İskenderun Körfezi Balıklarından İzole Edilen Bakterilerde Antibiyotik ve Ağır Metal Dirençliliklerinin Araştırılması

Biyoloji Bilimleri Araştırma Dergisi 2 (2): 1-5, 2009 ISSN:1308-3961, www.nobel.gen.tr İskenderun Körfezi Balıklarından İzole Edilen Bakterilerde Antibiyotik ve Ağır Metal Dirençliliklerinin Araştırılması Fatih MATYAR¹, Buse ERASLAN¹, Tamer AKKAN², Ayşenur KAYA², Sadık DİNÇER² ¹Çukurova Üniversitesi Eğitim Fakültesi Fen ve Teknoloji Öğretmenliği, Adana ²Çukurova Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü, Adana Sorumlu Yazar Geliş Tarihi : 10 Mart 2009 e-posta: fmatyar@cu.edu.tr Kabul Tarihi : 13 Nisan 2009 Özet Bu çalışmada İskenderun Körfezi balıklarının solungaç ve barsağından izole edilen Gram (-) bakterilerde antibiyotik ve ağır metal dirençliliği araştırılmıştır. Solungaçtan izole edilen bakteriler amfisilin (%66.7) ve sefazoline (%47.3) karşı yüksek oranda direnç gösterirken, hiçbir izolat imipeneme ve cefrizokzime karşı dirençlilik göstermemiştir. Barsak bakterileri en çok dirençliliği sırasıyla amfisilin (%44.0) ve sefazoline (%36.0) karşı göstermişlerdir. En az dirençlilik kloramfenikol (%1.3) ve kanamisine (%4.0) karşı görülmüştür. Birçok izolat farklı ağır metal konsantrasyonlarına tolerans göstermiştir. Bakterilerin toleranslı oldukları minimal inhibisyon konsantrasyonları 12.5 µg/ml den > 3200 µg/ml ye kadar değişmektedir. Bu sonuçlar İskenderun Körfezi balıklarının önemli miktarda antibiyotik ve ağır metal dirençliliği taşıyan Gram (-) bakterilere sahip olduğunu ve bunun da balık tüketen toplumlar için bir sağlık riski oluşturduğunu göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Ağır metal, Antibiyotik, Balık, Dirençlilik, Halk sağlığı Antibiotic and Heavy Metal Resistance of Bacteria Isolated From Fish of Iskenderun Bay Abstract In this study it investigated that antibiotic and heavy metal resistance of Gram(-) bacteria from Iskenderun Bay fish s gills and intestinal content. Bacteria isolated from gill showed high resistance to ampicillin (66.7%) and cefazolin (47.3%) whereas, no isolates showed resistance to imipenem and cefrizoxime. The intestinal bacteria showed the most resistance agains to ampicillin (44%) and cefazolin (36.0%) respectively. A proportion of resistance to chloramphenicol (1.3%) and kanamycin (4.0%) was shown among the intestinal bacteria. These results showed that Iskenderun Bay fish have significant proportion of Gram (-) bacteria with antibiotic and heavy metal resistance and this prompting a health risk to public health for fish consumers. Keywords: Heavy Metal, Antibiotic, Fish, Resistance, Public health GİRİŞ Tüm dünya genelinde balıklardan izole edilen bakterilerde antibiyotik dirençliliği çalışılmaktadır [1-3]. İnfeksiyon tedavisinde geniş çapta antibiyotik kullanımı, suyun da dahil olduğu çeşitli ortamlarda antibiyotiğe dirençli bakterilerin yayılmasına neden olmaktadır [4]. Hayvan beslemede ve balık üretiminde öncelikle antibiyotikli yemler kullanan gelişmiş ülkelerde sorun ciddi boyutlara ulaşmıştır [5]. Antibiyotik dirençliliği taşıyan bakteriler besinlerle tüketiciye bulaştığı zaman ciddi infeksiyonlar yapabilmektedirler [6]. Enzim ve enzimlerde kofaktör görevi yaptığı için birçok ağır metal (Fe, Zn, Mn, Co, Cu, Ni, V, Mo) az miktarda gerekirken, enzimlere ve DNA ya bağlandığı için ayrıca Fenton reaksiyonu vasıtasıyla oksijen radikalleri ürettiği için yüksek miktarda bulundukları zaman toksik etki göstermektedir [7]. Ağır metallerin farklı formlarda çevreye girmesi mikrobiyal topluluklarda ve onların aktivitelerinde kayda değer değişimler yapmaktadır [8]. Endüstriyel ve maden atıklarıyla sucul ortamlara giren ağır metaller önemli kirleticilerdir. Özellikle termik santraller önemli miktarda kül üretir ve bu kül arsenik ve selenyum gibi iz metallerinde dahil olduğu birçok ağır metali ihtiva eder. Kül kalıntıları çoğunlukla santral içinde su ile muamele edilir daha sonra atık olarak sucul ortamlara verilir [9]. Son yıllarda antibiyotik ve ağır metallere karşı dirençli bakteriler ve bunların dirençlilik yolları farklı çalışmalarda araştırılmıştır [10-12]. İskenderun Körfezi kuzeydoğu Akdeniz de lokalize olmuş (36 o 38 D, 36 o 05 K) ve balık avcılığı ve kültürü açısından ülkemizde önemli bir yere sahiptir. Farklı tipte balıklar ve kabuklular bu bölgede her yıl bol miktarda yakalanılır. İskenderun Körfezine kıyısı olan termik santral, gübre fabrikası, rafineri ve demir çelik üretme ve işleme fabrikaları işlenmiş ya da işlenmemiş atıklarını İskenderun Körfezine bırakırlar buna ek olarak hastane atıklarının da dâhil olduğu evsel atıklar da körfeze bırakılmaktadır. Ekolojik çalışmalar antibiyotik ve ağır metal dirençliliğinin global öneme sahip olduğunu göstermektedir. Plazmidler, antibiyotik ve ağır metal dirençlilik genlerini taşımaktadır [13]. Deniz bakterileri ağır metalleri adsorbe eder, biriktirir ve transforme edebilir [14]. Son yıllarda artan çevre kirliliği insan sağlığını direkt ya da dolaylı bir şekilde tehdit etmektedir. İnsan beslenmesinde önemli bir yere sahip olan balıkların mikrobiyal florasındaki değişim bu tehditlerden birisidir. Sahip olduğu çeşitli omurgalı ve kabuklu deniz ürünleri ile İskenderun Körfezi doğu Akdeniz halkının beslenmesinde önemli bir yere sahiptir. Ancak körfezin hızla kirlenmesi hem balık populasyonunu hem de mikrobial florayı

2 F. Matyar ve ark. / Bibad, 2 (2): 1-5, 2009 dönüşümsüz olarak etkilemekte ve bu çalışmayı zorunlu kılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, İskenderun Körfez inde yakalanan balıklardan izole edilen Gram (-) bakterilerin identifikasyonun yapılması, ağır metal ve antibiyotik dirençliliğinin araştırılması ile antibiyotik ve ağır metal dirençliliği arasındaki ilişki saptanmasıdır. MATERYAL VE YÖNTEM Beş farklı tür balık örneği (Çipura, Sparus aurata; Barbunya, Mullus barbatus; Gümüş, Atherina boyeri; Sardalye, Sardina pilchardu; Mırmır, Lithognathus mormyrus) Mart 2008-Kasım 2008 tarihleri arasında İskenderun Körfezinden balıkçılar tarafından yakalanıp steril torbalara konulmuştur. Tüm örnekler laboratuara soğuk zincir korunarak 4 saat içerisinde getirilmiştir [14]. Her balık örneğinden 1 gr solungaç ve 1 gr barsak içeriği alınarak seri sulandırma ile MacConkey Agar (McC) (Merck) üzerine ekim yapımış ve 24-72 saat 35ºC de inkübe edilmiştir. Bakteri kolonilerinden rasgele seçilerek Nutrient Agar da (Merck) stok kültürleri yapılmıştır. Toplam 168 adet bakteri izolatı seçilerek bunların fenotipik özellikleri, Gram boyamaları, oksidaz ve katalaz reaksiyonları, hareketlilik, OF glikoz ve jelatini eritme testleri yapılmıştır [15]. İzolatlar daha sonra Becton Dickonson CrystalE/NF identifikasyon kiti ve yazılımı (BBL, Md, USA) kullanılarak identifize edilmiştir. Hassasiyet testleri agar difüzyon testi uygulanarak yapılmıştır [16]. Yedi farklı sınıfı temsil eden 10 farklı antibiyotik diski Mueller-Hinton Agar (Difco) kullanılarak denenmiştir. Bu antibiyotikler; amfisilin (AM,10µg), kloramfenikol (C,30 µg), tetrasiklin (TE,30 µg), imipenem (IPM, 10 µg), sefazolin (CZ, 30 µg), seftizoksim (ZOX, 30 µg), sefuroksim (CXM, 30 µg), sefepim (FEP, 30µg), kanamisin (K, 30µg) ve trimethoprim-sülfametaksol (SXT, 1.25 µg ve 23.75µg) dur. Antibiyotik disklerinin etkisini doğrulamak için referans bakteri olarak NCCLS nin [17] önerdiği E.coli ATCC 25922 ve Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 kullanılmıştır. Tüm antibiyotik diskleri BBL den (Md, USA) satın alınmıştır. Her bakteri izolatı için 12.5 µg/ml den 3200 µg/ml ye kadar değişen konsantrasyonlarda Cd+2, Cu+2, Cr+3, Pb+2 ve Mn+2 ağır metallerini ihtiva eden Mueller- Hinton agar (Difco) kullanılarak minimal inhibisyon konsantrasyonları belirlenmiştir. Kullanılan beş farklı ağır metal tuzu şu formüllere sahiptir; CdCl2.2H2O, CuSO4.5H2O, CrCl3, Pb (NO3)2 ve MnCl2.2H2O (Merck). İzolatların MIC değerleri referans olarak kullanılan Escherichia coli K-12 nin MIC değerini geçmişse dirençli olarak sayılmışlardır [18]. BULGULAR ve tartışma Çalışmamızda balık solungaçlarından 93, barsak içeriğinden 75 olmak üzere toplam 168 adet Gr (-) bakteri izole edilmiştir. İzolat sayıları ve izole edildiği kaynak Çizelge 1 de gösterilmiştir. Çalışmamızda izole edilen bakteri türleri arasında dört izolat diğerlerine göre daha baskın bulunmuştur. Bunlar Enterobacter cloaceae (%37.5), Klebsiella oxytoca (%20.8), Proteus vulgaris (%11.3) ve Pantoea agglomerans (%8.9) tır (Çizelge 1). Solungaçtan izole edilen bakterilerin %49.5 i Enterobacter cloacae olarak tespit edilmiş olup bu bakteri en baskın tür olarak karşımıza çıkmaktadır. Barsak içeriğinden izole edilen türler arasında %46.7 ile en sık rastlanan izolat Klebsiella oxytoca olmuştur. Enterobacter cloacae, bakteriyemi, solunum yolu infeksiyonu, deri ve yumuşak doku infeksiyonlar, boşaltım sistemi infeksiyonları, endokardit, karıniçi infeksiyonlarının da dahil olduğu birçok nozokomiyal infeksiyondan sorumlu önemli bir patojendir [19]. Klebsiella cinsi, septisemi, pnömoni, idrar yolları infeksiyonu ve yumuşak doku infeksiyonun da dahil olduğu birçok hastalığı sebep olan fırsatçı bir patojendir. Hastanelerde Klebsiella infeksiyonu oranı yaklaşık %5-7 arasındadır ve bu oran Klebsiella cinsini hastane kaynaklı patojenler arasına çok önemli bir patojen olarak karşımıza çıkarmaktadır [20]. Elde edilen izolatlar arasında en sık rastlanan üçüncü izolat olan Proteus vulgaris insan dışkısında normal flora elemanı olarak bulunur. Bu nedenle lağım sularında sıklıkla rastlanır. İnsanda uygun şartlar bulduğunda infeksiyonlara neden olan fırsatçı bir patojendir. Özellikle hastane infeksiyonları, olan idrar yolları ve yara infeksiyonlarında rastlanır. Menejit, sepsis ve organ apselerinden de izole edilebilir. Genellikle hastanelerde diğer bakterilerle beraber ortak infeksiyonlara neden olur [19]. Solungaçtan izole edilen bakteriler arasında %3.2 ile Vibrio metschnikovii dördüncü sırada yer almaktadır. Vibrio lar deniz sularında normal flora içerisinde yer alır. Vibrio metschnikovii sucul ortamlarda yaygın olarak bulunmaktadır. Vibrio lar arasında V. parahaemolyticus akut gastroenterite neden olan bir patojendir. Japonya da çiğ ya da pişmiş deniz ürünleri tüketimi nedeniyle gıda kaynaklı gastroenteritlerin %50-70 i bu patojen tarafından oluşturulmaktadır [21]. Çalışmamızda 19 farklı bakteri türü izole edilmiştir. Deniz ortamlarında çok sayıda ve farklı türlerde bakteriler bulunur [22]. Dang ve ark., [23] Jiaozhou Körfezi, Çin de oksitetrasikline (OTC100) dirençli 89 bakteri izolatının 32 farklı türe ait olduğu saptamışlardır. Çalışma alanımızı oluşturan İskenderun Körfezi, İskenderun kanalizasyon sistemi vasıtasıyla hastane atıklarının da dahil olduğu evsel akıntılarla beslenir. Dolayısıyla çalışmamızda izole edilen bakteri türlerine bakıldığında farklı patojenlerin izole edilmesi normaldir (Çizelge 1).

F. Matyar ve ark. / Bibad, 2 (2): 1-5, 2009 3 Çizelge 1. Solungaç ve barsaktan izole edilen Gram (-) bakteri türleri. Çizelge 2. İskenderun Körfezi balıklarının solungaç ve barsaklarından izole edilen Gr(-) bakterilerin 7 farklı sınıfa ait 10 antibiyotiğe karşı dirençlilikleri. Çalışmamızda elde edilen bakterilere karşı test ettiğimiz 10 farklı antibiyotikten solungaç bakterileri arasında en fazla dirençlilik amfisiline (%66.7) karşı tespit edilmiştir. Bunu sırasıyla sefazolin (%47.3), tetrasiklin (%12.9) ve sefuroksim (%6.5) izlemektedir. Solungaç bakterileri arasında en düşük oranda dirençlilik kanamisin (%1.1) ve sefepime (%1.1) karşı gözlenirken, imipenem ve seftizoksime karşı test edilen tüm solungaç kökenli, izolatlar hassas olarak tespit edilmiştir (Çizelge 2). Barsak bakterileri arasında en yüksek dirençlilikler sırasıyla; amfisilin (%44.0), sefazolin (%36.0), sefuroksim (13.3.) ve trimethoprim-sulfamethokzole (%9.3) karşı gözlenmiştir.

4 F. Matyar ve ark. / Bibad, 2 (2): 1-5, 2009 Çizelge 3. Solungaç ve barsaktan izole edilen bakterilerin ağır metallere karşı toleransları Barsak bakterilerinin 4. kuşak sefalosporinlerden olan sefepime karşı %6.7 oranında dirençlilik göstermesi ilgi çekicidir. Barsak bakterilerinin tamamı test edilen tüm antibiyotiklere karşı az ya da çok dirençli olarak tespit edilmiştir. Solungaçtan izole edilen bakteriler arasında imipeneme karşı dirençlilik görülmezken, barsak bakterileri arasında bu oran %5.3 tür. (Çizelge 2). Amfisiline dirençlilik Vaseeharan ve ark., [23] bulgularıyla benzerlik taşımaktadır. İmipeneme karşı olan dirençlilik Schwartz ve ark., [24] bulgularıyla benzerlik taşımaktadır. Bu çalışmada tüm izolatlara karşı beş farklı ağır metal denenmiştir (Cd+2, Cu+2, Cr+3, Pb+2 ve Mn+2). Ağır metallere karşı olan tolerans bakterinin izole edildiği kaynağa gore değişkenlik göstermektedir. Solungaçtan izole edilen bakterilerde ağır metallere karşı olan tolerans Cd>Cu>Mn>Cr= Pb sırasıyla tespit edilirken, barsaktan izole edilen bakterilerde bu eğilim Cd>Cu>Cr>Mn=Pb olarak tespit edilmiştir. (Çizelge 3). Chandy [25] deniz bakterileri üzerine 16 farklı ağır metalin etkisini araştırmış ve toksisite sırasını şu şekilde tespit etmiştir; Hg>Ag>As=Cd=Cr=Co=Cu=Fe=Pb>Mo=Sb>Ni=V=Zn >Mn>Sr. Akinbowale ve ark., [18] 7 farklı ağır metalin Oncorhynchus mykiss ten izole ettkleri bakteriler üzerine etkisini araştırmış ve ağır metallerin etki sırasını şu şekilde bulmuştur; Cu = Pb >Mn >Cr > Zn >Co >Cd. Ağır metallere karşı toleranslılığı denenen solungaç bakterilerinin %60.2 si kadmiyuma, %50.5 i bakıra, %8.6 sı manganese, %6.5 i kroma ve %6.5 i kurşuna karşı toleranslı olarak tespit edilirken, barsak bakterilerinin %52 si kadmiyuma, %45.3 ü bakıra, %10.7 si kroma, %%.3 ü kurşuna ve %5.3 ü manganese karşı toleranslı olarak tespit edilmiştir. Izolatların minimal inhibisyon konsantrasyonları 12.5µg/ ml ile >3200µg/ml arasında değişmektedir. En yüksek ağır metal konsantrasyonuna (>3200µg/ml) olan tolerans solungaç izolatları arasında bakıra (%3.2) karşı gözlenmiştir. Oysa, en düşük konsantrasyonda (12.5µg/ml) ağır metale karşı tolerans barsak içeriği izolatları arasında kadmiyuma (%32.0) karşı tespit edilmiştir. Hem Gr (+) hem de Gr(-) bakteriler ağır metallere karşı tolerans gösterebilmektedir [26]. Bakterilerde ağır metallere karşı tolerans görülmesi çevrenin bu metallerle kirlendiğinin göstergesidir [27]. Endüstriyel aktiviteler, madencilik ve kültür balıkçılığı doğal ekosistemin değişmesinde etkili faktörler arasında sayılabilir. Bu faktörler bakteriler üzerine seçici bir baskı kurmaktadır [28]. Hem solungaç izolatları hem de barsak izolatları incelendiğinde bakır ve kadmiyuma karşı dirençlilik gösteren izolatların amfisilin ve sefazoline karşı dirençlilik gösterdiği saptanmıştır. SONUÇ ve öneriler Yapılan araştırmada beslenmede önemli yere sahip olan balıklardan insan sağlığı açısından önemli sayılacak birçok bakteriye rastlanmıştır. Bu bakterilerin tedavide kullanılan antibiyotiklere karşı dirençlilik taşıması da büyük bir sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu çalışma doğu Akdeniz in bir bölümünü kapsamaktadır. Üç tarafı denizlerle çevrili ve 7.833 km lik bir kıyı şeridi bulunan ayrıca balıkçılığın önemli bir ölçüde yapıldığı ülkemizde tüm Akdeniz, Ege, Marmara ve Karadeniz de bu ve buna benzer çalışmalar yapılmalıdır.

F. Matyar ve ark. / Bibad, 2 (2): 1-5, 2009 5 Ayrıca deniz kirliliğinin azaltılması için gerekli önlemler alınmalı, deniz kirliliğine ve çevre kirliliğine neden olan kişi ve kuruluşlar için yasal yaptırımlar uygulanmalıdır. Teşekkür Bu çalışmayı finansal açıdan desteklediği için Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeler Komisyonuna (BAPKOM) teşekkür ederiz (Proje numarası: EF2008BAP2) KAYNAKLAR [1] Smith P, 2001. Accuracy, precision and meaning of antimicrobial agent susceptibility testing of bacteria associated with fish diseases. Aquaculture, 196:253-266. [2] Nonaka L, Suzuki S., 2002. New Mg+2 dependent oxytetracycline resistance determinant Tet 34 in Vibrio isolates from marine fish intestine contents. Antimicrobial Agents and Chemotheraphy, 46:1550-1552. [3] Radu S, Ahmad N, Ling FH, Reezal A., 2003. Prevalence and resistance to antibiotics for Aeromonas species from retail fish in Malaysia. International Journal of Food Microbiology, 81:261-266. [4] Young HK, 1993. Antimicrobial resistance spread in aquatic environments. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 31: 627-635. [5] Wegener HC, Frimodt- Moller N., (2000). Reducing the use of antimicrobial agents in animals and man. Journal of Medical Microbiology, 49:11-113. [6] Teuber M, Perreten V, Wirsching F., 1996. Antibiotic resistant bacteria: A new dimension in food microbiology. Lebensmittel- Technologie, 29:182-199. [7] Lopez-Maury L, Garcia-Dominguez M, Florencio FJ, Reyes JC., 2002. A two companent signal transduction system involved in nickel sensing in the Cyanobacterium synechocystis sp. PCC 6803. Molecular Microbiology, 43:247 256. [8. Doelman P, Jansen E, Michels M, Van TM., 1994. Effects of heavy metals in soil on microbial diversty and activity as shown by the sensitivity-resistance index, an ecologically relevant parameter. Biology and Fertility of Soils, 17:177 184. [9] Rowe C, Hopkins WA, Congdon JD., 2002. Ecotoxicological implications of aquatic disposal of coal combustion residues in the United States: a review. Environmental Monitoring Assessment, 80:207 276. [10] McArthur J, Tuckfield RC., 2000. Spatial patterns in antibiotic resistance among stream bacteria: effects of industrial pollution. Applied and Environmental Microbiology, 66:3722 3726. [11] Berg J, Tom-Petersen A, Nybroe O., 2005. Copper amendment of agricultural soil selects for bacterial antibiotic resistance in the field. Letters in Applied Microbiology, 40:146 151. [12] Matyar F, Kaya A, Dinçer S., 2008. Antibacterial agents and heavy metal resistance in Gram-negative bacteria isolated from seawater, shrimp and sediment in Iskenderun Bay, Turkey. Science of the Total Environment, 407:279-285. [13] Sobecky PA., 1999. Plasmid ecology of marine sediment microbial communities. Hydrobiologia, 401:9 18. [14] APHA Microbial examination. In Standards Methods for the Examination of Water and Wastewater, 1992. 18th ed. Greenberg AE, Clesceri LS, Eaton AD, editors. American Public Health Association Washington DC. [15] Lemos ML, Toranzo AE, Barja JL., 1985. Modified medium for the oxidation-fermentation test in the identification of marine bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 49:1541 1543. [16. Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M., 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical Pathology, 45:493 496. [17] NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards. ApprovedStandards M2-A6., 1997. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, 6th edn., NCCLS., Wayne, Pennsylvania, USA. [18] Akinbowale OL, Peng H, Grant P, Barton MD, 2007. Antibiotic and heavy metal resistance in motile aeromonads and pseudomonads from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) farms in Australia. International Journal of Antimicrobial Agents, 30:177 182. [19] Holt JG, Krieg NR, Snetah PHA, Staley JT, Williams ST., 1994. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition, pp: 787. [20] Podschun R, Ullmann, U., 1998. Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods, and pathogenicity factors. Clinical Microbiological Reviews, 11:589 603. [21] Farmer JJ, Janda M, Birkhead K., 2003. Vibrio, In: Murray, PR, Baron, EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken, R.H. (Eds.), Manual of Clinical Microbiology, 8th edition. ASM Press, Washington, D C., pp. 706 718. [22] Dang H, Ren J, Song L, Sun S, An L., 2008. Diverse tetracycline resistant bacteria and resistance genes from coastal waters of Jiaozhou Bay. Microbial Ecology, 55:237 246. [23] Vaseeharan B, Ramasamy P, Murugan T, Chen, JC., 2005. In vitro susceptibility of antibiotics against Vibrio spp. and Aeromonas spp. isolated from Penaeus monodon hatcheries and ponds. International Journal of Antimicrobial Agents, 26:285 291. [24] Schwartz T, Kohnen W, Jansen B., Obst U., 2003. Detection of antibiotic-resistant bacteria and their resistance genes in wastewater, surface water, and drinking water biofilms. FEMS Microbology Ecology, 43:325 335. [25] Chandy, JP., 1998. Heavy metal tolerance in chromogenic and non-chromogenic marine bacteria from Arabian Gulf. Environmental Monitoring and Assessment, 59:321 330. [26] Silver S, Phung L T., 1996. Bacterial heavy metal resistance: new surprises. Annual Reviews of Microbiollogy, 50:753 789. [27] Aiking H, Stinamn A, Van-Ganderen C, Van-Heerikhuizen H, Vant-Riet J., 1984. Inorganic phosphate accumulation and cadmium detoxification in Klebsiella aerogenes NCTC 418 growing in continuous culture. Applied and Environmental Microbiology, 47:374 377. [28] Alanso A, Sanchez P, Martinez JL., 2001. Environmental selection of antibiotic resistance genes. Environmental Microbiology 3:1 9.