Pentilentetrazol İle Oluşturulan Kindling Modelinde Nöbet ve EEG Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Journal of Neurological Sciences [Turkish] 23:(2)# 7;84-92, 2006 http://www.jns.dergisi.org/text.php3?id=83 Olgu Sunumu Pentilentetrazol İle Oluşturulan Kindling Modelinde Nöbet ve EEG Özelliklerinin Değerlendirilmesi Füsun ERDOĞAN 1, Ayşegül KÜÇÜK 2, Asuman GÖLGELİ 2 1 Erciyes Üniversitesi, Nöroloji Anabilim Dalı, Kayseri, Türkiye 2 Erciyes Üniversitesi, Fizyoloji Anabilim Dalı, Kayseri, Türkiye Özet Bilimsel Zemin: Kimyasal kindling tekrarlayan subkonvülsif kimyasal stimülasyon ile progressif nöbet aktivitesine yol açan epilepsi ve epileptogenezisin deneysel modelini oluşturan bir işlemdir. Amaç: Pentilentetrazol(PTZ) ile oluşturulan kimyasal kindling modelinde nöbet ve EEG özelliklerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Materyal Metod: Çalışmada 24 adet erişkin erkek wistar albino rat kullanıldı. Deneklere kortikal elektrodlar yerleştirildi, gün aşırı 35mg/kg PTZ intraperitonal(ip) uygulanarak enjeksiyon sonrası 30 dakika süre EEG ve video ile nöbet kayıtları yapıldı. Gözlenen nöbetler Evre 0-5 arasında sınıflandırıldı. Kindling işlemi gün aşırı 19 kez ip PTZ enjeksiyonu ile tamamlandı, her bir enjeksiyondan sonra gözlenen nöbetlerin evrelerine göre toplam süreleri saptandı. Bulgular: Kindlingin ilk günlerinde evre 0 ve 1 nöbetlerin anlamlı şekilde daha uzun süreli iken kindlingin ilerleyen dönemlerinde evre 4 ve 5 nöbetlerin anlamlı şekilde uzun olduğu izlendi. Absans nöbetlerin deneysel modelini oluşturan evre 0 ve 1 nöbetler sırasında diken dalga deşarjlar, evre 3 miyoklonik nöbetler sırasında multipl dikenler, jeneralize klonik ve tonik klonik nöbetler sırasında hızlı multipl diken deşarjlar izlendi. Kindling süresince 3 hayvanda limbik nöbet özellikleri gözlendi. İzlenimler: PTZ ile indüklenen kimyasal kindling modelinde klinik ve EEG'de jeneralize nöbetler izlenmiştir. Az sayıda izlenen limbik nöbetler kindling işlemi sırasında limbik yapıların da etkilendiğine işaret etmektedir. Anahtar Kelimeler: Epilepsi, hayvan modeli, Pentilentetrazol, kindling The Assesment of The Features of Seizures and EEG in Pentylenetetrazol-induced Kindling Abstract Background: Chemical kindling is an experimental model of epilepsy and epileptogenesis in which repeated application of initially subconvulsive chemical stimulation induces progressive seizure activity. Objective: The assesment of the features of seizures and EEG in pentylenetetrazol (PTZ)-induced kindling. Material and Method: In this study 24 wistar albino rats were used. Cortical electrodes were implanted in the animals, 35mg/kg PTZ was injected intraperitoneally every other day,eeg and video recordings were taken for 30 minutes after injection.the seizures observed were staged as 0-5. Kindling was completed ip PTZ injections 19 times, and the total length of the sizures depending on their stages observed after injections was determined. Results: It was observed that while the stage O (absance) seizures of the beginning of kindling were found significantly longer, the stage 4 and 5 seizures were significantly longer at the advanced stages of the kindling. Spike and wave discharges during the stage of 0 and 1, which form the model of absence seizures, multipl spikes during the stage 3 myoclonic seizures, fast multiple spikes during generalized clonic and tonic-clınic seizures were observed in the EEG. Four animals exhibited the charecteristic of limbic seizures throughout kindling process. Conclusions: Generalized seizures were observed both in clinic and EEG, in PTZ-induced chemical kindling. The few limbic seizures observed indicate that limbic structures are also affected during PTZinduced kindling. Keywords: Epilepsy, animal model, Pentylenetetrazol, kindling 84

GİRİŞ Epilepsi uzun bir zaman dilimi içerisinde tekrarlayan nöbetlerin oluşumu ile karakterize kronik bir bozukluktur (17). Kindling ise elektriksel yada kimyasal subkonvülsif uyaranların tekrar tekrar uygulanması ile konvülsiyon aktivitesinde progressif yoğunlaşma ile sonuçlanan bir fenomendir. Deney hayvanında uyaran generalize konvülsiyon oluşturuyor ise kindling tamamlanmış ve bundan sonra bu anormal uyarılabilir durum kalıcı hale gelmiş demektir (8) Nöronal uyarılabilirlikteki kalıcı değişiklik sinaptik etkide plastik değişiklikler olduğunu düşündürmektedir (5) Kindling, epilepsi ve epileptogenezisin deneysel modelini oluşturur (12,20). Elektriksel ve kimyasal uyaranlar kullanılarak kindling modeli oluşturulabilir (24). Kimyasal kindling için PTZ, FG-7142 ve picrotoksin kullanılabilir (24).Kindling bir patolojik nöral plastisite formudur, elektriksel yada kimyasal yöntemlerle beyin yolaklarının tekrarlayan aktivasyonu nöbet uyarılmasına karşı progressif bir hassasiyete yol açar (11). Elektriksel kindling kompleks parsiyel epilepsinin deneysel modelini oluştururken (21) PTZ ile indüklenen kimyasal kindling primer jeneralize epilepsi modelini oluşturmaktadır (22,23). PTZ etki mekanizması tam olarak anlaşılabilmiş değildir. Genel olarak pikrotoksinin bağlanma bölgesi olan postsinaptik klor kanalları ile bağlantılı γ- aminobutirik asid tipa(gaba A ) reseptörlerine bağlanarak reseptör blokajı yaparak etkili olduğu bilinmektedir. GABA ve diğer inhibitör nörotransmitterlerin etkisini azaltarak nöronların depolarizasyonunu (18,19,23) kolaylaştırmaktadır. N-Metil-Daspartat (NMDA) reseptörleri ile düzenlenen ileti de PTZ ile indüklenen jeneralize tonikklonik nöbet oluşumunda önemli rol almaktadır (30).Düzenli olarak subkonvülsif dozda PTZ uygulanması PTZ-kindling adını almaktadır, bu uygulama ile provake olan nöbetler spesifik membran fonksiyonlarındaki bozukluklar, extra ve intrasellüler iyon miktarlarındaki değişiklikler ile artmış eksitatör ve/veya azalmış inhibitör aktivite nedeniyle görülür (4,6,7). PTZ ile indüklenen kimyasal kindling primer jeneralize epilepsi modelini oluşturduğu genel olarak kabul edilmesine rağmen (22,23) PTZ'nin kronik sekonder jeneralize nöbetlere benzer hareketlere neden olduğunu belirten veriler de mevcuttur (4). Biz bu çalışmada ratlarda PTZ ile indüklenen kindling modelinde nöbet ve EEG özelliklerini incelemeyi planladık. GEREÇ VE YÖNTEM Çalışma için gerekli etik kurul onayı alındıktan sonra deney hayvanları Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel ve Klinik Araştırmalar merkezinden sağlandı. Çalışmada 24 adet 50-60 günlük, 180-250 gr ağırlığında erkek wistar albino rat kullanıldı. Hayvanlar 12 saatlik karanlık aydınlık siklüsünde, yiyecek ve suya serbest olarak ulaşabilecekleri bir ortamda bulunmaktadırlar. Kortikal EEG kaydı için kayıt elektrodları kafa kemiğine yerleştirildi. Ratlara bu işlem için anestezi ketamin (100mg/kg intraperitoneal) ve xylazine (20mg/kg intraperitoneal) kullanılarak yapıldı. Anestezi sonrası kafaya orta hat insizyonu uygulanarak kafa derisi açıldı. Elektrodlar frontal, parietal ve serebellar bölgeye vida yardımı ile sabitlendi, daha sonra soğuk akrilik ile üzeri kapatılarak kafa derisi sütüre edildi (2). Elektrodlar yerlaştirildikten 1 hafta sonra PTZ-kindling işlemine başlandı. Tüm deneyler saat 10-12 arasında sessiz bir odada ve oda ısısı 22-24ºC olduğu halde gerçekleştirildi. Tüm ratlara 38 gün süre ile gün aşırı PTZ 35mg/kg dozunda ip enjekte edildi. Enjeksiyondan sonraki 30 dakika süre ile ratların EEG kayıtları alındı (EEG100B; Biopac sistem), nöbetleri gözlenerek video kayıtları alındı ve aşağıdaki gibi skorlandı (13) : Evre 0. Cevap yok Evre 1. Kulaklar ve yüzde seyirmeler Evre 2.Vücuda yayılan konvülsif dalga Evre 3. Myoklonik jerkler yada arka ayaklar üzerinde şaha kalkma Evre 4. Hayvanın olduğu yere düşmesi ile birlikte klonik nöbetler Evre 5. Tekrarlayan şiddetli tonik-klonik yada ölümcül nöbetler İSTATİSTİKSEL ANALİZ PTZ-kindling işlemi süresince her bir enjeksiyondan sonraki yarım saat süre içinde gözlenen nöbet tiplerinin süreleri Friedman 85

repeated measure analysis of variance on ranks' testi ile değerlendirildi. İstatistiksel olarak anlamlı farklılık saptandığında hangi değerin diğerinden farklı olduğunun değerlendirilmesinde de çoklu karşılaştırma işlemi Dunn metodu ile yapıldı. Tüm değerlendirmeler için P<0.05 değeri elde istatistiksel olarak anlamlı farklılığı göstermekte idi. BULGULAR Kindlingin başlangıcında evre 0 ve 1 nöbetlerin anlamlı şekilde daha uzun süreli olduğu görülürken (tablo 1; grafik 1,2) kindlingin sonlarına doğru evre 4 ve 5 nöbetlerin istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde sürece uzama gösterdiği izlendi (Tablo 1; grafik 5,6). Evre 2 ve 3 nöbetlerde kindlingin başlangıcında daha uzun süreli gözükürken bu nöbetler için istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı (Tablo 1; grafik 3,4). Posthoc analiz sonucu evre 0 nöbetlerin 1. enjeksiyonda 6. enjeksiyondan 19 enjeksiyona kadar olan zamanda görülen evre 0 nöbetlerden anlamlı olarak sürece daha uzun olduğu, ikinci enjeksiyonda açığa çıkan evre 0 nöbetlerin ise 14. enjeksiyondan 19.enjeksiyona kadarki zaman dilimi içinde görülen evre 0 nöbetlerden istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdiği izlendi. Evre 1 nöbetlerin ilk 6 enjeksiyonda daha sonraki enjeksiyonlara göre sürece anlamlı şekilde daha uzun olduğu saptandı. Evre 4 nöbetler için 15. enjeksiyondan sonra açığa çıkan nöbetlerin özellikle 4-7. enjeksiyonlar sırasında açığa çıkan nöbetlere göre sürece anlamlı olarak uzun olduğu saptandı. Evre 5 nöbetler için özellikle 10. enjeksiyondan sonra nöbet sürelerinin ilk 6 enjeksiyona oranla istatistiksel olarak anlamlı uzun olduğu saptandı. Tablo 1:. Kindling günlerinde izlenen nöbet sürelerinin evrelerine göre karşılaştırılması 86

Grafik 1: Evre 0 nöbetler Grafik 2: Evre 1 nöbetler Grafik 3: Evre 2 nöbetler 87

Grafik 4: Evre 3 nöbetler Grafik 5: Evre 4 nöbetler Grafik 6: Evre 5 nöbetler 88

Çalışma sonlanıncaya kadar toplam 12 hayvan nöbetler sırasında öldü, mortalite % 50 olarak belirlendi. PTZ ile oluşturulan kindling modelinde evre 4 ve 5 nöbetlerin tekrarlayan subkonvülsif dozda PTZ enjeksiyonu ile belirgin olarak artış gösterdiği saptanmıştır. PTZ kindling işlemi sırasında 3 hayvanda limbik nöbetlerde gözlenen ıslak köpek silkinmeleri (wet dog shake), 2 hayvanda tek ön ekstiremitede klonik kasılmalar izlendi. Evre 4 nöbetlerin peşpeşe tekrarı ile sonra açığa çıkan vahşi koşu hayvanları tamamında gözlendi.yine evre 3 nöbetler öncesi hareketsiz duruşa eşlik eden kuyrukta dikleşme ile karakterize nöbetler 6 hayvanda izlendi. EEG BULGULARI Nöbetler süresince izlenen EEG'de evre 0 ve 1 nöbetler sırasında diken-dalga deşarjları gözlendi(fig.1). Evre 2 ve 3 nöbetlerde multipl diken aktivitesi saptandı(fig 2). Evre 4 nöbetler sırasında nöbet süresince devam eden multipl dikenler(fig 3) ve evre 5 nöbet sırasında nöbet süresince devam eden hızlı diken dalgalar (fig 4) gözlendi. Figur 1: Evre 0 ve 1 nöbetler sırasında açığa çıkan diken-dalga deşarjları Figur 2: Evre 2 ve 3 nöbetler sırasında izlenen kısa süreli multipl diken aktivitesi Figur 3: Evre 4 nöbet sırasında izlenen uzun süreli multpl diken aktivitesi 89

Figur 4: Evre 5 nöbet sırasında izlenen hızlı multipl diken aktivitesi TARTIŞMA Bu çalışmada amacımız ratlarda PTZ ile indüklenen kindling modelinde nöbetlerin klinik ve EEG özelliklerini değerlendirmek idi. Kindling kriterlerini sağlayabilmek uygulanan yöntem ve hayvanın türüne göre 15 ile 38 gün arasında gerçekleşmektedir (1,3). Ayrıca denek hayvanları evre 4 ve/veya evre 5 nöbeti ardışık iki enjeksiyon döneminde geçirdiklerinde kindling gerçekleşmiş olarak değerlendirilmektedir (28). Bizim tüm denek hayvanlarımızda evre 4 ve 5 nöbetler ardışık olarak açığa çıktı. Çalışmamızda kindlingin erken döneminde evre 0 ve 1 nöbetler daha uzun süreli kindlingin ilerleyen dönemlerinde evre 4 ve 5 nöbetlerin diğer nöbetlere göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde uzun olduğu izlendi. Geçirilen nöbetlerin süresine bağlı olarak EEG'de gözlenen epileptik deşarjlarda da artış olduğu saptandı. Evre 0 ve 1 nöbetler sırasında EEG'de diken-dalga deşarjlarla birlikte zaman zaman multipl diken dalga aktivitesi gözledik. Düşük dozda uygulanan PTZ ile oluşturulan bu tip nöbetlerin insanlarda görülen absans epilepsisinin hayvan modelini oluşturduğu bilinmektedir (26). Bu tip nöbetler ratlarda EEG'de diken-dalga deşarjları ile birlikte davranışlarda duraklama ve yüzde, bıyıklarda seyirmelerle karakterizedir (25). Evre 2 ve 3 nöbetler sırasında ki bu nöbetlerde myokloniler belirgin olarak gözlenmektedir, EEG'de PTZ ile indüklenen myokloniler sırasında Cheryl ve arkadaşları (10) tarafından bildirildiği gibi klinikte açığa çıkan myoklonik nöbetin süresi ile eş zamanlı olarak ritmik hızlı multipl dikenler izlendi. Evre 4 klonik nöbetler sırasında ise yine multipl dikenler ve tonik fazla birlikte görülen evre 5 nöbetlerde ise hızlı diken aktivitesi saptandı. Benzer bulgular Keogh ve arkadaşları tarafından PTZ ile indüklenen nöbetlerde bildirilmiştir (15). PTZ kindling işlemi sırasında 3 hayvanda limbik nöbetlerde gözlenen ıslak köpek silkinmeleri (wet dog shake), 2 hayvanda tek ön ekstiremitede klonik kasılmalar, evre 4 nöbetlerin peşpeşe tekrarı ile sonra açığa çıkan vahşi koşu tüm hayvanlarda gözlendi. Vahşi koşu PTZ ile indüklenen nöbetlerin klinik bulguları arasında yer almaktadır (9,14) Yine evre 3 nöbetler öncesi hareketsiz duruşa eşlik eden kuyrukta dikleşme ile karakterize nöbetler (14) 6 hayvanda izlendi. Kindling işlemi süresince nadir olarak izlenen ıslak köpek silkinmeleri PTZ ile oluşturulan nöbetler sırasında Van Camp ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir (29), limbik nöbetlere özgü olan bu klinik bulgu (16) PTZ-kindling işlemi sırasında oluşan limbik yapılardaki etkilenmenin bir göstergesi olabilir. Çalışmamız PTZ kindling oluşturulurken erken dönemde absans nöbetlerin daha sık açığa çıkarken ilerleyen dönemlerde jeneralize klonik ve tonik-klonik nöbetlerin açığa çıktığını ve EEG de ise absans nöbetler eşlik eden diken-dalga deşerjlarıın, myoklonik nöbetler sırasında multipl dikenler ve jeneralize klonik ve tonik-klonik nöbetler sırasında hızlı multipl diken dalgaların PTZkindling işlemindeki elektrofizyolojik bulgular olduğunu göstermektedir.ptzkindling modeli jeneralize nöbetleri temsil etmekle birlikte bu işlem sırasında muhtemelen limbik yapıların etkilenmesine bağlı olarak nadir de olsa limbik nöbet özellikleri de izlenebilmektedir. 90

KAYNAKLAR 1. Atack JR, Cook SM, Hutson PH, File SE. Kindling induced by pentylenetetrazol in rats is not directly associated with changes in the expression of NMDA or benzodiazepine receptors. Pharmacol Biochem Behav.2000;65:743-750. 2. Ateş N, Akman Ö, Karson A. The effects of the immature rat model of febrile seizures on the occurance of later generalized tonic-clonic and absance epilepsy. Dev Brain Res. 2005;154:137-140. 3. Becker A, Grecksch G, Thiemann W, Hollt V. Pentylenetetrazol-kindling modulates stimulated dopamine release in the nucleus accumbens of rats. Pharmacol Biochem Behav.2000;66:425-428. 4. Bradford HF. Glutamate, GABA and epilepsy. Epilepsia. 1989;30:17-25. 5. Cooper JR, bloom FE. The biochemical basis of neuropharmacology Roth RH(Eds). Oxford University press;new York,1996:126-193. 6. De Boer T, stoof JC, van Duijn H. The effects of convulsant and anticonvulsant drugs on the release of radiolabeled GABA,Glutamate, noradrenaline, serotonine and acetylcholine from rat cortical slices. Brain Res. 1982;253:153-160. 7. De Deyn PP, Macdonald RL. Effects of antiepileptic drugs on reduction of GABA responses by PTZ and DMCM on mouse neurons in cell culture. Prog Neurobiol. 1995;47:477-511. 8. Elmer E, Kokaia M, McIntyre DC,Londavall O. Epileptogenesis induced by rapidly recurring seizures in genetically fast-but not slow-kindling rats. Brain Res. 1998;789:111-117. 9. Erdoğan F, Gölgeli A, Arman F, Ersoy A. The effects of pentylenetetrazol-induced status epilepticus on behavior, emotional memory, and learning in rats. Epilepsy behav.2004;5:388-393. 10. Frye CA, Muscatiello NA. 3α, 5β-THP in the raphe magnus attenuates PTZ-induced myoclonic seizures. Brain Res. 2001;911:146-151. 11. Goddard G. Development of epileptic seizures through brain stimulation at low intensity. Nature. 1967;214:1020-1021. 12. Goddard G, McIntyre DC, Leech CK. A permanent change in brain function resulting from daily electrical stimulation. Exp Neurol. 1969;25;295-330. 13. Grecksch G, Becker A, Rauca C. Effects on age on pentylenetetrazol-kindling and kindling-induced impairments of learning performance. Pharmacol Biochem Behav. 1997:56:595-601. 14. Itoh K, Watanabe M, Yoshıkawa K, Kanaho Y, Berliner LJ, Fujı H. Magnetic resonance and biochemical studies during pentylenetetrazol- kindling development: The relationship between nitric oxide, neural nitric oxide synthase and seizures. Neuroscience.2004;129:757-766. 15. Keogh BP, Cordes D, Stanberry L, Figler BD, Robbins CA, Tempel BL, et all. BOLD-fMRI of PTZ-induced seizures in rats. Epilepsy Res. 2005;66.75-90. 16. Lothman EW,Collins RC.Kainic acid induced limbic seizures. Metabolic, behavioral, electroencephalographic and neuropathologic corelates. Brain Res.1981:218:299-318. 17. Lowestein DH. Status epilepticus. N Engl J Med.1998;338:970-976. 18. Macdonald RL, Barker JL. Phenobarbital enhances GABA-mediated postsynaptic inhibition in cultured mammalian neurons. Trans Am Neurol Assoc. 1977;102;139-140. 19. Macdonald RL, Barker JL. Different actions of anticonvulsant and anhestetic barbiturates revealed by use of cultured mammalian neurons. Science. 1978;200:775-777. 20. Mason CR, Cooper RM. A permanent change in convulsive treshold in normal and brain-damaged rats with repeated small doses of pentylenetetrazol. Epilepsia. 1972;13;663-674. 21. McNamara JO. Kindling:an animal model of complex partial epilepsy. Ann neurol. 1984;168suppl):S72-76. 22. Ono J, Vieth RF, Walson PD. Electrocorticographical observation of seizures induced by pentylenetetrazol injections in rats. Funct Neurol. 1990;5:345-352. 23. Rossi R. Sensitization induced by kindling and kindling related phenomena as a model for multiple chemical sensitivity. Toxicology 1996;111:87-100. 24. Schmoll H, Badan I, Grecksch G, Walker L, Kessler C, Popa-Wagner A. Animal Model: Kindling status in sprague-dawley rats induced by pentylenetetrazole. Am J Pathology. 2003;162:1027-1034. 25. Snead OC III. Evidence for GABAB-mediated mechanisms in experimental generalized absence seizures in rat. Neuroscience Letters.1992;148:15-18. 26. Snead OC III, Depaulis A, Vergnes M, Marescaux C. Absence epilepsy: advences in experimental models.in: Jasper's basic mechanism of the epilepsies, 3rd edn: advances in Neurology,Vol. 79 (Eds a.v.delgado Escueta, WA Wilson, RW Olsen and RJ Porter) Philadelphia, Lippincot Williams and Wilkins, 1999:pp253-278. 27. Squires RF, Crawley JN, Skolnick P, Paul SM. Convulsant potencies of tetrazole are highly correlated with action on GABA/picrotoxin receptor complexes in brain. Life Sci. 1984;35:1439-1444. 28. Szyndler J, Rok P, Maciejak P, Walkowiak J, Czlonkowska A, et all. Effects of pentylenetetrazolinduced kindling of seizures on rat emotional behavior and brain monoaminergic systems. Pharmacol Biochem Behav.2002;73:851-861. 29. Van Camp N, D'Hooge R, Verhoye M, Peeters RR, De Deyn PP, Van der Linden A. Simultanous electroencephalographic recording and functional magnetic resonance imaging during pentylenetetrazolinduced seizures in rat. NeuroImage.2003;19:627-636. 30. Velisek L, Kusa R, Kuluvana M, Mares P. Exitatory amino acid antagonist and pentylenetetrazol-induced seizures during ontogenesis: I. The effects of 2-amino- 7phosphonoheptonate. Life Sci. 1990;46:1349-1357. İletişim: Füsun Erdoğan E-mail: ferdogan@erciyes.edu.tr Geliş Tarihi: Aralık 23 2005 Kabul Tarihi: Ocak 19 2006 The Online Journal of Neurological Sciences (Turkish) 1984-2005 This e-journal is run by Ege University Faculty of Medicine, Dept. of Neurological Surgery, Bornova, Izmir-35100TR as part of the Ege Neurological Surgery World Wide Web service. 91

Comments and feedback: E-mail: editor@jns.dergisi.org URL: http://www.jns.dergisi.org Journal of Neurological Sciences (Turkish) ISSNe 1302-1664 92