INFINITI RVP Plus Testi Kullanım Talimatı In Vitro Diagnostik Kullanım İçin SADECE İHRACAT İÇİN Üretim Yeri: AutoGenomics, Inc., 2980 Scott Street, Vista, CA USA 92081 Yetkili AB Temsilcisi: BÜHLMANN Laboratories AG Baselstrasse 55 CH-4124, Schönenbuch, Switzerland 1 of 10
KULLANIM AMACI AutoGenomics INFINITI RVP Plus testi insan nazofaringeal aspiratındaki (NPA) belirli respiratuar virüsleri tesbit etmek ve tanımlamak için tasarlanmış in vitro diagnostik bir metottur. Bu test diğer mevcut laboratuvar ve klinik bilgileri ile birlikte kullanılmalıdır, tek başına tanı amaçlı kullanılamaz. TEST TANIMI INFINITI RVP Plus testinin tesbit ettiği ve tanımladığı nazofaringeal aspiratındaki (NPA) respiratuar virüsleri aşağıda verilmiştir; Virüs Viral Tip Adenovirus A, A-Swine H1N1and B Grip 1, 2, 3, 4 İnsan Parainfluenza Virüsü (HPIV) A and B Rinovirüs A, B, C, D Enterovirus HKU1, OC43, NL63, 229E Coronavirüs A and B Insan metapnömovirüs (HMPV) A and B İnsan Solunum Sinsityal (HRSV) A, B, C, E INFINITI RVP Plus testi primer uzatılması ve entegre moleküler bir cihazda mikroarray hibridizasyonu tarafından takip edilen çoklu PCR çalışmasından oluşmaktadır. INFINITI RVP Plus testialtı temel prosese dayanır; Viral RNA nın ters transkripsiyonu Komplementer DNA nın çoklu PCR amplifikasyonu Spesifik algılama primer uzatması(dpe) ile PCR ürününün floresans etiketlenmesi Etiketli PCR ürününün microarraylerde hibridizasyonu Microarrayin taranması Sinyal tesbiti ve analizi Ters transkripsiyon ve çoklu PCR amplifikasyonu cdna ile cihaz aktif değilken gerçekleştirilir. Prosesin geri kalanı INFINITI Analizörü tarafından otomatikleştirilmiştir. UYARILAR VE ÖNLEMLER Gereksinimler In vitro diagnostik kullanım için. Eğitimli laboratuar personeli tarafından kullanılmalıdır. Bu test sadece insan nazoferingeal aspiratı ile çalışılmalıdır. Tüm hasta numuneleri potansiyel tehlike taşımaktadır ve insan kaynaklı materyaller çok dikkatli işlenmelidir. Hiçbir test yöntemi HCV, HIV veya diğer bulaşıcı ajanların bulunmadığına dair tam bir güvence vermez. CLSI talimatlarını takip ediniz (Molecular Diagnostics Methods for Infectious Diseases; Approved Guidelines; MM3-A). Örneklerin hazırlanmasından sonra durumlarını gözlemleyin. Özellikle örnek bütünlüğünün bozulduğunu gösteren belirtilere dikkat edin. ( buharlaşma, hacimde azalma, çökme, saçılma, renk bozulması, sedimentasyon, ayrılma, bulanıklık vb.). Herhangi bir olağandışılık gözlemlerseniz testi çalışmayınız. Kontaminasyon, saçılma veya örnek karışmasını engellemek için örnekler çok dikkatli çalışılmalıdır. Örneklerin karışmasını önlemek için açıkça etiketleyiniz. 2 of 10
Örnekleri gerekli koşullarda saklayınız. Çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için, numune hazırlama, PCR reaksiyonunu hazırlamak ve PCR ürün analizi gibi işlemler CLSI de olduğu üzere onaylanmış talimatlara göre yapılmalıdır(molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases: Approved Guideline). Farklı lotlardan reaktifleri karıştırmayın/havuz yapmayın. Son kullanım tarihi geçmiş kit veya reaktifleri kullanmayın. Reaktifleri ve kitleri ürün etiketine yazan koşullara göre saklayın. Laboratuar İşlemleri Laboratuar kullanımı için normal önlemleri izleyin. Ayrı kaplarda veya farklı lotlardaki reaktifleri karıştırmayın. Güvenli laboratuar prosedürlerini izleyin: ağız ile pipetleme yapmayın; koruyucu giysiler (örneğin, tek kullanımlık eldiven, laboratuar önlüğü gibi) ve koruyucu gözlük takın; laboratuarda çalışma alanlarında yemek yemeyin, içecek ve sigara içmeyin. Numunelere ve reaktiflere dokunduktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Atıkların İşlenmesi Kullanılmayan reaktif, örnek ve atıkları bulunduğu ülke, federal, eyalet ve yerel yönetmeliklere göre imha edin. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) AutoGenomics Müşteri Hizmetleri tarafından istek üzerine gönderilebilir. INFINITI Analizörü Cihazı kullanmadan önce INFINTI Analizör Kullanıcı El Kitabı nı okuyun. "Notlar" a özellikle dikkat edin. Kullanıcı El Kitabı nde Güvenlik Uyarıları ve Dikkat Edilmesi Gerekenleri izleyin. Cihazı kurarken Kurulum Gereksinimleri Bölümü ne bakın. Cihaz çalışırken hata ile karşılaşıldığında Hatalar Bölümü ne bakın. Bir sorun ile karşılaşıldığında Yardım Bölümü ne bakın. SAKLAMA/STABILITE BioFilmChip Microarray: 12 ay Oda Sıcaklığında (15 C ila 30 C) Intellipac Reaktifi: 12 ay Buzdolabında (2 C ila 8 C) Not: Açıldıktan 30 gün sonra Intellipac kullanmayın. Amplifikasyon Mix: 18 ay Dondurucuda (-30 C ila -15 C) Not: Ürünlerin son kullanma tarihi ürün üzerindeki etiketlerde bulunmaktadır. 3 of 10
SAĞLANAN MATERYALLER (Her paket 48 test içermektedir.) AutoGenomics Katalog Kodu: 04-1110-02 INFINITI RVP Plus Testi BioFilmChip Microarray Magazin Katalog Kodu: 04-2110-02 INFINITI RVP Plus Testi Intellipac Reaktif Modülü. Her testte 24 modül bulunmaktadır. İçeriği; Rxn Master Mix dntp ler Etiketlenmiş-dCTP Tesbit Spesifik Primer Mix Uzatma Reaksiyonu Tamponu Hibridizasyon Tamponu Katalog Kodu: 04-3110-02 INFINITI RVP Plus Testi Amplifikasyon Mixi. 4 x 250µl vial PCR reaksiyonu master mix bulunmaktadır. İçeriği; dntp ler Multiplex Primers Mix MgCl 2 Reaksiyon Tamponu Katalog Kodu: 12-0010-00: Yıkama Tamponu GEREKEN VE AUTOGENOMICS TARAFINDAN SAĞLANMAYAN REAKTİFLER RNA extraction kit (QIAmp Viral mini kit, Qiagen Katalo Kodu 52906) Zırhlı RNA: Armored RNA-Hepatitis C Virus (Genotype 1a) in TSM III Buffer, 250 µl (Asuragen Diagnostics, Katalog Kodu 42004) Ters transkripsiyon kiti: SuperScript III Supermix kit for 50 reactions (Invitrogen Katalog Kodu 18080400). Platin Taq DNA polimeraz (Invitrogen, Catalog Number 10966034) Titanyum Taq DNA polimeraz (Clontech Katalog Kodu 639209) SAP (USB Katalog Kodu 70092Z) EXO I (USB Katalog Kodu 70073Z) Distile su (DNAaz ve RNAaz sız) EKİPMANLAR ve SARF MALZEMERİ Aşağıdaki ekipmanlar gereklidir fakat test ile beraber sağlanmamaktadır: AutoGenomics Ürün Kodu 10-0010-00: INFINITI Analizör - Qmatic işletim yazılımı ile birlikte AutoGenomics Ürün Kodu 11-0010-00: INFINITI Pipet uçları AutoGenomics Ürün Kodu 11-0020-00: INFINITI Atık treyleri AutoGenomics Ürün Kodu 11-0030-00: INFINITI 24 well plate/lidler AutoGenomics Ürün Kodu 11-0050-00: INFINITI Temp Cycle Plate AutoGenomics Ürün Kodu 11-0060-00: INFINITI Atık trey / Stir Bars Mini santrifüj Pipet uçları Mikrofüj tüp rakları Termocycler Vortex PCR için 0.2 ml inceliğinde Wall tüpleri 4 of 10
1.5 ml mikro santrifüj tüpleri AutoGenomics NUMUNE Nazofaringeal aspirat (NPA) RNA ekstraksiyonuna kadar -80 C de tutulmalıdır. Çözüp dondurma işleminden kaçınınız. RNA EKSTRAKSİYONU Nükleik asit ekstraksiyonundan önce NPA yı çözünüz.(buzda) Pozitif Kontrol: RNA ekstraksiyonunu kontrol etmek için, RNA ekstraksiyonundan önce 1.0 µl zırhlı RNA yı 200 µl çözülmüş numuneye ekleyin. Otomatik ekstraksiyon metotları ile çalışırken 2.0 µl zırhlı RNA kullanın. QIAmp Viral RNA Mini Kit ile nükleik asit ekstraksiyonu yaparken üretici tarafından önerilen talimatları takip ediniz. Final elüsyon hacmi (40 µl) -80 C de saklanır. RNA ile çalışırken, tüpü her zaman buzda tutunuz. SUPERSCRIPT III RT SUPERMIX KULLLANARAK cdna SENTEZİ Ters transkripsiyon gerekli tüm inkübasyon süreleri ve sıcaklıkları karşılamak için programlanmış bir PCR cihazı içinde gerçekleştirilir. Eğer zırhlı RNA kontrol ekstraksiyondan önce eklenmediyse, ekstraksiyondan sonra eklenebilir. 0.6 µl 1:3 sulandırılmış zırhlı RNA (RNAaz sız su kullanın) 9.4 µl RNA post ekstraksiyonuna eklenir. Geri transkripsiyon reaksiyonu mix i; 1 µl Random Primerler 1 µl Annealing Tamponu 10 µl Ekstrakte edilmiş RNA Karışım, 70 C de 5 dakika inkübe edilmeli, ardından PCR bloğunda 4 C ye soğutulmalıdır. Ardından, aşağıdaki reaktifler eklenmelidir : 10 µl of 2X ilk iplikçik reaksiyon tamponu 2 µl of enzim mix 25 C de 5 dakika inkübe edin, sonrada 50 C de 50 dak. 85 C de 5 dak inkübe ederek enzimi inaktive edin. cdna PCR da kullanılmak üzere hazırdır. PCR REAKSİYONU Amplifikasyon mix ini oda sıcaklığına getirin. Platin Taq ı buz üstünde tutun. PCR reaksiyonunu aşağıdaki gibi kurunuz. 24 kuyucuklu plate kullanınız. Amplification Mix 17.4 µl Platin Taq 0.1 µl cdna Örnekleri 2.5 µl Toplam Hacim 20.0 µl 24 kuyucuklu platei aşağıdaki koşullarda ayarlanmış termocyclera yerleştirin; 5 of 10
Basamaklar Sıcaklık C Süre Döngü Sayısı 1 94 2 dak 1 94 30 sn 2 55 30 sn 39 72 1 dak 3 72 3 dak 1 4 4 Bekle 1 SAP/EXO PROTOKOLÜ PCR sonrası temizlik, geride kalan maddelerin sinyal amplifikasyonu ile interferans vermesini engellemek adına kritik önem taşımaktadır. Enzim karışımını örnek sayınızdan fazla hazırlayın. Örneğin; 10 PCR reaksiyonu yapacaksanız, 12 tanesine yetecek kadar master mix hazırlayın: 36 µl SAP, 9 µl Exo ve 6 µl Titanyum Taq SAP 3.00 µl / örnek Exo 0.75 µl / örnek Titanyum Taq 0.50 µl / örnek Total 4.25 µl Her reaksiyona 4.25 µl enzim mix ini koyun, hafifçe vortexleyin, 24 kuyucuklu plate ile termal cycler a yerleştirin. Termal cycler koşulları: Basamaklar Sıcaklık Süre 1 37 C 20 dak 2 94 C 10 dak 3 4 C Bekle INFINITI ANALİZÖRE ÖRNEK YÜKLEME INFINITI Analizör üzerine işlenmiş PCR ürünü SAP / Exo içeren 24 kuyulu platei yerleştirin. 24-well pleyti INFINITI Analizöre yükleyiniz. Test spesifik magazin, Intellipack pipet uçları ve yıkama solusüsyonlarını cihaza yükleyiniz. SONUÇLARIN YORUMLANMASI INFINITI RVP Plus testi belirli solunum virüslerini tesbit etmek ve belirlemek için tasarlanmıştır. Denemenin sonuçları belirli bir virüsün varlığı veya yokluğuna bağlı olarak POZİTİF veya NEGATİF olarak verilir. Sonuç sayfasında RNA-D kontrolü negatif ise, örnek tekrar çalışılmalıdır. Deneme tamamlanamaz veya sonuç raporu görülmez ise deneme tekrarlanmalıdır. Neden sonuç verilemediğini belirten bir mesaj gözlenirse, bu mesaj Error Log a kaydolacaktır. Lütfen hatanın tanımlanmış olabileceği INFINITI Analizör Kullanıcı El Kitabı nın Arıza Teşhisi kısmına başvurunuz veya AutoGenomics teknik servisine başvurunuz. 6 of 10
KISITLAMALAR AutoGenomics INFINITI RVP Plus testi bu paket içeriğinde listelenmiş solunum virülerini tesbit etmek ve tanımlamak için tasarlanmıştır. Deneme diğer virüsleri rapor etmez ve diğer virüslerin varlığı veya yokluğu üzerinde bir iddiada bulunmaz. Negatif sonuçlar virüs enfeksiyonunun olabileceği ihtimalini dışlamaz ve tek başına tedavinin temellendirilmesi veya diğer hasta yönetimi kararlarının alınmasında kullanılamaz. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik Spesifite Özgüllük ile ilgili çalışmalar analiz gelişimi sırasında yapılmıştır. Testte üç seviyede özgüllük çalışılmıştır. PCR primerleri ASP hedef bağlama bölgesi ASP çip bağlama bölgesi PCR primer özgünlüğü bir jel üzerinde amplikon boyutuna göre belirlenmiş ve amplikon sıralaması yapılmışır. ASP primer özgünlüğü bilinen genomik örnekleri kullanılarak test tarafından gönderilen doğru genotipler ile tespit edilmiştir. Prob un yakalama spesifitesi farklı oligoların hibridizasyonu ile tespit edilmiştir ve sadece bilinen noktaya doğru oligo hibridleşmesini göstermektedir. Çapraz Reaktivite Çapraz reaktiflik çalışmaları bakteriyel patojenler ve aşağıda listelenen solunum yolu virüslerinin varlığında INFINITI RVP Plus Testinin özgüllüğünü etkilemediğini göstermek için yapılmıştır. Bakteriler Streptococcus pneumoniae Bordetella pertusis Legionella pneumophila Bordetella parapertussis Bordetella holmesii Virusler Adenovirus C HRSV-A Adenovirus C HRSV-A and HMPV-V Coronavirus HKU1 HRSV-B Coronavirus HKU1 HRSV-B Enterovirus A HRSV-B Flu A (not S-OIV) HRSV-B Flu A (not S-OIV) Negative Flu B Parainfluenza virus 1 HMPV-A Parainfluenza virus 3 HMPV-B Parainfluenza virus 3 HRSV-A Parainfluenza virus 4 HRSV-A 7 of 10
Tesbit Limiti Analitik duyarlılık çalışmaları amplikonlar kullanılarak yapılmıştır. INFINITI RVP Plus testinin hassaslığı HRSV B ve HMPV A için 10 kopya hedef DNA dan parainfluenza virüsleri tip 2 ve 3 ve koronavirüs 229E için 2.500 kopya ve parainfluenza virüsleri tip 1 için 5.000 kopya ile ayarlanmıştır. H1N1 için INFINITI RVP Plus testinin analitik duyarlılığı (LoD) tespit edilmesinde iki örneğin 500 adet olmak üzere bir seri dilüsyonu kullanılmıştır. Deneme Hassasiyeti ve Tekrarlanabilirlik Konumlar arası, operatörler arası ve cihazlar arası tekrarlanabilirliği göstermek için üç konumlu bir tekrarlanabilirlik çalışması yürütülmüştür. Bir lot reaktif kullanılmıştır; her konumda bir kullanıcı ve bir cihaz vardır. Her konuma üretilmiş nazofarengeal birbirinin aynı 12 örnek verilmiştir. RNA tekrarlanabilirlik örneklerinden, örnekler ulaşır ulaşmaz ekstrakte edilmiştir. Her deneme günü, ekstrakte edilmiş RNA ikişer örnek halinde talimatlarına uygun olarak çalışıldı. 6525 virüsün varlığını tespit etmek için toplamda 261 test çalışıldı. (261 test x her örnek için 25 virüs ) Tablo 1 de üç konumlu tekrarlanabilirlik çalışmasının özeti görülmektedir; 8 of 10
# Calls Doğru Çağrılar Yanlış Çağrılar Toplam Pozitif Negatif # Doğru Çağrılar % Doğru Çağrılar # Yanlış Poz # Yanlış Neg Adeno A 261 0 261 261 100% 0 0 Adeno B 261 0 261 261 100% 0 0 Adeno C 261 22 239 257 98.5% 1 3 Adeno E 261 0 0 261 100% 0 0 CorOC43 261 0 0 261 100% 0 0 CorHKU1 261 0 0 261 100% 0 0 Cor229E 261 0 0 261 100% 0 0 CorNL63 261 22 239 258 98.8% 1 2 EnteroA 261 0 0 261 100% 0 0 EnteroB 261 22 239 258 98.8% 1 2 EnteroC 261 0 0 259 99.2% 1 1 EnteroD 261 0 0 261 100% 0 0 RhinoA 261 22 239 261 100% 0 0 RhinoB 261 0 0 261 100% 0 0 FluA 261 21 240 257 98.5% 0 4 H1-s 261 20 241 259 99.2% 2 0 FluB 261 22 239 261 100% 0 0 HmpvA 261 22 239 251 96.2% 8 2 HmpvB 261 22 239 261 100% 0 0 HRSV-alpha 261 22 239 256 98.1% 2 3 HRSV-beta 261 22 239 259 99.2% 2 0 Para1 261 0 0 261 100% 0 0 Para2 261 0 0 261 100% 0 0 Para3 261 22 239 255 97.7% 0 6 Para4 261 0 0 261 100% 0 0 TOPLAM 6525 261 6264 6484 99.4% 18 23 9 of 10
Lottan lota tekrarlanabilirlik çalışması bir konumda üç lot kullanılarak yapılmıştır. Çalışmada bir kullanıcı ve bir cihaz yer almaktadır. Aynı 12 tekrarlanabilirlik örneği kullanılmıştır. Tablo 2 de lottan lota tekrarlanabilirlik çalışmasının sonuçları özetlenmiştir; Tablo 2 Lot # test edilen örnekler Çağrı a veren örnekler Doğru b çağrı veren örnekler İlk çalışma Yanlış çağrı c veren örnekler Çağrı d vermeyen örnekler Doğru çağrı oranı e (%) Lot 1 118 118 111 7 0 94.1% Lot 2 24 24 23 1 0 95.8% Lot 3 f 24 20 15 5 4 75.0% Lot 4 f 24 24 24 0 0 100% a b c d e f Poitif veya negatif çağrının yapıldığı örnekler. Doğru çağrıların yapıldığı örnekler. Çağrı vermeyen örnekleri içermez. yanlış sonuç veren örnekler. ( yalancı pozitif, yalancı yanlış negatif) Çağrı vermeyen örnekleri içermez. Sonuç vermeyen örnekler. sonuç veren doğru sonuç veren örnekler. Çağrı vermeyen örnekleri içermez. Lot 3 de kullanıcı örneği hatası olduğundan çalışmaya Lot4 eklenmiştir. Klinik Performans- Metot Karşılaştırılması İkiyüz yirmi bir (221) nazofaringel aspirat (banked) INFINITI RVP Plus testi kullanılarak test edilmiştir ve sonuçlar Real-Time PCR ile karşılaştırılmıştır. Her iki yöntemdeki sonuçlar her numune için karşılaştırıldı ve örneklerin tanıda uyumunun % 94.1 oranında olduğu gözlendi. Her virüs için spesifik bir tanı olarak kabul edildiğinde, iki yöntem arasında HRSV tip A ve B, parainfluenza virüsleri, HMPV tip B ve koronavirüs OC43 için % 100 uyum gözlendi. % 5.9 (13/221) Uyuşmayan sonuçlu örneklerinden (sadece qrt-pcr ile pozitif), 7 si adenovirüsleri, 2si coronavirüsleri NL63, 1i koronavirüs HKU1, 1i HMPV A, A 1 grip ve 1i picornavirus idi. Uyuşmayan numuneler DNA dizilimi ile teyit edilmiştir. Yedi uyuşmayan numune DNA dizilimi tarafından teyit edilmiştir. qrt-pcr testi ile yapılan adeno virüs için pozitif beş numune teyit edilememiştir. qrt-pcr testinde coronavirus NL63 için pozitif bulunan bir numune, aynı zamanda INFINITI RVP testi ile equivocal coronavirus 229E için sinyal verirken DNA dizileme yöntemi ile de 229E için pozitif bulunmuştur. Bu durum qrt-pcr testinde muhtemel bir özgünlük problemine işaret etmektedir. qrt-pcr testi ve DNA dizilimine kıyasla INFINITI RVP testinde yalancı pozitiflik görülmemiştir. Kıyas çalışmasının sonuçları the Journal of Clinical Microbiology de 2009 Mart ında yayımlanmıştır. Doksan beş (95) nazofarengeal örnek INFINITI RVP Plus Test kullanılarak analiz edilmiştir. 95 denemenin bütün sonuçları Real-Time PCR (Kanada onaylı protokol) tarafından % 100 onaylanmıştır. Test esilen hasta numuneleri aşağıdadır; Numune Tipi # Hasta Örnekleri Adeno B 1 Adeno E 4 Coro43 1 RhinoA 1 FluA-sH1N1 22 FluB 1 HmpvA 5 10 of 10
HmpvB 1 Para1 1 Para3 2 Negative 56 Bir başka prospektif karşılaştırma çalışmasında, altmış altı (66) hasta numunesi INFINITI RVP Plus testi kullanılarak bir ABD hastanesi tarafından test edildi. Sonuçlar laboratuvarda geliştirilmiş/onaylanmış bir PCR metodu ile karşılaştırılmıştır. İlk INFINITI RVP Plus testi boyunca 66 örnekten 58 i (%88) doğru çağrı ile sonuçlandı ve kıyas metodu tarafından onaylandı. Sekiz tanesi (%12) sonuç vermedi. Yanlış sonuç gözlenmedi. Sekiz sonuçsuz örnekten sadece altısı tekrarlandı. Bilinmeyen sebeplerden ötürü diğer iki örneğin tekrar testi mümkün olmadı. Tekrarlanan altı örnekten üç tanesi kıyaslama metodu ile uyumlu sonuç vermiş üç tanesi yine sonuç vermemiştir. Sadece tek tekrar mümkündür. Karşılaştırma çalışmaları boyunca INFINITI RVP Plus testinden elde edilen bütün çağrılar ( 61 Hasta) PCR metodu tarafından onaylanmıştır (%100). Yanlış sonuç yoktur. Test esilen hasta numuneleri aşağıdadır; Numune Tipi # Hasta Örnekleri Adeno C 1 Coro 43 1 Entero A 1 Rhino A 3 Flu A 1 FluA-sH1N1 2 Flu B 1 Para 1 1 Para 3 2 Negative 48 11 of 10