + + + - + + C. parapsilosis + - - - + + - + - + (G: Glukoz, M: Maltoz, S: Sukroz, L: Laktoz, Gl: Galaktoz, R: Raffinoz) 2.11.4. Üreaz testi: Üreaz enzimine sahip mikroorganizmalar, üreyi amonyak ve karbondiokside parçalar. Amonyak ortamın alkali olamasını sağlar. Üre ve ph indikatörü olarak fenol kırmızısı içeren besiyerinde üreme olduğunda, üreaz enziminin varlığı, amonyağın oluşturduğu alkali ortamda fenol kırmızısının koyu pembe renge dönüşmesiyle saptanmaktadır. Bu test klinik önemi olan kandida türlerini diğer mayalardan ayırmaktadır. Klinik önemi olan türlerin büyük çoğunluğu üreaz negatiftir. C.krusei ve C.lipolytica üreyi hidroliz edebilir (12). 43

2.11.5. Kromojenik Besiyerinde Koloni Rengi ve Görünümünün Değerlendirilmesi Kandida türlerinin çoğunun SDA'daki kolonileri krem kıvamında ve ovaldir (C.albicans, C.stelloidea, C.tropicalis gibi). Koloni rengi geleneksel olarak kullanılan besiyerlerinde ayırt edilemez. Hızlı maya identifikasyonu sağlamak amacıyla birçok kromojenik besiyeri geliştirilmiştir. Türe özgü kromojenik substratlar içeren bu besiyerlerinde, mayaların ürettikleri enzimlerle bu substratlar reaksiyona girerek çeşitli renklerde kolonilerin oluşumunu sağlamaktadır. Pagano-Levin Agar (Difco), tetrazolium hidrokloridin redüksiyonu ile farklı renkte koloniler oluşturarak tek bir klinik örnekten birden fazla kandida türünün izolasyonuna olanak sağlar. Koloni rengine göre hızlı tanı sağlayan çeşitli kromojenik besiyerleri arasında; Albicans ID (bio Merieux), Candichrom albicans (International Mycoplasma), Candiselect (Sanofi Diagnostics Pasteur), CHROMagar Candida (BBL) sayılabilir. Kromojenik besiyerleri ile yapılan çalışmalarda duyarlılık ve özgüllüklerinin yüksek olduğu bildirilmektedir. Kromojenik besiyerlerinin kullanımı uygun antifungal ajanın seçilmesi ve tedaviye erken başlanması açısından klinisyene ve hastaya zaman kazandıracaktır (76,77,78). 2.11.6. Serolojik Testler Mikolojik hastalıkların tanısında mikrobiyolojik ve histopatolojik incelemeler yanında serolojik testlerde kullanılabilir. Serolojik yöntemlerle, kandida antijenleri ya da bu antijenlere karşı oluşan antikorların tespiti ile kandidiyazis olgularında erken tanı konulabilmesi mümkün olabilmektedir. Fungal infeksiyonların tanısında antijen tespiti için; Lateks Partiküler Aglütinasyon (LPA), Counter Immunoelektroforez (CIE), Radyoimmünoassay (RIA), Western Blotting (WB), Dot-Immünoassay, Enzim Immünoassay (EIA) gibi yöntemler kullanılırken, özgül antikorları ölçmek için ise; Kompleman Birleşme deneyi (CF), Immün Difüzyon (ID), Lateks Partiküler Aglütinasyon (LPA), Hemaglütinasyon (HA), Counter Immunoelektroforez (CIE) gibi 44

yöntemler kullanılır (67). Kandidiyazis olgularında antijen ölçümü, antikor ölçümüne göre daha duyarlıdır (73). Serolojik testler tanısal önemleri yanında hastalığın seyrinin izlenmesinde de yararlıdır ancak teknik uzmanlara gereksinim olması, reagenlerin zor hazırlanması ve maliyetlerinin yüksek olması nedeniyle rutinde kullanımları kısıtlıdır. Son yıllarda sistemik mantar infeksiyonlarında belirgin bir artışın olması, yeni mantar antijenlerinin elde edilmesine ve yeni teknolojk gelişmelere yönelik çalışmaları yoğunlaştırmış ve serolojik testler daha fazla kullanıma girmeye başlamıştır (9,26). 2.11.6.1. Antijen saptanması Kandida infeksiyonlarında özgül antijenleri göstererek tanı koymak yüksek derecede özgül fakat duyarlılık açısından klasik yöntemleri tamamlayıcı nitelikte görülmektedir. Kriptokok ve histoplazma infeksiyonlarının tanısında antijen saptama yöntemleri başarılı olurken, aspergillus ve kandida gibi fırsatçı mantarlarda bu yöntemin duyarlılığı düşük bulunmaktadır. Bu problemi çözebilmek için çok saf antijenleri kullanmak, monoklonal veya adsorbe poliklonal antikorları ve çok duyarlı yöntemleri geliştirmek gerekmektedir (9,26). Antijen saptama testleri: a- Kandida hücre duvarı mannoprotein (mannan) antijeninin saptanması: Mannan; kandida hücre yüzeyinin, infeksiyon sırasında, dolaşıma geçen karbonhidratıdır. Mannan antijeni oldukça özgün bir antijen olmasına rağmen serum yarı ömrü kısa olduğundan dolaşımdan çabuk temizlenir ve kandaki düzeyi hızla düşer. Ayrıca antikorlara hızlı bağlandığından serodiagnostik olarak saptanabilmesi için hastadan sık kan örneği alınması gerekir. İnvaziv kandidiyazis olgularında, dolaşımda hücre duvarı mannan antijenlerinin varlığı ilk kez 1976 da gösterilmiştir. Bu antijeni saptamak amacıyla Enzim-immüno-assay (EIA), Radyo-immuno-assay (RIA) ve lateks aglütinasyon testleri geliştirilmiştir. Ayrıca monoklonal antikorlar 45

kullanılarak uygulanan dot immunobinding yöntemi de kullanılabilmektedir. Mannoprotein antijenemisinin, kandida infeksiyonunun birinci haftasında ortaya çıktığı gözlemlenmiştir. Hücre duvarı mannan antijenlerinin varlığı invaziv kandidiyazisin tanısı ve tedavisi açısından iyi bir belirteç olarak değerlendirilmekle birlikte, kolonizasyon ve infeksiyon ayrımında sıkıntılar olduğu bilinmektedir. Değişik çalışmalarda duyarlılık ve özgüllüğüne ilşkin farklı oranlar bildirilmektedir. Kandidemili hastalarda, C.albicans fungemisinde duyarlılığı %77 iken C.glabrata fungemisinde %64 olarak bildirilmiş ve kan kültürü üremesinden 3-4 gün önce olumlu bulunmuştur. Yüksek riskli hastalarda antikor testleri ile birlikte yapıldığında duyarlılık ve özgüllüğünün daha yüksek olduğu, nötropenik hastalarda C.tropicalis in etken olduğu fungemilerin erken tanısında yararlı olduğu ve ayrıca BOS un incelendiği bir çalışmada da kandida menenjitlerinin tanısında etkin olabileceği bildirilmiştir (73). b- 36-44 kda luk antijenlerin EIA ile saptanması: C. albicans ın ısıya duyarlı 36, 38, 41, 42 ve 44 kda luk antijenlerinin EIA ile ölçümünün, kanserli nötropenik hastalardaki duyarlılığı %82, özgüllüğü %100 olarak bildirilmiştir (73). c- D-arabinitol saptanması: D-arabinitol aslında bazı kandida türlerinin metabolik ürünüdür. Sistemik kandidiyazisli hastaların idrarındaki düzeyi artar. D-arabinitol testinin duyarlılığı %50 civarındadır. Ayrıca C. krusei ve C.glabrata bu metaboliti üretmediklerinden bu iki etkenin infeksiyonlarında saptanmaz (73). d- Dolaşımda enolaz aktivitesinin saptanması: Enolaz ümit verici bir antijen olup duyarlılığı %54-75 olarak saptanmıştır. Ardışık alınan kanlarda aranmasının duyarlılığı arttıracağı kabul edilmektedir. Kanserli ve nötropenili olup kandidoz riski yüksek hastaların serumlarında enolaz saptanması için lipozomal immunoassay uygulanmıştır. Enolaz aktivitesinin saptanması bu grup hastalarda invaziv infeksiyon ve kolonizasyon 46

ayırımında yararlı ve kan kültürlerini destekleyici olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca enolaz kandida türlerine oldukça özgül olup yüzeyel kandidozlarda serumda saptanmaması da bir avantajdır (73). 2.11.6.2. Antikor saptanması Serolojik açıdan antikor tarama testleri özellikle kandida infeksiyonlarında, bu maya cinsinin flora üyesi olması dolayısıyla başarısızdır. Ayrıca hem kandida antijenlerinin immünojenitesinin düşük olması hem de kandida infeksiyonlarının sık görüldüğü hasta grubunun immun yetmezlikli olması nedeniyle yeterli antikor cevabı oluşamamaktadır (74). Antikor testleri için 1/32 veya üzerindeki titre yada üç hafta arayla titrede dört kat ve üzerindeki artış hastalığın tanısında değerli kabul edilmektedir. Daha düşük titreler ve aralıklı uygulanan testlerde dört katın altındaki artış, erken infeksiyonu veya nonspesifik çapraz reaksiyonu işaret eder (9). Doku invazyonu kanıtlandığı halde kan kültüründe üreme olmayan hastalarda erken dönemde antikorun gösterilmiş olması tanı ve tedavi yaklaşımı açısından önemli bulunmuştur (73,75). Antikor saptama testleri: a-sitoplazmik antijenlere karşı antikor araştırılması: ELISA ile invaziv kandidiyazisli hastaların serumlarında erken dönemde IgG sınıfı antikorların saptanmasının, yüzeyel infeksiyonlardan ayırt edici olduğu belirlenmiştir. Kandidanın enolaz antijenine karşı olan antikor yanıtı da araştırılmıştır. Kanıtlanmış invaziv infeksiyonu olan ya da yalnızca kolonizasyonu olan, ancak bağışıklık sistemi normal işlevini görebilen hastalardan elde edilen IgG yanıtlarına göre yöntemin duyarlılığı %50, özgüllüğü %86 olarak saptanmıştır (73). b-hücre duvarı (mannan) antijenine karşı antikor araştırılması: RIA ve ELISA ile hücre duvarı mannan antijenine karşı antikorların invaziv infeksiyonlular kadar, sağlıklı insanların serumunda da var olduğu gösterilmiştir. Bu testlerde en yüksek duyarlılık %65 olarak bildirilmiştir (73). 47

2.11.7. Kandida infeksiyonlarının tanısında moleküler biyolojik yöntemler İnvaziv kandida infeksiyonlarının zamanında ve doğru tanısı için daha hızlı, daha duyarlı ve daha özgül testlere gereksinim vardır. Bu amaçla DNA saptanmasına dayalı yöntemler geliştirilmiştir. Günümüzde fungal infeksiyonların tanısına yönelik kitler sadece birkaç etkene yöneliktir ve bunlar da esas olarak kültür ortamındaki mikroorganizmaların tanımlanmasında yararlıdır. Yapılan çalışmalarda invaziv kandida infeksiyonunu saptamada Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) nun, kan kültüründen daha duyarlı olduğu saptanmış ve invaziv kandida infeksiyonu için risk taşıyan ve kan kültürleri negatif olan hastaların bir kısmında PZR testi pozitif bulunmuştur. Bu sonuçlar invaziv kandidiyazis için risk taşıyan hastalarda serum örneklerinden C.albicans ın saptanmasında PZR'nun yararlı olduğunu göstermiştir. Bu testlerin kullanımı için referans laboratuvarlar ile yeterli deneyim ve teknik beceriye sahip uzmanlara ihtiyaç vardır (71,74). Fungal yükün çok az olması sebebiyle kültür ve serolojik tanının henüz yetersiz olduğu evrede, PZR temelli tanı yöntemlerinin çok daha etkin olacağı düşünülmektedir. 2.11.8. Hızlı Tiplendirme Kitleri Kandida türlerinin tanımlanmasında mikroskopik morfolojik özelliklerinin incelenmesi ve substrat assimilasyonunun değerlendirilmesine dayanan bazı metodlar kullanılır. Bu metodlar oldukça zaman gerektiren ve rutin laboratuvarda iş yükünü arttıran yöntemlerdir. Klasik idantifikasyon yöntemlerine alternatif olarak 4-72 saat içinde sonuç verebilen, uygulaması çok daha kolay olan çeşitli ticari sistemler geliştirilmiştir(6,7,11). Bu nedenle günümüz mikoloji laboratuvarlannda kısa sürelerde sonuç veren ve daha kolay uygulanabilen maya tiplendirme kitleri tercih edilmektedir. Bunlardan bazıları biyokimyasal ve enzimatik reaksiyonları değerlendirebilen ve/veya otomatize olarak kullanılabilen sistemlerdir. Bu sistemler maya idantifikasyon yönteminde 48

standardizasyon sağlamanın yanı sıra, hem sık bulunan hem de az rastlanan türleri idantifiye etmede yeterlidir. API ID 32C and API 20C AUX (bio Merieux), API Yeast Identification System (Analytab product), Yeast Star (CLARC Laboratories), RapID Yeast Plus System (Innovative Diagnostic Systems), Uni Yeast Tek (Flow Laboratories), Abott Yeast Identification System (Abott Diagnostic), Auto Microbic System (Vitek System), Micro Scan Yeast Identification Panel (Baxter Microscan), Candifast (International Mycoplasma), Mycotube (Roche Diagnostica), Auxocolor (Diagnostics Pasteur), Autobacl (Organon Tecnica) ve Pasteur Yeast System (Pasteur Production) gibi pek çok ticari kit vardır (9,75). 2.12. ANTİFUNGAL AJANLAR İlk kez 1903 yılında bir sporotrikoz vakasında, iyodidlerin ve 1939 da dermatofitlere karşı griseofulvinin tedavi maksadıyla kullanılmasından sonra, 1950 li yıllara kadar antifungal tedavide pek fazla gelişme olmamıştır. 1950 de nistatin, 1956 da Amfoterisin B, 1964 de flusitozin ve 1960 ların sonlarında da azoller antifungal tedavide kullanılmaya başlanmıştır (79,83). 1970 li yılların sonlarında o zamana kadar tedavide kullanılan Amfoterisin B ve flusitozine ek olarak intravenöz mikonazol ve oral ketokonazol tedaviye girmiştir. 1980 lerde triazollerin kullanılmaya başlaması ile sistemik antifungal seçenekleri artmış, günümüzde bu ajanlara ek olarak yeni triazoller, Amfoterisin B nin lipozomal türevleri, ekinokandinler, nikkomisinler, pradimisin ve analogları gibi yeni antifungaller de geliştirilmiştir. Ayrıca, fungal infeksiyon tedavisinde çeşitli antifungallerin ve immunmodülatör ajanların birlikte kullanımı da gündeme gelmiştir. Tedavi seçeneklerinin bu denli genişlemiş olmasına karşın, antifungal ajanların yaygın kullanımı ile bir veya birkaç ajana dirençli fungal patojenler ortaya çıkmıştır ( 79,83). Fungal infeksiyonların tedavisi bakteriyel infeksiyonların tedavisinden daha zordur. Bu da mantarların insan hücreleri gibi ökaryotik olmasından ve fungal hücrelere selektif toksik etkili ajanlar bulunmasındaki zorluktan kaynaklanmaktadır. Yeni jenerasyon antifungal ajanların geliştirilmesinde iki hedef vardır. Biri bu infeksiyonun patogenezini daha iyi anlayabilmek için 49

potansiyel hedefleri belirlemek, diğeri ise insan hücrelerine zarar vermeden maya hücrelerini selektif olarak inhibe edebilen, intrinsek insan savunma mekanizmalarından (rekombinant antikor) yararlanmaktır (79). Tablo 3 te çeşitli antifungal ajanlar ve etki mekanizmaları gösterilmiştir. 50

Tablo: 3 Çeşitli antifungal ajanlar ve etki mekanizmaları Antifungal Ajan Etki Mekanizması Poliyenler Nistatin Amfoterisin B Amfoterisin B Lipit Kompleks (ABLC) Amfoterisin B Kolloidal Dispersiyon (ABCD) Lipozomal Amfoterisin B Mantar hücre duvarı ergosterolüne bağlanarak hücre duvarı geçirgenliğini arttırır. Özellikle hücre içi K + kaybı ile hücrenin canlılığını yitirmesine neden olur. Azoller Ketokonazol Flukonazol İtrakonazol Vorikonazol** Alilamin ve tiyokarbamatlar Naftifin Terbinafin Tolnaftat Morfolinler Amorolfin Primidin analoğu Flusitozin Lanosterol 14 α demetilaz inhibisyonu ** 24 metilen dihidro lanosterol demetilaz inhibisyonu Oksidosqualen siklaz inhibisyonu Sterol 14 redüktaz ve 7-8 izomeraz inhibisyonu 5-florourasile dönüşerek RNA, timine dönüşerek DNA yapısını bozar. Ekinokandinler 1,3 β-d glukan sentetaz inhibitörü Kaspofungin Polyoxinler Hücre duvarında kitin sentez inhibisyonu Pradimisinler Mannan sentez inhibitörleri 51

AMFOTERİSİN B Toprakta bulunan Streptomyces nodosus cinsi mikroorganizmadan elde edilen Amfoterisin B halen en geniş spektrumlu poliyen grubu bir antifungaldir. Amfoterik özelikte olup asit ve bazik ortamda çözülebilen tuzlar yapar ve ph 2-11 arasında suda erimez. Bu nedenle sodyum deoksikolat ile kararlı kolloidal bir süspansiyon oluşturularak suda çözünebilirliği arttırılmıştır (79). Poliyen grubu antifungaller membran sterolleri ile kompleks yaparlar. Mantarlann sitoplazmik membranının temel sterolü olan ergosterole afinitesi memeli hücre membranının sterolü olan kolesterole göre daha fazladır. Mantar hücre membranında ergosterol ile etkileşen Amfoterisin B'nin membranda porlar oluşturup permeabiliteyi artırarak hücre ölümüne neden olduğu düşünülmektedir. Yüksek ilaç konsantrasyonları mantar hücre membranlarında 40-150 nm çaplı porlar oluşturur ve intrasellüler potasyum ve diğer moleküllerin kaybına bağlı olarak fungal hücrenin canlılığını yitirmesine neden olur (83). Aynca lipid peroksidasyonu, membran enzimlerinin inhibisyonu, endositoz ve immünstimülasyonun bloke edilmesi öne sürülen diğer etki mekanizmalarıdır. Etki hızlı başlar ve üreme oranı ile ilişkili değildir (83). Amfoterisin B geniş etki alanına sahip olup sık rastlanan patojenlerin çoğuna etkilidir. Kandida türleri, C. neoformans, Aspergillus türleri, Blastomyces dermatidis, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis gibi difazik mantarlara; zigomikoz, feohifomikoz ve hyalohifomikozun bazı klinik şekillerine etkilidir (79). Amfoterisin B'nin dermatifitozlar, aspergilloma, mantar miçetomu, kromomikoz ve belirli koksidiyoidomikoz şekillerine etkisi yoktur veya çok sınırlıdır. İn vitro ve in vivo olarak Pseudoallescheria boydii ve Trichosporon türlerine de etkisizdir (80). Amfoterisin B, Leishmania, Entamoeba, Naegleria, Trypanosoma ve Trichomonas gibi bazı protozoonlara da etki gösterir(80). İlaca karşı primer 52

veya sekonder direnç enderdir. Tedavi sırasında dirençli C.lusitaniae ve C.tropicalis suşları izole edilmiştir. Mantar, hücre zarındaki ergosterol miktarını azaltıp zarın yapısını değiştirerek direnç geliştirebilir (80). Amfoterisin B, deri ve mukozalardan emilmez. Gastrointestinal kanaldan emilimi minimaldir. Bu nedenle intravenöz yolla uygulanır. Verilen dozun %90'ından fazlası serum protein ve lipoproteinlerine bağlanır. İlacın en yüksek doku konsantrasyonlarına eriştiği organlar karaciğer ve dalaktır (83). Lipozomal formülasyonlar: Klasik Amfoterisin B'nin etki spektrumunu değiştirmeden yan etkilerini azaltan lipozomal formülasyonlar geliştirilmiştir. Lipid formülasyonların nefrotoksik etkilerinin belirgin olarak azalmasında etkili olan mekanizmalar; lipozom ile taşınan Amfoterisin B'nin seçici olarak fungal hücrelere transfer edilmesi ve HDL'ye klasik Amfoterisin B'den daha fazla bağlanması olarak özetlenebilir. Klasik Amfoterisin B kullanımı sırasında otaya çıkan infuzyona bağlı yan etkiler; monosit ve makrofajlardan TNF-α, IL-1, IL-6 gibi sitokinlerin salgılanmasıdır. Amfoterisin B'nin lipozomal yapılar ile çevrelenmesi bu proinflamatuar sitokinlerin salınımını azaltmaktadır. Tüm formülasyonlar %5 dekstroz içinde uygulanmalıdır. Bu formülasyonların klasik Amfoterisin B ile aynı etkinliği gösterebilmeleri için daha yüksek dozda kullanılmaları gerekmektedir. Güvenle kullanılan ilaçlar olmakla birlikte çok pahalı olmaları kullanımlarını kısıtlayan en önemli faktördür (83). Amfoterisin B Lipid Kompleks (ABLC): Lopez - Berstein tarafindan geliştirilen bu molekül 7:3 molar oranda dirniristoyl-fosfotidilkolin ve dirniristoyl-fosfatidilgliserolün oluşturduğu şerit şeklinde kompleks yapılardır. Bu komplekste lipozomal olan ve olmayan çift tabakalı lipit yapılar bulunur. Klasik Amfoterisin B ile in vitro ve in vivo aynı etkiye sahip olup nefrotoksik etkisi belirgin olarak düşüktür (83,84). Amfoterisin B Kolloidal Dispersiyon (ABCD): Amfoterisin B ile sodyum kolesteril sülfatın 1:1 oranında birleşmesi ile oluşturulmuş bir lipid formülasyondur. 53

Multilameller bir yapıya sahiptir, insanlarda diğer lipid formülasyonlara göre daha az çalışılmıştır. İnfüzyon ile ilişkili yan etkiler %86'ya kadar çıkmaktadır. Bunu engellemek için infüzyon hızı yavaş olmalı ve premedikasyon uygulanmalıdır. Nefrotoksik etki, klasik Amfoterisin B' ye göre oldukça düşüktür (83,84). Lipozomal Amfoterisin B (LAB): Lipozomal Amfoterisin B, uniform, sferik unilameller lipid veziküllerden oluşur. İn vitro aktivitesi klasik Amfoterisin B ile aynıdır. Nefrotoksik etkisi klasik Amfoterisin B' den daha düşüktür (83,84). Lipid Emülsiyonda Amfoterisin B: Amfoterisin B' nin %20 lik intralipid içindeki formülasyonudur. Doku dağılımı oldukça yüksektir. Nefrotoksik etki, klasik Amfoterisin B' ye göre oldukça düşüktür (83,84). FLUSİTOZİN 5-florositozin (5-FS) veya flusitozin, sentetik florlu bir primidindir. Mantar hücresine sitozin permeaz aracılığıyla girip hücrede sitozin 5-florourasile dönüştürülür. Bu madde RNA'daki urasilin yerini alarak protein sentezini inhibe eder. Flusitozin aynca timidilat sentetazı engelleyerek DNA sentezini de önler(79). 1972 yılında kullanıma sunulmuştur, suda çözünebilir ve gastrointestinal sistemden iyi absorbe olur. Flusitozinin etki spektrumu dardır. Özellikle kandida türleri ve C neoformans'a etkilidir. C.albicans suşlarının yaklaşık %95'i flusitozine duyarlı, C.tropicalis ve C.krusei başta olmak üzere diğer kandida türlerinin %25-30'u dirençlidir. C.galabrata ve C.neoformans suşlarının çoğu duyarlı bulunmuştur (79). Tedavi sırasında sekonder direnç ortaya çıkabilir. Bu nedenle C.neformans menenjiti, gastrointestinal mikoz gibi etken mikroroganizmanın çok yoğun bulunduğu infeksiyonlarda flusitozin tek ilaç olarak kullanılmamalıdır. Ayrıca flusitozin uygulamadan önce in vitro duyarlılık testleri de yapılmalıdır (79). 54

Amfoterisin B' ye göre etki spektrumu daha dardır ve genelde diğer antifungallerle kombine şekilde kullanılır. Primer direncin en yoğun görüldüğü ajandır. Direnç gelişimi önemli bir problem olup en önemli nedeni ilacın tek başına kullanımıdır. Nadir olarak döküntü, ishal ve karaciğer enzimlerinde yükselme görülebilir (73,79). FLUKONAZOL Flukonazol 1982 yılında bulunan, diflorafenil bistriazol türevidir. Flukonazol düşük konsantrasyonlarda 14-α-demetilaz enzimini ve ergosterol sentezini inhibe edip lanosterol / ergosterol oranını yükseltir. Yüksek konsantrasyonlarda lanosterol / ergosterol oranına bağlı olarak mantar hücre membranında hızlı bir şekilde hasar oluşturarak fungisid etki gösterir. Azoller oksidatif ve peroksidatif enzim sistemlerini inhibe ederek intrasellüler toksik reaktif peroksitlerin artışına neden olurlar (79,80). Etki spektrumu geniştir. C. albicans, C. tropicalis ve C. kefyr gibi kandida türleri ilaca duyarlıdır. C. krusei ve C. galabrata suşları ise dirençlidir (79). C.krusei suşları in vitro duyarlı bulunsalar bile intrinsek dirençli olduklarından dirençli olarak rapor edilmelidir (81). Oral yolla alınan flukonazolün tamamına yakını gastrointestinal kanaldan hızla absorbe edilir. Serum proteinlerine düşük (%12) oranda bağlanır. Dokulara ve vücut sıvılarına dağılımı iyidir ve %80' i değişmeden idrarla atılır (82). Özellikle kanserli ve AIDS hastalarının, orofarengeal ve özofageal kandida tedavisinde en etkili ajanlardan biridir. Ancak AIDS hastalarının %33 ünde flukonazole dirençli kandidalar tespit edilmiştir ve çoğunda diğer azollere de çapraz direnç vardır (79). Flukonazol iyi tolere edilir. Yan etkileri genellikle hafif ve geçici olup az sayıda hastada görülür. Bulantı ve kusma en sık görülen yan etkileridir. Ketokonazolden faklı olarak adrenal ve testiküler steroid metabolizmasını etkilemez (79,80,82). 55

KETOKONAZOL, ITRAKONAZOL Ketokonazol, itrakonazol sentetik dioksolon imidazol bileşiğidir. İmidazol türevleri, lanosterolden ergosterol sentezinde rol oynayan sitokrom P-450 ailesinden 14-α-demetilazın inhibisyonu yoluyla etki gösterirler. Bu etki sonucu ergosterol sentezi bloke olur ve membran permeabilitesi bozulur(79). Primer olarak fungostatiktirler. Oral alındığında emilimi normal mide ph' sında iyi olup, asit fazlalığında emilimleri artmaktadır. Plazma proteinlerine %99 oranında bağlanır (80). Oral antikoagülanlar, kotrikosteroidler, izoniazid, siklosporin, insülin, fenitoin, antasitler gibi birçok ilaçla etkileşime girerler (79). Bu grup ilaçların en sık görülen yan etkileri iştahsızlık, bulantı, kusma, karın ağrısı, döküntüsüz kaşıntı ve ishaldir. Karaciğer toksisitesi de görülebilir (80,87) VORİKONAZOL Sentetik flukonazol türevidir, oral ve IV formları mevcut olan yeni bir triazoldür, 14-α-demetilaz ve 24 metilen dihidro lanosterol demetilazı inhibe eder. Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Fusarium spp., Penicillium marneffei ve dermatofitlerde etkilidir (79,85,86). Vorikonazol Candida spp. ve Cryptococcus neoformans a karşı fungistatik etki gösterirken Aspergillus spp. için fungisidal etki göstermektedir. Vorikonazolün C.krusei gibi bazı dirençli kandida türlerinin yanısıra flamentöz mantarlara da genelde fungisidal etki gösteriyor olması olumlu bir özelliğidir. Flukonazole dirençli kandida suşlarının bir kısmı, çapraz direnç nedeniyle vorikonazole de dirençlidir. Vorikonazolün başlıca kullanım endikasyonları; özofageal kandidiyazis, nonnötropenik kandidemi ve invaziv aspergillozun tedavisidir. Yan etki olarak geçici görme bozukluğu, deride kızarıklık ve karaciğer enzimlerinde yükselme görülebilir (86,87). 56

POSAKONAZOL Faz III çalışmaları devam eden oral bir triazoldür. İn vitro koşullarda Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Fusarium spp., Zygomycetes, S.apiospermum ve dermatofitlere etkilidir. Klinik kullanımda olan diğer antifungallere yanıt vermeyen yada intolerans nedeniyle bu ilaçların kullanılamadığı invaziv fungal infeksiyonların tedavisinde %43-82 oranında başarı sağlamış, bu infeksiyonların tedavisinde kullanılması Avrupa da 27 Ekim 2005 tarihi itibariyle onaylanmıştır (87). RAVUKONAZOL Faz II-III çalışmaları devam eden oral ve IV formülasyonları geliştirilmiş olan bir triazoldür. İn vitro koşullarda Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Fusarium spp.,trichosporon, Rhizopus, S.apiospermum ve dermatofitlere etkilidir. Flukonazole doza bağlı duyarlı ve dirençli olan kandida suşlarına etkinliği, flukonazole duyarlı olanlara karşı etkinliğine kıyasla daha az saptanabilmektedir. Ravukonazolün fungal infeksiyonların tedavisindeki etkinliği, güvenilirliği ve farmakokinetik profili ile ilgili çalışmalar devam etmektedir (86,87) ALBAKONAZOL Faz II-III çalışmaları devam eden bir triazoldür. İn vitro koşullarda Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans, Malesseziae spp., Paecilomyces, S.apiospermum, S. prolificans ve dermatofitlere etkilidir (87 EKİNOKANDİNLER Siklik lipopeptid yapıda, fungisitik antifungal ajanlardır ve memelilerde bulunmayan 1,3 β-d glukan sentetaz enzimini nonkompetatif olarak inhibe edip hücre duvar sentezini önlerler (59). Bu grupta bulunan ilaçlar; kaspofungin, mikafungin ve anidulofungindir. Ekinokandinlerin oral biyoyararlanımları sınırlıdır, bu nedenle IV formları geliştirilmiştir. 57

Kaspofungin: Kaspofungin etkisini mantarların majör hücre duvar komponenti olan 1,3 β-d glukan sentezini önleyerek gösterir. Kandidalara karşı fungisidaldir. Aspergillus spp. ye karşı kullanılabilir. Cryptococcus neoformans a karşı etkisizdir. Azol ve Amfoterisin B dirençli kandida suşlarına etkili oluşları ve kandida biyofilmlerinde yeterli antifungal etki gösterebilmeleri önemli avantajlarındandır (88,89). PNÖMOKANDİNLER Ekinokandinlerin analoğu olup etki mekanizması da aynıdır. P.carinii (P.jiroveci), Candida spp., Aspergillus spp. a karşı etkindir. Bu grupta L- 743872 bileşiği araştırılmaktadır (59,89). ALİLAMİNLER Bu bileşikler ergosterol sentezinde anahtar enzim olan squalen epoksidazın reversibl nonkompetetif inhibitörüdür. Squalen birikimi ve ergosterol eksikliği membran fonksiyonlarının kaybına neden olur. Klinikte topikal olarak uygulanan terbinafin ve naftifin mevcuttur (59,73). MORFOLİNLER Alilaminler gibi sentetik ajanlar olup, ergosterol sentez yolunda, enzim inhibisyonu yoluyla etkilidir. Amorolfin bu gruptaki tek ilaç olup topikal olarak kullanılmaktadır (59,73). PARADİMİSİNLER- BENANOMİSİNLER Fungisidaldir ve kalsiyuma bağlı olarak hücre duvarı mannoproteinlerine bağlanarak, osmoza duyarlı lizise yol açar. İntrasellüler K + ile hücre membranı stabilizasyonunu bozar (59,73). SORDARİN VE AZASORDARİNLER Mantar hücresinde protein senteinde rol alan ve memeli hücresinde bulunmayan elongation factor 3 (EF 3) ü inhibe ederek protein sentezini 58

durduran bileşiklerdir. Sordarinlerin öncü bileşiği bir tetrahidrofuran türevi olan GM 237354, azasordarinlerin öncü bileşiği ise GW 471558 dir. Bu öncü bileşikleri takiben birçok başka sordarin ve azasordarin bileşiği geliştirilmiştir. Sordarin ve azasordarinler in vitro koşullarda Candida spp., Cryptococcus neoformans, Trichosporon spp., Pneumocystis carinii, Pseudallescheria boydii ve C. carionii ye etkilidir (88,89). İKOFUNGİPEN (BAY-10-8888, PLD-118) Kandida izolösil-trna sentetaz inhibitörü olan ve faz II çalışmaları devam eden bir antifungal bileşiktir. Azol dirençli suşlar da dahil olmak üzere kandida türlerine karşı aktivite gösterdiği, in vitro koşullarda ve hayvan modellerinde gösterilmiştir. HIV pozitif olgularda orofarengeal kandidiyazis tedavisinde etkili bulunmuş, ancak denenen dozlarda flukonazolden daha az etkin olduğu saptanmıştır (88,89). 2.13. ANTİFUNGAL DUYARLILIK TESTLERİ Sistemik mantar infeksiyonlarının tedavisinde uzun yıllar yalnızca Amfoterisin B ve flusitozin (5-FC) ile yetinilmiştir. Son yirmi yıl içerisinde infeksiyon sıkılığındaki çarpıcı artışla birlikte, 1980 li yıllarda triazol grubu antifungal ilaçların kullanıma girmesi; ardından mantarlarda direnç belirlenmesi ve tedavi seçiminde zorluklar birbirini izlemiştir (90,91). Bu durum antifungal duyarlılık testlerinin geliştirilmesi gereksinimini doğurmuştur. Antifungal duyarlılık testleri gerek in vitro sonuçlar ile klinik sonuçlar arasındaki korelasyon, gerekse yeni ilaçların geliştirilmesi ve değerlendirilmesi açısından antibakteriyel duyarlılık testlerinin gerisinde kalmıştır. Ayrıca laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası uyum da tam olarak sağlanamamıştır. Bunun üzerine ilk kez 1982 yılında NCCLS (CLSI) bünyesinde antifungal duyarlılık testleri için bir alt komite oluşturulmuş ve bu konuda çok merkezli çalışmalar yapılmaya başlanmıştır. Bu çalışmalar sonucunda 59

toplanan veriler doğrultusunda ilk kez 1992 yılında kandida türleri ve C.neoformans izolatları için referans bir yöntem önerilmiştir (NCCLS M27-P). İlerleyen yıllarda bu yöntem ile ilgili çalışmalar sürdürülerek 1995 de M27-T ve 1997 yılında kandida türleri ve C.neoformans için M27-A rehberleri yayımlanmıştır. Bu rehberde testte kullanılacak inokülüm miktarı, besiyeri içeriği, ısı ve inkübasyon süresi gibi değişkenlerin ve minimal inhibitör konsantrasyonu (MİK) belirleyen son değerlerin standardizasyonu ortaya konmuştur. Küf mantarları için 1998 de M38-P ve yeni düzenlemesi ile 2002 de M38-A rehberleri yayımlanmıştır. Yine 2002 de daha kolay olan mikrodilüsyon yönteminin uygulanmasına yönelik değişikliklerle M27-A2 ve 2003 yılında da disk difüzyon testi için M-44P rehberleri yayımlanmıştır (90,92). Antifungal duyarlılık testlerinin hangi durumlarda uygulanması gerektiği maddelerle belirlenmiştir. Buna göre; 1) Etken mikroorganizmaya etkili olduğu bilinen antifungal ilaç ile tedaviye yanıt alınamadığı durumlarda 2) Alternatif ilaçların araştırılmasının gerektiği ve özellikle seçilen ilaca karşı mantarın direnci olduğu bilinen durumlarda (örn: C.lusitaniae ile Amfoterisin B gibi) 3) Direncin sıklıkla görüldüğü flusitozin ile tedavi öncesinde ve esnasında 4) Yeni ilaçların kullanıldığı durumlarda 5) Nötropeni v.b ağır immun sistem yetmezliği bulunan hastalarda sistemik infeksiyon geliştiğinde 6) İn vitro ve in vivo uyumun belirlenmesini amaçlayan durumlarda antifungal duyarlılık testleri uygulanmalıdır (93). İdeal olarak in vitro antifungal duyarlılık testleri; iki ya da daha fazla ilacın aktivitesinin güvenilir olarak ölçülmesini, ilaçların in vivo aktiviteleri ve tedavi sonuçlarını ölçebilmeyi, duyarlı mikroorganizma topluluğu içindeki 60

direnç gelişiminin izlenmesini ve yeni geliştirilen ilaçların tedavi edici güçlerini ölçebilmeyi sağlamalıdır (93). Antifungal duyarlılık belirlenmesi amacıyla kullanılan testler tablo 4 de gösterilmiştir. Tablo 4. Antifungal duyarlılık testleri (36,94,95) Yöntemler MIK değeri ölçülmesi Buyyon makrodilüsyon Görsel (1:5 kontrol üreme bulanıklığı ile karşılaştırma ) ATP fotometre Bulanıklığı ölçme (türbidimetre) Kolorimetre Radyometre Kuru ağırlık Buyyon mikrodilüsyon Görsel (kontrol üreme bulanıklığı ile karşılaştırma) ATP fotometre Bulanıklığı ölçme (türbidimetre) Kolorimetre Radyometre Kuru ağırlık Kolorimetrik buyyon mikrodilüsyon Agar dilüsyon Agar difüzyon Disk E-test Renk değişiminin görsel olarak izlenmesi Görsel Görsel (inhibisyon zon çapı) Görsel (inhibisyon zonu) 61

Antifungal duyarlılık testleri için akılda tutulması gereken en önemli noktalar, duyarlı çıkan kökenlerin başarılı klinik sonucu garanti etmeyeceği gibi, dirençli çıkan kökenlerinde ilaca mutlak yanıtsızlık anlamına gelmeyeceğidir. Her iki durumunda üstünde öneme sahip olan etmen, konak savunmasıdır. Hastanın altta yatan hastalığı, CD4 sayısı, ilacın dozu, veriliş süresi ve veriliş yolu gibi faktörler terapötik sonucu etkilemektedir. İn vitro duyarlılık sonuçları ile terapötik sonuç arası korelesyon 90-60 kuralı ile belirlenmiştir. Buna göre duyarlı izolatlar 100 epizodun 90 ında uygun tedaviye yanıt verirken, dirençli çıkan kökenlere bağlı infeksiyonlarda ancak 60 epizodda olumlu yanıt alınmıştır. Antifungal duyarlılık testlerinde in vitro öngörünün ülçütleri olarak; doğru bir MİK sonucu, doğru bir inhibisyon zon çapı, EAK / MİK (eğri altı konsantrasyon / MİK) gibi ilaç-mikroorganizma etkileşimini ölçen değerlerin bilinmesi dikkate alınmaktadır. Eğri altı konsantrasyon, ilacın MİK değerinin birkaç katına yükseldiği yoğunluk ve bunun için geçen süreye göre çizilen eğridir. Bu eğrinin altında kalan alanın MİK e oranı hem etkili konsantrasyon hem de etkili zamanın her ikisini de içeren değerleri belirler. Bu oran büyük olduğunda ( 125) hastalardan alınan olumlu yanıt oranı yüksek çıkarken, düşük değerlerde olumlu yanıt da düşük oranda kalmaktadır. Bu sebeple bazı infeksiyonlarda doz arttırılsa bile eradikasyon sağlanamamasına rağmen, bazı infeksiyonlar da ise düşük dozlarla bile tedavi mümkün olmaktadır. Ayrıca hastada infeksiyon bölgesi, infeksiyon bölgesindeki etken patojenin yoğunluğu, hastanın immun durumu, hastanın tedaviye uyumu ve ilacın farmakodinamiği, farmakokinetiği tedavinin sonuçlarını önemli ölçüde etkiler. AIDS ya da kanser kemoterapisi gibi durumlarda antifungal tedaviye yanıt azdır (91). Dolayısıyla antifungal duyarlılık testleri aslında dirençlilik belirleyen bir test olarak nitelendirilmelidir. Öyle ki; klinik açıdan ilaç direncinin önceden bildirilmesi, duyarlılığın önceden bildirilmesinden çok daha önemlidir (97). 62

Antifungal duyarlılık testlerinin yapılmasında, standart bir yöntem önerilmesine rağmen henüz antifungal duyarlılık sonuçları ile ilgili sorunlar bitmemiştir. Kandida suşları için flukonazol, itrakonazol ve flusitozin için MIK direnç sınır değerleri belirlenmiştir. Ancak Amfoterisin B için bu değerler henüz kesinlik kazanmamıştır. Bunun nedeni, standart yöntemin Amfoterisin B' ye duyarlı ve dirençli suşları ayırt etmekte yetersiz kalmasıdır (97). Genellikle kandidiyazisli olgulardan izole edilen suşlarda flukonazole yanıt açısından in vitro ve in vivo sonuçlar arasında bir korelasyon olduğu görülmektedir. Ancak klinik yanıtı belirleyen tek parametre suşun o antifungal için saptanan in vitro duyarlılık durumu olmayıp birçok faktör sözkonusudur (97). Tablo 5 de CLSI ın mayalar için önerdiği (NCCLS M-27A rehberinde yayımlanan) referans yöntem ve test koşulları gösterilmiştir. Tablo 5. Mayalar için referans yöntem (NCCLS M27-A) (96). Yöntem Mikrodilüsyon Besiyeri RPMI1640 (L-glutarninli, sodyum bikarbonatsız) Tampon Morfolinopropansülfonik asit (MOPS) 0,165 M ph 7,0 İnokulüm 0.5-2.5x10 3 cfu/ml Süre MIK Değeri Öneri 48 saat (Candida), 72 saat (C.neoformans) Amfoterisin B için skor "0" (üremenin tam inhibisyonu) Azoller ve flusitozin skor "2" (üremenin %80 azalması) Azoller için mikroplağın okunmadan önce çalkalanması 63

Referans yöntem dışında önerilen diğer antifungal duyarlılık testleri CLSI ın önerdiği makrodilüsyon yöntemi ile ilgili teknik güçlükler ve görsel değerlendirmenin subjektif olması gibi nedenlerle, rutin laboratuvarlarda daha kolay uygulanabilecek alternatif yöntem arayışları tüm dünyada devam etmektedir. Bunlar arasında en sık kullanılan yöntemler aşağıda gösterilmiştir. I) Kolorimetrik Yöntemler A) Mikrodilüsyon yöntemleri 1) Alamar Mavisi Yöntemi Bir oksido-redüksiyon indikatörü olan alamar mavisi normalde mavi olup, mantar üremesi olduğunda pembe renge dönüşür. Mavi olan son kuyucuk MIK değerini verir (75). 2) MTT Yöntemi MTT boyası [(4,5 dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2h-tetrazolyum bromid)] canlı hücrelerdeki dehidrogenazlar tarafından indirgenerek sarı renkten mor renkli formazana dönüşür. Metabolik olarak aktif mantar hücreleri mitokondriyal dehidrogenazları aracılığı ile MTT ye sarı rengini veren tetrazolyum zincirini bozarak mor renkli MTT-formazan kristallerine dönüşümünü sağlar. Formazan kristalleri eritildikten sonra oluşan renk yoğunluğu canlı hücre sayısı ile doğru orantılı olmaktadır. Bu yöntem canlı hücre sayısının saptanmasının gerekli olduğu çalışmalarda kullanılabilir (75) B) Makrodilüsyon yöntemi Suda çözünebilen bir başka tetrazolium tuzunun (XTT) indirgenmesine dayanan bir antifungal duyarlılık testidir (75). 64

C) Agar Dilüsyon Yöntemi Bu yöntemde mayalar için standartlar henüz belirlenmemiş olup, farklı konsantrasyonlarda antifungal içeren besiyerlerine ekilen koloniler 24 saat sonra antifungal içermeyen besiyerindeki koloniler ile karşılaştırılır. Kontrole göre koloni çevresinde önemli miktarda azalma saptanan en düşük antifungal konsantrasyonu MİK değeri olarak belirlenir (94). II) Spektrofotometrik Yöntemler Bu yöntemde bulanıklığın kontrole göre Amfoterisin B için %90, flukonazol için %50-70 oranında azaldığı çukurlardaki antifungal madde konsantrasyonu MIK değeri olarak kabul edilir. Yapılan çalışmalarda bu testin standart yöntemle uyumu %80-100 arasında bulunmuştur (75). III) Diffüzyon Yöntemleri Bir test mikroorganizmasının yayıldığı agar plaklarında antifungallerin difüzyonuna dayanan kalitatif bir yöntemdir. Önemli bir avantajı ticari olarak hazır, antimikrobiyal emdirilmiş disk, tablet ya da kağıt şeritlerin ve agar plakların kullanılabilmesidir. Diğer önemli avantajı bu yöntemin her laboratuvarda kolaylıkla uygulanabilmesidir. A) Disk Diffüzyon Yöntemi Antifungal ajanlarla doyurulmuş disklerin kullanıldığı bu yöntem için kazeinli veya asparaginli yeast nitrojen glukoz agar ve 48 saatlik inkübasyon önerilmektedir. Azoller dışındaki antifungaller için uygundur, çünkü azollerde kısmi inhibisyon ve zon içi üremeler nedeniyle değerlendirme zor olmaktadır (80). Standart yöntem ile uyumu % 80 civarında bulunmuştur (98). B) E Test Yöntemi Azalan dilüsyonlarda antifungal ajanın emdirildiği plastik bir stribin, test edilecek mikroorganizmanın yayıldığı agar plağı yüzeyine yerleştirilmesi 65

ve antifungalin besiyerine diffuze olmasına dayanan bir testtir. Agar yüzeyinde üreme inhibisyon zonu ile antifungal emdirilmiş stribin kesiştiği noktadan MİK değeri saptanabilir. Bu test için önerilen besiyeri MOPS (morfolinopropan sülfonik asit) ile tamponlanmış RPMI 1640 katı besiyeridir. Amfoterisin B, ketokonazol, flukonazol, itrakonazol, vorikonazol ve flusitozin E test stripleri ticari olarak mevcuttur. Yapılan çalışmalar, E test ile tespit edilen MİK değerleri ve referans makrodilüsyon yöntemi ile belirlenen MİK değerleri arasında %85-100 oranında uyum olduğu göstermiş ve kantitatif sonuç alınmasında etkili bir yöntem olduğu ispatlanmıştır. Uygulama kolaylığı ve uygulama esnasında gereksinim duyulan ek malzemelerin azlığı nedeniyle Avrupa ve Kuzey Amerika ülkelerindeki birçok rutin laboratuvarda yüksek duyarlılıklı bir antifungal test olarak kullanılmaktadır. Testin değerlendirilmesi aşamasında doğabilecek yanlış yorumlar bakımından mikrodilüsyon yöntemine göre daha güvenilirdir. Pahalı olması en önemli dezavantajıdır (99). IV) Flowsitometrik Analiz Bu yöntem fungal DNA ya bağlanan katyonik floresan boyanın ölçümüne dayanır. DNA ya bağlanan vital boyalar yardımı ile ölü ve canlı hücre ayrımı yapılabilmektedir. Normal şartlarda hücre içine giremeyen boyalar, antifungal aktivitenin gösterilmesinde kullanılmaktadır. Floresan boyaların hücre içine alınması membran hasarına bağlıdır. Böylelikle antifungal ajan ile temas sonrası gelişen membran hasarı gösterilmektedir. Flowsitometri yöntemi, saatler içinde sonuç veren ve CLSI metodolojisi ile yüksek uyumlu bir yöntemdir. Bir defada 10.000 hücrenin incelenmesiyle istatiksel hatanın az olması gibi özellikler taşımakla birlikte pahalı bir teknik olması ve referans laboratuarlardaki uzman kişilerce çalışılabilmesi kullanımını sınırlandırmaktadır (75,94,97). 66

3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. TEST ORGANİZMALARI Çalışmamızda Nisan 2006 - Nisan 2008 tarihleri arasında Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi yoğun bakım, beyin cerrahisi, dahiliye ve genel cerrahi kliniklerinde yatan hastalara ait kan, kateter, BOS, periton mayi, plevra mayi, safra mayi gibi steril vücut sıvılarından izole edilen ve CDC kriterlerine göre nozokomiyal infeksiyon etkeni olduğu doğrulanan 89 kandida suşu ve 1 standart suş (C.albicans ATCC 90028 ) olmak üzere 90 suş kullanılmıştır. Bu suşların 56 sı kan, 12 si kateter, 3 ü BOS, 1 i plevra mayi, 11 i periton mayi ve 6 sı da safra mayi kültürlerinden izole edilmiş ve her hastaya ait tek bir suş kullanılmıştır. 3.2. İZOLASYON VE İDANTİFİKASYON 3.2.1. Primer İzolasyon Rutin laboratuvara mantar kültürü amacıyla gönderilen örnekler SDA a ekilerek 25ºC ve 37ºC de inkübe edildi. Üremeler günlük olarak kontrol edildi ve 72 saat sonunda, maya üremesi olmayan örnekler çalışma dışı bırakıldı. SDA da genellikle 2-3 günde üreyen, hamur kıvamında, 0,5-1 mm çapında, beyaz veya krem renkli, genellikle düzgün sınırlı ve kendine özgü maya kokusu olan kolonilerden Gram boyama yapıldı. Gram boyamada; Gram pozitif, oval veya uzamış tomurcuklu maya hücreleriyle, tek tek, bazen ikili, üçlü blastospor kümeleri ve pseudohif oluşturan maya hücreleri Candida spp. olarak tanımlandı. Saf olduğu saptanan kültürlerden, idantifikasyonun ileri aşamasında tür tayininde ve antifungal duyarlılık testinde kullanılmak üzere yatık SDA a pasaj yapıldı ve çalışılıncaya kadar -20 C de saklandı. 67

Şeki l30 da SDA da 24 saatlik inkübasyonla oluşan C.albicans kolonileri gösterilmiştir. Şekil 30. SDA da C.albicans kolonileri 3.2.2. Çimlenme (Germ Tüp Oluşturma) Deneyi Test edilecek koloniden öze ile bir miktar alınıp tüp içindeki 1 ml insan serumu içinde süspansiyon haline getirildi. 37ºC de 2,5-3 saat inkübe edildikten sonra süspansiyondan bir damla alınıp lam-lamel arası preparat hazırlanarak mikroskopta x400 büyütmede incelendi(70). İncelemede ana hücreden orjin alan ve başlangıç noktasında boğumlanma yapmaksızın ve uzunluğu boyunca belirgin kabarıklık olmayan, flament şeklinde uzantılar gösteren yapılar germ tüp olarak değerlendirildi ve incelenen suşun C. albicans olduğuna karar verildi. Mikroskobik incelemede germ tüpe benzeyen ancak ana hücreden boğumlanarak dışa doğru uzama gösteren hifal yapıların duvarlarının birbirine paralellik göstermediği yalancı germ tüp oluşumları da gözlendi. İleri idantifikasyonda bu oluşumların C. tropicalis e ait oldukları saptandı (36,60,67,100,101). Şekil 31 ve 32 de sırasıyla C.albicans a ait germ tüp yapıları ve C.tropicalis e ait pseudo germ tüp yapıları gösterilmiştir. 68

Şekil 31. C.albicans germ tüp (+) Şekil 32. C. tropicalis; çimlenme borusuna benzeyen uzamış yalancı hifimsi hücreler ve borucuğun maya hücresinden boğumlanarak çıktığı kısım 3.2.3. CHROM Agar Candida (Kromojenik Besiyeri) ya Ekim İdantifikasyon için CHROMagar Candida (BBL,Becton Dickenson, France) toz besiyeri kullanıldı. Üretici firma önerileri doğrultusunda hazırlanan besiyeri kullanılıncaya kadar +4 C de saklandı. Bu işlemin amacı kandidaların bu besiyerlerinde üreyerek oluşturdukları koloni renkleri yardımıyla ayırt edilmesidir. Çalışılacak suşlar ve standart suş (C.albicans ATCC 90028) bir gün önceden çözülerek SDA a pasajlandı. 24 saatlik inkübasyondan sonra elde edilen taze suşlardan CHROMagar Candida ya ekim yapıldı. İdantifikasyon için ekimi yapılan suşlar 37 ºC de 48-72 saat inkübe edildi. 24, 48 ve 72 saatlik inkübasyonlardan sonra kör olarak üç farklı kişi tarafından koloni rengi, morfolojisi ve etrafında hale varlığı dikkate alınmak suretiyle değerlendirildi. 69

Tüm suşların 24 saatlik inkübasyon sonucunda ürediği ve renklerinin ayırd edilebildiği, ancak 48 saatlik inkübasyon ile koloni renginin ve etrafında oluşan halenin daha net olarak izlendiği saptanmıştır. C.albicans ATCC 90028 standart suşunun CHROMagar Candida da yeşil renkli, düzgün koloniler oluşturduğu görüldü. CHROMagar Candida da ; Yeşil renkli, düzgün koloniler : C. albicans Açık pembe, basık koloniler : C. krusei Koyu pembe-menekşe koloniler : C. glabrata Kirli beyaz, krem renkli koloniler : C. kefyr Metalik mavi koloniler : C. tropicalis Parlak beyaz koloniler: C.parapsilosis Pembe yayılan tüylü koloniler : C. lypolitica lehine değerlendirildi (96,101). Şekil 33 te CHROMagar Candida da üreyen bazı kandida türleri gösterilmiştir. Şekil 33. CHROMagar Candida da kolonilerin görünümü 70

3.2.4. API 20C AUX Tiplendirme Sistemi ile idantifikasyon CHROMagar Candida daki koloni rengi ve morfolojilerine göre non albicans olduğu saptanan 40 kandida suşu, idantifikasyon sonuçlarının karşılaştırılması için eş zamanlı olarak hızlı idantifîkasyon sağlayan ticari kitlerden API 20C AUX (biomerieux, France) kullanılarak da test edildi. API 20C AUX; 19 karbonhidrat asimilasyon testinin hazırlandığı 20 mikrokuyucuk içerir. Test edilen karbonhidratlar: glukoz, gliserol, 2-keto-D-glukonat, L- arabinoz, D-ksiloz, adonitol, ksilitol, galaktoz, inositol, sorbitol, α-metil-dglukozid, asetil-d-glukozamin, selobiyoz, laktoz, maltoz, sükroz, trehaloz, melibiyoz ve rafinozdur. Mayalar inoküle edildikleri kuyucuktaki karbonhidratı karbon kaynağı olarak kullanıyorlarsa, o kuyucukta üreme olur. API 20C AUX'la mayaların karbonhidrat asimilasyon yetenekleri 24., 48. ve 72. saatte değerlendirilerek sonuç verilir. Testin Uygulanması: 1. Stripin hazırlanması: İnkübasyon kabının içindeki kuyucuklar 5 ml distile su ile dolduruldu ve strip paketi açılarak içine yerleştirildi. 2. İnokülasyon: SDA'daki 24 saatlik taze kandida kolonilerinden steril bir öze ile alınıp, 2 ml 'lik Suspension Medium (%0.85 NaCl) içinde karıştırılarak yoğunluğu 2 McFarland olacak şekilde ayarlandı. Bu süspansiyondan, kit içeriğinde olan C medium içine l00 µl aktarıldı. Bu süspansiyondan stribin içinde bulunduğu kuyucuklara dolacak fakat taşmayacak şekilde dağıtıldı. Strip inkübasyon kabının içine yerleştirilip, kapağı kapatıldı ve 30 C'de 24-72 saat inkübasyona bırakıldı. 3. Stribin okunması: Bulanıklık olan kuyucuklarda üreme pozitif kabul edildi. Negatif kontrolde üremenin olmamasına dikkat edildi. Özellikle glukoz kuyucuğunda üreme yoksa inkübasyon süresi 24 saatten 72 saate kadar uzatıldı. Üreme olan kuyucuklar not edildi. 4. İdantifikasyon: Test prosedürüne göre üreme olan kuyucuklara 71

değerlendirme cetvelinde 1,2,4 gibi numaralar verildi. Her bir grup içindeki sayılar toplandı ve sayısal profil elde edildi. Hif oluşumu için de 4 sayı eklendi. Elde edilen sayısal profil, API 20C AUX Analytical Profile Index'e göre değerlendirildi (API 20C AUX, biomerieux, France, kit prosedürü). 3.3. Antifungal Duyarlılık Testi Çalışmaya alınan kandida suşları ve C.albicans ATCC 90028 standart suşunun Amfoterisin B ve vorikonazole antifungal duyarlılığı E test yöntemi ile araştırıldı. 3.3.1. E test 3.3.1.1. Antifungal ajanlar Bu yöntemde Amfoterisin B ve Vorikonazolün 0.002-32 µg/ml arasında değişen konsantrasyonlardaki E test antifungal gradient stripleri (AB Biodisk, Solna, Sweden ) kullanıldı. E test stripleri kullanılıncaya kadar -20 C de saklandı. 3.3.2. Besiyeri Besiyeri olarak MOPS (morfolinopropan sülfonik asit) (Sigma Chemical Co, St Louis,MO,USA) ile tamponlanmış RPMI 1640 (L-glutaminli, sodyum bikarbonatsız) (Sigma Chemical CO,St Lois,MO,USA) toz besiyeri kullanıldı. 3.3.2.1. MOPS tamponlu RPMI 1640 agar besiyerinin hazırlanması 1) 34,53 g MOPS 1 lt distile suda çözüldü. (0,165 M) 2) 15 g agar (BBL,Becton Dickenson, France), 450 ml 0,165 M MOPS ilave edilerek eritildi ve 1 M NaOH ile ph 7.0 a ayarlandı. Son hacim 72

MOPS buffer ile 500 ml ye tamamlandı. Otoklavda 121 C de 15 dakika steril edildi. 3) 10,4 g RPMI 1640 toz besiyeri ve 18 g glukoz 450 ml 0,165 M MOPS ilave edilip eritildi ve 1M NaOH ile ph 7,0 a ayarlandı. Son hacim MOPS buffer ile 500 ml ye tamamlandı. Hazırlanan besiyeri 0,22 µm çaplı membran filtrelerden (Sartorius Stedim Biotech GmBH, Germany) geçirilerek sterilize edildi. 4) İki solüsyon karıştırılarak hazırlanan besiyeri 90 mm çapındaki petrilere yüksekliği 4-5 mm olacak şekilde yaklaşık 25 er ml dağıtıldı. 5) Kullanılıncaya kadar +4 ºC de saklandı. 3.3.3. Maya inokülumunun hazırlanması Test öncesi tüm suşlar SDA besiyerine pasajlanıp, 35 C'de inkübasyona bırakıldı. 24 saatlik taze kültürden 1 mm çaplı yaklaşık beş koloni alınarak 5 ml steril % 0.85 NaCl içinde homojen süspansiyon hazırlandı. Bu süspansiyon yaklaşık 15 saniye vortekslendikten sonra 0,5 McFarland bulanıklığa ayarlandı. Bu işlemle hazırlanan maya süspansiyonunun her mililitrede 1-5 x l0 6 hücre içermesi amaçlandı. 3.3.4. İnokülasyon, inkübasyon ve değerlendirme; 0.5 McFarland bulanıklığında hazırlanan maya süspansiyonu, pamuk uçlu steril eküvyon çubuklarla 90 mm çaplı RPMI 1640 agar plaklarına yayıldı. Plakların kuruması için yaklaşık 15 dakika oda ısısında bekletildikten sonra her iki antifungal strip (Amfoterisin B ve Vorikonazol) tek plakta olacak şekilde yerleştirildi. Plakların etrafı, nemin korunması için parafinle kapatıldı. Tüm plaklar 35 C'de 24-48 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonunda oluşan inhibisyon elipsleri değerlendirilirken, üretici firma ve CLSI önerileri doğrultusunda Amfoterisin B için üremenin tam inhibe olduğu (%100 inhibisyon) değer; Vorikonazol için ise üremenin %80 inhibe olduğu değer, o antifungal için MiK değeri olarak kabul edildi. (36). 73

Şekil 34 te RPMI 1640 agar plağında Amfoterisin B ve Vorikonazol E test striplerinin etrafında oluşan inhibisyon elipsleri gösterilmiştir. Şekil 34. E test yönteminde Amfoterisin B ve vorikonazol için inhibisyon elipsleri 74

4. BULGULAR Çalışmamızda kan, kateter, BOS, periton mayi, plevra mayi, safra mayi gibi steril vücut sıvılarından izole edilen 89 kandida suşu ve 1 standart suş (C.albicans ATCC 90028) olmak üzere toplam 90 suş kullanılmıştır. 4.1. Çalışmaya alınan kandida suşlarının idantifikasyon sonuçları: Germ tüp testi, CHROMagar Candida daki koloni rengi ve API 20C AUX Tiplendirme Sistemi ile tür düzeyinde tanımlanan 89 kandida suşunun 49 unu (%55,05) C.albicans ın, 40 ını (%44,95) ise non albicans türlerin oluşturduğu görüldü. Tablo 6 da çeşitli klinik örneklerden soyutlanan 89 kandida kökeninin izole edildiği materyaller ile C.albicans ve non albicans olmak üzere dağılımı gösterilmiştir. Tablo 6. Çeşitli klinik örneklerden soyutlanan 89 kandida kökeninin C.albicans ve non albicans olmak üzere dağılımı Candida türü Materyal Candida albicans Candida spp. Toplam Kan 32 24 56 ( % 62,9) Kateter 9 3 12 (% 13,4) BOS - 3 3 (% 3,37) Periton mayi 6 5 11 (% 12,35) Plevra mayi - 1 1 (% 1,12) Safra mayi 2 4 6 (% 6,74) 75

Germ tüp testi, CHROMagar Candida daki koloni rengi ve API 20C AUX tiplendirme sistemi ile tür düzeyinde tanımlanan 89 kandida suşundan 49 unun (%55,05) C.albicans, 21 inin (%23,59) C.tropicalis, 8 inin (%8,98) C.glabrata, 6 sının (%6,74) C.parapsilosis ve 5 inin (%5,61) C.kefyr olduğu görüldü. Şekil 35 te çeşitli kinik örneklerden izole edilen kandidaların türlere göre dağılımı gösterilmiştir. C.parapsilosis 6,74% C.kefyr 5,61% C.glabrata 8,98% C.tropicalis 23,59% C.albicans 55,08% C.albicans C.tropicalis C.glabrata C.parapsilosis C.kefyr Şekil 35. Klinik örneklerden izole edilen kandidaların türlere göre dağılım İzole edilen suşlardan C.albicans; kandan (%57,1), kateterden (%75) ve peritondan (%54,5) birinci sıklıkta soyutlanan tür olurken, C.tropicalis; kan (%19,6) ve kateterden (%25) ikinci sıklıkta soyutlanan tür olarak saptanmıştır., C.tropicalis ayrıca BOS tan izole edilen türler arasında birinci sırada yer almış ve peritonda (%18,2) C.glabrata ile eşit oranda, safrada ise (%33,3) C.albicans la eşit oranda soyutlanan tür olmuştur. Tablo 7 de 76

idantifiye edilen kandida suşlarının izole edildikleri yerlere ve türlere göre dağılımı gösterilmiştir Tablo 7. İdantifiye edilen kandida suşlarının izole edildikleri yerlere ve türlere göre dağılımı Candida Kan Kateter BOS Periton Plevra Safra Toplam türleri n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) C.albicans 32 57,1 9 75,0-0,0 6 54,5 - - 2 33,3 49 55,0 C.tropicalis 11 19,6 3 25,0 2 66,7 2 18,2 1 100 2 33,3 21 23,5 C.glabrata 5 9,0-0,0-0,0 2 18,2 - - 1 16,6 8 8,98 C.parapsilosis 4 7,1-0,0-0,0 1 9,1 - - 1 16,6 6 6,74 C.kefyr 4 7,1-0,0 1 33,3-0,0 - - - 0,0 5 5,61 Toplam 56 100 12 100 3 100 11 100 1 100 6 100 89 100 4.2.Çalışmaya alınan kandida suşlarının antifungal duyarlılık sonuçları: Çalışmamızda izole ettiğimiz 89 kandida suşunun Amfoterisin B için saptanan MİK aralıkları; C.albicans için 0,008-0,5 µg/ml, C.tropicalis için 0,006-0,50 µg/ml, C.glabrata için 0,023-0,125 µg/ml, C.parapsilosis için 0,008-0,25 µg/ml, C.kefyr için 0,016-0,125 µg/ml ; Vorikonazol için saptanan MİK aralıkları; ; C.albicans için 0,094-0,5 µg/ml, C.tropicalis için 0,016-0,064 µg/ml, C.glabrata için 0,032-0,125 µg/ml, C.parapsilosis için 0,023-0,19 µg/ml, C.kefyr için 0,016-0,125 µg/ml olarak belirlenmiştir. Çalışmamızda hiçbir suşta Amfoterisin B ve vorikonazol için dirençlilik tespit edilememiştir. Sonuç olarak hastanemizde nozokomiyal infeksiyon etkeni olan tüm kandida suşları Amfoterisin B ve Vorikonazole duyarlı bulunmuştur. 77

Tablo 8 de izole edilen kandida suşlarının test edilen edilen antifungallere göre MİK değer aralıkları gösterilmiştir. Tablo 8. İzole edilen kandida suşlarının Amfoterisin B ve vorikonazol için saptanan MİK değer aralıkları C.albicans n (49) C.tropicalis n (21) C.glabrata n (8) C.parapsilosis n (6) C. kefyr n (5) C.albic * Antifungal MİK aralığı µg/ml MİK aralığı µg/ml MİK aralığı µg/ml MİK aralığı µg/ml MİK aralığı µg/ml MİK µg/m Amfoterisin B 0,008-0,50 0,006-0,50 0,023-0,125 0,008-0,25 O,016-0,125 0,25 Vorikonazol 0,094-0,50 0,016-0,064 0,032-0,125 0,023-0,19 0,016-0,125 0,00 *C.albicans ATCC 90028 için ; Amfoterisin B MİK aralığı: 0,125-0,5 µg/ml Vorikonazol MİK aralığı: 0,004-0,016 µg/ml 78

5. TARTIŞMA ve SONUÇ Uzun yıllar sadece hematolojik malignitesi olan ya da transplant yapılmış, immunsupresse hastalarda gelişen infeksiyonların etkeni olarak anılan mantarlar günümüzde hemen tüm hastanelerde ve kliniklerde yatan hastalarda gittikçe artan sıklıkta infeksiyon etkeni olarak karşımıza çıkmaktadır. Epidemiyolojiyi değiştiren faktörlerin başında; organ veya doku naklinin gelişmesi, invaziv girişimlerin ve majör cerrahilerin daha sık yapılması, yaşam sürelerinin uzaması ile yaşlı ve düşkün hasta popülasyonunun artması, malign hastalıklar nedeniyle kemik iliğine toksik kemoterapötiklerin daha sık kullanılması, yoğun bakım ünitelerinin yaygınlaşması ile yaşam destek ünitelerine bağlı hasta sayısının artması, AIDS hastalığının hızla yayılmasının yanı sıra antibiyotik ve antifungal ajanların yaygın kullanımları da sayılabilir. Bu durum, en az bakteriyel patojenler kadar mortalite ve morbidite nedeni olan mantarların da önemini arttırmıştır. Mantarlar içinde son yirmi yılda mayalarla oluşan infeksiyonların sıklığında belirgin bir artış olmakla birlikte, mukozal tutulumdan invaziv infeksiyona kadar geniş bir yelpazede hastalık oluşturan kandidalar; özellikle immun sistemi baskılanmış, uzun süreli intravenöz tedavi ve total parenteral nutrisyon alan hastalarda nozokomiyal infeksiyon etkenleri arasında altıncı, hematojen infeksiyon etkenleri arasında ise dördüncü sırada yer almaktadır (45, 52,102). Mantar infeksiyonlarında görülen artışla birlikte, bu infeksiyonlara neden olan türlerin çeşitliliğinde de değişiklikler görülmeye başlanmıştır. Endojen kaynaklı olması nedeniyle hala nozokomiyal fungal infeksiyonlarda ilk sırayı C.albicans almakla birlikte antifungal tedaviye daha zor yanıt verdiği bilinen C.tropicalis, C.lusitaniae, C. krusei, C.glabrata, C.parapsilosis gibi nonalbicans türlerle karşılaşma oranı da giderek artmaktadır. Bu nedenle

türlerin idantifikasyonu ve direnç profillerinin belirlenmesi de oldukça önem taşımaktadır (103). Bir taraftan sıklığı her geçen gün artan fungal infeksiyonlar önem kazanırken, diğer taraftan ilaç sanayi araştırma-geliştirme faaliyetleri de son 20 yılda antifungal ajanlar üzerinde yoğunlaşmış ve bugün sistemik fungal infeksiyonların tedavisi iki seçenekli basit bir soru olmaktan çıkmış, etkinliği kanıtlanmış ajanlar arasından en etkin olanın seçimine doğru yol almıştır. Bu defa hekimin karşısına çıkan hangi hastaya tedavi vermeli sorusunun yanıtı da hem tanı testleri hem de yeni tedavi yaklaşımlarını tartışılır hale getirmiştir. Kandida türleri normalde insan deri ve mukoza florasında bulunan mikroorganizmalardır. Normal bireylerin % 30-50 sinin ağız ve gastrointestinal sisteminde bulunurlar ve bazı hazırlayıcı faktörlerin varlığında kandidiyazis olarak tanımlanan ciddi infeksiyonların gelişiminde rol oynarlar (104). Mayaların normal flora elemanı olmaları nedeniyle infeksiyon etkeni olup olmadığı konusunda tanıda zorluklar yaşanabilir ve zaman zaman tanı konmakta geç kalınmış olabilir. Bu nedenle nozokomiyal infeksiyon etkenlerinin doğru tespiti, türlerin ayrımı ve antifungal duyarlılık testlerininin yapılması gün geçtikçe zorunluluk haline gelmektedir. Ancak tedavide seçilen antifungallerin in vitro duyarlılığı her zaman in vivo koşullardaki duyarlılık ile uyumlu olmayabilir. Hastane infeksiyonları arasında kandida kaynaklı olanlar gittikçe artan oranda görülmeye başlamış olup, bu oranın araştırıldığı çeşitli çalışmalar incelendiğinde; İnan ve Çakmakçı; bakteriyel ve fungal etkenler arasında kandida türlerinin yoğun bakım ünitesinde %7-17.1 oranında olduğunu, Bengisun ve arkadaşları; sepsis etkenleri içerisinde kandida türlerini üçüncü sırada saptadıklarını, Kızırgil ve arkadaşları; kan kültürlerinden izole edilen mikroorganizmaların % 11.5 ini, Durmaz ve arkadaşları; % 15.1 ini kandida türlerinin oluşturduğunu, Tekerekoğlu ve arkadaşları ise % 6 sını kandida türleri olarak idantifiye ettiklerini bildirmişlerdir (120-124). 80

Hastanemizde 2007 yılında yapılan nokta prevalans çalışmaları sonucu elde edilen verilere göre nozokomiyal infeksiyon etkenleri arasında kandidalar %17,4 lük oran ile Acinetobacter sp., E.coli ve P.aeruginosa dan sonra dördüncü sırada yer almakta ve bunların %30 unu C.albicans, %70 ini ise non albicans türler oluşturmaktadır. Son yıllarda tüm dünyada non albicans kandida türlerinin sıklığındaki belirgin artışa paralel olarak çalışmamızda izole edilen kandida suşları arasında non albicans türlerin sıklığı dikkat çekicidir. Yapılan çalışmalarda izole edilen kandidaların kan kültürlerindeki dağılımı incelendiğinde; Sandven ve arkadaşları; 1991 1996 yılları arasında kandidiyazis etkeni olarak izole ettikleri 576 kökenin % 66.6 sını C. albicans, diğerlerini sırasıyla C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. guillermondii ve diğer türler olarak saptamışlardır (106). Pfaller ve arkadaşları; Amerika Birleşik Devletleri, Kanada ve Güney Amerika yı kapsayan 34 merkezde yaptıkları araştırmada tespit ettikleri 306 kandidiyazis etkeninin, % 53.3 ünü C.albicans, diğerlerini sırasıyla C. parapsilosis, C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei, C.guillermondii ve diğer türler olarak belirlemişlerdir. ABD de nonalbicans türler % 43.8 oranında saptanmış ve en sık olarak C.glabrata (%18.7) belirlenmiştir. Kanada da % 47.5 ile ilk sırayı C. parapsilosis (%22.9) alırken, Güney Amerika da ise yine % 59.5 ile ilk sırayı C. parapsilosis in (%38.1) daha sonra C. tropicalis (%11.9) in aldığı bildirilmiştir (107). Pfaller ve arkadaşları; yaptıkları diğer bir çalışmada kan kültürlerinden izole ettikleri 2047 kandida suşunun % 54 ünü C. albicans, % 16 sını C. glabrata, % 15 ini C. parapsilosis, % 10 unu C. tropicalis, diğerlerini sırasıyla C. krusei, C. guillermondii, C. lusitaniae olarak saptamışlardır (108). 81

Canton ve arkadaşları; çalışmalarında kandidiyazis etkeni olan 143 suşun % 45.5 ini C.albicans, % 40.5 ini C.parapsilosis, diğerlerini ise C.tropicalis, C. glabrata ve C. krusei olarak tespit etmişlerdir (109). Nguyen ve Yu; kandidiyazis etkeni olan 95 kandida suşunun % 41 ini C.albicans, % 22 sini C.glabrata, % 20 sini C.tropicalis, diğerlerini sırasıyla C.parapsilosis, C.lusitaniae, C.krusei olarak tespit etmişlerdir (110). Godoy ve arkadaşları; Latin Amerika hastanelerindeki kan kültürlerinden izole ettikleri 103 kandida suşunun % 42 sini C.albicans, % 24.2 sini C.tropicalis, % 21.3 ünü C.parapsilosis geri kalanını ise C.glabrata, C.guillermondii ve C. lusitaniae olarak belirlemişlerdir (111). Estrella ve arkadaşları; İspanya da yaptıkları çalışmada kan kültürlerinden izole ettikleri 351 kandida suşunun % 51 ini C. albicans, % 23 ünü C. parapsilosis, % 10 unu C. tropicalis geri kalanını sırasıyla C. glabrata, C. krusei, C. kefyr, C. lusitaniae, C. guillermondii, C. inconspicua, C. norvegensis ve C. dublinensis olarak belirlemişlerdir (112). Knoke ve arkadaşları 1992-1995 yılları arasında kan kültürlerinden izole edilen C. albicans ın %76 dan %54,4 e düştüğünü, bunun yanında non albicans türlerden C.glabrata nın izolasyonunda %11,7 den %28,4 e artış olduğuna dikkat çekmişlerdir (125). Ülkemizde yapılan çalışmalar incelendiğinde ise; Ermertcan; kan kültürlerinden izole ettiği 60 kökenin % 45 ini C. albicans, % 38.3 ünü C. tropicalis ve % 16.6 sını C. parapsilosis olarak bildirmiştir (113). Vural ve arkadaşları; kan kültürlerinden izole ettikleri 30 kökenin % 50 sini C.albicans, % 27 sini C.tropicalis ve geri kalanını diğer türler olarak belirlemişlerdir (114). 82

Yücesoy ve Yuluğ; nozokomiyal kandidiyazis etkeni olarak izole ettikleri 40 kandida suşunun % 60 ını C.albicans, diğerlerini C.parapsilosis, C.tropicalis, C. guillermondii ve C. lypolitica olarak belirlemişlerdir (115). Kurt ve arkadaşları; kan kültürlerinden izole ettikleri 50 kandida suşunun % 60 ını C.albicans, % 18 ini C.parapsilosis, % 10 unu C.tropicalis ve C.krusei, C.kefyr, C.lusitaniae, C.famata ve C.glabrata olarak bildirmişlerdir (116). Çalışmamızda başta kan olmak üzere steril vücut sıvılarından izole edilen 89 kandida suşu ve bir standart suş (C.albicans ATCC 90028) olmak üzere 90 kandida suşu kullanılmıştır. Kullanılan suşlar klasik germ tüp testi, CHROMagar Candida ve API 20C AUX kiti ile tür düzeyinde idantifiye edilmiş ve tüm suşların 49 unun (%55,05) C.albicans, 21 inin (%23,59) C. tropicalis, 8 inin (%8.98) C. glabrata, 6 sının (%6,74) C. parapsilosis ve 5 inin (%5.61) C. kefyr olduğu tespit edilmiştir. Çalışmamızda yer alan kandida suşlarının % 62,9 u kan kültürlerinden, %37,1 i ise steril vücut sıvılarından izole edilmiştir. Kan kültürlerinden izole edilen kandidaların %57,14 C.albicans, % 42,85 i ise non albicans türler olarak saptanmıştır. Kan kültürlerinden izole edilen non albicans türler sırasıyla; C.tropicalis (%19,6), C.glabrata (%9,0), C.parapsilosis (%7,1) ve C.kefyr (%7,1) olarak belirlenmiştir. Kateterden izole edilen suşlar; C.albicans (%75), C.tropicalis (%25) olarak, peritondan izole edilen suşlar C.albicans (%54,5), C.tropicalis (%18,2), C. glabrata (%18,2) ve C.parapsilosis (%9,1) olarak sptanmıştır. Bu oranlar Amerika ve Avrupa da yapılan çalışmalarla benzer dağılım oranları olduğunu göstermiştir. Çeşitli ülkelerde yapılan çalışmalar, kan kültürlerinden izole edilen maya türlerinin dağılımında büyük farklılıkların olduğunu ortaya çıkarmıştır. Amerika da türlerin %50 den fazlasını C. albicans oluştururken, Güney Afrika da bu oran %42, Brezilya da ise %20 olarak bildirilmiştir (108). 83

Çalışmamızda kandidaların idantifikasyonunda öncelikle klasik germ tüp testi kullanılmıştır. Germ tüp testi C.albicans' ın hızlı idantifikasyonu için yıllardır kullanılan ve bugün de değerini koruyan, basit ve oldukça duyarlı bir testtir. Yapılan çalışmalarla C.albicans suşlarının %95-97'sinin germ tüp pozitif olduğu saptanmıştır (16). Germ tüp testi ile klinik materyalden izole edilen mayaların, ilk aşamada albicans veya nonalbicans olmak üzere ayrımları yapılabilmekte ve bu da antifungal tedaviye başlanacak ajanın seçilmesinde yol gösterici olabilmektedir. Germ tüp testi ile C.albicans dışındaki türlerin idantifikasyonunun yapılamaması bir dezavantajdır. Çabuk ve kolay idantifikasyon için bir diğer yöntem kromojenik besiyerlerinin kullanılmasıdır. Albicans ID, Candiselect, Candichrom albicans, CHROMagar Candida gibi çeşitli kromojenik besiyerleri ticari olarak mevcuttur (22). Yapılan çalışmalara göre kromojenik besiyerlerinin C.albicans suşlarında 48 saatte üretme ve ayırdetmedeki duyarlılığı ve özgüllüğü %88-100 arasında değişmektedir (22,101,104). Çalışmamızda CHROMagar Candida da üreyen kandidalar koloni rengi ve morfolojisine göre tiplendirilmiş olup; yeşil renkli, düzgün koloniler; C. albicans, metalik mavi koloniler; C. tropicalis, koyu pembe-menekşe koloniler; C. glabrata, parlak beyaz koloniler; C.parapsilosis, kirli beyaz, krem renkli koloniler ise C. kefyr olarak idantifiye edilmiştir. Günümüz araştırmalarında standart idantifikasyon yöntemlerinin yerini karbonhidrat asimilasyon esasına dayanan ve 48-72 saatte tanımlama yapabilen ticari kitler almasına karşın, oldukça pahalı olan bu sistemlere çeşitli araştırmalarda referans test olarak başvurulmaktadır. Yaptığımız çalışmada, germ tüp negatif olan ve CHROMagar Candida da nonalbicans tür olarak tanımlanan suşlar ayrıca ticari bir tiplendirme kiti olan ve karbonhidrat asimilasyonuna dayanan API 20C AUX ile eş zamanlı olarak idantifiye edilmiş ve bu işlemler sonucunda isimlendirilemeyen suş olmamıştır. CHROMagar Candida ve API 20C AUX 84

tiplendirme kiti ile elde edilen idantifikasyon sonuçları arasında %100 e varan oranlarda uyumluluk saptanmıştır. CHROMagar Candida nın kullanımının kolay olması, çabuk sonuç vermesi, renk ayrımına göre değerlendirilebilmesi ve maliyetinin düşük olması rutin laboratuvar çalışmalarında kullanılabileceğini göstermiştir. Fungemi etkeni olan kandida türlerinin tanımlanmasında laboratuar iş akışında germ tüp, mısır unlu-tween 80 agar, API idantifikasyon panelleri sırası izlendiği takdirde pozitif sinyal veren ve maya hücresi saptanan şişeden ekim yapılan ilk gün SDA da üreyen kolonilerin saf olduğu varsayıldığında, C.albicans suşları yaklaşık olarak en erken 24-48 saatte tanımlanabilecektir. Albicans dışı türlerde ise tür düzeyinde tanımlama sadece konvansiyonel yöntemlerle en erken 48-72 saat sonra yapılabilecektir. API kullanımına başvurulduğu takdirde bu süreye 24 saatlik bir süre daha eklenebilir. Oysa maya hücresi saptanan pozitif şişeden doğrudan CHROMagar Candida besiyerine ekim yapılacak olursa klinik olarak sıklıkla izole edilen suşların yaklaşık %90 dan fazlası sadece SDA da maya kolonilerinin üremesi için geçen süre olan 24 saat sonra tür düzeyinde tanımlanabilecektir. Ayrıca polimikrobiyal üremelerin farkına varmak daha kolay olacaktır. Fungemi tanısıyla yatan hastalara doğru sonucun hızla ulaştırılmasının sağlanabileceği bu iş akışında CHROMagar Candida besiyeri API idantifikasyon panellerine göre daha fazla kullanılacağından laboratuvar maliyeti de azalacaktır. Bu yöntemlerle ayırtedilemeyen türlerin referans laboratuvarlarda idantifikasyonunun faydalı olacağı düşünülmektedir. Kan kültürleri ve steril vücut sıvılarında üreyen mayaların primer izolasyonu ve idantifikasyonu için CHROMagar Candida besiyerinin kullanımı klinik olarak önemli kandida türlerinin izolasyonuna izin vermesi, laboratuvar iş yükünü ve maliyetini düşürmesi ve daha önemlisi klinisyenlere antifungal ajan seçimini hızla yaptırarak hasta mortalite ve morbiditesini düşürmesi açısından önemlidir. Sonuç olarak CHROMagar Candida kullanımının, 85

kandida türlerinin ve özellikle C.albicans, C.tropicalis ve C.krusei suşlarının tanımlanmasında kolay, hızlı ve objektif bir yöntem olduğu düşünülmektedir. Sistemik mantar infeksiyonları immun sistemi baskılanmış hastalarda önemli morbidite ve mortalite sebebi olup, uygun antifungallerle tedavi edilmesi gerekir. Son yıllarda kandida infeksiyonlarının insidansındaki artışa paralel olarak pek çok yeni antifungal ajan kullanıma girmiş ve bunların profilaksi ve tedavide kullanımları giderek yaygınlaşmıştır. Özellikle triazol grubu antifungal ajanların sık kullanılması ile hem C. albicans dışındaki türlerde artış hem de antifungal ajanlara dirençte artış saptanmıştır. Klinik olarak bütün bunların sonucunda antifungal ajanların invitro duyarlılıklarını ölçen testlerin önemi artmış ve buna yönelik çalışmalar yoğunlaşmıştır. Çalışmamızda izole ettiğimiz ve tiplendirdiğimiz kandida kökenlerinin, hastanemizde antifungal tedavide sıkça kullanılan Amfoterisin B ve Vorikonazole karşı in vitro antifungal duyarlılıkları E test yöntemi ile çalışılarak, MIK değer aralıklarının CLSI da belirlenen duyarlılık ve dirençlilik sınırları dikkate alınarak belirlenmesi amaçlanmıştır. Kalkancı ve arkadaşları; hemotolojik malignensili ve nötropenisi olan hastalardan izole ettikleri 111 kandida suşunun antifungal duyarlılığını araştırmışlar ve sonuç olarak flukonazol için C. glabrata, C. tropicalis ve C. krusei de yüksek MIK değerleri tespit etmişlerdir. Vorikonazol için bütün kandida suşlarında MIK aralığını 0.07-2 µg/ml arasında tespit etmişlerdir(126). Cuenca-Estrella ve arkadaşları; İspanya da yaptıkları bir çalışmada kan kültüründen izole ettikleri kandida suşlarının altı antifungal ajana duyarlılıklarını mikrodilüsyon yöntemiyle araştırarak, MIK aralığı ve MIK 90 değerlerini sırasıyla, amfoterisin B için; C. albicans ta 0.03-0.25mg/L ve 0.12 mg/l, C. parapsilosis te 0.03-0.25mg/L ve 0.25mg/L, C. tropicalis te 0.06-0.5mg/L ve 0.12mg/L, C. glabrata da 0.03-0.5mg/L ve 0.25 mg/l, C. 86

krusei de 0.25-0.5mg/L ve 0.5mg/L, flukonazol için; C. albicans ta 0.125-8mg/L ve 0.25mg/L, C. parapsilosis te 0.125- > 64mg/L ve 1mg/L, C. tropicalis te 0.125- > 64mg/L ve 0.5 mg/l, C. glabrata da 2- > 64mg/L ve 16 mg/l, C. krusei de 32- > 64µg/ml ve 64µg/ml, vorikonazol için; C. albicans ta 0.01-0.5mg/L ve 0.01mg/L, C. parapsilosis te 0.01-0.5mg/L ve 0.03mg/L, C. tropicalis te 0.01-8µg/ml ve 0.06µg/ml, C. glabrata da 0.06-2µg/ml ve 0.5µg/ml, C. krusei de 0.25-1mg/L ve 0.5mg/L, kaspofungin için; C. albicans ta 0.01-1mg/L ve 0.25mg/L, C. parapsilosis te 0.125-2mg/L ve 1mg/L, C. tropicalis te 0.01-2mg/L ve 0.25mg/L, C. glabrata da 0.06-0.5mg/L ve 0.5mg/L, C. krusei de 0.5-2mg/L ve 1mg/L olarak bildirmişlerdir. Çalışma kapsamına alınan 351 suştan sadece 24 tanesinde flukonazol için MIK değeri 16mg/L olarak belirlenmiştir. Bunlardan 18 tanesi doza bağımlı duyarlı, 6 tanesi ise dirençli olarak tespit edilmiştir. Bu 24 suş için amfoterisin B, vorikonazol ve kaspofungin ile düşük MIK değerleri tespit edilmiştir. Çalışılan bütün suşlar için amfoterisin B ile genel MIK aralığı 0.03-0.5 mg/l olarak tespit edilmiş ve bunların içinde en yüksek MIK değerlerini C. krusei göstermiştir. Kaspofungin için sadece 19 suşta MIK değeri 1mg/L olarak tespit edilmiştir. Vorikonazol için; sadece 3 suşta MIK değeri 1mg/L olarak tespit edilmiştir. Bu 3 suş C. albicans, C. tropicalis ve C. glabrata olarak bildirilmiştir (115). Swinne ve arkadaşları çoğunluğunu kan kültüründen izole ettikleri 193 non albicans suşun antifungal duyarlılıklarını mikrodilüsyon yöntemiyle araştırarak, MIK aralıkları, MIK 50 ve MIK 90 değerlerini sırasıyla, amfoterisin B için; C. glabrata da 0.5-2µg/ml, 1 ve 2µg/ml, C. parapsilosis de 0.5-2µg/ml, 1 ve 2µg/ml, C. tropicalis te 1-2µg/ml, 1 ve 2µg/ml, C. krusei de 0.25-2µg/ml, 1 ve 1µg/ml, C. lusitaniae da 0-5- 1µg/ml, 0.5 ve 1µg/ml, flukonazol için; C. glabrata da 4-> 64µg/ml, 16 ve 64µg/ml, C. parapsilosis te 0.25-64µg/ml, 1 ve 2µg/ml, C. tropicalis te 0.5-> 64µg/ml, 1 ve 4µg/ml, C. krusei de 32-> 64µg/ml, 64 ve > 64µg/ml, C. lusitaniae da 0.13-1µg/ml, 0.25 ve 1µg/ml, vorikonazol için; C. glabrata da 0.13-4µg/ml, 0.25 ve 2µg/ml, C. parapsilosis te 0.008-0.25µg/ml, 0.016 ve 0.063µg/ml, C. tropicalis te 0.032-87

16µg/ml, 0.063 ve 0.5µg/ml, C. krusei de 0.25-2µg/ml, 0.5 ve 1µg/ml, C. lusitaniae da < 0.008-0.016µg/ml, 0.008 ve 0.016µg/ml olarak tespit etmişlerdir. Flukonazol için direnç gelişimi en çok C. glabrata ve C. krusei de bildirilmiştir. Çalışılan bütün suşlarda vorikonazol için MIK değerini %94 oranda 1µg/ml olarak saptamışlardır. Vorikonazol için duyarlılık oranlarını en yüksek C. parapsilosis ve C. lusitaniae da, en düşük ise C. glabrata da bildirmişlerdir. Ayrıca elde ettikleri sonuçların vorikonazol ün amfoterisin B ye dirençli maya infeksiyonlarının tedavisinde etkin olabileceğini belirtmişlerdir(127). Rubio ve arkadaşları vorikonazol ün kandida suşlarına karşı antifungal etkinliğini mikrodilüsyon yöntemiyle araştırarak MIK aralıklarını C. albicans için 0.015-0.03mg/l, C. glabrata için 0.03-1mg/l, C. tropicalis için 0.015-0.06mg/l, C. krusei için 0.12-0.25mg/l, C. parapsilosis için 0.015-0.03mg/l olarak saptamışlardır. 114 kandida suşunun tümüne bakıldığında ise 0.015-1mg/l olarak tespit etmişlerdir(129). Kurt ve arkadaşları yaptıkları çalışmada kan kültürlerinden izole ettikleri kandida suşlarının antifungal duyarlılığını mikrodilüsyon yöntemiyle araştırarak bütün suşlar için MIK aralığı, MIK 50 ve MIK 90 değerlerini sırasıyla, amfoterisin B için; 0.25-1µg/ml, 0.5 ve 1µg/ml, flukonazol için 0.125-64µg/ml, 0.25 ve 2µg/ml olarak bildirmişlerdir. Amfoterisin için bütün suşları duyarlı olarak tespit etmişler, flukonazol içinse sadece C. krusei de direnç tespit etmişlerdir (114). Antunes ve arkadaşları Brezilya da yaptıkları bir çalışmada Santa Casa Hastaneler kompleksinden elde edilen kan kültürlerinden izole edilen kandida suşlarının antifungal duyarlılığını mikrodilüsyon yöntemiyle araştırarak, MIK aralıklarını, Amfoterisin B için; C. albicans ta 0.25-1 µg/ml, C. parapsilosis te 0.12-1µg/ml, C. tropicalis te 0.5-1µg/ml, C. glabrata da 0.5-1µg/ml, C. krusei de 0.5-1µg/ml, flukonazol için; C. albicans ta 0.12-8µg/ml, C. parapsilosis te 0.12-2µg/ml, C. tropicalis te 0.12-2µg/ml, C. glabrata da 1-88

8µg/ml, C. krusei de 16µg/ml olarak bildirmişlerdir. Sonuç olarak hiçbir suşta flukonazol ve amfoterisin B için dirençlilik tespit edememişlerdir(128). Nawrot ve arkadaşları yaptıkları çalışmada hemotolojik rahatsızlığı bulunan çocuk ve erişkin hastaların steril vücut sıvıları ve kan örneklerinden izole ettikleri kandida suşlarının antifungal duyarlılıklarını mikrodilüsyon yöntemiyle araştırmışlardır. Çalışılan 206 suşdan %99 unu Amfoterisin B ye duyarlı olarak saptamışlardır. Sadece bir C. krusei amfoterisin B için orta derecede duyarlı olarak bildirilmiştir. Flukonazol için; C. albicans ta 109 suş duyarlı, 4 suş orta derecede duyarlı, 5 suş dirençli, C. glabrata da 9 suş doza bağımlı duyarlı, 4 suş dirençli, C. krusei de 10 suş dirençli, diğer kandida suşlarında 11 suş doza bağımlı duyarlı, 6 suş dirençli olarak bildirilmiştir(130). Makrodilüsyon ve E test yöntemlerinin uyumunu araştıran çalışmalarda; Birinci (75); yöntemlerin uyumunu ± 1 dilüsyonları aynı kabul ederek, Amfoterisin B için %84, flukonazol için %94-97, vorikonazol için %87-92, ketokonazol için % 60-79, Van Eldere ve arkadaşları (131); ± 2 dilüsyonları aynı kabul ederek Amfoterisin B için %89, flukonazol için %96, Swell ve arkadaşları(132); ± 2 dilüsyonları aynı kabul ederek flukonazol için % 71, Colombo ve arkadaşları (133); ± 2 dilüsyonları aynı kabul ederek flukonazol için %80, vorikonazol için %84, ketokonazol için % 71, itrakonazol için % 86 olarak saptamışlardır. Pfaller ve arkadaşları yaptıkları çok merkezli bir çalışmada amfoterisin B flukonazol vorikonazol ketokonazol flusitozin için E test ve makrodilüsyon yöntemlerinin uyumunu %86-100 olarak belirlemişlerdir (102). Çalışmamızda izole ettiğimiz 89 kandida suşunun Amfoterisin B için saptanan MİK aralıkları; C.albicans için 0,008-0,5 µg/ml, C.tropicalis için 0,006-0,5 µg/ml, C.glabrata için 0,023-0,125 µg/ml, C.parapsilosis için 0,008-0,25 µg/ml, C.kefyr için 0,016-0,125 µg/ml, vorikonazol için saptanan MİK aralıkları; ; C.albicans için 0,094-0,5 µg/ml, C.tropicalis için 0,016-0,064 89

µg/ml, C.glabrata için 0,032-0,125 µg/ml, C.parapsilosis için 0,023-0,19 µg/ml, C.kefyr için 0,016-0,125 µg/ml olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak hiçbir suşta Vorikonazol ve Amfoterisin B için dirençlilik saptanamamıştır. Hastanemizde uygulanan tedavi protokollerinin oluşturulmasında bu veriler dikkate alınmaktadır. Tanı, tedavi ve izleme açısından uzun süreli yatak işgaline neden olan nozokomiyal fungal infeksiyonların hastane infeksiyon kontrol komitelerince insidans, mortalite, etken spektrum ve antifungallere yanıtları bakımından izlenmesi gelişmiş tanı ve tedavi stratejilerine sahip olmak bakımından önemlidir. Sonuç olarak, gün geçtikçe artan oranlarda önem kazanan fungal infeksiyonlar içinde en sık görülen invaziv kandidiyazis etkenlerinin tedavisinde tür tanımlamasının ve antifungal duyarlılık testlerinin rutin olarak yapılması hem kendi hastanemizin antifungal kullanım protokollerinin belirlenmesine katkı sağlayacak hem de yurt çapında yapılacak daha geniş kapsamlı tedavi protokollerinin hazırlanmasına faydalı olacaktır. 90

. 6. ÖZET Sağlıklı kişilerin normal florasında bulunan kandidalar fırsatçı funguslardır. Bu mikroorganizmalar immun defansı hastalık veya iatrojenik nedenlerle baskılanmış kişilerde hayatı tehdit eden patolojilere yol açabilir. Kandidaların neden olduğu infeksiyonlara son 20 yılı aşkın bir süredir giderek artan bir sıklıkta rastlanmaktadır. Bu infeksiyonlar altta yatan ciddi hastalığı olan hastalar için mortalite ve morbiditenin önemli nedenlari arasında yer almaktadır. Fırsatçı ve nozokomiyal infeksiyonlardan antifungallere dirençli kandida türlerinin izolasyonunda son yıllarda belirgin biçimde artış olması, bu infeksiyonlardan izole edilecek kandida suşlarının tür düzeyinde tanımlanmasını ve antifungallere duyarlılık testlerinin yapılmasını zorunlu hale getirmiştir. İnfeksiyonlardan en sık izole edilen tür C.albicans olmakla beraber non albicans türlerle oluşan infeksiyon insidansında da artış görülmektedir. Ayrıca bu türlere karşı kullanılan antifungal ajanlara direnç görülmesi de önemli bir problem oluşturmaktadır. Bu nedenle çalışmamızda, klinik örneklerden izole ettiğimiz kandidaların tür düzeyinde tanımlanması ve varsa dirençli türlerin görülme sıklığını ve antifungal duyarlılık paternlerinin belirlenmesini amaçladık. Bu çalışmada, başlıca kan olmak üzere steril vücut boşluklarından izole edilen kandida suşları tür düzeyinde tanımlandı ve Amfoterisin B ile Vorikonazole in vitro duyarlılıkları E test yöntemi ile belirlendi. Maya izolatlarının tanımlanması germ tüp testi, CHROMagar Candida daki üreme özelliği ve API 20 C AUX sisteminde karbonhidrat asimilasyon testi ile yapıldı. İzole edilen 89 kandida suşunun 49 u (%55,05) C.albicans, 21 i (%23,59) C.tropicalis, 8 i (%8,98) C.glabrata, 6 sı (%6,74) C.parapsilosis ve 5 i (%5,61) C.kefyr idi. 91

Yapılan antifungal duyarlılık testinin sonuçlarına göre izolatlarımızın duyarlılığı Amfoterisin B için 0,006-0,50 µg/ml, Vorikonazol için 0,016-0,50 µg/ml arasında saptanmıştır. E test yöntemi ile bütün suşlar Amfoterisin B ve Vorikonazole duyarlı bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Candida albicans, Candida spp., antifungal duyarlılık, E test 92

7. SUMMARY Candida are opportunistic fungi found in the normal flora of healty persons. These microorganisms can cause life-treatening pathology in patients whose immune systems has been repressed by ilness or iatrogenic conditions. Infections caused by Candida have substantially increased in incidence over the past two decades. These infections are significant causes of morbidity and mortality for severly patients. In recent years, since there has been increasing trend in the isolation of Candida species from opportunistic and nosocomial infections resistant to antifungals, the identification of Candida strains at species-level and the use of antifungal susseptibility tests become obligatory. Although C.albicans is the most frequently isolated species there has also been an increase in the incidence of infection with non albicans species. The development of resistance to the antifungal agents used againts these species is also becoming an important problem. We aimed to identify the candida species isolated from clinical specimens and determine the percentage of resistant species and the antifungal sensitivity pattern. In this study, the Candida strains isolated from sterilize body spaces and especially from blood, were identified for species and their in vitro susseptibilty to Amphoterisine B and Voriconazole was determined by E test method. The identification of the yeast isolates was made according to germ tube test, the ability of reproduction in the CHROMagar Candida and carbonhydrate assimition test in API 20 C AUX system. Of the 89 Candida strains, C.albicans was 49 (55,05%), C.tropicalis 21(23,59%), C.glabrata 8 (8,98%), C.parapsilosis 6 (6,74%) and C.kefyr 5 (5,61%). 93

Antifungal sensitivty tests revealed the sensitivty of our isolates to Amphoterisine as B 0,006-0,50 µg/ml and Voriconazole as 0,016-0,50 µg/ml. All of the strains were found susseptibility Amphoterisine B and Voriconazole. E test Key Words: Candida albicans, Candida spp.,antifungal susseptibility, 94

8. KAYNAKLAR 1. Akan E.Mantarlar Tıbbi Mikrobiyoloji(2. baskı).saray Medikal Yayıncılık, İzmir 1995,ss460-467 2.Erbakan N.Derinin Mantar Hastalıkları. Türkiye Klinikleri Yayınevi, Ankara 1999,ss 1-90 3.Uzun M, Ağaçfidan A, Anğ Ö. Cinsel Yolla Bulaşan Hastalıklar 1999,İstanbul, ss 365-385 4. Edwards JE. Candida Species. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R.(eds) Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th ed. Philadelphia, Churchill Livingstone 2000: 2656-74. 5. Rippon JW. Medical Mycology. Eds 2.ed. New York, WB Saunders 1982:484-532. 6. Bilgehan H. Candida'nın Tarihçesi, Ekolojisi ve Dağılımı. Candida ve İnfeksiyonlan. Tümbay E. İzmir, Bilgehan Basmıevi 1986:1-9. 7. Hazen KC,Howell SA. Candida, Cryptococcus and other yeasts of medical importance. In: Manual of clinical microbiology. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller M, Yolken RH, eds 8th edition. ASM Pres: Washington DC 2003:1693-711 8. Dignani MC. Clinical syndroms by Candida species. In: Wingard JR, Anaissie EJ (eds). Fungal infections in the immuncompromised patient.1 st ed. Taylor & Francis Group,2005:215-56 9. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC. Mycology. 95

In: Diagnostic Microbiology, 5th ed. Philadelphia, Lippincott 1997: 983-1069. 10. Larone DH: Medical Important Fungi. 2 nd ed.washington AMS 1998:53 11.İnci R:Mantarların yapıları, Üreme Özellikleri ve Sınıflandırılması, In: Ustaçelebi Ş (ed) Temel ve Klinik Mikrobiyoloji, Güneş Kitabevi, Ankara, 1999,pp:1015-1021 12.Tümbay E: Kandida türleri. In: Ustaçelebi Ş (ed) Temel ve Klinik Mikrobiyoloji, Güneş Kitabevi, Ankara,1999,pp:1081-1085 13.Dixon DM, Rhodes JC, Fromtling RA. Taxonomy, Classification, and Morphology of the Fungi. In: Manual of clinical microbiology. Murray PR,Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller M, Yolken RH, eds 8th edition.asm Pres: Washington DC 2003:pp 1161-1166 14. Jawetz E, Melnick JL, Adelberg EA, Brooks GF, Butel JS, Ornston LN. Medical Mycology. In: Medical Microbiology, 18th ed.connecticut, Appleton and Lange 1989:294-314. 15. Rodriguez-Todela JL, Martinez-Suarez JV. Improved medium for fluconazole susceptibility testing of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother 1994,38:45-8. 16. Baumgartner C, Freydiere A, Gille Y.Direct identification and recognition of yeasts species from clinical material by using Albicans ID and CHROMagar Candida plates.j Clin Microbiol 2003;34:454-6 17. Rinaldi GM..Biology and pathogencity of Candida species.in: Bodey PG (ed).candidiasis, pathogenesis, diagnosis and treatment.new York :Raven Press;2000:1 96

18. Shepherd MG...Biology of Candida species.in: Samaranayake LP, MacFarlane TW (eds). Oral Candidiasis.Cambridge : Butterworth and Co. Ltd 1990:11 18. Heath IB.The cytoskeleton. In:Gow NAR, Gadd G.M (eds). The growing fungus. London: Chapmann and Hall.1995:99. 19. Gow NAR, Crombie T, Gooday W. Polarized morphogenesis of Candida albicans,in: Tümbay E, Seeliger HPR, Ang O. Candida and Candidamycosis. New York: :Milenium Pres.1989:13 20. Calderone RA, Braun PC. Adherence and reseptor relationships of Candida albicans. Microbiological Reviews. 55 (1) ;1991:1 21. Kiraz N. Klinik örneklerden izole edilen Candida albicans suşlarının fenotiplendirilmesi ve farklı fenotiplerin bazı antifungal maddelere duyarlılıklarının araştırılması. Istanbul, Istanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı. Yan Dal Uzmanlık tezi 1996. 22. Odds FC. Presidential address. Candida albicans, the life and times of a pathogenic yeast. J Medical and Veterinary Mycology 1994; 32(1):1-8. 23. Arıkan S, Sancak B, Hasçelik G, Günalp A. Candida albicans izolatlarında fosfolipaz aktivitesinin saptanması. Flora 1998; 3: 240-243. 24. Ghannoum MA, Abu-Elteen KH. Patogenicity determinants of candida. Mycoses 1990; 33:268-282. 25. Kuştimur S. Kandida patogenezinde rol oynayan faktörler. Mikrobiyoloji Blt. 28:2;1994:75 26. Culter JE. Putative virulans factors of Candida albicans. Annu. Rev. Microbiol. 45;1991:187 97

27. Kiraz N. Candida türlerinde fenotipik ve genotipik tiplendirme. 1. Ulusal Mantar Hastalıkalrı ve Klinik Mikoloji Kongresi, Izmir, Kongre Kitabı 1999:125-135. 28. Critchley IA, Kouglas JL. Isolation and partial characterization of an adhesin from Candida albicans. J Gen Microbiol 1978; 133:629-632. 29. Rodriguez-Todela JL, Martinez-Suarez JV. Improved medium for flukonazole susceptibility testing of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38:45-48. 30. Magee BB, Hube B, Wright RJ, Sullivan PJ, Magee PT. The genes encoding the secreted aspartyl proteinase of Candida albicans constitute a family with at least three members. Infect Immun 1993; 61: 3240-3243. 31. Ener B, Douglas LJ. Correlation between cell-surface hydrophobicity of Candida albicans adhesion to buccal epithelial cells. Fems Microbiol Letter 1992; 99:37-42. 32. Kaufman RH. Establishing a correct diagnosis of vulvovaginal infection. Am J Obstet Gynecol 2000; 158: 986-988. 33. Buckley HR. Identifications of yeasts. In: Evans EGV and Richardson MD (eds). Medical Mycology: A Practical Approach. Oxford, Oxford University Press, 1989: 97-109. 34. Warnock DW. Methods a pratical approach. IRL Pres England 1989: 235-259 35. Doğruman Al F. Çeşitli Klinik Örneklerden Izole Edilen Kandida Türlerinin tiplendirilmesi ve Antifungal Duyarlılığının Belirlenmesinde Standart Makrodilüsyon ile E Test Yöntemlerinin Karşılaştırılması. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Uzmanlık Tezi, Erzurum, 2000. 36. Ener B: Hastane İnfeksiyonu Olarak Mantarlar. Ustaçelebi Ş. Temel ve Klinik Mikrobiyoloji, Güneş Kitabevi, Ankara,1999,pp:1015-1021 98

37. Pirinççiler M :Maya mantarlarının tiplendirilmesi ve antifungal duyarlılığı. Uzmanlık tezi.on Dokuz Mayıs Üniversitesi, Samsun,1995 38. Jang SJ, Han HL, Lee SH, et al.prge-based epidemiyological study of an outbreak of Candida tropicalis candiduria : The importace of medical waste as a reservoir of nosocomial infection.jpn J Infect Dis 2005 ;58:263-7 39. Barchiesi f, Caggiano G, Falconi DI, et al. Outbreak fungemia due to Candida parapsilosis in a pediatric oncology unit. Diagn. Microbiol. Infect. Dis 2004;49:269-71 40. Podzamczer D, Ventin M, Sauca G, et al.contamined lemons as possible source of infection in heroin abusers with disseminated candidiasis. Eur J Clin Microbiol1996;5-477 41. Odds FC, Kibbler CC, Walker E et al. Carriage of Candida species and C. albicans biyotypes in patients undergoing chemotherapy or bone marrow transplantation for hematological disease. J Clin Pathol 1999;42:129-35 42. Cole GT, Halawa A, Anaisse EJ. The role of gastrointestinal tract in hematogenous candidiasis:from the laboratory bedside. Clin İnfect. Dis. 2000;22;73-88 43. Martino P, Girmenia C, Micozzi A, DeBernardis F, Boccanera M, Cassone A. Prospectivestudy of Candida colonization, use of empiric amphotericin B amd development of invasiv mycosis in neutrophenic patients. Eur J ClinMicrobiol Infect Dis 1994;13:797-804 44. Abi Said D, Anaissie EJ, Uzun O, Raad I, Pinzcowski H, Vartivarian S. The epidemiology of hematogenous candidiasis caused by different Candida species. Clin Infect Dis 1997;24:1122-8 45. Marr KA, Seidel K, White TC, Bowden RA, Candidemia in allogeneic blood and bone 99

marrow transplant recipients: Evolution of risk factors after adoption of prophylactic fluconazole. J Infect Dis 2000;181:309-16. 46. Uzun Ö, Aşçıoğlu S, Anaissie EJ, Rex JH. Risk factors and predictors of outcome in patients with cancer and breakthrough candidemia. Clin Infect Dis 2001;32:1713-7. 47. Castaldo P, Stratta RJ, Wood RP, et al. Fungal disease in liver transplant recipients: A multivariate analysis of risk factors. Transplant Proc 1991;23:1517-9. 48. Mora NP, Cofer JB, Solomon H, et al. Analysis of severe infections (INF) after 180 consecutive liver transplants: The impact of amphotericin B prophylaxis for reducing the incidence and severity of fungal infections. Transplant Proc 1991;23:1528-30. 49. Singh N. Changing spectrum of invasive candidiasis and its therapeutic implications. Clin Microbiol Infect 2001;7(Suppl 2):1-7. 50. Castro J, Samore MH, Hadley S, et al. Development and validation of a prediction rule for invasive fungal infection in liver transplant recipients. 38th International Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, San Diego, CA, 1998, abstract: K-39. 51. Berrouane YF, Herwaldt YA, Pfaller MA. Trends in antifungal use and epidemiology of nosocomiyal yeast infections in a university hospital. J Clin Microbiol 1999;37:531-7 52. Gleason TG, May AK, Caparelli D,Farr BM, Sawyer MD. Emerging evidence of selection flıconazole tolerant fungi in surgical intensive care units. Arch Surg 1997;132:1197-202 53. Segal E, Elad D. Candida species and Blastoschizomyces capitatus In:Ajello L, Hay JR (eds). Topley and Wilson s Microbiology and microbial infections. Vol 4. Medical Microbiology.New York :Oxford University Pres, Inc 1998:423 54. Larone DH, :Medically important fungi, Second ediction, American Society for 100

Microbyology, Washington, 1993:49 55. Rippon JW. Medical Mycology. The pathogenic fungi and the pathogenic Actinomyces, Third ediction, W.B Saunders Company. 1999:532 56. Unat EK, Yücel A, Atlaş K, Samastı M. Unat ın Tıp Parazitolojisi. İnsanın ökaryonlu parazitleri ve bunlarla oluşan hastalıkları, beşinci baskı, İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Vakfı No:15, İstanbul, s.682,1995 57. Bailey ans Scott s :Diagnostic microbiology,ninth ediction,1994:689 58. Sugar MA, Lyman CA. Candida.A Practical Guide to Medically İmportant Fungi and the Diseases They Cause.Phidelphia :Lipinncott-Rawen 1997:34 59. Tümbay E, Karakartal G. Sistemik kandida infeksiyonları.tümbay E (ed). Candida infeksiyonları.türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Yayınları. Bilgehan Yayınevi1994:35 60. a) Richardson MD, Warnock DW. Superficial Candidosis.In: Fungal İnfection, Diagnosis and Management.2nd ed.blackwell Science,1997:78 b) Richardson MD, Warnock DW. Deep Candidosis.In: Fungal İnfection,Diagnosis and Management.2nd ed.blackwell Science,1997:131 61. Gudlaugsson O, Gillerpie S, Lee K, et al.attributable mortality of nosokomiyal candidemia, revisited.clin Infect Dis 2003;37:1172-7 62. Viscoli C, Girmenia C, Marinus A, et al.candidemia in cancer patients:a prospective multicenter surveillance study by the invasive fungal infection group (IFIG) of the European Organization for Research and Treatment of Cancer. Clin Infect Dis 1999;28:1071-9 63. Crislip MA, Edwards JE. Candida albicans and related species.in: Gorbach SL, Barlett SG, Blacklow NR (eds) Infection Diseases.Philadelphia: WP Saunders Company.1998:1887 101

64. Buckley HR. Identification of yeasts. In:Evans EG, Richardson MD(eds). Medical Mycology: A Practical Approach. Oxford, Oxford University Press, 1989:97-109. 65. Larone DH. Yeasts and yeastlike organisms. In: Medically Important Fungi, 3rd ed. Washington, ASM Press 1995:61-90. 66. Warren NG, Shadomy HJ. Candida, Cryptococcus and other yeasts of medical importance. In Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH(eds). Manual of Clinical Microbiology, 6th edition. Washington DC, ASM Press 1995; 723-37. 67. Berardinelli S, Opheim D. New germ tube induction medium for identification of Candida albicans. J Clin Microbiol 1985;22:861-2. 68. Price MF, Larocco MT, Gentry LO. Fluconazole susceptibilities of Candida species recovered from blood cultures over a 5 year period. Antimicrob Agents Chemother 1994;38:1422-4. 69. Yücel A, Kantarcıoğlu S. Some important changes in taxonomy of Candida albicans. Cerrahpaşa J Med. 2000;30:236-246. 71. Yıldıran ŞT. Mantar Infeksiyonlarında Laboratuar Tanı. Ustaçelebi Ş, eds. Temel ve Klinik Mikrobiyoloji. Öncü Basımevi, Güneş Kitabevi, 1999: 1129-1144. 72. Çotuk A. Mantarlar. Genel Mikrobiyoloji Laboratuar yöntemleri. Nobel Tıp Kitabevi, Istanbul, 2003:97-102. 73. Willinder B. Laboratory diagnosis and theraphyof invaziv fungal infections current Drug Targets 2006;7:513-522 102

74. Saraçlı MA. Candida infeksiyonlarının laboratuvar tanısında moleküler ve genetik tanı yöntemleri. Candida Mikrobiyolojisi ve Infeksiyonları Simpozyumu, Eskişehir, Kongre Kitabı, 2002:133-145. 75.Birinci A. Candida türlerinin tiplendirilmesinde ve antifungal duyarlılığın belirlenmesinde çeşitli yöntemlerin karşılaştırılması. Samsun. Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim dalı. Uzmanlık tezi 1999. 76. Baumgartner C, Freydiere AM, Gille Y. Direct identification of yeast species from clinical material by using Albicans ID and CHROMagar Candida plates. J Clin Microbiol 1996; 34: 454-6. 77. Freydiere AM, Buchaille L, Gille Y. Comparison of three commercial media for direct identification and discrimination of Candida species in clinical specimens. Euro J Clin Microbiol Infect Dis 1997; 16: 464-7. 78. Yamane N, Saitoh Y. Isolation and detection of muitiple yeasts from a single clinical sample by use of Pagano-Levin agar medium. J Clin Microbiol 1985; 21: 276-7 79. Stevens DA, Bennett JE. Antifungal agents. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R.(eds) Principles and Practice of infectious Diseases, 5th ed. Philadeiphia, Churchill Livingstone 2000: 448-59 80. Göller S. Klinik örneklerden izole edilen kandidaların tiplendirilmesi ve antifungal ajanlara duyarlılıkları. Izmir Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı. Uzmanlık tezi, l999. 103

81. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution susceptibility testing of yeasts: Approved standard. NCCLS Document M27-A, Villanova, Pensylvania, 1997. 82.Wildfeuer A. Fluconazole: Pharmacokinetics, therapy, susceptibility. Mycoses 1997; 40: 259-65. 83. Taşova Y. Amfoterisin B'nin lipit formülasyonlan. 2. Ulusal Mantar Hastalıkları ve Klinik Mikoloji Kongresi 2001 Ankara, Kongre kitabı, s: 163-79. 84. Viong-Beringer A, Jacobs RA, Gringiellimo BJ. Lipid formulations of amphotericin B: clinical efficacy and toxicities. Clin Infect Dis 1998; 27: 603-18. 85. Topçu Willke A, Söyletir G, Doğanay M. Infeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi, Nobel Tıp Kitabevleri, Istanbul, 2002: 296. 86. Clancy CJ, Nguyen MH. In vitro efficacy and fungicidal activity of voriconazole against Aspergillus and Fusarium species. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1998;17:573-575. 87. Sheehan DJ, Hitchcock CA, Sibley CM. Current and emerging azole antifungal agents. Clin. Microbiol. Rev. 1999;12:40-79. 88. Kurtz MB, Abruzzo G, Flattery A, Bartizal K, Marinan JA, Li W, Milligan J, Nollstadt K, Douglas CM. Characterization of echinocandin-resistant mutants of Candida albicans: Genetic, biochemical, and virulence studies. Infect. Immun.1996;64:3244-3251. 89. Franzot SP, Casadevall A. Pneumoncandin L-743,872 enhances the activities of amphotericin B and fluconazole against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 1997;41:331-336. 104

90.Hofmann HL, Pfaller MA. In vitro antifungal susseptibility testing. Pharmacotherapy 2001;21:111-23 91. Hospenthal DR, Murray CK, Rinaldi GM. The role of antifungal susseptibility in the therapy of candidiasis.diag Microbiol Infect Dis 2004;48:153-60 92. Espinel-Ingroof. Utility of mold susseptibility testing. Curr Opin Infect Dis 2003;16:527-32 93.Franzot SP, Casadevall A. Pneumoncandin L-743,872 enhances the activities of amphotericin B and fluconazole against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 1997;41:331-336. 94. Yücesoy M. Mayalar için antifungal duyarlılık testleri. I. Ulusal Mantar Hastalıkları ve Klinik Mikolji Kongresi, Izmir, Kongre Kitabı, 1999: 191-198. 95.Kuştimur S. Antifungal duyarlılık testleri. Usataçelebi Ş, eds. Temel ve Klinik Mikrobiyoloji. Öncü Basımevi. Güneş Kitabevi, 1999: 1159-1165 96. National Committee for clinical laboratory Standads. 2002. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; approved Standards. Second edition, document M27-A2. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 97.Arıkan S. Antifungal duyarlılık testlerini ne zaman ve nasıl yapalım. XXX. Türk Mikrobiyoloji Kongresi 2002 Antalya, Kongre kitabı s: 243 98. May JL, King A, Warren CA. Voriconazole disk diffüsion testing for the routine laboratory. J Antimicrob Chemother 1997; 40: 511-6. 105

99. Kebudi R, Devecioğlu Ö, Gürler N. Tanımlar ve tanı yöntemleri. Flora 2004; 9: 73-105. 100. Walsh TJ, Chanock SJ. Invaziv fungal infeksiyonlarının tanısı: Kültür dışı sistemlerde gelişmeler. In Remington JS, Swartz MN, eds. Infeksiyon hastalıklarında güncel ve klinik yaklaşımlar. Ünal S. Blackwell Science. 1998: 105-129. 101. Sandven P. Laboratory identification and sensivity testing of yeast isolates. Acta Odontol Scand 1990; 48:27-36. 102. Pfaller M, Wenzel R. Impact of the Changing Epidemiology of Fungal Infectionsin the 1990s.Eur J Clin Microbiol Infect Dis April 1992;11:287-291 103. Ener B.İnvitro antifungal duyarlılık testleri: standardizasyon ve klinik önemi. Mikrobiyoloji Bülteni.1996;30:419-425 104. Koç AN. Tıbbi bakımdan önemi olan candida türlerinin mikolojik özellikleri. Candida Mikrobiyolojisi ve Infeksiyonları Simpozyumu, Eskişehir, Kongre Kitabı 2002: 37-50 105. Çolak H. Hastane kaynaklı kan dolaşımı infeksiyonları. Klimik Derg 2000; 13: 11 106. Sandven P, Bevanger L, Digranes A, Gausted P, Haukland HH, Steinbakk M. Constant low rate of fungemia in Norway, 1991 to 1996. J Clin Microbiol 1998; 36(12): 3455-3459. 107. Pfaller MA, Jones RN, Doern GV, Sader HS, Hollis RJ, Messer SA. International survelliance of bloodstream infections due to Candida species: 106

frequency of occurrence and antifungal susceptibilities of isolates collected in 1997 in the United States, Canada, and South America for the sentry program. J Clin Microbiol 1998; 36(7): 1886-1889. 108. Pfaller MA, Diekema DJ, Jones RN, Messer SA, Hollis RJ, SENTRY Participants Group. Trends in antifungal susceptibility of Candida spp. isolated from pediatric and adult patients with bloodstream infections: SENTRY antimicrobial surveillance program, 1997 to 2000. J Clin Microbiol 2002; 40: 852-856. 109. Canton E, Peman J, Carillo-Munoz A, Orero A, Ubedo P, Vıudes A, Gobernado M. Flukonazole susceptibilities of bloodstream Candida sp. Isolates as determined by National Committee for Clinical Laboratory standarts method M27-A and two other methods. J Clin Microbiol 1999; 37(7): 2197-2200. 110. Hong Nguyen M, Yu CY. Influence of incubation time inoculum size, and glucosa concentrations on spectrophotometric endpoint determinations for amphotericin B, fluconazole, and itraconazole. J Clin Microbiol 1999; 37(1): 141-145. 111. Godoy P, Tiraboschi IN, Severo LC, Bustamante B, Calvo B, Almeida LP, Matta DA, Colombo AL. Species distribution and antifungal susceptibility profile of candida spp. bloodstream isolates from latin american hospitals. Mem Inst Oswaldo Cruz 2003; 98(3): 401-405. 112. Cuenca-Estrella M, Rodriguez D, Almirante B, Morgan J, Planes AM, Almela M, Mensa J, Sanchez F, Ayats J, Gimenez M, Salvado M, Warnock DW, Pahissa A, Rodriguez-Tudela JL; Barcelona Candidemia Project Study Group. In vitro susceptibilities of bloodstream isolates of Candida species to six antifungal agents: results from a population-based active surveillance 107

programme, Barcelona, Spain, 2002-2003. J Antimicrob Chemother 2005 ; 55(2):194-199. 113. Ermertcan Ş. Kan kültürlerinden soyutlanan Candida kökenlerinin flukonazole in vitro duyarlılığının makrodilüsyon ve kolorimetrik mikrodilüsyon yöntemleri ile saptanması. Ege Üniversitesi Tıp fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, Uzmanlık Tezi, Bornova, Izmir, 1998 114. Vural T, Çolak D, Çelebioğlu N, Felek R, Öngüt G, Er D, Şekercioğlu AE, Tuncer D, Saygan M, Gökay S. Kan kültürlerinden izole edilen Candida türleri ve antifungal duyarlılıkları. Ankem Derg 1998; 12(2): 147. 115. Yücesoy M, Yuluğ N. Kan kültürlerinden soyutlanan kandida türlerinin antifungal ajanlara in vitro duyarlılıkları. I. Ulusal Mantar Hastalıkları ve Klinik Mikoloji Kongresi, Izmir, Kongre Kitabı 1999: 234. 116. Kurt Ö, Kurt H, Bayar B, Memikoğlu KO, Azap A, Tekelli E. Typing and antifungal susceptibility testing of Candida strains isolated from the blood cultures of candidemia patiens. Clinical Microbiology and infection 2002; 8: 559. 117. Kocabay G, Aydın S, Tiryaki B, Vatansever S, Erk O, Akkaya V, Güler K. Candida kefyr ile oluşan pnömoni. Ist Tıp Fak Derg 2005;68:26-28. 118.Krcmery V, Barnes AJ. Non-albicans Candida spp. causing fungaemia: pathogenicity and antifungal resistance. J Hosp Infect 2002;50:243-260. 119.Nguyen MH, Peacock JE Jr, Morris AJ. The changing face of candidemia: emergence of non-candida albicans species and antifungal resistance. Am J Med 1996;100:617-623. 120. Inan M, Çakmakçı M. Cerrahi yoğun bakım infeksiyonları. Hastane 108

Infeksiyonları Derg 1997;1: 91-96 121. Bengisun JS, Palabıyıklıoğlu I, Akan H. Hematoloji kliniği kan kültür sonuçları.türk Klinik Mikrobiyoloji ve Infeksiyon Hastalıkları Kongresi, Antalya, Kongre Kitabı 1999: 284. 122. Kızırgil A, Çalaşyer I, Erkmen N, Aral M, Kerküklü F, Aşçı Z. Fırat Tıp Merkezinde kan kültürlerinden izole edilen mikroorganizmalar. 9. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve Infeksiyon Hastalıkları Kongresi, Antalya, Kongre Kitabı 1999:251. 123. Durmaz G, Us T, Aydınlı A, Kiraz N, Akgün Y. Bactec 9120 otomatik kan kültür sistemi sonuçlarının 3 yıllık analizi. 9. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve Infeksiyon Hastalıkları Kongresi, Antalya, Kongre Kitabı 1999: 203. 124. Tekerekoğlu MS, Durmaz B, Taştekin N, Otlu B. Otomatize kan kültür sistemi ile üç yıllık dönemde alınan sonuçların değerlendirilmesi. 9. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve Infeksiyon Hastalıkları Kongresi, Antalya, Kongre Kitabı 1999: 125. Knoke M, Schulz K, Bernhardt H. Dynamics of Candida isolations from humans from 1992-1995 in Greifswald, Germany.Mycosis 1997;40(3-4):105-110 126. Kalkancı A, Güzel Ö, Şenol E, Kuştimur S. In vitro activities of vorikonazole, amphoterisin B and flukonazole against Candida strains isolated from neutropenic patiens with haematologic malignancies. 13th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), 2003, Glasgow, UK. Clinical Mikrobiology and Infection 2003;9(1):365. 127. Swinne D, Watelle M, Nolard N. In vitro activities of voriconazole, 109

fluconazole, itraconazole and amphotericin B against non Candida albicans yeast isolates. Rev Iberoam Micol 2005; 22: 24-28. 128. Antunes AGV, Pasqualotto AC, Diaz MC, d'azevedo PA, Severo LC. Candidemia in a Brazilian tertiary care hospital: species distribution and antifungal susceptibility patterns. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2004; 46(5): 239-241. 129. Rubio MC, de Ocariz IR, Gil J, Benito R, Rezusta A. Potential fungicidal effect of voriconazole against Candida spp. Int J Antimicrob Agents 2005; 25(3): 264-267. 130. Nawrot U, Nowicka J, Juszczak K, Gusin B. Susceptibility to antifungal agents of Candida species isolated from pediatric and adult patients with haematological diseases. Mycoses 2005; 48(6): 385-390 131. Van Eldere J, Joosten L, Verhaeghe A, Surmont I. Antifungal susseptibility testing by National Committee for Clinical Laboratory Standarts broth macrodilution method compared with E test and semiautomated broth microdilution test. J Clin Microbiol 1996;34(4):842-847 132. Swell DL, Pfaller MA, Barry AL.Comparison of macrodilution, broth microdilution, and E test antifungal susseptibility test for flıkonazole.. J Clin Microbiol 1996;32(9)2099-2102 133. Colombo A, BarchiesiF, McGOUGH DA, Rinaldi MG. Comparison of by National Committee for Clinical Laboratory Standarts broth macrodilution method fo azole antifungal susseptibility testing. J Clin Microbiol 1995;33(3):535-54 110

111